WO2016010228A1 - 나노-마이크로 하이브리드 섬유 기반의 미성숙 수지상세포 배양방법 및 분석방법 - Google Patents

나노-마이크로 하이브리드 섬유 기반의 미성숙 수지상세포 배양방법 및 분석방법 Download PDF

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WO2016010228A1
WO2016010228A1 PCT/KR2015/003181 KR2015003181W WO2016010228A1 WO 2016010228 A1 WO2016010228 A1 WO 2016010228A1 KR 2015003181 W KR2015003181 W KR 2015003181W WO 2016010228 A1 WO2016010228 A1 WO 2016010228A1
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nanofiber mat
cells
culturing
cell
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PCT/KR2015/003181
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곽종영
정영훈
김창근
윤식
진송완
김태언
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동아대학교 산학협력단
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    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/70—Polysaccharides

Definitions

  • the present invention relates to a method for culturing and analyzing immature dendritic cells based on nano-micro hybrid fibers, specifically, dendritic cells separated from the spleen using a cell culture structure based on nano-micro hybrid fibers.
  • the present invention relates to a method for culturing immature dendritic cells and a method for analyzing immature dendritic cells, which can be stably cultured while maintaining the inactive form of dendritic cells.
  • Dendritic cells are antigen-presenting cells with the function of linking innate and adaptive immunity to damaged / modified cells in the body as well as external antigens, and not only recognize external antigens but also regulate T cell responses. .
  • the ability of dendritic cells to detect and activate external antigens and present antigens to T cells is important for the regulation of immune responses in vivo, and this impairment or damage of dendritic cells can lead to the development of several immune diseases, including cancer, autoimmune diseases and chronic inflammation. Brings about.
  • Mouse dendritic cells are divided into CD11c + CD45RA + migratory plasmacytoid DCs (pDCs) and CD11c + CD45RA - lymphoid tissue resident conventional DCs (cDCs) according to the degree of CD11c expression on the cell surface.
  • dendritic cells are CD4 - CD8 -, CD4 + CD8 - and CD4 - CD8 + cells are classified into CD4 - CD8 + cells caused a Th1 response by secreting IL-12 CD4 + CD8 - cells give rise to Th2 responses.
  • mouse CD4 - CD8 + dendritic cells are known to activate CD8 + cellular T cells, and have the ability to acquire and process foreign antigens and present them through MHC-I.
  • dendritic cells can be divided into two immature and mature dendritic cells by stages of differentiation.
  • Immature dendritic cells acquire antigens from peripheral tissues and mature dendritic cells present these antigens to T cells from lymphoid tissues.
  • Unstimulated dendritic cells are immature and do not induce T cell activity.
  • the co-stimulatory factor is hardly expressed in the dendritic cells, but immature dendritic cells express various receptor molecules necessary for antigen capture on the cell surface, thus capturing the antigen very effectively, and thus is responsible for the initial stage of immunity.
  • unstimulated dendritic cells steady-state DCs
  • MHC-I or II are stimulated to significantly increase their expression on the cell surface.
  • dendritic cells present in the spleen are mostly immature and appear to be involved in maintaining immune tolerance. These dendritic cells are present at a rate of less than 1% of the total cell number of the spleen. Dendritic cells in the spleen have a half-life within 2 days and most of them die in the immature state. CD11c + typical dendritic cells present in the spleen are immature forms of high phagocytosis and low expression of complementary activators in the absence of infection and without stimulation [Wilson, 2003]. Using various separation methods, dendritic cells in the spleen and lymph nodes have been isolated from other cells in the spleen.
  • the present inventors have been devised in view of the above, by culturing the cells based on the nano-micro hybrid fibers to enable the movement and infiltration of the cells, thereby stimulating dendritic cells purely separated from the spleen or lymph nodes.
  • the present invention has been completed to develop a culture technology that can be maintained and cultured in an inactive state as in vivo.
  • Patent Document 0001 Republic of Korea Patent Registration No. 10-1370222
  • Non-Patent Document 0001 Vremec D, Shortman K. Dendritic cell subtypes in mouse lymphoid organs: crosscorrelation of surface markers, changes with incubation, and differences among thymus, spleen, and lymph nodes. J Immunol. 1997; 159 (2): 565-73.
  • Non-Patent Document 0002 Vremec D, et al., Factors determining the spontaneous activation of splenic dendritic cells in culture. Innate Immun. 2011; 17 (3): 338-52.
  • Non-Patent Document 0003 Vremec D, Segura E. The purification of large numbers of antigen presenting dendritic cells from mouse spleen. Methods Mol Biol. 2013; 960: 327-50.
  • Non-Patent Document 0004 Wilson NS, et al., Most lymphoid organ dendritic cell types are phenotypically and functionally immature. Blood. 2003; 102 (6): 2187-94.
  • the present invention provides a method for culturing immature dendritic cells that maintain inactive forms of dendritic cells.
  • Another object of the present invention is to provide a method for analyzing immature dendritic cells using the cultured immature dendritic cells.
  • the present invention is an aspect
  • the upper and lower portions are detachably formed based on the locking projection
  • the second cultured cells in the upper nanofiber mat provides a method for culturing immature dendritic cells, characterized in that to maintain the inactive form of dendritic cells.
  • the polymer nanofiber mat is formed by an electrospinning method.
  • the polymer nanofiber mat disposed in the step (1) is a nano-micro hybrid fiber consisting of 55 to 85% by weight of the fibers of the nanometer diameter and 15 to 45% by weight of the fibers of the micrometer diameter. It is characterized by.
  • the polymer nanofiber mat is characterized in that the thickness is 70 ⁇ 100 ⁇ m.
  • the polymer nanofibers disposed in the step (1) may include chitosan, elastin, hyaluronic acid, gelatin, collagen, cellulose, polyethylene glycol (PEG), polyethylene oxide (PEO), and polycaprolactone (PCL).
  • Polylactic acid polyglycolic acid (PGA), poly [(lactic-co- (glycolic acid)) (PLGA), poly [(3-hydroxybutyrate) -co- (3-hydroxyvallate) (PHBV), polydioxanone (PDO), poly [(L-lactide) -co- (caprolactone)], poly (esterurethane) (PEUU), poly [(L-lactide) -co- (D -Lactide)], poly [ethylene-co- (vinyl alcohol)] (PVOH), polyacrylic acid (PAA), polyvinyl alcohol (PVA), polyvinylpyrrolidone (PVP), polystyrene (PS) and polyaniline ( And one or more biocompatible polymers selected from the group consisting of PAN), copolymers thereof, or mixtures thereof.
  • the lower nanofiber mat further comprises a material for inducing the movement of the active dendritic cells.
  • the dendritic cell of step (2) is characterized in that the dendritic cells separated from the spleen.
  • the primary culture of step (3) is for 3 to 5 hours
  • the secondary culture of step (4) is for 10 to 20 hours.
  • the present invention is another aspect,
  • It provides a method for analyzing immature dendritic cells, characterized in that for measuring the cell culture, cell migration or cell activity of the immature dendritic cells.
  • the polymer coating layer polydimethylsiloxane (PDMS), polystyrene (PS), polymethyl methacrylate (PMMA), polytetrafluoroethylene (PTFE), polyethylene (PE), polyurethane (PU), cellulose And at least one selected from the group consisting of silicone rubbers.
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • PS polystyrene
  • PMMA polymethyl methacrylate
  • PTFE polytetrafluoroethylene
  • PE polyethylene
  • PU polyurethane
  • cellulose cellulose
  • silicone rubbers at least one selected from the group consisting of silicone rubbers.
  • Immature dendritic cells can be cultured that can be kept inactive and cultured as in vivo.
  • cell culture is possible using the cultured immature dendritic cells.
  • FIG. 1 is a schematic diagram (a) of the cell culture structure according to the present invention, a schematic diagram (b) showing the electrospinning process for the production of the polymer nanofiber mat disposed in the cell culture structure (b) and the electrospinning process The scanning micrograph (c) of the nanofiber mat prepared is shown.
  • Figure 2a shows a step of culturing dendritic cells of the spleen in a three-dimensional nanofiber mat (3D NFS) and a two-dimensional dish (2D dish), according to an embodiment of the present invention
  • Figure 2b is a process of Figure 2a According to the dendritic cells cultured in accordance with the high or low cell culture state after showing the result of measuring the activation.
  • 3 is a result of measuring the number of activated cells after culturing dendritic cells of the spleen in a three-dimensional nanofiber mat (3D NFS) and a two-dimensional culture dish (2D dish) according to an embodiment of the present invention It is shown.
  • Figure 4 after incubation for 12 hours with or without LPS in a three-dimensional nanofiber mat (3D NFS) and a two-dimensional culture dish (2D dish) of the cells by confocal fluorescence microscope The results of confirming the shape and the degree of MHC classII expressed on the surface of the cell are shown.
  • 3D NFS three-dimensional nanofiber mat
  • 2D dish two-dimensional culture dish
  • FIG. 5 shows the shape of cells with a scanning electron microscope after 12 hours of incubation with or without LPS in a three-dimensional nanofiber mat (3D NFS) and a two-dimensional culture dish (2D dish) according to an embodiment of the present invention. It shows the result of checking.
  • 3D NFS three-dimensional nanofiber mat
  • 2D dish two-dimensional culture dish
  • FIG. 6 is a poly-L-lysine and the surface of the nanofibers and the culture dish in a three-dimensional nanofiber mat (3D NFS) and a two-dimensional dish (2D dish) according to an embodiment of the present invention; It shows the result of measuring the degree of activation of the spleen dendritic cells cultured after coating with collagen.
  • Figure 8 when separating the cells using the cell culture constructs prepared in Example 2, the number of cells moved in response to the chemokine in the lower by CFSE fluorescence The results were measured by flow cytometry and the number of CD86 + cells by fluorescence staining with CD86 antibody.
  • chemokine 9 is a mouse spleen CD11c + cells (1 ⁇ 10) stained with green fluorescence, which is CFSE on top of NFS, when the cells are separated using the cell culture construct prepared in Example 2, according to one embodiment of the present invention. 6 ) Incubated with NFS at the bottom with or without CCL-21, a chemokine, was measured by fluorescence microscopy and the number of cells moved.
  • Example 10 is to measure the degree of activation of the spleen CD11c + dendritic cells in the upper and lower by separating the cells for 12 hours using the cell culture structure prepared in Example 2 according to an embodiment of the present invention .
  • FIG. 11 shows the total number of CD11c + cells migrated after 4 hours in response to CCL-21 or filtered by lower NFS in cell separation using the cell culture construct prepared in Example 2, according to one embodiment of the present invention. It shows the number which confirmed the cell responding to the CD86 antibody which bound the red fluorescence.
  • Figure 12 in the cell activation assay using the cell culture constructs prepared in Example 2, the cells attached to the upper NFS is separated from the lower NFS after incubating for a period of time to determine the degree of activation The measurement results are shown.
  • FIG. 13 in the cell activation assay using the cell culture construct prepared in Example 2 by separating the cells attached to the upper NFS from the lower NFS by treatment with lipopolysaccharide (LPS) The results of fluorescence microscopy determined by activation of CD86 expression are shown.
  • LPS lipopolysaccharide
  • the present invention enables the migration and infiltration of cells by culturing cells based on nano-micro hybrid fibers, thereby inactivating dendritic cells purely isolated from the spleen or lymph nodes, without being activated in vivo as if they were not stimulated.
  • the present invention relates to a culture method and an analysis method capable of maintaining and culturing.
  • the upper and lower portions are detachably formed based on the locking projection
  • FIG. 1 is a schematic diagram (a) of the cell culture structure according to the present invention, a schematic diagram (b) showing the electrospinning process for the production of the polymer nanofiber mat disposed in the cell culture structure (b) and the electrospinning process The scanning micrograph (c) of the nanofiber mat prepared is shown.
  • the inner side has a locking projection 20 protruding in the center direction, the upper portion based on the locking projection 20
  • the bottom and the bottom is formed detachably.
  • the nanofiber mat for cell culture is disposed and seated on the latching jaw 20 and the bottom surface of the lower portion, so that the nanofiber mat on the upper side and the nanofiber mat on the lower side are spaced in two stages.
  • the cells are filtered, so that only immature dendritic cells can be isolated and cultured stably.
  • the shape of the latching jaw 20 is not limited, and may be any shape that can arrange the nanofiber mat for cell culture.
  • the shape of the latching jaw 20 may be provided with a protrusion 20 in the centric direction along the inner surface of the chamber-shaped cell culture structure.
  • First step (1) is a step of placing the nanofibers for cell culture in the cell culture structure, specifically, the nano-micro hybrid on the locking jaw 20 and the bottom surface of the upper cell culture structure It is a step of disposing the polymer nanofiber mat (40, 50) of the three-dimensional structure formed of fibers, respectively. That is, by placing the polymer nanofiber mat (40, 50) on the upper end of the cell suspension structure and the locking step 20 and the lower surface of the nanofiber mat 40 and the bottom nanofiber mat (50) Are spaced apart from each other in a two-stage configuration.
  • the cells are cultured in the nanofiber mat having the three-dimensional structure, and thus cell attachment to the upper nanofiber mat 40 and cell infiltration to the lower nanofiber mat 50 are achieved, thereby allowing three-dimensional contact.
  • the effect is to coculture with the enemy.
  • the polymer coating layer 30 is polydimethylsiloxane (PDMS), polystyrene (PS), polymethyl methacrylate (PMMA), polytetrafluoroethylene (PTFE), polyethylene (PE), polyurethane (PU), cellulose and silicone It may be formed from one or more selected from the group consisting of rubber, more preferably may be formed of polydimethylsiloxane.
  • the polymer nanofiber mats 40 and 50 are mats having a three-dimensional matrix structure as an aggregate of microfibers and nanofibers having a micro diameter and a nano diameter. Accordingly, the nanofiber mat has a large surface area in a small space, is durable, very easy to handle, can be manufactured in various forms, and it is easy to chemically combine various materials. In particular, in the case of biocompatible polymer fibers produced using biocompatible polymers, a large number of pores are formed to allow the passage of cells, thereby invading and attaching cells and thereby culturing the cells.
  • the adhesion of the cells in the polymer nanofiber mat is mainly made of nanofibers, by increasing the size of the pores by the microfibers to form a three-dimensional matrix structure. Therefore, preferably in the present invention, the polymer nanofiber mat is preferably composed of 55 to 85% by weight of the nanofibers and 15 to 45% by weight of the microfibers.
  • the nanofibers are included in more than the above range, as the porosity is lowered, infiltration and adhesion of the cells are not made, so that cell culture is made only at the upper portion of the support (TOP).
  • the culture of the cell occurs only in the lower part of the support (BOTTOM) due to the infiltration of the cell is preferably mixed within the above range to form a hybrid fiber.
  • the upper portion of the microfibers contains 40% or more of the microfibers in the upper portion, and the lower portion of the microfibers in the lower portion thereof contains 30% or less by weight. Attachment can happen well.
  • the polymer nanofiber mat may be manufactured using an electrospinning process.
  • the electrospinning process may be performed by a method used in manufacturing a conventional nanofiber. For example, after dissolving a biocompatible polymer in a solvent to prepare a polymer solution, the polymer solution is injected into an electrospinning apparatus and discharged to produce a biocompatible polymer nanofiber having a porous structure.
  • the solvent used in the preparation of the polymer solution used for the preparation of the polymer nanofiber mat, the concentration of the polymer solution, the voltage used for electrospinning, the spinning distance, the flow rate, etc. are the type of the polymer used or the desired biocompatible polymer fiber. Those skilled in the art can appropriately adjust according to their physical properties.
  • a square grid-shaped metal mesh plate having a pitch size of 0.5 to 1 mm is provided on the integrated plate of the electrospinning apparatus, as shown in FIG. 3D formed of nano-micro hybrid fibers by covering the glass plate of the film and controlling the intensity of the electric field at the same time while intensively accumulating the polymer fibers around the metal wire constituting the mesh and increasing the generation rate of the polymer fibers of the micrometer diameter. It is desirable to produce polymeric nanofiber mats of structure. At this time, in order to fabricate a large-area polymer fiber mat and to be integrated with a relatively uniform thickness, the integrated plate moves along a raster scanning path, and the size of the path is matched to the size of the mat to be manufactured. Let it move
  • the polymer nanofiber mat is preferably formed in a three-dimensional matrix structure using nanofibers and microfibers having a diameter of 100 nm ⁇ 2 ⁇ m.
  • the electron micrograph of the polymer nanofiber mat prepared according to an embodiment of the present invention in Figure 1b it can be seen that the nano-micro hybrid fiber was produced from 500 nm to 2 ⁇ m in diameter.
  • the polymer nanofiber mat is preferably 50 ⁇ 500 ⁇ m thickness, more preferably 70 ⁇ 100 ⁇ m.
  • the polymer nanofiber mat is an electrospinable polymer, chitosan, elastin, hyaluronic acid, gelatin, collagen, cellulose, polyethylene glycol (PEG), polyethylene oxide (PEO), polycaprolactone (PCL), poly Lactic acid (PLA), polyglycolic acid (PGA), poly [(lactic-co- (glycolic acid)) (PLGA), poly [(3-hydroxybutyrate) -co- (3-hydroxybalate) (PHBV ), Polydioxanone (PDO), poly [(L-lactide) -co- (caprolactone)], poly (esterurethane) (PEUU), poly [(L-lactide) -co- (D-lock Tide)], poly [ethylene-co- (vinyl alcohol)] (PVOH), polyacrylic acid (PAA), polyvinyl alcohol (PVA), polyvinylpyrrolidone (PVP), polystyrene (PS) and poly
  • the polymer nanofiber mat is coated with one or more selected from the group consisting of chitosan, elastin, alginate, gelatin, collagen, cellulose and polylysine (ploy-L-lysine).
  • chitosan elastin
  • alginate elastin
  • gelatin elastin
  • collagen elastin
  • cellulose elastin
  • polylysine ploy-L-lysine
  • step (2) is a step of applying dendritic cells 60 separated from immune tissue to the upper nanofiber mat 40 disposed on the locking jaw 20.
  • the dendritic cells 60 in particular, it is preferable that the dendritic cells separated from the spleen. More preferably, they are CD11c + dendritic cells isolated from the spleen.
  • step (3) is a step of primary culture of the applied dendritic cells. Specifically, the step of incubating for a predetermined time by injecting the cell culture solution into the cell culture structure (10) to culture the dendritic cells applied to the nanofiber mat disposed on the upper locking jaw. A portion of the dendritic cells 60 applied to the nanofiber mat 40 of the upper portion is attached and cultured by the primary culture, and some of the dendritic cells that are not attached to the nanofiber mat 40 of the upper portion are activated. All dendritic cells are infiltrated through the pores inside the nanofiber mat of the three-dimensional structure is moved to the nanofiber mat 50 at the bottom.
  • step (3) of the nano-microcapable three-dimensional cell culture is a step of primary culture of the applied dendritic cells. Specifically, the step of incubating for a predetermined time by injecting the cell culture solution into the cell culture structure (10) to culture the dendritic cells applied to the nanofiber mat disposed on the upper locking jaw. A portion of the dendritic cells 60 applied to the nanofiber mat 40 of the upper portion is attached and cultured by the primary culture, and some of the dendritic cells that are not attached to the nanofiber mat 40 of the upper portion are activated.
  • All dendritic cells are infiltrated through the pores inside the nanofiber mat of the three-dimensional structure is moved to the nanofiber mat 50 at the bottom. That is, some of the dendritic cells not attached to the upper nanofiber mat and the dendritic cells before activation are separated and filtered on the lower nanofiber mat.
  • a cell culture structure that can be spaced apart in two stages nano-micro hybrid polymer nanofiber mat capable of three-dimensional cell culture, the separation of the cells by the attachment and infiltration of the cells, the top of the immature dendritic cells only It can be attached and cultured on a nanofiber mat.
  • the lower nanofiber mat 50 may further include a material for inducing the movement of the active dendritic cells.
  • the dendritic cells in the active state or the active state cultured in the upper nanofiber mat are pores of the three-dimensional nanofiber mat. It moves and infiltrates in the direction of gravity, thereby moving and infiltrating into the underlying nanofiber mat.
  • inactive dendritic cells remain attached to and cultured on the upper nanofiber mat without moving.
  • the active dendrite or active dendritic cells are filtered out of the upper nanofiber mat 40, so that immature dendritic cells can be stably cultured. More preferably, chemokine may be injected as a substance for inducing the movement of the active dendritic cells.
  • Next step (4) is a step of secondary culture of the dendritic cells attached to the nanofiber mat of the upper portion, specifically, after removing the lower nanofiber mat, further injecting the cell culture solution to the nanoparticles of the upper portion By culturing only the dendritic cells attached to the fiber mat, the dendritic cells attached to the nanofiber mat of the upper can be stably cultured.
  • the secondary cultured cells are dendritic cells that do not adhere to the upper nanofiber mat or after dendritic cells are infiltrated and filtered, and are immature dendritic cells that maintain inactive form. do.
  • the activation rate of the cell gradually decreases as the density of the cell is reduced due to the increase of pores. (See FIG. 3). That is, some of the dendritic cells that are not attached to the upper nanofiber mat and the dendritic cells before activation are filtered by the primary culture so that inactive dendritic cells remain on the upper nanofiber mat.
  • the additional culture in the nanofiber mat is low enough to be activated, the inactive immature dendritic cells can be stably cultured by the secondary culture.
  • the immature dendritic cells are attached and cultured to the upper nanofiber mat, and some of the dendritic cells not attached to the upper nanofiber mat with the lower nanofiber mat and the dendritic cells before activation are separated by infiltration.
  • the secondary culture of step (4) is preferably made for 10 to 20 hours. More preferably, the culture medium may be replaced periodically during the culture.
  • the immature dendritic cells are cultured on the upper nanofiber mat by the above method, so that they are applied to one side of the biochip to culture, cell migration or cell activity on the nanofiber mat. By observing and the like, cell analysis becomes possible.
  • the cell culture of immature dendritic cells After forming a polymer coating layer on the substrate, and attaching the upper nanofiber mat containing the immature dendritic cells cultured according to the method on the polymer coating layer, the cell culture of immature dendritic cells There is provided a method for analyzing immature dendritic cells, characterized by measuring cell migration or cell activity.
  • the degree of movement from the upper nanofiber mat to the lower nanofiber mat during the analysis or the degree of activation of dendritic cells in three-dimensional culture conditions can be analyzed by confocal microscopy. .
  • the degree of receptor expression on the surface of the immature dendritic cells, or changes in cytokines secreted in the culture medium may be measured and analyzed.
  • the polymer coating layer polydimethylsiloxane (PDMS), polystyrene (PS), polymethyl methacrylate (PMMA), polytetrafluoroethylene (PTFE), polyethylene (PE), polyurethane (PU), cellulose And at least one selected from the group consisting of silicone rubbers. More preferably polydimethylsiloxane.
  • the nanometer and micrometer diameter polymer fibers are adjusted at an appropriate ratio, and in order to secure the space between the polymer fibers, the present embodiment uses a three-dimensional electrospinning device having the following differences from the existing electrospinning apparatus.
  • a nanofiber mat a nanofiber support (hereinafter referred to as 3D NFS (Nanofiber scaffold)) having a mat shape having a three-dimensional structure was produced.
  • 3D NFS Nanofiber scaffold
  • a simple metal plate is used as an integrated plate, but in this embodiment, a square grid-shaped metal mesh plate having a pitch size of 0.5 to 1 mm is used.
  • a square grid-shaped metal mesh plate having a pitch size of 0.5 to 1 mm is used.
  • by covering the 0.5 ⁇ 1 mm thick glass plate on the top of the electric field while simultaneously controlling the intensity of the polymer fibers around the metal wire constituting the mesh is concentrated intensively, to increase the rate of generation of polymer fibers of the micrometer diameter.
  • FIG. 1B An electron microscope photograph of the electrospinning apparatus used in this embodiment and the nanofiber mat manufactured thereby is shown in FIG. 1B. It can be seen that nano-micro hybrid fibers having a diameter of 500 nm to 2 ⁇ m were produced.
  • Example 2 cell culture construct and cell culture using the same
  • the chamber is provided with a locking projection protruding in the center direction on the inner surface.
  • a cell culture construct was formed in which the upper part and the lower part were separable.
  • the bottom surface of the polystyrene cell culture chamber with an open top surface is coated with PDMS, and the hybrid nanofiber mat prepared in Example 1 is attached to PDMS to fabricate a lower portion of the cell culture structure.
  • the cell culture structure is produced by assembling an upper layer on the lower part of the cell culture structure.
  • the cells after attaching the CD11c + dendritic cells isolated from the spleen to the upper nanofiber mat disposed on the prepared cell culture structure, the cells were cultured for about 4 hours.
  • the culture chamber in which the upper nanofiber mat was disposed was removed, the lower nanofiber mat was removed from the lower culture chamber, and further cultured by adding a cell culture solution.
  • the cell culture process according to the present example is shown schematically in Figs. 2a and 13.
  • Example 3 from the spleen CD11c + Dendritic Separation
  • CD11c + dendritic cells in the spleen, cells using biotin-bound CD19 (ID3), CD3 (145-2C11), TER-119 (TER-119), and Ly-6G (RB6-8C5) antibodies Lineage-negative cells were combined and removed using anti-biotin microbeads. In order to separate high purity CD11c + cells, CD11c + dendritic cells were isolated by positive-selection using CD11c + antibody.
  • Bone marrow cells were isolated from the thighs and calves of 5-6 week old mice.
  • the isolated bone marrow cells (1 ⁇ 10 6 cells / ml) were treated at 37 ° C. with 10% CO 2 in RPMI-1640 medium containing 10% fetal bovine serum, 100 U / ml penicillin and 100 ⁇ g / ml streptomycin.
  • 15 ng / ml granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and 15 ng / ml of interleukin-4 (IL-4) were incubated together for 7 days to induce differentiation into dendritic cells.
  • Differentiated dendritic cells were separated using specific protein surface factors, CD11c and MHC-class II, and isolated using CD11c microbeads.
  • Example 5 nanofiber Dendritic Scanning electron microscope SEM ) observe
  • the nanofibrous support prepared in Example 1 the nanofibrous support prepared in Example 1, spectacular dendritic cells (Spleen DC, SDC) isolated in Example 3 and dendritic cells (bone marrow-) differentiated from the bone marrow prepared in Example 4 derived DC, BMDC) were added and incubated for 12 hours.
  • dendritic cells attached to each fiber were fixed with 4% formaldehyde for one day, lyophilized, and observed. The results are shown in FIGS. 1B and 5.
  • Example 6 spleen Dendritic Culture and flow by flow cytometry Activation level measurement
  • the activity of splenic dendritic cells incubated in 2D plates or 3D nanofiber scaffolds (NFS) for a suitable time was measured as the number of cells in which CD86 expressed on the cell surface was measured.
  • Cultured dendritic cells were reacted with CD11c antibody bound to FITC and CD86 antibody bound to PE, and then measured by flow cytometry. The results are shown in FIGS. 2B, 3 and 6.
  • Example 7 activated spleen Dendritic analysis - Confocal Microscopic measurement, After incubation Cytokine measurement
  • Dendritic cells autonomously, stimulated or converted to active forms increase the expression of CD80, CD86 and MHC class II on the cell membrane and migrate in response to chemokines.
  • the degree of activation of bone marrow-derived dendritic cells produced by differentiating splenocytes or bone marrow from autologous or lipopolysaccharide (LPS) was measured.
  • Spleen dendritic cells (1 ⁇ 10 5 cells) were fluorescently stained with CFSE, attached to the nanofiber scaffolds, and cultured for 12 or 18 hours to induce whether dendritic cells were activated.
  • cytokine was measured after culturing in the nanofiber support culture chamber and the results are shown in FIG. 7.
  • Chemokines CCL2, CCL3, and CCL4 (200 ng / ml), known to increase the migration of inactive dendritic cells, were soaked in a nanofibrous support on the lower layer and left for 12 hours to dry. 5 were attached. Also it was attached to known chemokines CCL21 (200ng / ml) for damping the nanofiber support the lower layer after dried is allowed to stand 12 hours upstairs CD11c + cells were separated from the spleen open-circuit 1 ⁇ 10 5 to increase the movement of the active dendritic cells. The two-layered cultivation chamber was allowed to descend cells or cells reacting with chemokines from the upper layer down to the nanofiber support on the lower layer. After 4 hours, the culture chamber constituting the cell support of the lower layer was removed, and the expression level of CD86 was measured while culturing the culture layer of the upper layer for 12 to 18 hours.
  • FIG. 1B shows a mat-shaped nanofiber support (left) prepared in Example 1 and dendritic cells (right) attached to the nanofiber support in Example 5, referring to the nanofiber support phase Attachment and infiltration of cells can be confirmed.
  • Figure 2a shows a step of culturing dendritic cells of the spleen in a three-dimensional nanofiber mat (3D NFS) and a two-dimensional dish (2D dish),
  • Figure 2b shows a high cell density of the dendritic cells cultured by the above process After culturing in low or low state, the result of measuring activation is shown.
  • the activity is reduced by about two times (60.1-> 34.0) when incubated on the 3D nanofiber scaffold than when cultured in a 2D culture plate for 12 hours.
  • the nanofibers and the microfibers are hybridized, as the voids are formed, there is a space allowance, which means that activity is reduced.
  • the cell activity was increased even when the cell culture density was increased, but it was confirmed that the cell activity was significantly reduced compared to the 2D culture dish.
  • Figure 3 shows the results of measuring the number of activated cells after culturing dendritic cells of the spleen in a three-dimensional nanofiber mat (3D NFS) and a two-dimensional dish (2D dish).
  • 3D NFS three-dimensional nanofiber mat
  • 2D dish two-dimensional dish
  • Figure 4 is a MHC class expressed on the shape and cell surface of the cells by confocal fluorescence microscopy after incubation for 12 hours with or without LPS in 3D nanofiber mat (3D NFS) and 2D dish (2D dish) The result of confirming the degree of II is shown.
  • 3D NFS 3D nanofiber mat
  • 2D dish 2D dish
  • Figure 5 shows the results of confirming the shape of the cells by scanning electron microscope after incubation for 12 hours in the state with or without LPS in a three-dimensional nanofiber mat (3D NFS) and a two-dimensional culture dish (2D dish).
  • 3D NFS three-dimensional nanofiber mat
  • 2D dish two-dimensional culture dish
  • FIG. 6 shows spleen dendritic cells cultured after coating the surfaces of the nanofibers and the culture dish with poly-L-lysine and collagen in a 3D nanofiber mat (3D NFS) and a 2D dish. It shows the result of measuring the degree of activation of the cells. Polylysine or collagen coating can be confirmed that the adhesion of the culture plate or nanofibers is increased to increase the activity of the cells.
  • FIG. 7 shows cytokines after preparation of culture medium in which CD11c + splenic dendritic cells were cultured for 12 hours in a 2D dish and culture medium in which CD11c + splenic dendritic cells were cultured according to a protocol in a 3D nanofiber support (3D NFS). The difference is obtained by using the array kit.
  • the table below compares the different factors. When cultured in 3D NFS, it showed lower activation than 2D dish, indicating that cytokine was secreted less.
  • Figure 8 using the cell culture structure prepared in Example 2, and cultured all the cells isolated from the mouse spleen (total spleen cells, 5 ⁇ 105) in the upper NFS and injected with CCL2, CCL3, CCL4 chemokine at the bottom Infiltrate and separate cells to filter, and the cells moved in response to the chemokine below the fluorescent staining with CD11c-FITC and CD86-PE antibody shows the results of the microscopic image. From this result, it can be seen that the cells separated from the spleen using the cell culture constructs were separated by the lower NFS by infusion of chemokines.
  • Example 10 is a cell culture construct prepared in Example 2 to measure the extent to activate the spleen CD11c + dendritic cells in the upper and lower by separating the cells for 12 hours to measure the expression of CD86 by fluorescence microscope
  • the number of CD86 + cells is expressed as a percentage of the total number of cells remaining on top.
  • the activation level of remaining dendritic cells was about 20%, indicating that immature dendritic cells were cultured.
  • the activation of dendritic cells reached 42.2% with CCL-21, indicating that the active dendritic cells were transferred to the lower NFS by CCL-21.
  • dendritic cell activation of the lower NFS was only 11.4% without CCL-21.
  • FIG. 11 shows the antibody of CD86 conjugated with red fluorescence with respect to the total number of CD11c + cells migrated after 4 hours with NFS of CCL-21 with or without CCL-21 in cell separation using the cell culture construct prepared in Example 2. It shows the number of confirmed cells to react. In the absence of CCL-21 in the lower NFS, dendritic cell activation reached 27.3%, and in the presence of CCL-21, active dendritic cells reached 64.9%. Detach from NFS.
  • Figure 12 shows the results of measuring the degree of activation after culturing for a period of time after separating the cells attached to the upper NFS in the cell activation analysis using the cell culture construct prepared in Example 2 from the lower NFS.
  • the activation rate of the cells was 7.8%, and in the absence of CCL-21, 21.4% of the cells separated by the primary cell culture and 23.4% of the secondary cultures.
  • the degree was shown.
  • the presence of CCL-21 was found to be 11.8% when the cells were separated by primary cell culture, and only 13.4% when the cells were cultured by secondary cell culture.
  • 21 was introduced into the lower NFS, it was confirmed that inactive immature dendritic cells could be cultured more stably.
  • FIG. 13 shows the fluorescence measured by CD86 expression in the cell activation assay using the cell culture construct prepared in Example 2, in which the cells attached to the upper NFS are separated from the lower NFS and activated by treatment with lipopolysaccharide (LPS). Microscopic results are shown.
  • the immature dendritic cells of the upper NFS showed 91.5% activation by LPS treatment. That is, by treating the inducer of activation of dendritic cells in the upper NFS, the expression level of the receptor on the surface of the immature dendritic cells can be measured and analyzed.

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Abstract

본 발명은 나노-마이크로 하이브리드 섬유 기반의 미성숙 수지상세포 배양방법 및 분석방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 내측면에 중심방향으로 돌출형성된 걸림턱을 구비하고, 상기 걸림턱을 기준으로 상부와 하부가 분리가능하게 형성되는, 챔버형상의 세포배양용 구조물을 이용하고, (1) 상기 세포배양용 구조물 상부의 걸림턱 및 상기 하부의 바닥면에 나노-마이크로 하이브리드 섬유로 형성된 3차원 구조의 고분자 나노섬유 매트를 각각 배치하는 단계; (2) 상기 상부의 걸림턱에 배치된 나노섬유 매트에, 면역조직으로부터 분리된 수지상 세포를 도포하는 단계; (3) 상기 도포된 수지상 세포를 1차 배양함으로써, 상기 상부의 나노섬유 매트에 상기 수지상세포를 부착시키고, 상기 상부의 나노섬유 매트에 부착되지 않은 수지상세포와 활성화전 수지상세포가 상기 하부의 나노섬유 매트에 침윤분리되는 단계; 및 (4) 상기 하부의 나노섬유 매트를 제거한 후, 상기 상부의 나노섬유 매트에 부착된 수지상 세포를 2차 배양하는 단계를 포함하여 이루어지고, 상기 상부의 나노섬유 매트에서 2차 배양된 세포는 수지상세포의 비활성형을 유지하는 것을 특징으로 하는, 미성숙 수지상세포의 배양방법이 개시된다.

Description

나노-마이크로 하이브리드 섬유 기반의 미성숙 수지상세포 배양방법 및 분석방법
본 발명은 나노-마이크로 하이브리드 섬유를 기반으로 한 미성숙 수지상세포의 배양방법 및 분석방법에 관한 것으로, 구체적으로는 나노-마이크로 하이브리드 섬유를 기반으로 한 세포배양용 구조물을 이용하여 비장에서 분리한 수지상세포를 수지상세포의 비활성형을 유지하는 상태로 안정적으로 배양할 수 있는, 미성숙 수지상세포의 배양방법 및 미성숙 수지상세포의 분석방법에 관한 것이다.
살아있는 유기체 내에서 세포는 동적으로 시스템이 변화하고, 일정한 지놈(genome)을 유지하면서 세포를 분화하는 능력과 함께 복잡한 형태를 가지고 있다. 따라서 세포의 배양과 분석을 위해서는, 종래 2차원적 세포 배양의 단점을 극복하고, 생체내부의 공간적(spatial), 시간적(temporal) 조건을 정교하게 모사(mimicking)함으로써, 복잡한 생화학적 생체 내(in vivo) 환경을 제공하여 3차원적으로 세포를 배양 및 분석하는 것이 중요하다. 이에 최근 나노공학 기반의 나노/마이크로 기술의 개발로 세포의 배양 및 분석기술이 개발되고 있다. 그러나 아직까지 면역세포의 배양 및 분석에 있어서 면역세포들이 가지는 면역반응의 특성으로 인하여 나노공학 기반의 생체재료를 다양하게 활용하지는 못하고 있는 실정이다.
한편, 수지상세포(Dendritic cell)는 외부항원 뿐만 아니라 체내의 손상/변형된 세포에 대한 선천면역과 적응면역을 연결하는 기능을 가진 항원제시세포로서, 외부항원을 인식할 뿐만 아니라 T 세포반응 조절한다. 수지상세포가 외부항원을 탐식하고 활성화가 되어 T 세포로 항원을 제시하는 능력은 생체 면역반응 조절에 중요하며 수지상세포의 이러한 기능 저하나 손상은 암, 자가면역질환 및 만성염증 등 여러 면역성 질환의 발생을 초래한다.
마우스 수지상세포는 세포 표면에서 CD11c의 발현 정도에 따라 CD11c+CD45RA+ 이동형 혈장성 수지상세포(migratory plasmacytoid DC, pDC)와 CD11c+CD45RA-전형성 수지상세포(lymphoid tissue resident conventional DC, cDC)로 크게 나누고 전형성 수지상세포는 CD4-CD8-, CD4+CD8- 및 CD4-CD8+세포로 구분되는데 CD4-CD8+세포는 IL-12를 분비하여 Th1 반응을 일으키고 CD4+CD8-세포는 Th2 반응을 일으킨다. 따라서 마우스 CD4-CD8+ 수지상세포는 CD8+ 세포성 T 세포를 활성화시키는 세포로 알려져 있으며 외부 항원을 획득하여 처리하고 MHC-I을 통하여 제시하는 교차제시 능력을 가지고 있다.
이러한 수지상세포는 분화 단계별로 크게 미성숙 (immature) 및 성숙(mature) 수지상세포 둘로 나누어 볼 수 있다. 미성숙 수지상세포는 말초조직에서 항원을 획득하고 성숙형의 수지상세포는 림프조직에서 이들 항원을 T 세포에 제시한다. 자극을 받지 않은 수지상세포는 미성숙 상태로 존재하며 T 세포 활성을 유도하지 못한다. 이 경우 수지상세포에는 보조자극 인자가 거의 발현되지 않고 있지만 미성숙 수지상세포는 세포표면에 항원 포획에 필요한 다양한 수용체 분자들을 다량 발현하고 있어 매우 효과적으로 항원을 포획함으로써 면역의 초기단계를 담당한다. 또한 자극을 받지 않은 수지상세포(steady-state DC)는 비록 적은 양의 MHC-I이나 II를 발현하고 있지만 자극을 받게 되면 세포 표면에서 이들의 발현이 현저히 증가된다.
특히, 비장에 존재하는 수지상세포는 대부분 미성숙형으로서 면역관용(tolerance)를 유지하는데 관여하는 것으로 보인다. 이러한 수지상세포는 비장의 전체 세포수의 1% 미만으로 비율로 존재한다. 비장의 수지상세포는 반감기가 2일 이내로 대부분은 미성숙상태 (immature state)로 세포사멸한다. 비장에 존재하는 CD11c+ 전형성 수지상세포는 감염이 없고 자극을 받지 않은 상태에서는 탐식능이 높고 보보활성인자의 발현이 낮은 미성숙의 형으로 존재한다[Wilson, 2003]. 다양한 분리법을 사용하여 비장이나 림프절에 존재하는 수지상세포는 비장의 다른 세포들로부터 순수하게 분리하는 기술은 확립되어 있으나 [Vremec, 2013] 이들 조직으로부터 분리한 수지상세포들을 단독으로 배양할 경우 어떠한 자극이 없이도 매우 짧은 시간의 배양 후에 자가활성(Spontaneous activation)이 된다[Vremec, 1997]. 따라서 현재까지 이차 림프조직으로부터 분리한 수지상포를 이용한 면역학적인 연구가 수행되지 못하고 있는 실정이다. 자가활성화된 수지상세포는 항원의 탐식이나 제시 능력이 세균에 의하여 활성화된 수지상세포보다 떨어지는 등 면역기능을 정확하게 알 수 없게 된다. 배양 중 자가활성이 되는 원인을 규명하려는 연구가 진행되었으나 아직 정확한 기전이나 자가활성이 일어나지 않고 배양을 할 수 있는 기술은 개발되어 있지 않다[Vremec, 2011].
최근 비장으로부터 분리한 CD11c+ 전형성 수지상세포의 자가활성은 세포간의 결합에 의한 활성인자의 분비에 의한다고 보고되었다[Vremec, 2011]. 이러한 자가활성은 2차원적인 세포배양에 의하여 세포간 접촉으로 수지상세포가 활성인자를 분비하는 것으로 추측된다. 따라서 이러한 세포간 결합은 여러 가지 다양한 세포가 존재하거나 조직 내 세포주위를 둘러싸고 있는 세포외기질(extracellular matrix)이 있는 in vivo에서는 일어나지 않을 것이므로 이들 세포를 in vivo-유사 환경인 3차원적 조건에서 배양할 경우 in vitro에서 steady-state의 배양 세포를 얻을 수 있을 것이다.
따라서 본 발명자들은 상기와 같은 점에 착안하여 안출된 것으로, 나노-마이크로 하이브리드 섬유를 기반으로 하여 세포를 배양함으로써 세포의 이동·침윤이 가능하도록 하여, 비장이나 림프절로부터 순수 분리한 수지상세포를 자극을 받지 않은 in vivo에서와 같이 활성화되지 않은 상태로 유지하고 배양할 수 있는 배양기술을 개발하고 본 발명을 완성하였다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
(특허문헌 0001) 대한민국 특허등록 제10-1370222호
[비특허문헌]
(비특허문헌 0001) 1. Vremec D, Shortman K. Dendritic cell subtypes in mouse lymphoid organs: crosscorrelation of surface markers, changes with incubation, and differences among thymus, spleen, and lymph nodes. J Immunol. 1997;159(2):565-73.
(비특허문헌 0002) 2. Vremec D, et al., Factors determining the spontaneous activation of splenic dendritic cells in culture. Innate Immun. 2011;17(3):338-52.
(비특허문헌 0003) 3. Vremec D, Segura E. The purification of large numbers of antigen presenting dendritic cells from mouse spleen. Methods Mol Biol. 2013;960:327-50.
(비특허문헌 0004) 4. Wilson NS, et al., Most lymphoid organ dendritic cell types are phenotypically and functionally immature. Blood. 2003;102(6):2187-94.
따라서 본 발명은 수지상세포의 비활성형을 유지하는 미성숙 수지상세포의 배양방법을 제공하는 것을 그 해결과제로 한다.
또한 본 발명은 상기 배양된 미성숙 수지상세포를 이용하는 미성숙 수지상세포의 분석방법을 제공하는 것을 그 해결과제로 한다.
상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 일 양태로서,
내측면에 중심방향으로 돌출형성된 걸림턱을 구비하고, 상기 걸림턱을 기준으로 상부와 하부가 분리가능하게 형성되는, 챔버형상의 세포배양용 구조물을 이용하고,
(1) 상기 세포배양용 구조물 상부의 걸림턱 및 상기 하부의 바닥면에 나노-마이크로 하이브리드 섬유로 형성된 3차원 구조의 고분자 나노섬유 매트를 각각 배치하는 단계;
(2) 상기 상부의 걸림턱에 배치된 나노섬유 매트에, 면역조직으로부터 분리된 수지상 세포를 도포하는 단계;
(3) 상기 세포배양용 구조물에 상기 도포된 수지상 세포를 1차 배양함으로써, 상기 상부의 나노섬유 매트에 상기 수지상세포를 부착시키고, 상기 상부의 나노섬유 매트에 부착되지 않은 수지상세포와 활성화전 수지상세포가 상기 하부의 나노섬유 매트에 침윤·분리되는 단계; 및
(4) 상기 하부의 나노섬유 매트를 제거한 후, 상기 상부의 나노섬유 매트에 부착된 수지상 세포를 2차 배양하는 단계를 포함하여 이루어지고,
상기 상부의 나노섬유 매트에서 2차 배양된 세포는 수지상세포의 비활성형을 유지하는 것을 특징으로 하는, 미성숙 수지상세포의 배양방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 고분자 나노섬유 매트는, 전기방사법에 의해 형성된 것을 특징으로 한다.
또한 바람직하게는, 상기 (1) 단계에서 배치된 상기 고분자 나노섬유 매트는, 상기 나노미터 직경의 섬유 55~85 중량%와 마이크로미터 직경의 섬유 15~45 중량%로 이루어지는 나노-마이크로 하이브리드 섬유인 것을 특징으로 한다.
또한 바람직하게는, 상기 고분자 나노섬유 매트는, 두께가 70~[0022] 100 ㎛ 인 것을 특징으로 한다.
또한 바람직하게는, 상기 (1) 단계에서 배치된 상기 고분자 나노섬유는, 키토산, 엘라스틴, 히알루론산, 젤라틴, 콜라겐, 셀룰로오스, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리[(락틱-co-(글리콜산))(PLGA), 폴리[(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트)(PHBV), 폴리다이옥산온(PDO), 폴리[(L-락타이드)-co-(카프로락톤)], 폴리(에스테르우레탄)(PEUU), 폴리[(L-락타이드)-co-(D-락타이드)], 폴리[에틸렌-co-(비닐 알코올)](PVOH), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리스티렌(PS) 및 폴리아닐린(PAN)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 생체적합성 고분자, 이들의 공중합체 또는 이들의 혼합물로 형성되는 것을 특징으로 한다.
또한 바람직하게는, 상기 고분자 나노섬유는, 키토산, 엘라스틴, 알지네이트, 젤라틴, 콜라겐, 셀룰로오스 및 라이신(ploy-L-lysine)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상으로 코팅된 것을 특징으로 한다.
또한 바람직하게는, 상기 (1) 단계 또는 (3) 단계에서 상기 하부의 나노섬유 매트는, 활성형 수지상세포의 이동을 유도하는 물질을 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한 바람직하게는, 상기 (2) 단계의 수지상세포는, 비장에서 분리된 수지상세포인 것을 특징으로 한다.
또한 바람직하게는, 상기 (3) 단계의 1차 배양은 3~5시간 동안, 상기 (4) 단계의 2차 배양은 10~20시간 동안 이루어지는 것을 특징으로 한다.
상기 다른 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 다른 양태로서,
기판 상에 고분자 코팅층을 형성하고,
상기 고분자 코팅층 상에 상기 방법에 따라 배양된 미성숙 수지상세포를 포함하는 상부의 나노섬유 매트를 부착한 후,
미성숙 수지상세포의 세포배양, 세포이동 또는 세포활성을 측정하는 것을 특징으로 하는, 미성숙 수지상세포의 분석방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 고분자 코팅층은, 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리스타이렌(PS), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리테트라플루오르에틸렌(PTFE), 폴리에틸렌(PE), 폴리우레탄(PU), 셀룰로오스 및 실리콘 고무로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상으로부터 형성된 것을 특징으로 한다.
상기 본 발명에 따르면 3차원 구조의 매트형상을 갖는 나노-마이크로 하이브리드 섬유를 기반으로 하여 세포를 배양함으로써 세포의 이동· 침윤이 가능하도록 하여, 비장이나 림프절로부터 순수 분리한 수지상세포를 자극을 받지 않은 in vivo에서와 같이 활성화되지 않은 상태로 유지하고 배양할 수 있는 미성숙 수지상세포를배양할 수 있다. 또한 상기 배양된 미성숙 수지상세포를 이용하여 세포분석이 가능하다.
또한 본 발명에 따르면 3차원 구조의 매트형상을 갖는 나노-마이크로 하이브리드 섬유를 2단 구조로 이격되게 배치될 수 있도록 하는 챔버형상의 세포배양 구조물을 이용하여 배양함으로써 상부 나노섬유 매트에 부착되지 않거나 활성화전 상태의 수지상세포를 하부 나노섬유 매트에 걸러내어 세포를 분리하고, 상부 나노섬유 매트만 추가 배양하여 미성숙 수지상세포만을 안정적으로 배양할 수 있는 효과가 있다. 이에 따라 생체조직과 유사한 상태로 부착된 비장 수지상세포의 배양조건도 확립할 수 있고, 배양된 미성숙 수지상 세포는 자가활성을 방지하고 안정화된 상태로 배양되어, 실시간 면역학적 분석이 가능한 효과가 있다. 따라서 현재까지 시험관 내에서 비장 수지상세포의 면역학적 기능을 측정할 수 없어서 골수로부터 GM-CSF와 IL-4로 분화시킨 수지상세포를 사용하여 면역학적 기능을 연구하는 기술을 대체하며 생체 내 존재하는 비장 수지상세포의 면역학적 역할 등을 규명할 수 있는 배양기술과 세포를 제공하는 효과가 있다.
도 1은 본 발명에 따른 세포배양용 구조물의 개략적인 모식도(a)와, 세포배양용 구조물에 배치되는 고분자 나노섬유 매트의 제조를 위한 전기방사공정을 나타낸 모식도(b) 및 상기 전기방사공정으로 제조되는 나노섬유 매트의 주사현미경 사진(c)를 나타낸 것이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따라, 3차원 나노섬유 매트(3D NFS)와 2차원 배양접시(2D dish)에서 비장의 수지상세포를 배양하는 공정을 나타낸 것이고, 도 2b는 도 2a의 공정에 따라 배양한 수지상세포를 세포밀도가 높거나 낮은 상태로 배양한 후 활성화정도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라, 3차원 나노섬유 매트(3D NFS)와 2차원 배양접시(2D dish)에서 비장의 수지상세포를 시간별로 배양한 후 활성화된 세포의 수를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라, 3차원 나노섬유 매트(3D NFS)와 2차원 배양접시(2D dish)에서 LPS를 넣거나 넣지 않은 상태에서 12시간 배양한 후 공촛점 형광현미경으로 세포의 모양과 세포표면에 발현되는 MHC classII의 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라, 3차원 나노섬유 매트(3D NFS)와 2차원 배양접시(2D dish)에서 LPS를 넣거나 넣지 않은 상태에서 12시간 배양한 후 주사전자현미경으로 세포의 모양을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라, 3차원 나노섬유 매트(3D NFS)와 2차원 배양접시(2D dish)에서 상기 나노섬유 및 배양접시의 표면을 폴리라이신(poly-L-lysine) 및 콜라겐으로 코팅 한 후 배양한 비장 수지상세포가 활성화되는 정도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라, 3차원 나노섬유 매트(3D NFS)와 2차원 배양접시(2D dish)에서 비장으로부터 분리한 전체 세포와 CD11c+ 세포만을 배양한 후 배양액에 분비된 사이토카인 및 케모카인을 측정한 후 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 실시예 2에서 제작된 세포배양 구조물을 이용한 세포의 분리시, 하부의 케모카인에 반응하여 이동한 세포를 CFSE 형광으로 확인하고 이동한 세포의 수는 flow cytometry로 측정하였고 CD86 항체로 형광염색하여 CD86+세포의 수를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 실시예 2에서 제작된 세포배양 구조물을 이용한 세포의 분리시, 상부의 NFS에 얹은 CFSE인 녹색형광으로 염색한 마우스 비장 CD11c+세포(1×106)가 케모카인인 CCL-21이 있거나 없는 하부의 NFS로 시간별로 배양한 후 이동하는 것을 형광현미경으로 측정하고 그 이동한 세포의 수를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 실시예 2에서 제작된 세포배양 구조물을 이용하여 12시간동안 세포를 분리함으로써 상부 및 하부에 있는 비장 CD11c+ 수지상세포가 활성화되는 정도를 측정한 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 실시예 2에서 제작된 세포배양 구조물을 이용한 세포분리에 있어서 하부 NFS로 걸러지거나 CCL-21에 반응하여 4시간 후 이동한 CD11c+ 세포의 전체 수에 대하여 적색형광을 결합시킨 CD86의 항체에 반응하는 세포를 확인한 수를 나타낸 것이다.
도 12은 본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 실시예 2에서 제작된 세포배양 구조물을 이용한 세포 활성화 분석에 있어서 상부 NFS에 부착한 세포를 하부 NFS로부터 분리한 후 일정시간 배양한 후 활성화정도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 실시예 2에서 제작된 세포배양 구조물을 이용한 세포 활성화 분석에 있어서 상부 NFS에 부착한 세포를 하부 NFS로부터 분리한 후 lipopolysaccharide (LPS)의 처리에 의하여 활성화되는가를 CD86 발현으로 측정한 형광현미경 결과를 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 나노-마이크로 하이브리드 섬유를 기반으로 하여 세포를 배양함으로써 세포의 이동·침윤이 가능하도록 하여, 비장이나 림프절로부터 순수 분리한 수지상세포를 자극을 받지 않은 in vivo에서와 같이 활성화되지 않은 상태로 유지하고 배양할 수 있는 배양방법과 분석방법에 관한 것이다.
따라서 본 발명은 일 양태로서,
내측면에 중심방향으로 돌출형성된 걸림턱을 구비하고, 상기 걸림턱을 기준으로 상부와 하부가 분리가능하게 형성되는, 챔버형상의 세포배양용 구조물을 이용하고,
(1) 상기 세포배양용 구조물 상부의 걸림턱 및 상기 하부의 바닥면에 나노-마이크로 하이브리드 섬유로 형성된 3차원 구조의 고분자 나노섬유 매트를 각각 배치하는 단계; (2) 상기 상부의 걸림턱에 배치된 나노섬유 매트에, 면역조직으로부터 분리된 수지상 세포를 도포하는 단계; (3) 상기 세포배양용 구조물에 상기 도포된 수지상 세포를 1차 배양함으로써, 상기 상부의 나노섬유 매트에 상기 수지상세포를 부착시키고, 상기 상부의 나노섬유 매트에 부착되지 않은 수지상세포와 활성화전 수지상세포가 상기 하부의 나노섬유 매트에 침윤·분리되는 단계; 및 (4) 상기 하부의 나노섬유 매트를 제거한 후, 상기 상부의 나노섬유 매트에 부착된 수지상 세포를 2차 배양하는 단계를 포함하여 이루어지고, 상기 상부의 나노섬유 매트에서 2차 배양된 세포는 수지상세포의 비활성형을 유지하는 것을 특징으로 하는, 미성숙 수지상세포의 배양방법이 제공된다.
도 1은 본 발명에 따른 세포배양용 구조물의 개략적인 모식도(a)와, 세포배양용 구조물에 배치되는 고분자 나노섬유 매트의 제조를 위한 전기방사공정을 나타낸 모식도(b) 및 상기 전기방사공정으로 제조되는 나노섬유 매트의 주사현미경 사진(c)를 나타낸 것이다.
상기 도면을 참고하여 본 발명을 자세히 살펴보면, 본 발명에 따른 미성숙 수지상세포의 배양방법은, 내측면에 중심방향으로 돌출형성된 걸림턱(20)을 구비하고, 상기 걸림턱(20)을 기준으로 상부와 하부가 분리가능하게 형성되는, 챔버형상의 세포배양용 구조물(10)을 이용하는 것이 중요하다. 이에 따라 상기 걸림턱(20)과 상기 하부의 바닥면에 세포배양을 위한 나노섬유매트가 배치·안착되어, 상부의 나노섬유매트와 하부의 나노섬유매트가 이격되게 2단으로 배치되고, 이에 따라 세포배양시 상부에서 하부로 세포의 부착 및 침윤이 이루어져 세포가 걸러짐으로써, 미성숙 수지상세포만을 분리하여 안정적으로 배양하는 것이 가능해진다.
따라서 상기 걸림턱(20)의 형상은 제한되지 않으며, 세포배양을 위한 나노섬유매트를 배치할 수 있는 형상이면 무방하다. 바람직하게는 도 1a에 나타난 바와 같이 상기 챔버형상의 세포배양용 구조물 내측면을 따라 주심방향으로 돌출형성되는 (20)을 구비할 수 있다.
먼저 (1) 단계는 세포배양을 위한 나노섬유를 상기 세포배양용 구조물에 배치하는 단계로, 구체적으로는 상기 세포배양용 구조물 상부의 걸림턱(20) 및 상기 하부의 바닥면에 나노-마이크로 하이브리드 섬유로 형성된 3차원 구조의 고분자 나노섬유 매트(40, 50)를 각각 배치하는 단계이다. 즉, 상기 세포배양용 구조물 상부의 걸림턱(20) 및 하부의 바닥면에 상기 고분자 나노섬유 매트(40, 50)을 배치함에 따라 상부의 나노섬유 매트(40)와 하부의 나노섬유 매트(50)가 서로 이격되게 2단 형상으로 배치된다. 이와같이 나노섬유 매트가 배치됨으로써 상기 3차원 구조의 나노섬유 매트에서 세포가 배양됨에 따라 상부 나노섬유 매트(40)에의 세포 부착 및 하부 나노섬유 매트(50)로의 세포침윤이 이루어져 상호접촉이 없이 3차원적으로 공배양하는 효과를 가져오게 된다.
이 때, 바람직하게는 상기 나노섬유 매트(40, 50)가 세포배양용 구조물(10)에 용이하게 고정될 수 있도록 상기 걸림턱(20)의 상면 및 하부의 바닥면에 고분자 코팅층(30)을 형성하도록 한 후에 상기 나노섬유 매트(40,50)를 배치하도록 한다. 상기 고분자 코팅층(30)은 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리스타이렌(PS), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리테트라플루오르에틸렌(PTFE), 폴리에틸렌(PE), 폴리우레탄(PU), 셀룰로오스 및 실리콘 고무로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상으로부터 형성될 수 있으며, 보다 바람직하게는 폴리디메틸실록산으로 형성될 수 있다.
또한 상기 고분자 나노섬유 매트(40, 50)는, 마이크로 직경과 나노직경을 갖는 마이크로 섬유 및 나노섬유의 집합체로서 3차원적 매트릭스의 구조를 갖는 매트형상인 것이 특징이다. 이에 따라 상기 나노섬유 매트는 적은 공간에 넓은 표면적을 지니고 있으며, 내구성이 강하고, 다루기가 매우 간편하고, 다양한 형태로 제작이 가능하며 또한, 다양한 물질을 화학적으로 결합시키는 것이 용이하게 된다. 특히, 생체적합성 고분자를 이용하여 제작되는 생체적합성 고분자 섬유의 경우 세포의 통과가 가능할 정도로 다수의 공극(PORE)을 형성하고 있어 세포의 침윤·부착 및 이에 따른 세포배양이 가능하게 된다.
이 때, 상기 고분자 나노섬유 매트 내 세포의 부착은 주로 나노섬유에서 이루어지고, 마이크로 섬유에 의하여 공극의 크기를 증가시킴에 따라 3차원 매트릭스 구조를 형성하게 되는 것이다. 따라서 바람직하게는 본 발명에 있어서 상기 고분자 나노섬유 매트는 상기 나노섬유 55~85 중량%과 마이크로 섬유 15~45 중량%로 구성되는 것이 적합하다. 상기 나노섬유가 상기 범위를 초과하여 포함하는 경우에는 공극률이 저하됨에 따라 세포의 침윤·부착이 이루어지지 않아 세포배양이 상기 지지체 상부(TOP)에서만 이루어지게 되고, 상기 범위 미만으로 포함되는 경우에는 공극률이 지나치게 높아짐에 따라 세포의 침윤에 의하여 상기 지지체 하부(BOTTOM)에서만 세포의 배양이 일어나게 되는 문제점이 있으므로 상기 범위 내에서 혼합되어 하이브리드 섬유를 구성하는 것이 바람직하다. 이 경우, 보다 바람직하게는 상부에서는 마이크로 섬유의 비율이 40% 이상으로 많이 함유되고, 하부에서는 마이크로 섬유의 비율이 30중량% 이하로 적게 함유되도록 하이브리드 섬유를 구성할 때 상부에서 하부로 세포의 침윤·부착이 잘 일어날 수 있다.
바람직하게는 상기 고분자 나노섬유 매트는 전기방사공정을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 전기방사공정은 통상의 나노섬유 제조시 사용되는 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 생체적합성 고분자를 용매에 용해시켜 고분자 용액을 제조한 후, 상기 고분자 용액을 전기방사 장치에 주입하고 토출시켜 다공성 구조를 갖는 생체적합성 고분자 나노섬유를 제조한다. 상기 고분자 나노섬유 매트의 제조를 위해 사용되는 고분자 용액의 제조시 사용되는 용매, 고분자 용액의 농도, 전기방사에 사용되는 전압, 방사거리, 유속 등은 사용되는 고분자의 종류나 목적하는 생제적합성 고분자 섬유의 물성 등에 따라 당업자가 적절히 조절할 수 있다.
본 발명에 있어서 보다 바람직하게는, 도 1b에 나타낸 바와 같이 전기방사 장치의 집적판 상에 피치크기를0.5~1 mm로 하는 정사각형 그리드 모양의 금속메쉬판을 설치하고, 이 위에 0.5~1 mm 두께의 유리판을 덮어 전기장의 세기를 동시에 조절하면서 메쉬를 구성하는 금속선 주변에 고분자 섬유가 집중적으로 집적되고, 여기에 마이크로미터 직경의 고분자 섬유 발생비율 또한 높일 수 있도록 하여 나노-마이크로 하이브리드 섬유로 형성된 3차원 구조의 고분자 나노섬유 매트를 제조하는 것이 바람직하다. 이 때, 대면적의 고분자 섬유 매트를 제작하고, 비교적 균일한 두께로 집적이 되도록 하기 위해 집적판은 지그재그 경로(raster scanning)를 따라 움직이도록 하고, 경로의 크기는 제작하고자 하는 매트의 크기에 맞춰 움직이도록 한다.
또한 본 발명에 있어서, 상기 고분자 나노섬유 매트는 100 nm ~ 2 ㎛의 직경을 가지는 나노섬유와 마이크로섬유를 이용하여 3차원 매트릭스 구조로 형성되는 것이 바람직하다. 또한 도 1b에 본 발명의 일 실시예에 따라 제작된 고분자 나노섬유 매트의 전자현미경 사진을 나타내었는바, 직경이 500 nm에서 2 ㎛에 이르는 나노-마이크로 하이브리드 섬유가 제작되었음을 확인할 수 있다. 이 때 상기 고분자 나노섬유 매트는 그 두께가 50~500 ㎛, 보다 바람직하게는 70~100 ㎛인 것이 적합하다.
또한 바람직하게는, 상기 고분자 나노섬유 매트는, 전기방사가능한 고분자로서 키토산, 엘라스틴, 히알루론산, 젤라틴, 콜라겐, 셀룰로오스, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리[(락틱-co-(글리콜산))(PLGA), 폴리[(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트)(PHBV), 폴리다이옥산온(PDO), 폴리[(L-락타이드)-co-(카프로락톤)], 폴리(에스테르우레탄)(PEUU), 폴리[(L-락타이드)-co-(D-락타이드)], 폴리[에틸렌-co-(비닐 알코올)](PVOH), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리스티렌(PS) 및 폴리아닐린(PAN)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 생체적합성 고분자, 이들의 공중합체 또는 이들의 혼합물로 형성되는 것을 특징으로 한다. 본발명에서 사용하는 생체적합성 고분자는 이에 제한되는 것은 아니나, 수평균 분자량이 10,000 내지 1,000,000, 예컨대, 50,000 내지 500,000의 범위인 것을 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 이 중 PCL을 이용하여 나노섬유를 제작하였다.
또한 바람직하게는, 상기 고분자 나노섬유 매트는, 키토산, 엘라스틴, 알지네이트, 젤라틴, 콜라겐, 셀룰로오스 및 폴리라이신(ploy-L-lysine)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상으로 코팅된 것을 특징으로 한다. 상기 양이온성 그룹에 속하는 물질로 코팅됨으로써 세포에의 부착성을 높일 수 있다. 보다 바람직하게는 폴리라이신을 이용하도록 한다.
다음으로 (2) 단계는, 상기 걸림턱(20)에 배치된 상부의 나노섬유 매트(40)에, 면역조직으로부터 분리된 수지상세포(60)를 도포하는 단계이다. 세포배양을 위한 수지상세포를 도포하여 배양을 준비하는 단계로, 상기 수지상세포(60)는 특히, 비장으로부터 분리된 수지상세포인 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 비장으로부터 분리한 CD11c+ 수지상세포이다.
다음으로 (3) 단계는, 상기 도포된 수지상 세포를 1차 배양하는 단계이다. 구체적으로, 상기 상부의 걸림턱에 배치된 나노섬유 매트에 도포된 수지상 세포를 배양할 수 있도록 세포배양액을 상기 세포배양용 구조물(10)에 주입하여 일정시간 배양시키는 단계이다. 상기 1차 배양에 의하여 상기 상부의 나노섬유 매트(40)에 도포된 수지상세포(60)의 일부가 부착되어 배양되고, 상기 상부의 나노섬유 매트(40)에 부착되지 않은 수지상세포 일부와, 활성화전 수지상세포는 상기 3차원 구조의 나노섬유 매트 내부의 공극을 통하여 침윤됨으로써 하부의 나노섬유매트(50)로 이동하게 된다. 즉, 상기 상부의 나노섬유 매트에 부착되지 않은 수지상세포 일부와 활성화 전 수지상세포가 하부의 나노섬유 매트에 분리되어 걸러지게 된다. 이와 같이 3차원 세포배양이 가능한 나노-마이크로 다음으로 (3) 단계는, 상기 도포된 수지상 세포를 1차 배양하는 단계이다. 구체적으로, 상기 상부의 걸림턱에 배치된 나노섬유 매트에 도포된 수지상 세포를 배양할 수 있도록 세포배양액을 상기 세포배양용 구조물(10)에 주입하여 일정시간 배양시키는 단계이다. 상기 1차 배양에 의하여 상기 상부의 나노섬유 매트(40)에 도포된 수지상세포(60)의 일부가 부착되어 배양되고, 상기 상부의 나노섬유 매트(40)에 부착되지 않은 수지상세포 일부와, 활성화전 수지상세포는 상기 3차원 구조의 나노섬유 매트 내부의 공극을 통하여 침윤됨으로써 하부의 나노섬유매트(50)로 이동하게 된다. 즉, 상기 상부의 나노섬유 매트에 부착되지 않은 수지상세포 일부와 활성화 전 수지상세포가 하부의 나노섬유 매트에 분리되어 걸러지게 된다. 이와 같이 3차원 세포배양이 가능한 나노-마이크로 하이브리드 고분자 나노섬유 매트를 2단으로 이격되게 배치할 수 있는 세포배양 구조물을 이용함으로써, 세포의 부착 및 침윤에 의하여 세포의 분리가 이루어져 미성숙 수지상세포만 상부 나노섬유 매트에 부착· 배양될 수 있게 된다.
바람직하게는 안정적으로 상부의 나노섬유 매트(40)에서 미성숙 수지상세포만 배양될 수 있도록, 하부의 나노섬유 매트(50)에 활성형 수지상세포의 이동을 유도하는 물질을 더 포함하도록 할 수 있다. 상기 활성형 수지상 세포의 이동을 유도하는 물질이 더 포함하여 세포배양을 하게 되면, 상기 상부의 나노섬유 매트에서 배양된 활성전상태 또는 활성형상태로의 수지상세포가 상기 3차원 나노섬유 매트의 공극에 의하여 중력방향으로 이동 및 침윤되고, 이에 따라 하부의 나노섬유 매트로 이동· 침윤이 이루어지게 된다. 또한 비활성형 수지상세포는 상기 이동하지 않고 상부의 나노섬유 매트에 남아 부착· 배양된다. 따라서 상부의 나노섬유 매트(40)에서 활성전 또는 활성형의 수지상세포가 걸러지게 되어, 미성숙 수지상세포가 안정적으로 배양할 수 있게 된다. 보다 바람직하게는 상기 활성형 수지상세포의 이동을 유도하는 물질로서 케모카인을 주입할 수 있다.
다음으로 (4) 단계는, 상기 상부의 나노섬유 매트에 부착된 수지상세포를 2차 배양하는 단계로, 구체적으로는 상기 하부의 나노섬유 매트를 제거한 후, 세포배양액을 더 주입하여 상기 상부의 나노섬유 매트에 부착된 수지상세포만을 배양하여 상기 상부의 나노섬유 매트에 부착된 수지상세포가 안정적으로 배양될 수 있게 된다.
이 때, 상기 2차 배양된 세포는, 상기 상부의 나노섬유 매트에 부착되지 않거나 활성전상태의 수지상세포가 침윤되어 걸러지고 난 후의 수지상세포로서, 비활성형을 유지하는 미성숙 수지상세포인 것을 특징으로 한다. 관련하여 본 발명의 일 실시예에 따르면 특히 3차원 나노-마이크로 하이브리드 고분자 나노섬유 매트를 이용하여 배양할 경우 공극의 증가로 인한 세포의 밀도가 감소됨에 따라 세포의 활성화율이 점차 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 3 참고). 즉, 상기 1차 배양에 의하여 상기 상부의 나노섬유 매트에 부착되지 않은 수지상세포의 일부와 활성전의 수지상세포가 걸러지게 되어 비활성형의 수지상세포가 상부의 나노섬유 매트에 남아있게 되고, 상기 3차원 나노섬유 매트에서의 추가 배양시 추가적으로 활성화되는 정도가 낮아, 상기 2차 배양에 의하여 비활성형인 미성숙 수지상세포가 안정적으로 배양될 수 있는 것이다.
바람직하게는 상기 상부의 나노섬유 매트에 미성숙 수지상세포가 부착· 배양되고, 상기 하부의 나노섬유 매트로 상기 상부의 나노섬유 매트에 부착되지 않은 수지상세포 일부와 활성화 전 수지상세포가 침윤에 의하여 분리되기 위해서는 상기 (3) 단계의 1차 배양은 3~5시간 동안, 상기 (4) 단계의 2차 배양은 10~20시간 동안 이루어지는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 상기 배양시 주기적으로 배양액의 교체도 가능하다.
상기 방법으로 상부 나노섬유 매트에 미성숙 수지상세포가 배양되게 되면, 매트형상의 나노섬유에 미성숙 수지상세포가 배양되어 있으므로 바이오칩의 일 면에 이를 적용하여 상기 나노섬유매트에서 세포배양, 세포이동 또는 세포활성 등을 관찰함으로써 세포분석이 가능해진다.
따라서 본 발명의 다른 양태로서, 기판 상에 고분자 코팅층을 형성하고, 상기 고분자 코팅층 상에 상기 방법에 따라 배양된 미성숙 수지상세포를 포함하는 상부의 나노섬유 매트를 부착한 후, 미성숙 수지상세포의 세포배양, 세포이동 또는 세포활성을 측정하는 것을 특징으로 하는, 미성숙 수지상세포의 분석방법이 제공된다.
또한 바람직하게는 본 발명에 있어서 상기 분석시 상기 상부의 나노섬유 매트에서 상기 하부의 나노섬유 매트로 이동된 정도 또는 3차원 배양조건에서 수지상세포의 활성화정도를 공촛점 현미경으로 관찰하여 분석할 수 있다.
또한 바람직하게는 상기 상부의 나노섬유 매트에 수지상세포의 활성화 유도물질을 처리한 후, 상기 미성숙 수지상세포 표면의 수용체 발현정도, 또는 배양액에 분비되는 사이토카인의 변화를 측정 및 분석할 수 있다.
바람직하게는, 상기 고분자 코팅층은, 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리스타이렌(PS), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리테트라플루오르에틸렌(PTFE), 폴리에틸렌(PE), 폴리우레탄(PU), 셀룰로오스 및 실리콘 고무로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상으로부터 형성된 것을 특징으로 한다. 보다 바람직하게는 폴리디메틸실록산으로 형성된다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
< 실시예 >
실시예 1: 전기방사법에 의한 나노섬유의 제작
나노미터와 마이크로미터 직경의 고분자 섬유가 적절한 비율로 조절되어 있으며, 고분자 섬유간 공간의 확보를 위해 본 실시예에서는 기존의 전기방사장치에서 다음과 같은 차이점을 가지고 있는 전기방사장치를 이용하여 3차원 나노섬유 매트로서, 3차원 구조의 매트형상을 갖는 나노섬유 지지체(이하, 3D NFS(Nanofiber scaffold))를 제작하였다.
(1) 기존의 전기방사장치에서는 단순한 금속판을 집적판으로 사용하고 있으나, 본 실시예에서는 피치크기를 0.5~1 mm로 하는 정사각형 그리드 모양의 금속메쉬판을 사용하였다. 또한 그 위에 0.5~1 mm 두께의 유리판을 덮어 전기장의 세기를 동시에 조절하면서 메쉬를 구성하는 금속선 주변에 고분자 섬유가 집중적으로 집적되고, 여기에 마이크로미터 직경의 고분자 섬유 발생비율 또한 높일 수 있도록 하였다.
(2) 대면적의 고분자섬유 매트의 제작 및 비교적 균일한 두께로 집적이 되도록 집적판은 지그재그 경로(raster scanning)를 따라 움직였으며, 이때 경로의 크기는 제작하고자 하는 매트의 크기에 맞춰 움직이도록 하였다.
상기 본 실시예에서 사용된 전기방사장치 및 이에 의하여 제작된 나노섬유 매트의 전자현미경 관찰 사진을 도 1b에 나타내었다. 직경이 500 nm에서 2 ㎛에 이르는 나노-마이크로 하이브리드 섬유가 제작되었음을 확인할 수 있다.
실시예 2: 세포배양 구조물 제작 및 이를 이용한 세포배양
2-1 세포배양 구조물의 제작
본 실시예에서는 저면에 구멍이 형성된 챔버를 상부에, 저면에 구멍이 형성되지 않은 챔버를 하부에 위치하도록 적층하여 조립함으로써, 내측면에 중심방향으로 돌출형성된 걸림턱을 구비하고, 상기 걸림턱을 기준으로 상부와 하부가 분리가능하게 형성되는 세포배양 구조물을 제작하였다.
이를 위해, 먼저 상면이 개방된 폴리스티렌 세포배양 챔버의 저면을 PDMS로 코팅하고 PDMS에 상기 실시예 1에서 제작한 하이브리드 나노섬유 매트를 부착하여 세포배양 구조물의 하부를 제작한다. 저면에 구멍이 형성되고 상면이 개방된 폴리스티렌 세포배양 챔버를 준비하고 챔버의 저면을 PDMS로 코팅한 다음, PDMS에 상기 실시예 1에서 제작한 하이브리드 나노섬유 매트를 부착하여 세포배양 구조물의 상부를 제작한다. 이를 상기 세포배양 구조물의 하부의 위에 상부를 적층하여 조립함으로써 세포배양 구조물이 제작된다.
상기와 같이 제작됨으로써 제작된 모형은 도 1a에 나타내었다.
2-2 제작된 세포배양 구조물을 이용한 세포배양
본 실시예에서는 상기 제작된 세포배양 구조물의 상부에 배치된 상부 나노섬유 매트에 비장으로부터 분리한CD11c+ 수지상세포를 부착시킨 후, 4시간 정도 세포 배양을 실시하였다.
상기 상부 나노섬유매트가 배치된 배양챔버를 분리하여 하부의 배양챔버에서 하부 나노섬유매트를 제거하고, 다시 세포배양액을 첨가하여 일정시간 배양하였다.
본 실시예에 따른 세포배양 공정은 도 2a 및 도 13에 모식화하여 나타내었다.
실시예 3: 비장으로부터 CD11c + 수지상세포의 분리
비장에서 CD11c+ 수지상세포를 제외한 세포는 바이오틴(biotin)에 결합된 CD19(ID3), CD3(145-2C11), TER-119(TER-119), 및 Ly-6G(RB6-8C5) 항체를 이용하여 계통 음성 세포(lineage-negative cell)를 결합시키고 항바이오틴 마이크로비드(anti-biotin microbeads)를 사용하여 제거하였다. 고순도의 CD11c+ 세포를 분리하기 위하여 CD11c+ 항체를 이용하여 CD11c+ 수지상세포를 positive-selection으로 분리하였다.
실시예 4: 골수유래 수지상세포의 제작
5~6 주령의 마우스의 대퇴부 및 종아리에서 골수세포를 분리하였다. 분리된 골수세포(1×106cells/ml)는 10% 소 태아 혈청과 100 U/ml 페니실린 그리고 100 μg/ml 스트렙토마이신이 들어있는 RPMI-1640 배지에서 10%의 CO2가 공급되는 37℃ 배양기로 배양하였으며, 수지상세포로 분화유도를 위하여 15 ng/ml 과립구 대식세포 집락자극인자(GM-CSF)와 15 ng/ml의 인터루킨-4(IL-4)를 7일 동안 함께 배양하였다. 분화된 수지상세포는 특이적 단백질 표면 인자인 CD11c 및 MHC-class Ⅱ를 이용하여 구분하고, CD11c 마이크로비드를 이용하여 분리하였다.
실시예 5: 나노섬유와 수지상세포의 주사전자현미경( SEM ) 관찰
본 실시예에서는 상기 실시예 1에서 제조한 나노섬유 지지체에, 상기 실시예 3에서 분리한 비장 수지상세포(Spleen DC, SDC) 및 상기 실시예 4에서 제작한 골수로부터 분화시킨 수지상세포(bone marrow-derived DC, BMDC)를 넣고 12시간 동안 배양하였다. 주사전자현미경 촬영을 위한 전 처리과정으로 각각의 섬유에 부착된 수지상세포는 4% 포름알데하이드로 하루 동안 고정을 하고 동결건조를 시킨 뒤 부착된 모양을 관찰하였다. 그 결과는 도 1b 및 도 5에 도시하였다.
실시예 6: 비장 수지상세포의 배양 및 flow cytometry로 활성화 정도 측정
2D 배양접시나 3D 나노섬유 지지체 (NFS)에서 적당한 시간 동안 배양한 비장 수지상세포의 활성정도를 세포표면에 발현되는 CD86가 측정되는 세포수로서 측정하였다. 배양한 수지상세포는 FITC가 결합된 CD11c 항체와 PE가 결합된 CD86 항체로 반응시킨 다음 flow cytometry를 이용하여 측정하였다. 그 결과는 도 2b, 도 3 및 도 6에 도시하였다.
실시예 7: 활성화된 비장 수지상세포의 분석 - 공촛점 현미경 측정, 배양후 사이토카인 측정
수지상세포는 자가적으로나 자극에 의하거나 활성형으로 전환되면 세포막에 CD80, CD86 및 MHC class II의 발현이 증가되고 케모카인에 반응하여 이동을 한다. 이에 본 실시예에서는 비장의 수지상세포나 골수로부터 분화시켜 제작된 골수유래 수지상세포가 자가적이거나 lipopolysaccharide (LPS)에 의하여 활성화되는 정도를 측정하였다. 비장 수지상세포(1×105cells)를 CFSE로 형광 염색한 후 나노섬유 지지체에 부착시키고 12 시간 혹은 18시간 동안 배양하여 수지상세포가 활성화되는가를 유도하였다. 성숙화의 유도 확인은 수지상세포의 단백질 표면인자인 CD86 및 MHC class II가 세포 면에 발현되는 정도를 항체를 이용하여 공촛점 현미경으로 확인하였다. 전체 CFSE-positive 세포 수에 대하여 CD86-positive 세포수를 %로 표시하였다. 그 결과는 도 4, 도 10 및 도 11에 도시하였다.
또한 나노섬유 지지체 배양챔버에서 배양 후 사이토카인을 측정하여 그 결과를 도 7에 도시하였다.
실시예 8: 비장 수지상세포의 안정화 및 세포 배양
비활성형 수지상세포의 이동을 증가시키는 것으로 알려진 케모카인 CCL2, CCL3, 및 CCL4( 200 ng/ml)을 아래층의 나노섬유 지지체에 적시고 12시간 방치하여 말린 후 위층에는 비장으로부터 분리한 CD11c+ 세포를 1×105개로 부착시켰다. 또한 활성형 수지상세포의 이동을 증가시키는 것으로 알려진 케모카인 CCL21( 200ng/ml)을 아래층의 나노섬유 지지체에 적시고 12시간 방치하여 말린 후 위층에는 비장으로부터 분리한 CD11c+ 세포를 1×105개로 부착시켰다. 두층으로 구성된 배양챔버를 위층에서 부착되지 않은 세포나 케모카인에 반응하는 세포를 아래층의 나노섬유 지지체로 내려오도록 하였다. 방치하고 4시간 후에 아래층의 세포지지체를 구성하는 배양챔버를 제거하고 위층의 배양챔버를 12 시간에서 18시간 동안 배양하면서 CD86의 발현 정도를 측정하였다.
그 결과는 도 8, 도 [0092] 12 및 도 13에 도시하였다.
이하, 도면을 참고하여 상기 실시예의 결과를 설명하기로 한다.
도 1b는 상기 실시예 1에서 제작된 매트형상의 나노섬유 지지체(왼쪽)와, 상기 실시예 5에서 상기 나노섬유 지지체 상에 부착된 수지상세포(오른쪽)을 나타내었는바 이를 참고하면 나노섬유 지지체 상에 세포의 부착 및 침윤을 확인할 수 있다.
도 2a는 3차원 나노섬유 매트(3D NFS)와 2차원 배양접시(2D dish)에서 비장의 수지상세포를 배양하는 공정을 나타낸 것이고, 도 2b는 상기 공정에 의하여 배양한 수지상세포를 세포밀도가 높거나 낮은 상태로 배양한 후 활성화정도를 측정한 결과를 나타낸 것이다. 도 2b를 참고하면 12시간 배양한 경우 2D 배양접시에서의 배양시보다 3D 나노섬유 지지체 상에서 배양시 2배 정도 활성이 감소함(60.1 -> 34.0)을 확인할 수 있다. 나노섬유와 마이크로섬유가 하이브리드 됨에 따라 공극이 형성됨에 따라 공간적 여유가 있어 활성이 감소하였음을 의미한다. 또한 세포배양시 밀도를 높게 할 경우에도 세포활성은 증가하였으나 2D 배양접시에 비하여 세포활성이 상당히 감소하는 것으로 나타남을 확인할 수 있다.
도 3은 3차원 나노섬유 매트(3D NFS)와 2차원 배양접시(2D dish)에서 비장의 수지상세포를 시간별로 배양한 후 활성화된 세포의 수를 측정한 결과를 나타낸 것이다. 2D 배양접시에서 배양한 경우 시간이 경과함에 따라 활성화된 세포의 수가 선형으로 증가하는 것을 확인할 수 있으나, 3D 나노섬유 지지체에서 배양한 경우 6시간 배양시까지는 활성화된 세포의 수가 증가하다가 점차 그 증가폭이 둔화되는 것을 확인할 수 있었다. 이로써 3차원 나노-마이크로 섬유 매트를 이용함으로써 세포의 활성을 감소시킬 수 있는 것으로 확인된다.
도 4는 3차원 나노섬유 매트(3D NFS)와 2차원 배양접시(2D dish)에서 LPS를 넣거나 넣지 않은 상태에서 12시간 배양한 후 공촛점 형광현미경으로 세포의 모양과 세포표면에 발현되는 MHC class II의 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다. 3차원 나노섬유 매트(3D NFS)에서 배양한 경우 및 LPS를 넣지 않은 경우에 세포표면에 발현되는 MHC class II의 정도가 상대적으로 감소하는 것을 확인할 수 있다.
도 5는 3차원 나노섬유 매트(3D NFS)와 2차원 배양접시(2D dish)에서 LPS를 넣거나 넣지 않은 상태에서 12시간 배양한 후 주사전자현미경으로 세포의 모양을 확인한 결과를 나타낸 것이다. 골수에서 분화된 수지상세포 및 LPS를 주입한 경우에는 활성형의 수지상세포가 배양됨을 확인할 수 있었으나, 비장으로부터 분리한 수지상 세포의 경우 3차원 나노섬유 매트(3D NFS)에서 배양하고, LPS를 넣지 않은 경우에 미성숙한 수지상세포가 배양되었음을 확인할 수 있었다. 비장 수지상세포를 이용하고, 3차원의 나노섬유 매트를 이용하여 미성숙한 수지상세포의 배양이 가능함을 확인할 수 있다.
도 6은 3차원 나노섬유 매트(3D NFS)와 2차원 배양접시(2D dish)에서 상기 나노섬유 및 배양접시의 표면을 폴리라이신(poly-L-lysine) 및 콜라겐으로 코팅 한 후 배양한 비장 수지상세포가 활성화되는 정도를 측정한 결과를 나타낸 것이다. 폴리라이신 또는 콜라겐 코팅시 배양접시 또는 나노섬유에의 부착이 증가되어 세포의 활성이 증가되는 것을 확인할 수 있다.
도 7는 2차원 배양접시(2D dish)에서 12시간 CD11c+ 비장 수지상세포를 배양한 배양액과 3차원 나노섬유 지지체(3D NFS)에서 프로토콜에 따라 CD11c+ 비장 수지상 세포를 배양한 배양액을 각각 준비한 후 사이토카인 어레이키트를 사용하여 차이를 알아본 결과를 나타낸 것으로, 아래의 표는 각각 차이나는 팩터를 비교한 것이다. 3D NFS에서 배양했을 때 2D dish에서보다 낮은 활성화를 나타내어 사이토카인이 분비되는 정도도 적은 것을 확인할 수 있다.
도 8은 상기 실시예 2에서 제작된 세포배양 구조물을 이용하고, 상부 NFS에 마우스 비장으로부터 분리한 모든세포를(total spleen cells, 5×105) 배양한 후 하부에 CCL2, CCL3, CCL4 케모카인을 주입하여 침윤 및 분리하여 세포를 거르도록 하고, 하부의 케모카인에 반응하여 이동한 세포를 CD11c-FITC와 CD86-PE 항체로 형광 염색하여 현미경으로 촬영한 결과를 나타낸 것이다. 이 결과로부터 세포배양 구조물을 이용하여 비장으로부터 분리한 세포가 케모카인의 주입에 의하여 하부 NFS로 분리되었음을 확인할 수 있다.
도 9는 상기 실시예 2에서 제작된 세포배양 구조물을 이용한 세포의 분리시, 상부의 NFS에 얹은 CFSE인 녹색형광으로 염색한 마우스 비장 CD11c+세포(1×106)가 케모카인인 CCL-21이 있거나 없는 하부의 NFS로 시간별로 배양한 후 이동하는 것을 형광현미경으로 측정하고 그 이동한 세포의 수를 나타낸 것이다. 시간이 경과에 따라 하부 NFS로 이동한 세포의 수는 증가하나, 활성형 수지상세포의 이동을 유도하는 CCL-21이 없는 경우에는 4시간 경과후부터 거의 이동하지 않는 것으로 나타났다. 이를 통해 구조물의 하부에 활성형 수지상세포의 이동을 유도하는 물질을 포함하게 되면 상부 NFS에서 안정적으로 미성숙 수지상세포가 배양될 수 있음을 확인할 수 있다.
도 10은 상기 실시예 2에서 제작된 세포배양 구조물을 이용하여 12시간동안 세포를 분리함으로써 상부 및 하부에 있는 비장 CD11c+ 수지상세포가 활성화되는 정도를 측정한 것으로 CD86의 발현을 형광현미경으로 측정하고 CD86+ 세포의 수를 그 상부에 남아 있는 전체 세포의 수에 대한 백분율(%)로 나타낸 것이다. 상부 NFS의 경우에는 남아있는 수지상세포의 활성화정도가 20% 전후로 나타났는바, 미성숙 수지상세포가 배양되었음을 확인할 수 있었다. 하부 NFS의 경우에는 CCL-21이 있는 경우 수지상세포의 활성화정도가 42.2%에 이르는 것으로 나타났는바 CCL-21에 의하여 활성형 수지상세포가 하부 NFS로 많이 이동되었음을 의미한다. 또한 CCL-21이 없는 경우 하부 NFS의 수지상세포 활성화정도는 11.4%에 불과한 것으로 나타났다.
도 11은 상기 실시예 2에서 제작된 세포배양 구조물을 이용한 세포분리에 있어서 CCL-21이 있거나 없는 하부의 NFS로 4시간 후 이동한 CD11c+ 세포의 전체 수에 대하여 적색형광을 결합시킨 CD86의 항체에 반응하는 세포를 확인한 수를 나타낸 것이다. 하부 NFS에 CCL-21이 없는 경우 수지상세포의 활성화정도가 27.3%에 이르고 CCL-21이 있는 경우 활성형 수지상세포가 64.9%에 이르는 것으로 나타났는바 활성형 수지상세포가 하부 NFS로 많이 이동하여 상부 NFS로부터 분리되었음을 의미한다.
도 12은 상기 실시예 2에서 제작된 세포배양 구조물을 이용한 세포 활성화 분석에 있어서 상부 NFS에 부착한 세포를 하부 NFS로부터 분리한 후 일정시간 배양한 후 활성화정도를 측정한 결과를 나타낸 것이다. 상부 NFS에 세포를 부착한 후 1시간이 경과되었을 때 세포의 활성화 정도는 7.8%이고, CCL-21이 없는 경우에는 1차 세포배양에 의한 세포분리시 21.4%, 2차 배양시 23.4%의 활성화정도를 나타내었다. 그러나 CCL-21이 있는 경우에는 1차 세포배양에 의한 세포분리시 11.8%이고, 2차 배양시 13.4%에 불과한 것으로 나타나 세포의 활성화 정도가 거의 증가되지 않은 것으로 확인되었는바, 이러한 결과로부터 CCL-21을 하부 NFS에 도입할 경우에는 비활성형의 미성숙 수지상세포가 보다 안정적으로 배양될 수 있음을 확인할 수 있었다.
도 13은 상기 실시예 2에서 제작된 세포배양 구조물을 이용한 세포 활성화 분석에 있어서 상부 NFS에 부착한 세포를 하부 NFS로부터 분리한 후 lipopolysaccharide (LPS)의 처리에 의하여 활성화되는가를 CD86 발현으로 측정한 형광현미경 결과를 나타낸 것이다. 상부 NFS의 미성숙한 수지상세포는 LPS 처리에 의하여 91.5%의 활성화정도를 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 즉 상부 NFS에 수지상세포의 활성화 유도물질을 처리함으로써 상기 미성숙 수지상세포 표면의 수용체 발현정도를 측정 및 분석할 수 있다.
이상 본 발명은 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 본 발명은 이것에 의해 한정되지 않으며 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술사상과 아래에 기재될 특허 청구범위의 균등 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능함은 물론이다.

Claims (11)

  1. 내측면에 중심방향으로 돌출형성된 걸림턱을 구비하고, 상기 걸림턱을 기준으로 상부와 하부가 분리가능하게 형성되는, 챔버형상의 세포배양용 구조물을 이용하고,
    (1) 상기 세포배양용 구조물 상부의 걸림턱 및 상기 하부의 바닥면에 나노-마이크로 하이브리드 섬유로 형성된 3차원 구조의 고분자 나노섬유 매트를 각각 배치하는 단계;
    (2) 상기 상부의 걸림턱에 배치된 나노섬유 매트에, 면역조직으로부터 분리된 수지상 세포를 도포하는 단계;
    (3) 상기 도포된 수지상 세포를 1차 배양함으로써, 상기 상부의 나노섬유 매트에 상기 수지상세포를 부착시키고, 상기 상부의 나노섬유 매트에 부착되지 않은 수지상세포와 활성화전 수지상세포가 상기 하부의 나노섬유 매트에 침윤·분리되는 단계; 및
    (4) 상기 하부의 나노섬유 매트를 제거한 후, 상기 상부의 나노섬유 매트에 부착된 수지상 세포를 2차 배양하는 단계를 포함하여 이루어지고,
    상기 상부의 나노섬유 매트에서 2차 배양된 세포는 수지상세포의 비활성형을 유지하는 것을 특징으로 하는, 미성숙 수지상세포의 배양방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 고분자 나노섬유 매트는, 전기방사법에 의해 형성된 것을 특징으로 하는, 미성숙 수지상세포의 배양방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 (1) 단계에서 배치된 상기 고분자 나노섬유 매트는, 상기 나노미터 직경의 섬유 55~85 중량%와 마이크로미터 직경의 섬유 15~45 중량%로 이루어지는 나노-마이크로 하이브리드 섬유인 것을 특징으로 하는, 미성숙 수지상세포의 배양방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 고분자 나노섬유 매트는, 두께가 70~100 ㎛ 인 것을 특징으로 하는, 미성숙 수지상세포의 배양방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 (1) 단계에서 배치된 상기 고분자 나노섬유는, 키토산, 엘라스틴, 히알루론산, 젤라틴, 콜라겐, 셀룰로오스, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리[(락틱-co-(글리콜산))(PLGA), 폴리[(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트)(PHBV), 폴리다이옥산온(PDO), 폴리[(L-락타이드)-co-(카프로락톤)], 폴리(에스테르우레탄)(PEUU), 폴리[(L-락타이드)-co-(D-락타이드)], 폴리[에틸렌-co-(비닐 알코올)](PVOH), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리스티렌(PS) 및 폴리아닐린(PAN)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 생체적합성 고분자, 이들의 공중합체 또는 이들의 혼합물로 형성되는 것을 특징으로 하는, 미성숙 수지상세포의 배양방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 고분자 나노섬유는, 키토산, 엘라스틴, 알지네이트, 젤라틴, 콜라겐, 셀룰로오스 및 라이신(ploy-L-lysine)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상으로 코팅된 것을 특징으로 하는, 미성숙 수지상세포의 배양방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 (1) 단계 또는 (3) 단계에서 상기 하부의 나노섬유 매트는, 활성형 수지상세포의 이동을 유도하는 물질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 미성숙 수지상세포의 배양방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 (2) 단계의 수지상세포는, 비장에서 분리된 수지상세포인 것을 특징으로 하는, 미성숙 수지상세포의 배양방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 (3) 단계의 1차 배양은 3~5시간 동안, 상기 (4) 단계의 2차 배양은 10~20시간 동안 이루어지는 것을 특징으로 하는, 미성숙 수지상 세포의 배양방법.
  10. 기판 상에 고분자 코팅층을 형성하고,
    상기 고분자 코팅층 상에 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항의 방법에 따라 배양된 미성숙 수지상세포를 포함하는 상부의 나노섬유 매트를 부착한 후,
    미성숙 수지상세포의 세포배양, 세포이동 또는 세포활성을 측정하는 것을 특징으로 하는, 미성숙 수지상세포의 분석방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 고분자 코팅층은, 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리스타이렌(PS), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리테트라플루오르에틸렌(PTFE), 폴리에틸렌(PE),폴리우레탄(PU), 셀룰로오스 및 실리콘 고무로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상으로부터 형성된 것을 특징으로 하는, 미성숙 수지상세포의 분석방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111330004A (zh) * 2020-03-04 2020-06-26 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 二硫化钼纳米片层在制备树突状细胞功能促进剂中的应用

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102289726B1 (ko) * 2019-11-11 2021-08-13 포항공과대학교 산학협력단 3차원 나노섬유 멤브레인의 제조 방법 및 장치, 그리고 이에 의해 제조된 3차원 나노섬유 멤브레인
AU2022269982A1 (en) * 2021-05-07 2023-11-30 NANOFAENTECH CO., Ltd. Method for culturing dendritic cells

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20040021664A (ko) * 2001-07-27 2004-03-10 메릭스 바이오싸이언스 인코포레이티드 임상적 적용을 위한 백혈구성분분리 산물로부터 완전히성숙하고 안정한 수지상 세포의 생성
KR20090133062A (ko) * 2008-06-23 2009-12-31 연세대학교 산학협력단 암세포 침윤 저해제의 스크리닝 방법 및 스크리닝 시스템
KR20100101094A (ko) * 2007-12-12 2010-09-16 트리메드 바이오테크 게엠베하 수지상 세포를 생산하는 방법
KR20120097948A (ko) * 2011-02-28 2012-09-05 금오공과대학교 산학협력단 생분해성 고분자를 이용한 나노/마이크로 하이브리드 섬유 부직포 및 그 제조방법
KR101410293B1 (ko) * 2014-01-29 2014-06-20 한국산업기술대학교산학협력단 세포이동 측정용 어세이 칩 및 이를 이용한 세포이동 측정 방법

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010124207A1 (en) * 2009-04-24 2010-10-28 The Ohio State University Interactive microenvironment system

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20040021664A (ko) * 2001-07-27 2004-03-10 메릭스 바이오싸이언스 인코포레이티드 임상적 적용을 위한 백혈구성분분리 산물로부터 완전히성숙하고 안정한 수지상 세포의 생성
KR20100101094A (ko) * 2007-12-12 2010-09-16 트리메드 바이오테크 게엠베하 수지상 세포를 생산하는 방법
KR20090133062A (ko) * 2008-06-23 2009-12-31 연세대학교 산학협력단 암세포 침윤 저해제의 스크리닝 방법 및 스크리닝 시스템
KR20120097948A (ko) * 2011-02-28 2012-09-05 금오공과대학교 산학협력단 생분해성 고분자를 이용한 나노/마이크로 하이브리드 섬유 부직포 및 그 제조방법
KR101410293B1 (ko) * 2014-01-29 2014-06-20 한국산업기술대학교산학협력단 세포이동 측정용 어세이 칩 및 이를 이용한 세포이동 측정 방법

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111330004A (zh) * 2020-03-04 2020-06-26 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 二硫化钼纳米片层在制备树突状细胞功能促进剂中的应用
CN111330004B (zh) * 2020-03-04 2023-02-10 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 二硫化钼纳米片层在制备树突状细胞功能促进剂中的应用

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