KR20100039944A - 줄기세포 증식용 나노패턴과 이를 이용하여 줄기세포의 증식을 증대시키는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 줄기세포 증식용 나노패턴과 이를 이용하여 줄기세포의 증식을 증대시키는 방법에 관한 것으로 보다 상세하게는 잘 제어된 나노미터 크기의 반복 구조를 가지는 미세 패턴을 체계적으로 제조하고 그 패턴의 형태와 크기 등에 따라 줄기 세포의 세포 반응을 조절하는, 특히 증식력을 증대시키는 기술에 관한 것이다. 이를 위한 본 발명은 나노미터 수준의 패턴을 알루미늄 양극 산화 기법으로 제조하고 이로부터 임프란트 기법으로 전사한 육각 밀집 구조의 나노패턴에 있어서, 상기 패턴 구조의 직경은 45 ~ 90 nm 인 것을 특징으로 하는 줄기세포 증식용 나노패턴이다. 그리고 상기 나노 패턴의 간격은 100 ~ 120 nm인 정도인 것이 정도의 것이 바람직하다. 상기 범위의 경우에 줄기세포의 증식이 잘 이루어진다.

줄기세포, 나노패턴, 증식력

Description

줄기세포 증식용 나노패턴과 이를 이용하여 줄기세포의 증식을 증대시키는 방법{The nanopattern for stem cell proliferation and the enhancement method of stem cell proliferation using thereof}

본 발명은 줄기세포 증식용 나노패턴과 이를 이용하여 줄기세포의 증식을 증대시키는 방법에 관한 것으로 보다 상세하게는 잘 제어된 나노미터 크기의 반복 구조를 가지는 미세 패턴을 체계적으로 제조하고 그 패턴의 형태와 크기 등에 따라 줄기 세포의 세포 반응을 조절하는, 특히 증식력을 증대시키는 기술에 관한 것이다.

나노 미터 크기의 정밀성을 가지는 미세 패턴 제작 기술은 특히 최근 반도체 공업의 발전에 크게 힘입은 바 있다. 100 nm의 선폭을 광기술의 기술적 한계로 여기던 것이 불과 몇 년 전이었음을 생각해 본다면 45 nm 선폭의 제품이 쏟아져 나오고 있는 오늘의 현실은 그야말로 눈부신 기술적 발전을 이룬 것이며, 이와 함께 발전해 온 전자선 기술, 주사탐침 현미경 기술, 나노 임프린트 기술, 마이크로 컨택 프린트 기술 등 다양한 나노 미터 크기의 제어 기술들은 또한 최근 들어 이들을 이용한 각종 응용기술의 개발을 가능하게 하고 있다.

이를테면 나노 패턴을 이용한 바이오 센서의 개발이나 각종 화학 및 전기 전자 소자의 개발 등이 그러한 것들인데, 이와 같은 기술 환경의 변화는 과거 단순히 패턴의 해상도를 경쟁적으로 올리는 구도에서 벗어나 연구 목적에 알맞은 해상도와 모양의 나노 패턴을 얼마나 싼 가격에 얼마나 빠르게 만들어 내느냐의 여부로 기술개발구도의 축을 옮겨가게 하였다.

알루미늄 양극 산화(anodized aluminum oxide)를 이용한 기술은 이미 오래 전부터 잘 알려진 보호용 및 장식용 알루미늄 피막 제조 기술의 하나인데, 특히 양극산화를 산 용액 조건에서 수행할 경우 다공성의 막이 형성되며 막의 형성과 제거를 반복할 경우 매우 균일한 크기와 모양의 다공성 피막이 형성되는 것으로 알려져 있다. 특히 이 기술은 이용한 산 용액의 종류와 농도 및 가해 준 인가전압, 사후 식각환경 등에 따라 원하는 크기와 폭의 패턴을 육각밀집 구조형태로 제조할 수 있다는 장점이 있다.

이렇게 제조된 패턴은 내구도 또한 훌륭하여 이 패턴을 주형으로 음각의 복제 패턴을 만들어 내는데도 이용할 수 있다. 이미 이 패턴을 이용하여 단단한 고분자 평판을 임프린트 하는 기술이 소개된 바 있는데, 이 기술은 가공성 및 표면의 화학적 개질 등이 용이한 고분자 기판위에 쉽고 빠르게 패턴을 전사할 수 있기 때문에 매우 유용하다. 하지만 단단한 고분자 평판을 이용하다보면 해당 기판의 Tg근처까지 온도를 올려 주어야 하고 큰 압력을 요구하는 등의 제한된 실험적 조건을 맞춰주어야 하기 때문에 거대한 장치가 요구되는 단점도 있다. 그럼에도 불구하고 이 기술이 유용한 점은 특히 기판을 폴리스티렌(Polystyrene, PS)으로 이용할 경우 오랜 기간 세포 배양용 기판으로 이용되어 왔고 다양한 실험적 결과들이 축적되어 왔기 때문에 나노패턴이 전사된 PS기판을 이용한 단백질 및 DNA등 생체 물질의 고정화, 세포 거동 연구 등의 다양한 나노 바이오 연구는 기존의 수많은 실험적 결과들과 직접적으로 비교할 수 있게 된다.

한편 세포 거동을 제어하기 위한 연구는 그 다양하고도 폭 넓은 의학적 응용가능성 때문에 여러 가지 기술들이 개발되어 왔다. 특히 줄기세포의 분화를 제어하는 것은 그 임팩트가 매우 클 것으로 예상되기 때문에 최근 주목받고 있다. 줄기세포의 분화를 비롯한 세포의 여러 가지 거동제어는 세포에 해당 신호를 전달하는 화학 물질들을 이용하는 것이 일반적이었는데, 미세 패턴을 이용하여 세포의 거동을 제어하는 연구는 학술적 차원에서 몇 차례 진행된 바 있으며 패턴의 크기 또한 과거 마이크로 단위에서 최근 나노패턴으로 발전하고 있다.

간엽 줄기세포의 거동을 제어하기 위하여 본 발명에서는 다양한 종류의 잘 제어된 크기와 형태를 가지는 알루미늄 패턴을 체계적으로 제조하고 이로부터 임프린트 기술로 제조된 PS 나노 패턴을 구성하였다. 이와 같이 구성된 나노 패턴을 이용하여 세포의 증식력을 크게 향상시킴으로써 나노 패턴을 이용한 세포 치료 및 조직공학, 생체 재료의 신개발 등 다양한 의학적 생물학적 응용 기술의 중요한 기반을 제공하고자 한다.

이를 위한 본 발명은 나노미터 수준의 패턴을 알루미늄 양극 산화 기법으로 제조하고 이로부터 임프란트 기법으로 전사한 육각 밀집 구조의 나노패턴에 있어서, 상기 패턴 구조의 직경은 45 ~ 90 nm 인 것을 특징으로 하는 줄기세포 증식용 나노패턴이다. 그리고 상기 나노 패턴의 간격은 100 ~ 120 nm인 정도인 것이 정도의 것이 바람직하다. 상기 범위의 경우에 줄기세포의 증식이 잘 이루어진다.

그리고 상기 양극 산화용 전해질은 옥살산을 이용하는 것이 이를 구현하는데 용이하다. 그리고, 상기 나노패턴의 전사는 고분자 기판 위에 이루어지는 것이 바람직하며, 상기 고분자 기판은 폴리스티렌(PS)기판인 것이 더욱 바람직하다.

또한 본 발명은 상기 나노패턴을 이용하여 줄기세포의 증식을 증대시키는 방법이다. 상기 줄기세포는 간엽 줄기세포인 것이 바람직하다.

본 발명은 특정 세포의 배양능력을 크게 끌어올리거나 줄기세포의 분화 방향을 제어하는 등의 유용한 기능성을 적극 활용하여 세포치료에 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 조직 공학적 측면에서 생체 내 조건(in vivo)에서의 조직적응력을 높일 수 있는 적절한 스캐폴드의 설계에 중요한 단서를 제공해 줄 수 있다. 또한 생체재료의 개발에 있어 특히 임플란트용 재료 이용시 발생할 수 있는 fibro encapsulation 등의 문제를 방지하는데 이용될 수도 있고, 박테리아의 흡착을 방지하는 기능성을 부여하도록 는 등의 각종 응용 연구에 중요한 기술적 기반을 제공하고 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 보다 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 치환 및 균등한 타 실시예로 변경할 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 명백할 것이다.

본 발명은 크게 체계적인 나노 패턴의 제작 및 이를 이용한 세포반응의 제어라는 두 단계의 기술적 과정으로 나누어 요약할 수 있다.

본 발명에서는 다음과 같이 세 가지 종류의 크기와 형태를 가지는 나노패턴을 알루미늄 산화 기법을 이용하여 제조하였다; 1) 구멍의 폭이 70 nm이고 구멍간 거리가 110 nm의 간격을 가지는 육각밀집 구조의 나노 패턴 (O-70), 2) 구멍의 폭 이 280 nm이고 구멍간 거리가 500 nm인 육각밀집 구조의 나노 패턴 (P-280), 3) 구멍의 폭이 430 nm이고 구멍간 거리가 500 nm인 육각밀집 구조의 나노 패턴 (P-430).

1)번 패턴은 옥살산을 이용하여, 2), 3)번 패턴들은 인산을 전해액으로 이용하여 제조한 나노 패턴들이다. 또한 이들을 주형으로 하여 음각형태의 패턴 즉, 원기둥 모양의 나노 패턴을 PS 기판 위에 임프린트 기법으로 전사하여 각각 세포 배양에 이용하였다. 세포는 인간 간엽줄기세포를 이용하였고 적절한 배양액을 이용하여 24시간 동안 배양 후 각 패턴에서의 세포반응을 관찰하였다.

본 발명의 실시 예를 구체적이며 단계적으로 설명하면 다음과 같다.

실시예 1. 알루미늄 양극 산화 패턴의 제조 및 PS 임프린트 패턴(O-70) 제조

1) 알루미늄 양극 산화 기술을 이용하여 반복적이며 그 크기가 나노 미터 수준으로 제어된 미세 구조물을 제작한다.

- 알루미늄 기판 (2x5 cm²)을 25% 과염소산 에탄올 용액에 넣고 약 5분간 20V의 전위를 가해 준다. 온도는 7°C로 유지한다.

- 0.3M 옥살 산 용액에서 8시간 동안 15°C, 40V의 조건으로 양극산화 시킨다.

- 크롬산 용액에 65°C를 유지하며 3시간 또는 4시간 동안 담그어 둔다.

- 0.3M 옥살 산 용액에서 3분 동안 15°C, 40V의 조건으로 양극산화 시킨다.

- 인산용액에 30°C를 유지하며 40분간 동안 담그어 둔다.

2) 위 1)에서 제작한 미세 구조물을 이용하여 임프린트 기법으로 단단한 PS 기판 위에 원기둥 형태의 패턴을 전사한다. 이와 같은 공정으로 제조된 PS 기판은 가시광선에 대하여 투명하며, 본 실시예의 경우 약 2×2 cm²의 면적에 전사할 수 있었다. 본 실시예를 통하여 제조한 나노 패턴의 실사진을 도 1에 나타내었으며 전자 현미경 사진을 도 2에 나타내었다. 패턴의 폭과 간격이 각각 70 nm, 110 nm인 육각 밀집 구조의 패턴이 잘 형성되었음을 알 수 있다.

실시예 2. 알루미늄 양극 산화 패턴의 제조 및 PS 임프린트 패턴(P-280) 제조

1) 알루미늄 양극 산화 기술을 이용하여 반복적이며 그 크기가 나노 미터 수준으로 제어된 미세 구조물을 제작한다.

- 알루미늄 기판 (2x5 cm²)을 25% 과염소산 에탄올 용액에 넣고 약 5분간 20V의 전위를 가해 준다. 온도는 7°C로 유지한다.

- 0.1M 인산용액에서 10시간 동안 0°C, 193V의 조건으로 양극산화 시킨다.

- 크롬산 용액에 65°C를 유지하며 12시간 동안 담그어 둔다.

- 0.1M 인산용액에서 5시간 동안 0°C, 193V의 조건으로 양극산화 시킨다.

- 인산용액에 30°C를 유지하며 두 시간 반 동안 담그어 둔다.

2) 위 1)에서 제작한 미세 구조물을 이용하여 임프린트 기법으로 단단한 PS 기판 위에 원기둥 형태의 패턴을 전사한다. 본 실시예를 통하여 제조한 나노 패턴의 전자현미경 사진을 도 3에 나타내었다. 패턴의 폭과 간격이 각각 280 nm, 500 nm인 육각 밀집 구조의 패턴이 잘 형성되었음을 알 수 있다.

실시예 3. 알루미늄 양극 산화 패턴의 제조 및 PS 임프린트 패턴(P-430) 제조

1) 알루미늄 양극 산화 기술을 이용하여 반복적이며 그 크기가 나노 미터 수준으로 제어된 미세 구조물을 제작한다.

- 알루미늄 기판 (2x5 cm²)을 25% 과염소산 에탄올 용액에 넣고 약 5분간 20V의 전위를 가해 준다. 온도는 7°C로 유지한다.

- 0.1M 인산용액에서 10시간 동안 0°C, 193V의 조건으로 양극산화 시킨다.

- 크롬산 용액에 65°C를 유지하며 12시간 동안 담그어 둔다.

- 0.1M 인산용액에서 5시간 동안 0°C, 193V의 조건으로 양극산화 시킨다.

- 인산용액에 30°C를 유지하며 네 시간 동안 담그어 둔다.

2) 위 1)에서 제작한 미세 구조물을 이용하여 임프린트 기법으로 단단한 PS 기판 위에 원기둥 형태의 패턴을 전사한다. 본 실시예를 통하여 제조한 나노 패턴의 전자현미경 사진을 도 4에 나타내었다. 패턴의 폭과 간격이 각각 430 nm, 500 nm인 육각 밀집 구조의 패턴이 잘 형성되었음을 알 수 있다.

실시예 4. 세포반응 확인.

1) 일반적으로 세포 배양에 사용되는 PS 기판과 위 실시예 1~3을 통하여 제조한 각각의 나노 패턴들 위에 인간 간엽줄기세포를 배양하였다.

2) 배양밀도는 5×103/well이었고 배양에 이용한 배양기는 PTFE를 이용하여 자작하였다. 본 발명에 이용된 배양기의 사진을 도 5에 나타내었다.

3) DMEM, 10%FBS 및 항생물질로 이루어진 배양액을 이용하여 24시간 동안 배양한다.

4) 4% p-formaldehyde를 이용하여 세포를 고정화 한다.

5) Alexa Fluor 568 phalloidin을 이용하여 액틴 미세섬유를 염색한다.

6) 도 6에 각 패턴에서 얻어진 배양물들의 live and dead cell assay결과를 나타 내었으며 도 7에 CCK assay 결과를 나타내었다. 모든 환경에서 충분한 생존 능력을 가지는 것을 확인할 수 있다.

7) 도 8에 각 패턴에서 얻어진 배양물들의 증식력에 관한 CCK assay 결과를 나타내었다. P-280과 P-430 패턴에 비하여 O-70의 증식 능력이 월등하게 높은 것을 확인할 수 있다.

8) 도 9에 액틴 미세섬유를 염색하여 촬영한 현미경 사진을 나타내었다.

9) 도 10에 6시간 및 24시간 배양후 측정한 cell area에 관한 분석 결과를 나타내었다. View analyzer basic을 이용하였으며, O-70패턴이 다른 나노 패턴이나 평판에 비하여 더 큰 cell area를 가지는 것을 확인할 수 있었다.

이상 상술한 바와 같이 O-70의 나노 패턴에 대하여 인간 간엽줄기세포의 증식 능력이 일반적으로 사용하는 PS 기판을 이용한 것에 비하여 크게 향상 된 것을 확인할 수 있다.

한편, 본 발명의 구체적 범위는 상기 기술한 실시예 보다는 특허청구범위에 의하여 한정지어지며, 특허청구 범위의 의미와 범위 및 그 등가적 개념으로 도출되는 모든 변경 및 변형된 형태를 본 발명의 범위로 포함하여 해석하여야 한다.

도 1은 본 발명에 이용된 폴리 스티렌 나노 패턴 O-70의 실사진이다.

도 2는 본 발명에 이용된 폴리 스티렌 나노 패턴 O-70의 전자현미경 사진이다.

도 3은 본 발명에 이용된 폴리 스티렌 나노 패턴 P-280의 전자현미경 사진이다.

도 4는 본 발명에 이용된 폴리 스티렌 나노 패턴 P-430의 전자현미경 사진이다.

도 5는 본 발명에서 세포 배양에 이용된 자작 배양기의 실사진이다.

도 6은 세포의 생존력을 측정한 형광 사진이다.

도 7은 세포의 생존력을 비교한 CCK assay 결과이다.

도 8은 세포의 증식력을 비교한 CCK assay 결과이다.

도 9는 세포의 액틴 미세섬유 형성을 비교하기 위하여 염색한 결과이다.

도 10은 세포의 cell area를 분석한 결과이다.

Claims (7)

1. 나노미터 수준의 패턴을 알루미늄 양극 산화 기법으로 제조하고 이로부터 임프란트 기법으로 전사한 육각 밀집 구조의 나노패턴에 있어서, 상기 패턴 구조의 직경은 45 ~ 90 nm 인 것을 특징으로 하는 줄기세포 증식용 나노패턴.
2. 제 1항에 있어서,

   상기 나노 패턴의 간격은 100 ~ 120 nm인 것을 특징으로 하는 줄기세포 증식용 나노패턴.
3. 제 1항 또는 제 2항의 어느 한 항에 있어서,

   상기 양극 산화용 전해질은 옥살산을 이용하는 것을 특징으로 하는 줄기세포 증식용 나노패턴.
4. 제 1항 또는 제 2항의 어느 한 항에 있어서,

   상기 나노패턴의 전사는 고분자 기판위에 이루어지는 것을 특징으로 하는 줄기세포 증식용 나노패턴.
5. 제 4항에 있어서,

   상기 고분자 기판은 폴리스티렌(PS)기판인 것을 특징으로 하는 줄기 세포 증 식용 나노패턴.
6. 제 1항 내지 제 5항의 어느 한 항에 의한 나노패턴을 이용하여 줄기세포의 증식을 증대시키는 방법.
7. 제 6항에 있어서,

   상기 줄기세포는 간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는 방법.

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