WO2018038391A1 - 나노패턴을 이용한 줄기세포의 심근세포로의 분화방법 - Google Patents

나노패턴을 이용한 줄기세포의 심근세포로의 분화방법 Download PDF

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WO2018038391A1
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nanopattern
cardiomyocytes
stem cells
differentiation
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임도선
이규백
주형준
서하림
최룡휘
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고려대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a method for culturing stem cells in a nanopattern culture dish and differentiating them into cardiomyocytes. More particularly, the present invention relates to a stem cell using a dual gradient nanopattern culture dish in which the diameter is constantly increased and the interval is constantly reduced. It relates to a method of differentiating into cardiomyocytes.
  • Stem cells are undifferentiated cells capable of differentiating into various cells constituting biological tissues, and since they can differentiate into specific cells according to differentiation environments, the use of stem cells for the purpose of preventing and treating intractable diseases is increasing. Survival rates of intractable heart disease, such as acute myocardial infarction, which are rapidly increasing worldwide due to westernized eating habits, lack of exercise, and older people, are on the rise due to the development of medical technologies such as intractable heart disease drugs and interventional procedures. . However, there is no existing cell therapy that requires fundamental cell therapy that requires regeneration of damaged myocardium. In particular, mature cardiomyocytes have a very small proliferation rate, so it is necessary to induce differentiation from stem cells to secure a large amount of cardiomyocytes.
  • the present inventors have made efforts to find a method for efficiently differentiating stem cells into cardiomyocytes.
  • the present inventors have found that the mesoderm cells and embryoid bodies induced by differentiation from stem cells are constantly increased in diameter, and the spacing is constantly reduced.
  • the present invention was completed.
  • nm nanometers
  • the present invention is a height of 200 to 500 nm mesenchymal cells derived from stem cells; A diameter of 120 to 360 nm; And it provides a method for differentiating stem cells into cardiomyocytes, comprising the step of differentiating into cardiomyocytes by culturing in a nano-pattern culture dish with an interval of 80 to 240 nm.
  • the invention also, the height of the embryoid body derived from stem cells 200 to 500 nm; A diameter of 120 to 360 nm; And it provides a method for differentiating stem cells into cardiomyocytes, comprising the step of differentiating into cardiomyocytes by culturing in a nano-pattern culture dish with an interval of 80 to 240 nm.
  • 1 illustrates the structure of a nanopattern.
  • FIG. 2 shows a nanopattern attached to a general culture dish, (B) shows a scanning electron micrograph of a nanopattern tilted at 45 ° (scale bar is 100 nm), and (C) shows various gradient structures Scanning electron microscope image of a nanopattern having.
  • Figure 3 is a fluorescence microscope picture of the stem cell-derived mesoderm cells in DAT staining after incubation in a nanopattern culture dish for 2 or 4 days (scale bar is 50 ⁇ m), (B) and (C) is This is a result of comparing the number of cells and the number of colony formation per unit area of stem cells cultured in a nanopattern plate for 4 days. (D) shows the expression of Phospho histone 3 (PHH3) and F-actin by immunofluorescence staining (scale bar is 50 ⁇ m), and (E) shows the ratio of cells expressing PHH3.
  • Phospho histone 3 Phospho histone 3
  • E shows the ratio of cells expressing PHH3.
  • Figure 4 is a result of comparing the mRNA levels of Mesp1, Flk1, ⁇ -SMA, Runx1 and Gata2 of stem cells cultured for 2 or 4 days in the nanopattern culture dish.
  • FIG. 5 (A) schematically shows the differentiation of mesoderm cells into cardiomyocytes using nanopatterns, and (B) shows the differentiation patterns of cardiomyocytes after treatment with the myocardial cell differentiation inducer complex by fluorescence microscopy (scale 50 ⁇ m), (C), (D) and (E) compare the number of differentiation-induced cardiomyocyte populations, cardiomyocyte populations, and the circumference of cardiomyocyte populations in nanopatterned dishes.
  • Figure 6 (A) schematically shows the differentiation method of cardiomyocytes from goblet cells in the nanopattern (scale bar is 100 ⁇ m), (B) is structural of the goblet cultured in the nanopattern culture dish compared to the control group An optical micrograph showing the morphological changes (scale bar is 200 ⁇ m), (C) is a fluorescence photograph confirming the differentiation pattern of embryonic body to cardiomyocytes cultured on the 8th day in the control and nanopattern culture dishes, and (D) Muscle fibers were identified by fluorescence microscopy by cTnT staining of embryonic bodies cultured on day 12 in control and nanopattern culture dishes.
  • FIG. 7 after treatment with small molecules and inhibitors for differentiation into cardiomyocytes, (A) is a fluorescence confirming the expression of ⁇ -actinin of differentiation induced stem cells (scale bar is 10 ⁇ m), (B) Connexin Expression of 43 was confirmed by immunofluorescence staining (scale bar is 25 ⁇ m), (C) is a result of comparing the expression of ⁇ -MHC, cTnT, cTnl and Nkx2.5 at the mRNA level after 4 days incubation.
  • the mesoderm cells after inducing differentiation of stem cells into mesoderm cells or embryoid bodies, the mesoderm cells are constantly increasing in diameter to 200 to 280 nm, the dual gradient nanopattern culture plate is constantly reduced to 240 to 160 nm intervals
  • myocardium is cultured in a dual-gradient nanopattern culture dish with constant increase in diameter of 280 to 360 nm and constant decrease in interval of 160 to 80 nm It was confirmed that differentiation is efficiently induced into cells.
  • the present invention is consistent with, the height of the mesoderm cells derived from stem cells 200 to 500 nm; A diameter of 120 to 360 nm; And it relates to a method for differentiating stem cells into cardiomyocytes comprising the step of differentiating to cardiomyocytes by culturing in a nanopattern culture dish with an interval of 80 to 240 nm.
  • the diameter of the nanopattern is preferably 200 to 280 nm, and the interval of the nanopattern is preferably 160 to 240 nm, but is not limited thereto.
  • the nanopattern may be characterized in that the dual gradient is a constant increase in diameter, the interval is constant decrease, but is not limited to this may be used a nanopattern having no gradient.
  • the mesoderm cells have a height of 200 to 500 nm, the diameter is preferably incubated in a nano-patterned dish that is constantly increased to 200 to 280 nm and the interval is constantly reduced to 240 to 160 nm, It is not limited to this.
  • the induction of differentiation into mesodermal cells is 10% (v / v) fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine (L-Glutamine), 50 Units / mL penicillin (Penicillin), 50 ⁇ g Culture of stem cells in ⁇ -MEM medium including / mL Streptomycin, and 100 ⁇ M beta-mercaptoethanol is preferred, but is not limited thereto.
  • the differentiation of the stem cells into mesodermal cells is preferably induced for 4.5 days, but is not limited thereto.
  • the differentiation-induced mesoderm cells preferably further comprise the step of separating using an antibody, but is not limited thereto.
  • mesodermal cells after stem cells were first differentiated into mesodermal cells, only mesodermal cells were purified and cultured.
  • Mesoderm cells are multipotent and can differentiate into vascular endothelial cells, vascular smooth muscle cells, blood cells and cardiomyocytes.
  • differentiation into ectodermal and endoderm-derived other cells may be blocked.
  • the mesoderm cells were purely isolated and cultured, but the present invention is not limited thereto. That is, the present invention is not limited to specific protein positive mesodermal cells, and is not limited to expression of a single cell surface marker.
  • the differentiation-induced mesoderm cells are preferably inoculated at 1 ⁇ 10 4 to 2 ⁇ 10 4 cells / cm 2 , but are not limited thereto.
  • the induction of differentiation of the mesoderm cells into cardiomyocytes is preferably performed for 4 days, but is not limited thereto.
  • stem cell refers to the undifferentiated cells that can differentiate into various cells constituting biological tissues, and may be classified by various methods.
  • One of the most commonly used methods is according to the differentiation capacity of stem cells and can be divided into pluripotent stem cells, multipotent stem cells, and unipotent stem cells.
  • Nesoderm in the present invention refers to the interlayer between the ectoderm and the endoderm in the early development of most multicellular animals, and then specifically to the heart, blood vessels, muscles, bones, reproductive organs and several parts Differentiation is made into tissues that make up the pessimism.
  • differentiation refers to changing to the level of a complex or individual of a specific cell or tissue having a special function during the cell division and growth.
  • the embryoid bodies after forming embryoid bodies from stem cells, the embryoid bodies were induced to differentiate into cardiomyocytes in a nanopattern.
  • the embryonic body was prepared by the Hanging drop culture method to induce differentiation into cardiomyocytes, but the embryonic body was cultured using a non-adherent culture plate or the surface of the general culture plate was coated. The cell attachment may be inhibited to culture the embryoid body.
  • the present invention in another aspect, the height of the embryonic body derived from stem cells 200 to 500 nm; A diameter of 120 to 360 nm; And it relates to a method for differentiating stem cells into cardiomyocytes comprising the step of differentiating to cardiomyocytes by culturing in a nanopattern culture dish with an interval of 80 to 240 nm.
  • the diameter of the nanopattern is preferably 280 to 360 nm
  • the interval of the nanopattern is preferably 80 to 160 nm, but is not limited thereto.
  • the nanopattern may be characterized in that the dual gradient is a constant increase in diameter, the interval is constant decrease, but is not limited to this may be used a nanopattern having no gradient.
  • the embryoid body has a height of 200 to 500 nm, the diameter is cultivated in a dual gradient nanopattern culture plate which is constantly increased to 280 to 360 nm and the interval is constantly reduced to 160 to 80 nm.
  • the present invention is not limited thereto.
  • the induction of differentiation into the embryoid body is 10% (v / v) fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 50 Units / mL penicillin, 50 ⁇ g / mL streptomycin, and 100 ⁇ M beta-mercaptoethanol It is preferable to culture the stem cells in the ⁇ -MEM medium containing, but is not limited thereto.
  • the differentiation of the stem cells into embryoid bodies is preferably induced for 2 days, but is not limited thereto.
  • the goblet of the present invention is a globular cell mass composed of stem cells, and thus can be differentiated into mesodermal cells, thereby inducing differentiation of vascular endothelial cells, vascular smooth muscle cells, blood cells and cardiomyocytes.
  • the stem cells forming one embryoid body are preferably 2 ⁇ 10 3 to 4 ⁇ 10 3 , and more preferably 3 ⁇ 10 3 stem cells, but are not limited thereto. That is, when the embryonic body is produced, the number of cells is not limited, and the embryonic body of various sizes can be produced by controlling the number of cells.
  • the differentiation into the cardiomyocytes is preferably cultured by attaching 10 embryoid bodies to the nanopattern culture dish, but is not limited thereto.
  • the culture for differentiating the embryoid body into cardiomyocytes is preferably performed for 8 days, but is not limited thereto.
  • Stem cells have different attachment and growth capacities and cell differentiation depending on the surface of the culture dish.
  • the surface of the culture plate that adherent cells contact during in vitro culture has projections of nano units and the gradient pattern becomes smaller or larger in diameter
  • the stem cells are nano-patterned by the cell-substrate interaction at the beginning of culture.
  • the nanopattern is preferably a protrusion, but is not limited thereto, and any shape that may be a pattern may be used.
  • the cells were cultured in a space having an area of 700 mm 2 having a width of 35 mm and a cell of 20 mm, but is not limited thereto.
  • the height of the nanopattern is preferably 200 to 500 nm, but is not limited thereto.
  • a surface structure suitable for stem cell culture according to the present invention may be performed using a nanopattern culture dish in which diameters and intervals are changed at the same time.
  • the uniformly arranged nanopatterns varying in diameter and spacing were defined as "dual gradient nanopatterns.”
  • gradient in the present invention means a constant and regular change.
  • the dual gradient nanopatterns introduced into the general culture dish according to the present invention may be manufactured to increase the diameter and the gap at the same time, or decrease the diameter and the gap at the same time or increase the diameter but decrease the interval.
  • the present invention is used to describe the gap between the diameter of the nanopatterns increasing at a constant rate and the nanopatterns decreasing at a constant rate.
  • the diameter of the nanopattern means a diameter measured by assuming the upper portion of the nanopattern as a circle of a similar size as shown in [Fig. 1], and the interval of the nanopattern is also shown in [Fig. 1], one The distance between the nanopatterns closest to the nanopattern may be measured.
  • the dual-gradient nanopattern with increasing diameter and decreasing spacing is characterized by controlling an exposure time to an acidic solution and anionic aluminum oxide containing nanoporous pores having diameters increasing from one end to the other end. It can be prepared using.
  • This manufacturing technique was used in Korean Patent Application No. 10-2014-0129841.
  • the anionic aluminum oxide may be prepared by anodizing an aluminum plate in a phosphoric acid solution and etching it with a chromic acid solution.
  • the resulting anionic aluminum oxide with aligned pores can be anodized again and treated with a gradual increase in immersion time in the phosphate solution to produce an anionic aluminum oxide mold with a constant increase in pore diameter.
  • the prepared anionic aluminum oxide template does not have cytotoxicity such as polystyrene and can be prepared by thermal imprinting on a substrate made of a material that can be used as a cell culture dish.
  • the manufacturing process may further comprise coating HDFS (Heptadecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrodecyl trichlorosilane) monolayer by self-assembly on the anionic aluminum oxide template prior to thermal etching.
  • the immersion time in the phosphate solution for preparing the anionic aluminum oxide template in which the pore size is constantly increased may be preferably 0 minutes to 500 minutes, but is not limited thereto.
  • the substrate for preparing a nanopattern by thermally engraving an anionic aluminum oxide containing pores with a constant diameter of the prepared diameter is intended for cell culture for the purpose of the present invention, biocompatibility that preferably does not exhibit cytotoxicity It may be made of a polymer material.
  • it may be a polystyrene material which is generally a material of a general culture plate used for cell culture, and a commercially available polystyrene cell culture plate may be directly used, but is not limited thereto.
  • heat engraving may be performed by heating the substrate at 100 to 150 ° C. for 7 to 13 minutes and compressing the substrate to 2.5 to 3.5 bars for 80 to 120 seconds.
  • nanopattern refers to a uniform arrangement of nano-projections, and was produced for the purpose of continuously culturing stem cells having stem cell abilities.
  • the nanopattern is an in vitro simulation of the flexion of tissue surface in the body, and the cell morphology change at the adhesion surface during cell culture may affect the characteristics and differentiation of cells. Therefore, the nanopattern of the present invention can select an optimal surface morphology suitable for cardiomyocyte differentiation, thereby reducing the differentiation of cells of different nature and enhancing the differentiation into cardiomyocytes.
  • Electrostatic cell adhesion is electrically negative by phospholipids, which are components of the cell membrane, and thus is a method of inducing cell adhesion by producing an electrically positive cell surface.
  • Most commonly used culture plates are manufactured using the principle of electrostatic cell adhesion, and plasma treatment is performed on the surface of the general culture plates to produce positive electric surfaces.
  • Adhesive refers to the property that a cell binds to a surface, extracellular matrix or other cell through a cell adhesion molecule. Proper cell adhesion is an essential property for the maintenance of multicellular structures.
  • the cell adhesion may connect the cytoplasm of cells and may be involved in signaling.
  • Nanopattern culture dish of the present invention can be used by coating a coating material known in the art to facilitate the cell culture.
  • the coating material may be collagen, fibronectin, laminin, gelatin, alginate, poly-D-lysine or agar, but may improve cell adhesion to the culture plate without showing cytotoxicity. Any material that can be used can be used without limitation.
  • the differentiation of stem cells into cardiomyocytes of the present invention is preferably to introduce a nano-pattern on the surface of the general culture dish, and to prepare and use a cell culture dish that is electrically positive by plasma treatment, but is not limited thereto.
  • the nanopattern culture dish should be manufactured so that the integrin in the cell membrane can recognize the surface of the culture dish through 0.1% gelatin coating before use.
  • the treated material is a coating material that does not induce cell death, it can be used without limitation. Can be.
  • the stem cells are preferably pluripotent stem cells, more preferably embryonic stem cells, but is not limited thereto.
  • the stem cells are 10% (v / v) Knockout serum replacement, 100 ⁇ M beta-mercaptoethanol, 1% (v / v) Non-essential amino acid, 1 mM Sodium pyruvate, 1% (v / v) fetal bovine serum, 50 Units / mL penicillin, 50 ⁇ g / mL streptomycin, 2000 Units / mL Leukemia inhibiory factor, 100 Culture in GMEM medium containing ⁇ g / mL blasticidin and 100 ⁇ g / mL Geneticin is preferred, but is not limited thereto.
  • the stem cells are preferably cultured in a general culture dish coated with 0.1% gelatin, but is not limited thereto.
  • stem cells are cultured in ⁇ -MEM medium containing fetal bovine serum, L-glutamine, penicillin, streptomycin, beta-mercaptoethanol and cardiomyocyte inducer complex upon differentiation from mesodermal cells to cardiomyocytes.
  • the cardiomyocyte differentiation medium may include cyclosporin A, an immunosuppressive agent, as a cardiomyocyte inducing factor. Cyclosporin A is known to induce differentiation into cardiomyocytes upon treatment with myocardial progenitor cells alone.
  • cardiomyocyte inducer but not limited to the mixing of the inducer known in the conventional known cardiomyocyte differentiation, if the treatment material can be differentiated into cardiomyocytes at the same time without inducing cell death Can be used without limitation.
  • the present invention relates to a method for efficiently differentiating stem cells into cardiomyocytes through synergistic effects of nanopatterns and cardiomyocyte differentiation medium.
  • a comparative analysis of cytological characteristics changes in the process of differentiating myocardial cells (Sarcomere) formed from the stem cells to the myocardial cells, and through the results to confirm the possibility of differentiation into cardiomyocytes by gene expression difference dish culture plate The cardiomyocyte differentiation rate of stem cells in cardiomyocyte differentiation medium was compared and analyzed at the same time.
  • Cytological and morphological characterization of stem cells cultured in nanopatterned dishes can be performed by polymerase chain reaction or immunofluorescent staining with antibodies that specifically bind markers. Can be.
  • the gene expression is vascular endothelial cells, vascular smooth muscle cells, blood cells and cardiomyocyte specific genes such as Flk1 as a marker for vascular endothelial cells, ⁇ -SMA as a marker for vascular smooth muscle cells, Runx1 and Gata2 as a marker for blood cells, and Cardiomyocyte markers can be identified by the difference in expression of Mesp1 and cTnT. Although the embodiment of the present invention confirmed the gene expression difference of cells with the markers, the characteristics of each cell are not limited to these markers.
  • two or more different wavelengths of fluorescent materials can be detected at the same time and can be detected at the same time.
  • the location and number of cells can be confirmed using DAPI staining DNA in the nucleus.
  • Cells cultured in the nanopattern culture dish of the present invention is difficult to determine the presence or absence of cells when observed under an optical microscope, the DAPI can be used to determine the location of the cells for the purpose, limited to the dyeing solution only the material It is not.
  • Stem cell culture in nanopatterns can acquire differentiation into cardiomyocytes, but this cannot be a complete mediator to mature cells.
  • the differentiation of stem cells consists of the stages of mature cells, from pluripotency to pluripotency, again from pluripotency to no differentiation. At each stage of differentiation, signaling by specific growth factors occurs, which does not cover the entire stage of differentiation. Therefore, due to the synergistic effect of the known inducer in the nanopattern and conventional cardiomyocyte differentiation can be differentiated into cardiomyocytes, and the rate of differentiation from stem cells to cardiomyocytes in the cardiomyocyte differentiation medium can be confirmed. Maturation analysis of the differentiated cardiomyocytes can be performed by measuring the expression of cardiomyocyte specific markers. Markers of such cardiomyocytes are preferably ⁇ -actinin, Connexin 43, ⁇ -MHC, cTnT, cTnI, Nkx2.5, but are not limited thereto.
  • EMG7 mouse-derived embryonic stem cells distributed from Jun K. Yamashita, Kyoto University, Japan.
  • the EMG7 mouse-derived embryonic stem cells were activated when the ⁇ -Myosin heavy chain ( ⁇ -MHC) promoter was activated.
  • eGFP Enhanced green fluorescence protein
  • nanopattern culture dish was manufactured with a diameter in a range smaller than the diameter of the nanopattern previously presented.
  • Anodized aluminum oxide containing the well-aligned pores prepared above was anodized again under the same conditions for 4 hours and treated in a phosphoric acid solution using a tensiometer (Operating speed 1.0 mm / min). However, the intensity was adjusted while gradually increasing the dipping time.
  • An anionic aluminum oxide template containing controlled gradient pores was coated with a self-assembled HDFS (Heptadecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrodecyl trichlorosilane) monolayer.
  • An anionic aluminum oxide template containing pores having a gradient diameter in nanometers was thermally imprinted using a NANOSIS TM 610 nanoprinter to prepare a polystyrene nanopattern culture dish.
  • a polystyrene polymer sheet of 700 mm 2 (35 mm ⁇ 20 mm) size was heated at 165 ° C. for 10 minutes and compressed to 3 bars for 120 seconds. After the temperature was lowered to room temperature, the anionic aluminum oxide template was separated from the polystyrene sheet.
  • anionic aluminum oxide comprising a regular array of patterns was prepared by two step anodization in phosphoric acid.
  • Anionic aluminum oxide having a pattern gradient of nanometer specifications was obtained by slowly increasing the immersion time in the phosphate solution from 30 minutes to 30 minutes for pattern expansion.
  • the diameter of the pattern increased linearly with increasing immersion time, and polystyrene surface patterning with nanopatterns of varying diameters was applied to the thermal nanoimprinting of anionic aluminum oxide templates with double-gradient nanopatterns.
  • Polystyrene the most widely used material in commercial cell culture dishes, was selected as the bottom material.
  • the height of the nanopattern was set to an average of 200 to 500 nm, the nanopattern was produced in various diameters and intervals of the nanopattern (Fig. 1). That is, a dual gradient nanopattern was produced in which the diameter of the nanopattern was constantly increased to 200 to 280 nm or 280 to 360 nm, and the gap was constantly reduced to 240 to 160 nm or 160 to 80 nm (FIG. 2C).
  • the prepared dual gradient nanopattern was used in a general culture dish having a diameter of 60 mm in the form of a substrate having an area of 700 mm 2 with a width of 35 mm and a length of 20 mm (FIG. 2A).
  • EMG7 cells cultured in Example 1-1 were washed with Phosphate buffer saline (PBS), and then 0.25% trypsin / Ethylenediaminetetraacetic acid (T / E) was added to the cells in a 37 ° C. incubator. The cells were detached by reacting for a minute. Cells were harvested and centrifuged at 1000 rpm for 3 minutes 30 seconds, then the supernatant was discarded and pellets were suspended in EMG7 culture medium used in Example 1-1 above to obtain 2 ⁇ 10 3 cells / cm 2 cells. Was dispensed into petri dishes coated with 0.1% gelatin.
  • PBS Phosphate buffer saline
  • T / E trypsin / Ethylenediaminetetraacetic acid
  • the differentiation medium Eruption was also induced.
  • Stem cells were induced to differentiate into mesodermal cells by culturing with changing medium every 2 days for 4.5 days.
  • Differentiation-induced cells were washed with phosphate buffered saline for 4.5 days, and then detached by reacting for 2 minutes in a 37 ° C. incubator with 0.25% trypsin / IDT. After centrifugation at 1000 rpm for 5 minutes, the supernatant was removed, and the cells resuspended by adding differentiation medium were stabilized in a 37 ° C. incubator for 30 minutes. After centrifugation at 1000 rpm again for 5 minutes, the pellet was reacted at 4 ° C. for 20 minutes with a blocking solution containing Flk1 primary antibody.
  • the cells were washed once with phosphate buffered saline, treated with Streptavidin or Biotin microbead secondary antibody at 4 ° C. for 30 minutes, and then washed once with phosphate buffered saline to give automagnetically active cells. Only mesodermal cells were purified by using a sorter (Auto magnetic-activated cell sorting; Auto MACS) equipment.
  • a sorter Auto magnetic-activated cell sorting; Auto MACS
  • mesoderm cells were cultured in a general culture dish and a nanopattern culture dish as a control.
  • mesoderm cells were cultured for 4 days in control and nanopattern culture dishes. After staining with DAPI, the morphology was observed by optical and fluorescence microscopy. After 4 days of culture, the number of cells per unit area and the number of colony formation were analyzed. In addition, Phospho histone 3 (PHH3) and Cleaved caspase 3 (C-caspase 3) were measured. Finally, polymerase chain reaction of genes expressing differentiation-induced stem cells by culturing mesoderm cells in a nanopatterned dish. was carried out.
  • Phospho histone 3 Phospho histone 3
  • C-caspase 3 Cleaved caspase 3
  • the mRNA levels of the cardiomyocyte, vascular endothelial cells, smooth muscle cells and blood cell markers Mesp1, Flk1, ⁇ -SMA, Runx1 and Gata2 of mesoderm cells cultured 2 or 4 days in the nanopattern culture dish were compared. It was confirmed that the expression of the cardiomyocyte marker Mesp1 was increased in the cells differentiated in the nanopattern culture dish (FIG. 4).
  • Differentiation into cardiomyocytes was induced by adding a myocardial cell inducer complex into the differentiation medium of stem cell-derived mesodermal cells prepared to express eGFP in the alpha-myosin heavy chain promoter isolated in Example 2.
  • the control and nanopattern culture dishes were coated with 0.1% gelatin and then dispensed 1.43 ⁇ 10 4 cells / cm 2 per 60 mm diameter space, ie a total of 3 ⁇ 10 5 mesoderm cells, and cultured in differentiation medium for 4 days (FIG. 5A).
  • stem cells cultured in differentiation medium to which the cardiomyocyte inducer complex was added in the control and nanopattern culture dishes were stained with DAPI, and optical and fluorescence microscope images were observed in real time. Image J software was used to graphically compare the number of differentiated cardiomyocytes, populations, colony area, and colony circumference in control and nanopattern culture dishes.
  • eGFP positive cardiomyocytes were found, and it was possible to identify mature cardiomyocytes beating in a clustered form.
  • the cardiomyocyte population increased significantly compared to the control (Fig. 5B).
  • the area of the differentiated cardiomyocytes increased more than three times in the nanopatterned culture dish compared to the control group, and the population circumference of the differentiated cardiomyocytes was more than doubled (Figs. 5C, 5D and 5E).
  • the EMG7 cells of Example 1 were formed into embryoid bodies according to the previously reported Hanging drop culture method. Specifically, 3 ⁇ 10 3 EGM7 cells contained 10% (v / v) fetal bovine serum, 1% L-glutamine, 100 ⁇ M beta-mercaptoethanol, 50 Units / mL penicillin, 50 ⁇ g / mL streptomycin Differentiation was induced into embryonic bodies by incubation for 2 days in a suspension culture using 20 ⁇ l of ⁇ -MEM medium.
  • Stem cell-derived embryos made to express eGFP upon activation of the alpha-myosin heavy chain promoter were cultured by attaching 10 control plates each coated with 0.1% gelatin and 10 nanopattern culture dishes. After one day of culture, it was confirmed that the embryoid body was attached to the culture dish, and then cultured while replacing the medium every two days for 8 days to induce differentiation of the culture into cardiomyocytes (FIG. 6A). In addition, changes in the structural morphology of the embryoid body in the nanopattern culture dish were recorded by optical microscopy until days 1, 2, 4, 6 and 8 of the culture (FIG. 6B). To confirm the differentiation pattern of cardiomyocytes of the embryoid body cultured in the nanopattern dish, eGFP positive cardiomyocytes were analyzed by fluorescence image through DAPI staining.
  • eGFP which is a cardiomyocyte marker
  • Fig. 6C the expression of eGFP and cTnT in the cardiomyocytes differentiated from the control group and the nanopattern culture dish was confirmed by confocal laser scanning microscopy.
  • the embryoid body cultured in the nanopattern culture dish was able to differentiate into cardiomyocytes (FIG. 6D).
  • the maturity was evaluated by analyzing the change in the cytological characteristics of differentiation-induced cardiomyocytes by differentiation inducer treatment in the nanopattern culture dish. Cardiomyocyte maturity was measured by immunofluorescence staining and polymerase chain reaction of cardiomyocyte specific markers ⁇ -actinin, Connexin 43, ⁇ -MHC, cTnT, cTnI, and Nkx2.5.
  • the mesoderm cells and embryoid bodies of Examples 2 and 5 were cultured in a nanopattern culture dish having various diameters and intervals to induce differentiation into cardiomyocytes, and the mesoderm cells were differentiated by addition of inducers known to cardiomyocyte differentiation. Medium was used. Differentiated cardiomyocytes were analyzed for maturity by measuring the expression of cardiomyocyte specific markers.
  • mRNA expression of the cardiomyocyte-specific markers Mesp1 and cTnT was increased.
  • mesodermal cells exhibited the highest expression of Mesp1 in the nanopatterns of 200 to 280 nm in diameter, and 280 to 360 nm in the embryoid body.
  • CTnT expression was found to be the highest in the nanopattern of (Fig. 8).
  • a method of differentiating stem cells into cardiomyocytes using nanopatterns optimized for cardiomyocyte differentiation is economical because it does not require expensive extracellular matrix or support cells to be used, and cultures cells on nanopatterns. It is an advantage that induces cardiomyocyte differentiation in a simple way. In addition, the differentiation efficiency into cardiomyocytes is excellent.

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Abstract

본 발명은 줄기세포를 나노패턴 배양접시에 배양하여 심근세포로 분화시키는 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 직경이 일정하게 증가하고 간격이 일정하게 감소하는 이중구배 나노패턴 배양접시를 이용하여 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 심근세포 분화에 최적화된 나노패턴 배양접시를 이용한 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 방법은 고가의 세포외 기질을 코팅하거나 지지세포를 이용할 필요 없어 경제적이며, 심근세포로의 분화 효율이 우수하다.

Description

나노패턴을 이용한 줄기세포의 심근세포로의 분화방법
본 발명은 줄기세포를 나노패턴 배양접시에 배양하여 심근세포로 분화시키는 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 직경이 일정하게 증가하고 간격이 일정하게 감소하는 이중구배 나노패턴 배양접시를 이용하여 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다.
줄기세포란 생물 조직을 구성하는 다양한 세포들로 분화할 수 있는 미분화 세포로서 분화환경에 따라 특정 세포로 분화할 수 있기 때문에 난치병 예방 및 치료목적의 줄기세포 이용 가능성이 높아지고 있다. 서구화된 식습관, 운동부족 및 노년층의 증가로 인하여 전 세계적으로 급격히 증가하고 있는 급성 심근경색과 같은 난치성 심장질환자의 생존율은 난치성 심장질환 약물 및 중재 시술 증대 등의 의학기술 발달에 따라 소폭 증가추세에 있다. 하지만 아직까지 기존의 치료법으로는 손상된 심근의 재생을 요구하는 근본적인 세포치료가 전무한 실정이다. 특히 성숙한 심근세포는 증식률이 매우 미미하기 때문에 줄기세포로부터 분화를 유도하여 다량의 심근세포를 확보하는 과정이 필수적이다.
나노 기술의 발전으로 다양한 나노표면 배양접시를 이용하여 줄기세포의 분화를 시도하고 있으나 대부분 특정 직경의 나노패턴이 포함된 배양접시를 이용한 연구결과가 보고되고 있다. 이러한 연구 결과는 줄기세포의 형태변화 관찰 및 신경세포로의 분화유도 (Z.Z. Wu et al., Biotechnol Bioeng., 1:106, 2010; L. Qi et al., PLoS One, 8:3, 2013) 수준으로 현재, 심근세포의 분화를 위한 최적화된 나노 패턴의 연구가 미흡한 실정이다. 최근 연구결과에서 줄기세포로부터 심근세포 분화유도 방법이 제시된 바 있으나 (J.M Vilches et al., J. Cardiovasc . Dev . Dis., 1:1, 2014; Z. Limor et al., Eur Heart J., 34:21, 2013) 이들 대부분은 배상체 (Embryoid body)를 형성한 후 일반 배양접시에 부착하여 분화를 유도하였기 때문에 분화 후 실질적인 심근세포의 수율이 전체 세포의 5% 미만으로 보고되었다. 또한, 외배엽 및 내배엽 세포에서 기원한 다양한 종류의 세포로 분화할 수 있어서 분화세포 종류를 예측하는데 한계가 있었다. 뿐만 아니라 분화 유도한 세포집단을 그대로 생체에 이식하거나 치료에 이용하기 곤란하다는 문제가 있었다.
이에, 본 발명자들은 줄기세포를 효율적으로 심근세포로 분화시키는 방법을 찾고자 예의 노력한 결과, 줄기세포로부터 분화 유도된 중배엽 세포 및 배상체를 직경은 일정하게 증가하고, 간격은 일정하게 감소하는 특정 구조의 나노패턴 배양접시에서 배양할 경우, 심근세포로 효율적으로 분화하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 줄기세포에서 유도된 중배엽 세포 또는 배상체 (Embryoid body)를 나노 단위 (nm)의 높이 (Height)를 갖고, 직경 (Diameter)은 일정하게 증가하고, 간격 (Spacing)은 일정하게 감소하는 나노패턴 배양접시에 배양하여 심근세포로 분화시키는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 줄기세포에서 유도된 중배엽 세포를 200 내지 500 nm의 높이; 120 내지 360 nm의 직경; 및 80 내지 240 nm의 간격의 나노패턴 배양접시에 배양하여 심근세포로 분화시키는 단계를 포함하는 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 줄기세포에서 유도된 배상체를 200 내지 500 nm의 높이; 120 내지 360 nm의 직경; 및 80 내지 240 nm의 간격의 나노패턴 배양접시에 배양하여 심근세포로 분화시키는 단계를 포함하는 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 방법을 제공한다.
도 1은 나노패턴의 구조를 나타낸 것이다.
도 2의 (A)는 일반 배양접시 안에 부착된 나노패턴을 나타낸 것이고, (B)는 45° 기울여진 나노패턴의 주사전자현미경 사진이며 (스케일 바는 100 nm), (C)는 다양한 구배구조를 갖는 나노패턴의 주사전자현미경 이미지이다.
도 3의 (A)는 줄기세포 유래 중배엽 세포를 2일 또는 4일 동안 나노패턴 배양접시에서 배양 후 DAPI를 염색한 형광현미경 사진이고 (스케일 바는 50 ㎛), (B) 및 (C)는 나노패턴 배양접시에서 4일 동안 배양한 줄기세포의 단위면적 당 세포 수 및 군집 형성 수를 비교한 결과이다. (D)는 Phospho histone 3 (PHH3)와 F-actin의 발현을 면역형광염색법으로 확인한 것이고 (스케일 바는 50 ㎛), (E)는 PHH3을 발현하는 세포의 비를 나타낸 것이다. (F)는 Cleaved caspase 3 (C-caspase 3)과 F-actin의 발현을 면역형광염색법으로 확인한 것이고 (스케일 바는 50 ㎛), (G)는 C-caspase 3을 발현하는 세포의 비를 나타낸 것이다.
도 4는 나노패턴 배양접시에서 2일 또는 4일 동안 배양한 줄기세포의 Mesp1, Flk1, α-SMA, Runx1 및 Gata2의 mRNA 수준을 비교한 결과이다.
도 5의 (A)는 나노패턴을 이용한 중배엽 세포의 심근세포로의 분화방법을 개략적으로 나타낸 것이고, (B)는 심근세포 분화 유도인자 복합물 처리 후 심근세포 분화양상을 형광현미경으로 확인한 것이며 (스케일 바는 50 ㎛), (C), (D) 및 (E)는 나노패턴 배양접시에서 분화 유도된 심근세포 군집 수, 심근세포 군집 면적 및 심근세포 군집의 군집둘레를 비교한 것이다.
도 6의 (A)는 나노패턴에서 배상체로부터 심근세포의 분화방법을 개략적으로 나타낸 것이며 (스케일 바는 100 ㎛), (B)는 대조군과 비교해서 나노패턴 배양접시에서 배양한 배상체의 구조적 형태 변화를 확인한 광학현미경 사진이고 (스케일 바는 200 ㎛), (C)는 대조군 및 나노패턴 배양접시에서 8일째 배양한 배상체의 심근세포로의 분화 양상을 확인한 형광 사진이며, (D)는 대조군 및 나노패턴 배양접시에서 12일째 배양한 배상체를 cTnT 염색 하여 근섬유분절을 형광현미경으로 확인한 것이다.
도 7은 심근세포로 분화를 위해 저분자 및 저해제를 처리한 후, (A)는 분화 유도된 줄기세포의 α-actinin의 발현을 확인한 형광사진이고 (스케일 바는 10 ㎛), (B)는 Connexin 43의 발현을 면역형광염색법으로 확인한 사진이며 (스케일 바는 25 ㎛), (C)는 4일 배양한 후 α-MHC, cTnT, cTnl 및 Nkx2.5의 발현을 mRNA 수준에서 비교한 결과이다.
도 8은 중배엽 세포 및 배상체로부터 각각 심근세포로의 분화 시, 나노패턴 직경에 따른 유전자 발현 양상을 중합효소연쇄반응으로 확인한 결과이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 줄기세포를 중배엽 세포 또는 배상체로 분화를 유도한 후, 상기 중배엽 세포는 직경이 200 내지 280 nm로 일정하게 증가하고, 간격이 240 내지 160 nm로 일정하게 감소하는 이중구배 나노패턴 배양접시에서 분화유도인자가 포함된 배지를 사용하여 배양하고, 배상체는 직경이 280 내지 360 nm로 일정하게 증가하고, 간격이 160 내지 80 nm로 일정하게 감소하는 이중구배 나노패턴 배양접시에서 배양하면 심근세포로 분화가 효율적으로 유도된다는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일관점에서, 줄기세포에서 유도된 중배엽 세포를 200 내지 500 nm의 높이; 120 내지 360 nm의 직경; 및 80 내지 240 nm의 간격의 나노패턴 배양접시에서 배양하여 심근세포로 분화시키는 단계를 포함하는 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 나노패턴의 직경은 200 내지 280 nm인 것이 바람직하며, 나노패턴의 간격은 160 내지 240 nm인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 나노패턴은 직경이 일정하게 증가하고, 간격이 일정하게 감소하는 이중구배인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 구배를 가지지 않는 나노패턴을 사용하여도 무방하다.
본 발명에 있어서, 중배엽 세포를 200 내지 500 nm의 높이를 갖고, 직경은 200 내지 280 nm로 일정하게 증가하고 간격은 240 내지 160 nm로 일정하게 감소하는 나노패턴 배양접시에서 배양하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 중배엽 세포로 분화 유도는 10% (v/v) 소태아혈청 (Fetal bovine serum), 2 mM L-글루타민 (L-Glutamine), 50 Units/mL 페니실린 (Penicillin), 50 μg/mL 스트렙토마이신 (Streptomycin), 및 100 μM 베타-머캅토에탄올 (β-Mercaptoethanol)을 포함하는 α-MEM 배지에서 줄기세포를 배양하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 줄기세포의 중배엽 세포로의 분화는 4.5일 동안 유도하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 분화 유도된 중배엽 세포는 항체를 이용하여 분리하는 단계를 추가로 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서는 줄기세포를 중배엽 세포로 일차적 분화를 거친 후, 중배엽 세포만을 순수 분리하여 배양하였다. 중배엽 세포는 다분화능의 세포로써 혈관내피세포, 혈관평활근세포, 혈액세포 및 심근세포로 분화가 가능하다. 또한 중배엽으로 이미 분화된 세포이기 때문에 외배엽 및 내배엽에서 기원되는 다른 세포로의 분화가 차단될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 중배엽 세포를 순수 분리하여 배양하였으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 즉, 특정 단백질 양성의 중배엽 세포만으로 한정되는 것은 아니며, 또한 단일의 세포 표면마커의 발현으로만 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 분화 유도된 중배엽 세포는 1×104 내지 2×104세포/cm2로 접종하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 중배엽 세포를 심근세포로 분화 유도 배양은 4일 동안 수행하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 "줄기세포 (Stem cell)"는 생물 조직을 구성하는 다양한 세포들로 분화할 수 있는 미분화 세포들을 총칭하여 일컫는 말로서, 다양한 방법으로 분류할 수 있다. 그 중 가장 흔히 이용되는 방법 중 하나는 줄기세포의 분화능에 따른 것으로 만능 (Pluripotent) 줄기세포, 다분화능 (Multipotent) 줄기세포 및 단분화능 (Unipotent) 줄기세포로 나눌 수 있다.
본 발명에서 "중배엽 (Mesoderm)"은 대부분의 다세포 동물의 초기 발생에서 외배엽과 내배엽의 사이에 존재하는 중간층을 지칭하며, 이후, 특이적으로 심장, 혈관, 근육, 뼈, 생식기관 및 몇몇의 분비관 등을 이루는 조직으로 분화가 이루어진다.
본 발명에서 "분화 (Differentiation)"는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 특별한 기능을 갖는 특정한 세포나 조직의 복합체 또는 개체의 수준으로 변해가는 것을 말한다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서는 줄기세포로부터 배상체를 형성시킨 후, 배상체를 나노패턴에서 심근세포로 분화 유도하였다.
본 발명의 일 실시예에서는 현적배양 (Hanging drop culture) 법으로 배상체를 제작하여 심근세포로 분화를 유도하였으나, 세포 비부착성 배양접시를 사용하여 배상체를 배양하거나 또는 일반 배양접시 표면을 코팅하여 세포 부착을 저해하여 배상체를 배양하여도 무방하다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 줄기세포에서 유도된 배상체를 200 내지 500 nm의 높이; 120 내지 360 nm의 직경; 및 80 내지 240 nm의 간격의 나노패턴 배양접시에서 배양하여 심근세포로 분화시키는 단계를 포함하는 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 나노패턴의 직경은 280 내지 360 nm인 것이 바람직하며, 나노패턴의 간격은 80 내지 160 nm인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 나노패턴은 직경이 일정하게 증가하고, 간격이 일정하게 감소하는 이중구배인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 구배를 가지지 않는 나노패턴을 사용하여도 무방하다.
본 발명에 있어서, 배상체를 200 내지 500 nm의 높이를 갖고, 직경은 280 내지 360 nm로 일정하게 증가하고 간격은 160 내지 80 nm로 일정하게 감소하는 이중구배 나노패턴 배양접시에서 배양하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 배상체로 분화 유도는 10% (v/v) 소태아혈청, 2 mM L-글루타민, 50 Units/mL 페니실린, 50 μg/mL 스트렙토마이신, 및 100 μM 베타-머캅토에탄올을 포함하는 α-MEM 배지에서 줄기세포를 배양하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 줄기세포를 배상체로의 분화는 2일간 유도하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 배상체는 줄기세포들로 이루어진 구형체 세포 덩어리로서 중배엽 세포로의 자연적인 분화가 가능하기 때문에 혈관내피세포, 혈관평활근세포, 혈액세포 및 심근세포의 분화를 유도할 수 있다.
본 발명에 있어서, 배상체 한 개를 형성하는 줄기세포는 2×103 내지 4×103개인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 3×103개 줄기세포인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다. 즉, 배상체 제작 시에는 세포수를 한정하지 않으며 세포의 수를 조절하여 다양한 크기의 배상체를 제작할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 심근세포로의 분화는 나노패턴 배양접시에 배상체 10개를 부착시켜 배양하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 배상체를 심근세포로 분화시키기 위한 배양은 8일 동안 수행하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
줄기세포는 배양접시의 표면구조에 따라 부착 및 생장능이 달라지고 세포분화를 조절 받는다. 부착성 세포가 체외 배양시 접촉하는 배양접시의 표면이 나노 단위의 돌기가 있으며, 직경의 크기가 점점 작아지거나 커지는 구배패턴인 경우, 배양초기의 세포-기질 간 상호작용에 의해 줄기세포가 나노패턴 배양접시의 표면에 접촉하고 증식하여, 심근세포로의 분화능을 획득할 수 있다.
본 발명에 있어서, 나노패턴은 돌기형인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 패턴으로 될 수 있는 어떤 형태라도 사용 가능하다.
본 발명의 일 실시예에서는 가로 35 mm, 세포 20 mm의 면적 700 mm2을 가진 공간 내에 세포를 배양하였으나, 그 크기에 국한되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 나노패턴의 높이는 200 내지 500 nm인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 줄기세포 배양에 적합한 표면구조는 직경과 간격이 동시에 변화하는 나노패턴 배양접시를 이용하여 수행되는 것일 수 있다. 상기 직경과 간격이 동시에 변화하는 나노패턴이 균일하게 배열된 것을 "이중구배 나노패턴 (Dual gradient nanopattern)"이라 정의하였다. 상기 본 발명의 용어 "구배 (Gradient)"는 일정하고 규칙적인 변화를 의미한다. 상기 본 발명에 따른 일반 배양접시에 도입된 이중구배 나노패턴은 직경과 간격이 동시에 증가하거나, 직경과 간격이 동시에 감소하거나 또는 직경은 증가하되 간격은 감소하도록 제조된 것일 수 있다. 바람직하게 본 발명에서는 일정한 비율로 증가하는 나노패턴의 직경과 일정하게 감소하는 나노패턴 사이의 간격을 묘사하기 위하여 사용한다. 상기 나노패턴의 직경은 [도 1]에 나타난 것과 같이, 나노패턴의 상부를 유사한 크기의 원형으로 가정하여 측정되는 지름을 의미하며, 상기 나노패턴의 간격 역시 [도 1]에 나타난 것과 같이, 하나의 나노패턴과 가장 가깝게 이웃한 나노패턴의 거리를 측정한 값이 될 수 있다.
상기 직경이 증가하는 동시에 간격은 감소하는 이중구배 나노패턴은 산성용액에 대한 노출시간을 조절하여 일 말단으로부터 다른 말단으로 증가하는 직경을 갖는 나노다공성 기공을 포함하는 음이온성 산화알루미늄 (Anodic aluminium oxide)을 이용하여 제조할 수 있다. 본 제조기술은 한국특허출원 제10-2014-0129841호를 이용하였다. 상기 음이온성 산화알루미늄은 알루미늄판을 인산용액에서 양극산화처리하고 크롬산 용액으로 식각하여 제조되는 것일 수 있다. 결과로 생성된 정렬된 기공을 갖는 음이온성 산화알루미늄을 다시 양극산화처리하고 인산용액에 담금 시간을 점진적으로 증가시키면서 처리하여 기공의 직경이 일정하게 증가하는 음이온성 산화알루미늄 주형을 제작할 수 있다. 마지막으로, 상기 제조된 음이온성 산화알루미늄 주형을 폴리스티렌 등의 세포독성을 갖지 않아 세포 배양접시로 사용가능한 재질의 기판에 열각인 (Thermal imprinting)하여 제조할 수 있다. 상기 제조과정은 열각인 전에 음이온성 산화알루미늄 주형 상에 자기조립에 의해 HDFS (Heptadecafluoro- 1,1,2,2-tetrahydrodecyl trichlorosilane) 단일층을 코팅하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 기공크기가 일정하게 증가하는 음이온성 산화알루미늄 주형을 제조하기 위한 인산용액에 담금 시간은 바람직하게 0분으로부터 500분까지일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 제조한 직경이 일정하게 증가하는 기공을 포함하는 음이온성 산화알루미늄을 열각인하여 나노패턴을 제조하기 위한 기판은 본 발명의 목적상 세포배양을 목적으로 하는 것이므로, 바람직하게 세포독성을 나타내지 않는 생체적합성 고분자 재질로 제조되는 것일 수 있다. 바람직하게 일반적으로 세포배양에 사용되는 일반 배양접시의 재질인 폴리스티렌 재질일 수 있으며, 상용화되는 폴리스티렌 세포 배양접시를 직접 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 폴리스티렌 기판을 사용하는 경우 열각인은 기판을 100 내지 150℃에서 7 내지 13분간 가열하고 2.5 내지 3.5 바 (bar)로 80 내지 120초간 압축하여 수행될 수 있다.
본 발명에서 “나노패턴 (Nanopattern)”은 나노 단위의 돌기가 균일하게 배열되어 있는 것을 말하며, 줄기세포능을 갖는 줄기세포를 지속적으로 배양하기 위한 목적으로 제작하였다. 나노패턴은 체내 조직표면의 굴곡을 생체 외에서 모사한 것으로써, 세포 배양 시 부착표면에서의 세포 형태변화가 세포의 특성 및 분화에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 본 발명의 나노패턴은 심근세포 분화에 적합한 최적의 표면형태를 선발하여, 다른 성격의 세포분화를 감소시키는 동시에 심근세포로의 분화를 증진시킬 수 있다.
생체의 세포표면을 모사한 나노패턴에 세포가 부착하는 방법으로는 세포외 기질 구성성분을 매개로한 세포부착과 정전기적 세포부착으로 구분 지을 수 있다. 세포외 기질을 구성성분을 매개로한 세포부착에서는 콜라겐 (Collagen), 피브로넥틴 (Fibronectin), 라미닌 (Laminin) 및 젤라틴 (Gelatin) 등을 코팅하여 상기 세포외 기질 구성성분에 존재하는 특정 단백질 리간드를 인지할 수 있는 세포막 내 인테그린과 결합하여 부착이 가능하다. 정전기적 세포부착은 세포막의 구성성분인 인지질에 의해 전기적으로 음성을 띠게 되므로, 전기적으로 양성인 세포표면을 제작하여 막의 전기적 성질에 의해 세포의 부착을 유도하는 방법이다. 통상적으로 사용되고 있는 대부분의 일반 배양접시는 정전기적 세포부착 원리를 이용하여 제작되고 있으며, 양성의 전기적 표면을 제작하기 위해 일반 배양접시 표면에 플라즈마 처리를 한다.
상기 본 발명의 용어 "부착성 (Adhesive)"은 세포가 세포 부착 분자 (Cell adhesion molecule)을 통해 표면, 세포외 기질 또는 다른 세포에 결합하는 성질을 의미한다. 적절한 세포 부착성은 다세포구조 (Multicellular structure)의 유지에 필수적인 특성이다. 상기 세포부착성은 세포의 세포질을 연결할 수 있으며 신호전달에 관여할 수 있다.
본 발명의 나노패턴 배양접시는 세포의 부착배양을 용이하게 하기 위해 당업계에 알려진 코팅물질을 코팅하여 이용할 수 있다. 바람직하게 상기 코팅물질은 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌, 젤라틴, 알긴산염 (Alginate), 폴리-D-라이신 또는 한천 (Agar)일 수 있으나, 세포독성을 나타내지 않으면서 배양접시에 대한 세포 부착능을 향상시킬 수 있는 물질이면 제한 없이 사용할 수 있다.
본 발명의 줄기세포의 심근세포로의 분화는 일반 배양접시 표면에 나노패턴을 도입하고, 플라즈마 처리를 하여 전기적 양성을 띠는 세포 배양접시를 제작하여 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 나노패턴 배양접시는 사용하기 전 0.1% 젤라틴 코팅을 통해 세포막 내 인테그린이 배양접시 표면을 인지할 수 있도록 제작하는 것이 바람직하나, 처리한 물질이 세포 사멸을 유도시키지 않는 코팅물질이라면 제한 없이 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 줄기세포는 만능 줄기세포인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 배아 줄기세포인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 줄기세포는 10% (v/v) 혈청 대체물 (Knockout serum replacement), 100 μM 베타-머캅토에탄올, 1% (v/v) 비필수 아미노산 (Non-essential amino acid), 1 mM 피루빈산나트륨 (Sodium pyruvate), 1% (v/v) 소태아혈청, 50 Units/mL 페니실린, 50 μg/mL 스트렙토마이신, 2000 Units/mL 백혈구유저지인자 (Leukemia inhibiory factor), 100 μg/mL 블라스티시딘 (Blasticidin) 및 100 μg/mL 제네티신 (Geneticin)을 포함하는 GMEM 배지에서 배양한 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 줄기세포는 0.1% 젤라틴으로 코팅한 일반 배양접시에서 배양하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 중배엽 세포로부터 심근세포로의 분화 시 소태아혈청, L-글루타민, 페니실린, 스트렙토마이신, 베타-머캅토에탄올 및 심근세포 유도인자 복합물이 포함된 α-MEM 배지에서 줄기세포를 배양하는 것이 바람직하며, 이러한 심근세포 분화 배지에는 심근세포 유도인자로 면역억제제인 사이클로스포린 에이 (Cyclosporin A) 등이 포함될 수 있다. 사이클로스포린 에이는 심근전구세포에 단독 처리 시 심근세포로의 분화를 유도하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 심근세포 유도인자를 복합하여 처리하였으나, 기존에 심근세포 분화에 알려진 유도인자만의 혼합으로 제한되지 않으며, 처리 물질이 세포 사멸을 유도하지 않고 동시에 심근세포로 분화 가능하다면 제한 없이 사용할 수 있다.
본 발명은 나노패턴과 심근세포 분화 배지에 의한 시너지효과를 통해 효율적으로 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서는 줄기세포로부터 근섬유분절 (Sarcomere)이 형성된 심근세포로 분화하는 과정에서 세포학적 특성 변화를 비교분석하고, 그 결과를 통해 심근세포로의 분화 가능성을 유전자 발현차이로 확인하여 나노패턴 배양접시에서 심근세포 분화 배지 내 줄기세포의 심근세포 분화율을 비교분석함과 동시에 성숙도를 평가하였다.
나노패턴 배양접시에서 배양된 줄기세포의 세포학적 및 형태학적 특성 분석은 특성에 맞는 마커들의 유전자 발현을 중합효소연쇄반응을 통해서 수행하거나 마커 특이적으로 결합하는 항체를 이용한 면역형광염색법을 통하여 수행할 수 있다.
상기 유전자 발현은 혈관내피세포, 혈관평활근세포, 혈액세포 및 심근세포 특이적인 유전자 예컨대, 혈관내피세포의 마커로 Flk1, 혈관평활근세포의 마커로 α-SMA, 혈액세포의 마커로 Runx1 및 Gata2, 그리고 심근세포의 마커로 Mesp1 및 cTnT의 발현 차이로 확인 가능하다. 본 발명의 실시예는 상기 마커로 세포의 유전자발현 차이를 확인하였으나, 각 세포의 특성이 이들 마커로만 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 면역형광염색법을 수행함에 있어 두 개 이상 서로 다른 파장의 형광물질을 염색하였을 경우 동시에 검출할 수 있으며, 세포핵 속 DNA를 염색하는 DAPI를 이용하여 세포의 위치 및 수를 확인할 수 있다. 본 발명의 나노패턴 배양접시에서 배양된 세포는 광학현미경으로 관찰하였을 때 세포의 유무를 확인하기 어려우므로, 상기 DAPI는 목적상 세포의 위치를 가늠하기 위해 사용할 수 있으며, 염색용액을 상기 물질로만 한정하는 것은 아니다.
나노패턴에서의 줄기세포 배양은 심근세포로의 분화능을 획득할 수는 있지만 이것이 성숙한 세포로의 완전한 매개체는 될 수 없다. 줄기세포의 분화는 전분화능에서 다분화능으로, 다시 다분화능에서 분화능이 없는 성숙한 세포의 단계로 이루어진다. 각 분화가 일어나는 단계에서는 특정 성장인자들에 의한 신호전달이 일어나며, 이것이 분화단계의 전체를 아우르지는 않는다. 따라서 나노패턴과 기존의 심근세포 분화에 알려진 유도인자의 시너지효과로 인해 심근세포로 분화시킬 수 있으며, 심근세포 분화 배지 내에 줄기세포로부터 심근세포로의 분화율을 확인할 수 있다. 상기 분화한 심근세포의 성숙도 분석은 심근세포 특이적인 마커의 발현을 측정함으로써 수행될 수 있다. 이러한 심근세포의 마커는 α-actinin, Connexin 43, α-MHC, cTnT, cTnI, Nkx2.5인 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 줄기세포 및 나노패턴 배양접시
1-1: 줄기세포의 배양
줄기세포는 일본 교토대학교 Jun K. Yamashita로부터 분양받은 EMG7 마우스유래 배아 줄기세포를 사용하였으며, 상기 EMG7 마우스유래 배아 줄기세포는 알파-미오신 중쇄 (α-Myosin heavy chain; α-MHC) 프로모터가 활성화되면 eGFP (Enhanced green fluorescence protein)이 발현되는 세포주이다. 이 EMG7 세포를 0.1% 젤라틴으로 코팅한 일반 배양접시에서, 10% (v/v) 혈청 대체물 (Knockout serum replacement), 100 μM 베타-머캅토에탄올 (β-Mercaptoethanol), 1% (v/v) 비필수 아미노산 (Non-essential amino acid), 1 mM 피루빈산나트륨 (Sodium pyruvate), 1%(v/v) 소태아혈청 (Fetal bovine serum), 50 Units/mL 페니실린 (Penicillin), 50 μg/mL 스트렙토마이신 (Streptomycin), 2000 Units/mL 백혈구유저지인자 (Leukemia inhibitory factor), 100 μg/mL 블라스티시딘 (Blasticidin) 및 100 μg/mL 제네티신 (Geneticin)을 포함하는 GMEM 배지로 배양하여 준비하였다.
1-2: 나노패턴 배양접시
나노 임프린트 기술 (Nanoimprint technology) (한국특허출원 제10-2014-0129841호)을 이용하여, 이전에 제시된 나노패턴의 직경보다 작은 범위의 직경으로 나노패턴 배양접시를 제작하였다.
초고순도 알루미늄판 (Ultrapure aluminum plates)을 과염소산용액 (Perchloric acid:absolute ethanol=1:4)으로 7℃에서 20V 전압을 이용하여 전기화학적으로 세척하였다. 상기 세척한 알루미늄판을 0℃에서 12시간 동안 193V 전압을 적용하여 인산용액 (DI water:methanol:phosphoric acid=59:40:1)으로 양극산화처리 (Anodizing)하고, 크롬산용액 (9 g chromic acid 및 20.3 mL phosphoric acid가 포함된 500 mL DI water)으로 식각 (Etching)하였다. 상기 제조된 잘 정렬된 기공을 포함하는 음이온성 산화알루미늄 (Anodic aluminum oxide)을 다시 4시간 동안 동일한 조건으로 양극산화처리하고 장력계 (Tensiometer; Operating speed 1.0 mm/min)를 이용하여 인산용액에 처리하되, 담금 (Dipping) 시간을 점진적으로 증가시키면서 강도를 조절하였다. 조절된 구배 기공을 포함하는 음이온성 산화알루미늄 주형을 자기조립된 HDFS (Heptadecafluoro-1,1,2,2- tetrahydrodecyl trichlorosilane) 단일층으로 코팅하였다. 음이온성 산화알루미늄의 표면을 먼저 피라냐 용액 (Piranha solution; 35% H2SO4:H2O2=7:3, v/v)으로 수산화하고 3 mM 무수 (Water-free) HDFS n-헥산용액을 이용하여 표면상에 HDFS 자기조립 단일층이 형성되도록 하였다. 나노각인장치, NANOSIS™ 610를 사용하여 나노미터 단위의 구배 직경을 갖는 기공을 포함하는 음이온성 산화알루미늄 주형을 열각인 (Thermally imprinting)시켜 폴리스티렌 (Polystyrene) 나노패턴 배양접시를 제조하였다. 700 mm2 (35 mm×20 mm) 크기의 폴리스티렌 고분자 시트를 165℃에서 10분간 가열하고 3 바 (bar)로 120초간 압축하였다. 실온으로 온도를 낮춘 후 폴리스티렌 시트로부터 음이온성 산화알루미늄 주형을 분리하였다.
나노패턴 제조를 위하여, 인산에서 2 단계 양극산화에 의해 패턴의 규칙적인 어레이를 포함하는 음이온성 산화알루미늄을 제조하였다. 30℃에서 패턴 확장을 위해 인산용액에서 담금 시간을 0분으로부터 350분까지 서서히 증가시킴으로써 나노미터 규격의 패턴 구배를 갖는 음이온성 산화알루미늄을 획득하였다. 음이온성 산화알루미늄에서 패턴의 직경은 담금 시간이 증가함에 따라 선형적으로 증가하였고, 변화하는 직경의 나노패턴을 갖는 폴리스티렌 표면 패턴화는 이중구배 나노패턴을 가지는 음이온성 산화알루미늄 주형의 열 나노각인에 의해 수행되었다. 상용되는 세포 배양접시에 가장 널리 사용되는 물질인 폴리스티렌을 바닥소재로써 선택하였다.
그 결과, 나노패턴의 높이는 평균 200 내지 500 nm으로 하여, 나노패턴의 직경 및 간격을 다양하게 나노패턴을 제작하였다 (도 1). 즉, 나노패턴의 직경이 200 내지 280 nm 또는 280 내지 360 nm로 일정하게 증가하고, 간격이 240 내지 160 nm 또는 160 내지 80 nm로 일정하게 감소하는 이중구배 나노패턴을 제작하였다 (도 2C). 제작된 이중구배 나노패턴은 가로 35 mm 및 세로 20 mm로 면적 700 mm2의 기판 형태로 직경 60 mm의 일반 배양접시 안에 도입하여 사용하였다 (도 2A).
실시예 2: 줄기세포 유래 중배엽 세포
2-1: 중배엽 세포로의 분화 유도
실시예 1-1에서 배양한 EMG7 세포를 인산염완충식염수 (Phosphate buffer saline; PBS)로 세척한 후, 0.25% 트립신/이디티에이 (Trypsin/Ethylenediaminetetraacetic acid; T/E)를 첨가하여 37℃ 배양기에서 1분 동안 반응하여 세포를 탈착하였다. 세포를 수거하여 1000 rpm에서 3분 30초 동안 원심분리한 후, 상층액을 버리고 펠렛 (Pellet)을 상기 실시예 1-1에서 사용한 EMG7 배양 배지에 부유시켜 2×103개/cm2의 세포를 0.1% 젤라틴으로 코팅한 배양접시에 분주하였다. 그 다음, 분화 배지인 10% (v/v) FBS, 2 mM L-글루타민, 50 Units/mL 페니실린, 50 μg/mL 스트렙토마이신 및 100 μM 베타-머캅토에탄올을 포함하는 α-MEM 배지를 사용하여 분화유도 하였다. 4.5일 동안 2일마다 배지를 교체하면서 배양하여 줄기세포를 중배엽 세포로 분화 유도하였다.
2-2: 중배엽 세포의 분리
4.5일 동안 분화 유도한 세포를 인산염완충식염수로 세척한 후, 0.25% 트립신/이디티에이를 첨가하여 37℃ 배양기에서 2분간 반응하여 세포를 탈착하였다. 1000 rpm에서 5분간 원심분리한 후 상층액을 제거하고 분화 배지를 첨가하여 재 부유시킨 세포를 37℃ 배양기에서 30분간 안정화하였다. 1000 rpm에서 5분간 다시 원심분리한 후 펠렛은 Flk1 1차 항체를 포함하는 차단용액으로 4℃에서 20분 동안 반응시켰다. 그 다음, 인산염완충식염수로 1회 세척하여 스트렙타비딘 (Streptavidin) 또는 바이오틴 (Biotin) 마이크로비드 2차 항체를 4℃에서 30분 동안 처리한 후, 인산염완충식염수로 1회 세척하여 자동 자성활성 세포 분류기 (Auto magnetic-activated cell sorting; Auto MACS) 장비를 이용하여 중배엽 세포만을 순수 분리하였다.
실시예 3: 나노패턴 배양접시에서 분화 유도된 줄기세포의 특성
실시예 2에서 분리한 분화 유도된 줄기세포의 성장 특성을 확인하기 위해, 대조군으로서 일반 배양접시와 나노패턴 배양접시에서 중배엽 세포를 배양하였다.
실시예 2의 분화 배지를 사용하여, 대조군 및 나노패턴 배양접시에서 4일 동안 중배엽 세포를 배양하였다. 이후, DAPI로 염색하여 광학 및 형광현미경으로 형태를 관찰하였으며, 배양 4일 후에 단위면적 당 세포 수, 군집 형성 수를 분석하였다. 또한, Phospho histone 3 (PHH3) 및 Cleaved caspase 3 (C-caspase 3)를 측정하였으며, 마지막으로, 중배엽 세포를 나노패턴 배양접시에서 배양하여 분화 유도된 줄기세포가 발현하는 유전자에 대한 중합효소연쇄반응을 실시하였다.
그 결과, 나노패턴 배양접시에서 배양된 중배엽 세포 수가 대조군에 비해서 증가한 것을 확인할 수 있었으며 (도 3A 및 도 3B), 나노패턴 배양접시에서 배양하여 분화 유도된 줄기세포의 군집 형성률이 3배 이상 증가한 것을 알 수 있었다 (도 3C).
이와 더불어, PHH3 및 C-caspase 3의 발현을 면역형광염색법을 통하여 확인한 결과, 나노패턴 배양접시에서 배양된 중배엽 세포에서 PHH3 양성세포가 증가한 것을 알 수 있었다 (도 3D 및 도 3E). 반면, 대조군과 나노패턴 배양접시에서 배양된 중배엽 세포에서 C-caspase 3 양성 세포의 수는 유사한 것으로 확인되었다 (도 3F 및 도 3G).
또한, 나노패턴 배양접시에서 2일 또는 4일 배양된 중배엽 세포의 심근세포, 혈관내피세포, 평활근세포 및 혈액세포 마커들인 Mesp1, Flk1, α-SMA, Runx1 및 Gata2의 mRNA 수준을 비교한 결과, 나노패턴 배양접시에서 분화된 세포에서 심근세포 마커인 Mesp1의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다 (도 4).
실시예 4: 나노패턴을 이용한 중배엽 세포의 심근세포로의 분화
실시예 2에서 분리한 알파-미오신 중쇄 프로모터에 eGFP이 발현하도록 제작된 줄기세포 유래 중배엽 세포를 분화 배지 내에 심근세포 유도인자 복합물을 첨가하여 심근세포로의 분화를 유도하였다. 대조군 및 나노패턴 배양접시를 0.1% 젤라틴으로 코팅한 후 60 mm 직경의 공간 당 1.43×104세포/cm2 즉, 총 3×105개의 중배엽 세포를 분주하고, 분화 배지 내에서 4일 동안 배양하였다 (도 5A). 심근세포 분화양상을 확인하기 위해 대조군 및 나노패턴 배양접시에서 심근세포 유도인자 복합물이 첨가된 분화 배지에 배양한 줄기세포를 DAPI로 염색하여 광학 및 형광현미경 이미지를 실시간으로 관찰하였다. Image J 소프트웨어를 사용하여 대조군 및 나노패턴 배양접시에 분화된 심근세포 수, 군집 수, 군집 면적 및 군집 둘레를 비교분석하여 그래프로 나타내었다.
그 결과, 배양 2일째부터 eGFP 양성인 심근세포가 발견되며, 군집형태를 이루어 박동하는 성숙한 심근세포를 확인할 수 있었다. 특히 나노패턴 배양접시에서 배양하였을 경우 심근세포 군집 수가 대조군에 비해 유의적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다 (도 5B). 또한, 대조군에 비해 나노패턴 배양접시에서 분화된 심근세포 군집 면적이 세 배 이상 증가하는 것을 확인할 수 있었고, 분화된 심근세포의 군집둘레는 두 배 이상 증가한 결과를 확인할 수 있었다 (도 5C, 5D 및 5E).
실시예 5: 배상체 (Embryoid body)의 심근세포로의 분화
5-1: 줄기세포 유래 배상체
실시예 1의 EMG7 세포를 기존에 보고된 현적배양 (Hanging drop culture)법에 따라 배상체를 형성시켰다. 구체적으로, 3×103개의 EGM7 세포를 10% (v/v) 소태아혈청, 1% L-글루타민, 100 μM 베타-머캅토에탄올, 50 Units/mL 페니실린, 50 μg/mL 스트렙토마이신을 포함하는 20 μl의 α-MEM 배지를 이용한 현적배양법으로 2일간 배양하여 배상체로 분화 유도하였다.
5-2: 나노패턴을 이용한 배상체의 심근세포로의 분화
알파-미오신 중쇄 프로모터의 활성화 시 eGFP가 발현하도록 제작된 줄기세포 유래 배상체를 0.1% 젤라틴으로 코팅한 대조군과 나노패턴 배양접시에 각각 10개씩 부착하여 배양하였다. 배양 하루 뒤 배상체가 배양접시에 부착 된 것을 확인한 다음, 8일 동안 2일마다 배지를 교체하면서 배양하여 배양체를 심근세포로 분화 유도하였다 (도 6A). 또한, 나노패턴 배양접시에서 배상체의 구조적 형태 변화를 배양 1, 2, 4, 6 및 8일째까지 광학현미경으로 기록하였다 (도 6B). 나노패턴 배양접시에서 배양된 배상체의 심근세포로 분화양상을 확인하기 위해 배양 8일째 eGFP 양성의 심근세포를 DAPI 염색을 통하여 형광이미지로 분석하였다.
그 결과, 배양 6일째부터 군집형태를 이루어 박동하는 성숙된 심근세포를 확인할 수 있었고, 배양 8일째 나노패턴 배양접시에서 배양한 배상체에서 심근세포 마커인 eGFP 발현이 대조군보다 증가한 것을 공초점 레이저 주사 현미경으로 확인할 수 있었다 (도 6C). 또한, 배양 12일째 대조군과 나노패턴 배양접시에서 분화된 심근세포에서 eGFP와 cTnT의 발현을 공초점 레이저 주사 현미경으로 확인하여 분화한 심근세포에서 근섬유분절을 관찰할 수 있었다. 즉, 나노패턴 배양접시에서 배양된 배상체는 심근세포로 분화 가능함을 확인할 수 있었다 (도 6D).
실시예 6: 심근세포 분화에서 분화 유도인자 처리의 영향
나노패턴 배양접시에서 분화 유도인자 처리에 의해 분화 유도된 심근세포의 세포학적 특성 변화를 분석하여, 성숙도를 평가하였다. 심근세포의 성숙도는 심근세포 특이적인 마커인 α-actinin, Connexin 43, α-MHC, cTnT, cTnI, Nkx2.5를 면역형광염색법 및 중합효소연쇄반응으로 측정하였다.
그 결과, 심근세포 특이적인 마커가 모두 발현 증가한 것을 확인하고, 나노패턴과 심근세포 분화 유도인자의 시너지효과로 인해 심근세포로의 분화 효율이 현저히 증가하는 것을 알 수 있었다 (도 7).
또한, 실시예 2 및 5의 중배엽 세포 및 배상체를 다양한 직경과 간격을 갖고 있는 나노패턴 배양접시에서 배양하여 심근세포로 분화 유도하였으며, 상기 중배엽 세포는 심근세포 분화에 알려진 유도인자를 첨가한 분화 배지를 사용하였다. 분화한 심근세포는 심근세포 특이적인 마커의 발현을 측정하여 성숙도를 분석하였다.
그 결과, 심근세포 특이적 마커인 Mesp1 및 cTnT의 mRNA 발현이 증가한 것을 알 수 있었으며, 특히 중배엽 세포에서는 직경 200 내지 280 nm의 나노패턴에서 Mesp1의 발현이 가장 높았고, 배상체에서는 직경 280 내지 360 nm의 나노패턴에서 cTnT의 발현이 가장 높은 것을 알 수 있었다 (도 8).
본 발명에 따르면, 심근세포 분화에 최적화된 나노패턴을 이용하여 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 방법은 고가의 세포외 기질을 코팅하거나 지지세포를 이용할 필요가 없어 경제적이며, 나노패턴 위에 세포를 배양하는 단순한 방법으로 심근세포 분화를 유도하는 장점이 있다. 또한 심근세포로의 분화 효율이 우수하다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (18)

  1. 줄기세포에서 유도된 중배엽 세포를 200 내지 500 nm의 높이 (Height); 120 내지 360 nm의 직경 (Diameter); 및 80 내지 240 nm의 간격 (Spacing)의 나노패턴 배양접시에서 배양하여 심근세포로 분화시키는 단계를 포함하는 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 상기 나노패턴의 직경은 200 내지 280 nm인 것을 특징으로 하는 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 나노패턴의 간격은 160 내지 240 nm인 것을 특징으로 하는 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 나노패턴은 직경이 일정하게 증가하고, 간격이 일정하게 감소하는 이중구배인 것을 특징으로 하는 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 중배엽 세포를 200 내지 500 nm의 높이 (Height)를 갖고, 직경 (Diameter)은 200 내지 280 nm로 일정하게 증가하고 간격 (Spacing)은 240 내지 160 nm로 일정하게 감소하는 이중구배 나노패턴 배양접시에서 배양하는 것을 특징으로 하는 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 중배엽 세포는 1×104 내지 2×104세포/cm2로 접종하는 것을 특징으로 하는 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 배양은 4일 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 배양은 FBS, L-글루타민 (L-Glutamine), 페니실린 (Penicillin), 스트렙토마이신 (Streptomycin), 베타-머캅토에탄올 (β-Mercaptoethanol) 및 심근세포 분화유도인자 복합물이 포함된 α-MEM 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 심근세포 분화유도인자는 사이클로스포린 에이 (Cyclosporin A)를 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 방법.
  10. 줄기세포에서 유도된 배상체를 200 내지 500 nm의 높이 (Height); 120 내지 360 nm의 직경 (Diameter); 및 80 내지 240 nm의 간격 (Spacing)의 나노패턴 배양접시에서 배양하여 심근세포로 분화시키는 단계를 포함하는 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 나노패턴의 직경은 280 내지 360 nm인 것을 특징으로 하는 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 나노패턴의 간격은 80 내지 160 nm인 것을 특징으로 하는 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 방법.
  13. 제10항에 있어서, 상기 나노패턴은 직경이 일정하게 증가하고, 간격이 일정하게 감소하는 이중구배인 것을 특징으로 하는 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 방법.
  14. 제10항에 있어서, 배상체를 200 내지 500 nm의 높이 (Height)를 갖고, 직경 (Diameter)은 280 내지 360 nm로 일정하게 증가하고 간격 (Spacing)은 160 내지 80 nm로 일정하게 감소하는 이중구배 나노패턴 배양접시에서 배양하는 것을 특징으로 하는 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 방법.
  15. 제10항에 있어서, 나노패턴 배양접시에 배상체 10개를 부착시켜 배양하는 것을 특징으로 하는 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 방법.
  16. 제10항에 있어서, 상기 배양은 8일 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 방법.
  17. 제1항 또는 제10항에 있어서, 상기 나노패턴은 돌기형인 것을 특징으로 하는 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 방법.
  18. 제1항 또는 제10항에 있어서, 상기 줄기세포는 만능 줄기세포인 것을 특징으로 하는 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 방법.
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