KR101490671B1 - 나노구배패턴을 포함하는 배양용기를 이용한 배아줄기세포 배양에 적합한 표면구조의 스크리닝 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 직경(Diameter) 또는 간격(Spacing)이 일정하게 변화하는 구배 나노기둥 어레이를 포함하는 세포배양용기에 세포를 배양하는 단계를 포함하는 배아줄기세포 배양에 적합한 표면구조를 스크리닝하는 방법, 상기 스크리닝 방법에 사용되는 일정하게 증가하는 직경을 갖는 나노기둥이 일정하게 감소하는 간격으로 균일하게 배열된 나노기둥을 포함하는 세포배양용기 및 상기 스크리닝 방법에 의해 선별된 조건의 나노기둥을 포함하는 세포배양용기에 세포를 배양하는 단계를 포함하는 지지세포 없이 줄기세포능(stemness)을 유지하면서 배아줄기세포를 배양하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 일정하게 증가하는 직경(Diameter)을 갖는 나노기둥이 일정하게 감소하는 간격(Spacing)으로 균일하게 배열된 나노기둥을 포함하는 세포배양용기는 하나의 배양용기 내에서 다양한 표면 형태를 제공할 수 있으므로, 동일한 조건에서 수행되는 단일 배양에 의해 표면 형태의 변화가 세포특성에 미치는 영향을 동시에 모니터링할 수 있으며, 이를 이용하여 세포배양에 적합한 최적의 표면형태를 선별할 수 있다. 상기 스크리닝을 통해 선별된 인간 배아줄기세포를 배양하는 방법은 값비싼 세포외 기질을 코팅하거나 지지세포를 이용할 필요없이 줄기세포능을 유지하면서 증식시킬 수 있는 방법을 제공할 수 있다.

Description

나노구배패턴을 포함하는 배양용기를 이용한 배아줄기세포 배양에 적합한 표면구조의 스크리닝 방법{A screening method for the optimal surface structure of embryonic stem cell culture using a cell culture plate comprising gradient nanopattern}
본 발명은 직경(Diameter) 또는 간격(Spacing)이 일정하게 변화하는 구배 나노기둥 어레이를 포함하는 세포배양용기에 세포를 배양하는 단계를 포함하는 배아줄기세포 배양에 적합한 표면구조를 스크리닝하는 방법, 상기 스크리닝 방법에 사용되는 일정하게 증가하는 직경을 갖는 나노기둥이 일정하게 감소하는 간격으로 균일하게 배열된 나노기둥을 포함하는 세포배양용기 및 상기 스크리닝 방법에 의해 선별된 조건의 나노기둥을 포함하는 세포배양용기에 세포를 배양하는 단계를 포함하는 지지세포 없이 줄기세포능(stemness)을 유지하면서 배아줄기세포를 배양하는 방법에 관한 것이다.
21세기 생명공학은 인간복지를 목표로 식량, 환경, 건강 문제에 새로운 해결책의 가능성을 제시하고 있으며, 특히 최근 줄기세포의 이용기술은 난치병 치료의 새로운 장으로 떠오르고 있다. 이전까지는 난치병 치료를 위해 장기 이식이나 유전자 치료 등이 제시되었으나, 면역 거부와 공급장기 부족, 유전자에 대한 지식 부족으로 실용화가 미진하였다.
이에 줄기세포 연구에 대한 관심이 고조되어, 증식과 분화를 통해 모든 기관을 형성할 능력을 가진 만능 줄기세포가 대부분의 질병 치료는 물론 장기 훼손을 근원적으로 해결할 수 있는 것으로 인식되었다. 또한, 많은 과학자가 거의 모든 장기재생은 물론 난치병이었던 파킨슨병, 각종 암, 당뇨병과 척수손상 등의 치료에 이르기까지 다양하게 줄기세포의 적용 가능성을 제시해왔다.
줄기세포(stem cells)란 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포로, 만능 줄기세포(totipotent stem cells), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cells; MSCs)로 분류할 수 있다.
만능 줄기세포는 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있는 만능의 성질을 가진 세포로 난자와 정자의 수정 이후 8 세포기까지의 세포가 이러한 성질을 가지며 이 세포를 분리하여 자궁에 이식하면 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있다. 전분화능 줄기세포는 외배엽, 중배엽, 내배엽층 유래의 다양한 세포와 조직으로 발생할 수 있는 세포로, 수정 4 내지 5일 후 나타나는 배반포(blastocyst)의 안쪽에 위치한 내세포괴(inner cell mass)에서 유래하며 이를 배아 줄기세포라 하며 다양한 다른 조직세포로 분화되지만 새로운 생명체를 형성하지는 못한다.
다분화능 줄기세포는 성체 골수에서 최초로 분리되었고(Y. Jiang et al., Nature, 418:41, 2002), 그 후 다른 여러 성체 조직에서도 확인되었다(C. M. Verfaillie, Trends Cell Biol., 12:502, 2002). 다시 말해, 골수는 가장 널리 알려진 줄기세포의 공급원이지만, 다분화능 줄기세포는 피부, 혈관, 근육 및 뇌로부터도 확인되었다(J. G. Toma et al., Nat. Cell Biol., 3: 778, 2001; M. Sampaolesi et al., Science, 301: 487, 2003; Y. Jiang et al., Exp. Hematol., 30: 896, 2002). 그러나, 골수와 같은 성체 조직 내의 줄기세포는 매우 드물게 존재하고, 이러한 세포들은 분화유도하지 않고 배양하기 어려워서, 특이적으로 스크린 된 배지들이 없으면 그 세포들을 배양하기 어렵다.
상기 줄기세포의 운명은 생체 내 위치(in vivo niche)에서 복합성과 동력학을 구성하는 다수의 인자들에 의해 결정된다. 시험관 내 배양 동안 세포의 미세환경을 모사하려는 시도는 가용성 인자들(예컨대, 성장인자, 사이토카인, 소분자, 영양분 등)의 사용에 의존한다. 그러나, 축적된 증거는 생화학적 환경에 더하여, 줄기세포와 근본 기저막(underlying basement membrane) 간의 물리적 상호작용이 다양한 세포행동에 대한 중요한 매개체로 작용함을 나타낸다.
기저막은 부착-의존적 줄기세포의 생존, 증식 및 분화를 위한 기층을 제공하는 세포외 기질(extracellular matrices; ECM)이다. 위상학 연구에 의해 기저막은 나노수준에서 다공성이며, 이는 라미닌 및 콜라겐과 같은 한데 감기는 섬유단백질(interwinding fibrous proteins)에 의해 형성됨이 밝혔졌다. 되는 다양한 크기의 기공으로 구성됨이 밝혀졌다. 자기조립(self-assembly) 및 석판인쇄술(lithography)과 같은 최근 나노기술의 발전으로 줄기세포 행동에 대한 세포-나노지형(nanotopography) 상호작용을 연구하기 위한 다양한 형태의 나노단위의 표면 특징을 제조할 수 있게 되었다. 예컨대, 부착성 도트의 공간적 배열은 국소 부착의 조립(assembly of focal adhesions)과 세포골격 조직화(cytoskeletal organization)를 변화시킴으로써 세포 확산을 조절할 수 있고, 다양한 형태의 나노구조(예컨대, 선형 격자(line gratings), 기둥, 튜브 및 다공성)는 다양한 형태의 줄기세포의 유지, 분화 및 증식에 영향을 줄 수 있다.
일반적으로 배아줄기세포는 마우스 또는 인간 유래의 지지세포(보통 섬유아세포)와 공배양한다. 상기 지지세포는 배아줄기세포가 줄기세포능을 잃지 않고 미분화상태로 유지되도록 하기 위하여 분비인자, 세포외 기질(extracellular matrix; ECM) 및 세포접촉을 제공한다. 그러나, 상기 지지세포의 사용은 동물의 병원균이 인간 배아줄기세포에 전달되는 등의 교차감염(cross contamination) 위험성을 내포하여 인간 배아줄기세포의 임상적용을 가로막는 요인이 되고 있다. 따라서, 이러한 지지세포를 이용하지 않는 배아줄기세포 배양시스템 발굴을 위한 연구가 진행되고 있다. 이러한 노력의 일환으로 지지세포와의 직접적인 접촉 없이 배아줄기세포를 배양하는 방법으로써 마우스 또는 인간 지지세포를 배양한 배지 등의 조건화된 조건배지(conditioned medium; CM) 또는 다른 성장인자 및 이외의 신호전달인자를 포함하는 배지를 이용하여 배양하고 있다.
종래에는 지지세포 없이, 줄기세포능을 유지하면서 배아줄기세포를 배양하는 다른 방법으로는 mTeSR 배지 등을 이용하여 플레이트의 표면을 낮은 온도에서 마트리겔(matrigel)로 코팅하는 방법을 사용하였다. 그러나 마트리겔을 사용하는 경우, 배아줄기세포의 계대배양 시 플레이트의 표면을 낮은 온도로 유지하고 마트리겔을 제거하기 위한 시약처리 공정이 추가되는 복잡한 문제가 있다. 또한 mTeSR 배지(feeder-free media, Stem Cell Technologie)의 경우 고가의 단백질 코팅(matrigel, BD Science)을 필요로 한다. 또한 이러한 배양방법의 경우 단가가 높은 mTeSR 배지를 매일 교환해 주어야 하므로 비용 또한 문제가 된다.
이에 본 발명자들은 지지세포 없이, 줄기세포능을 유지하면서 배아줄기세포를 배양하는 최적의 조건을 탐색하기 위한 방법을 찾고자 예의 연구 노력한 결과, 일정하게 증가하는 직경을 갖는 나노기둥이 일정하게 감소하는 간격으로 균일하게 배열된 나노기둥을 포함하는 세포배양용기를 이용하여 세포를 배양하는 경우 특정 직경 범위에서 전분화능 마커의 발현이 더 높은 수준으로 유지되는 것을 확인하여, 상기 나노구배패턴을 포함하는 세포배양용기를 줄기세포의 분화, 증식 및 유지를 위한 최적의 표면구조 탐색에 이용할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 직경(Diameter) 또는 간격(Spacing)이 일정하게 변화하는 구배 나노기둥 어레이를 포함하는 세포배양용기에 부착성 세포를 배양하는 단계를 포함하는 세포배양에 적합한 표면구조를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 스크리닝 방법에 사용되는 일정하게 증가하는 직경을 갖는 나노기둥이 일정하게 감소하는 간격으로 균일하게 배열된 나노기둥을 포함하는 세포배양용기를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 스크리닝 방법에 의해 선별된 120 nm 내지 170 nm의 직경을 갖는 나노기둥이 320 nm 내지 250 nm 간격으로 균일하게 배열된 나노기둥을 포함하는 줄기세포능 유지를 위한 세포배양용기를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 세포배양용기에 세포를 배양하는 단계를 포함하는 지지세포 없이 줄기세포능을 유지하면서 배아줄기세포를 배양하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 직경(Diameter) 또는 간격(Spacing)이 일정하게 변화하는 구배 나노기둥 어레이를 포함하는 세포배양용기에 세포를 배양하는 단계를 포함하는 배아줄기세포 배양에 적합한 표면구조를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 스크리닝 방법에 사용되는 일정하게 증가하는 직경을 갖는 나노기둥이 일정하게 감소하는 간격으로 균일하게 배열된 나노기둥을 포함하는 세포배양용기를 제공한다.
본 발명에 따른 배아줄기세포 배양에 적합한 표면구조를 스크리닝하는 방법은 직경과 간격이 동시에 변화하는 나노기둥을 포함하도록 제조된 세포배양용기를 이용하여 수행되는 것일 수 있다. 상기 직경과 간격이 동시에 변화하는 나노기둥이 균일하게 배열된 것을 "이중 나노구배패턴(dual gradient nanopattern)" 또는 줄여서 "나노구배패턴(gradient nanopattern; G-Np)"이라 정의하였다.
상기 본 발명의 용어 "구배(gradient)"는 일정하고 규칙적인 변화를 의미한다. 상기 본 발명에 따른 세포배양용기에 도입된 이중 나노구배패턴은 직경과 간격이 동시에 증가하거나, 직경과 간격이 동시에 감소하거나 또는 직경은 증가하되 간격은 감소하도록 제조된 것일 수 있다. 바람직하게 본 발명에서는 일정한 비율로 증가하는 나노기둥의 직경과 일정하게 감소하는 나노기둥 사이의 간격을 묘사하기 위하여 사용한다.
상기 나노기둥의 직경은 나노기둥의 상부를 유사한 크기의 원형으로 가정하여 측정되는 지름을 의미하며, 하나의 나노기둥의 중심으로부터 가장 가깝게 이웃한 나노기둥의 중심까지의 거리를 측정하고 그로부터 각 나노기둥의 반지름을 뺀 차이값으로 계산될 수 있다.
바람직하게 상기 직경이 증가하는 동시에 간격은 감소하는 나노기둥을 포함하는 나노구배패턴은 산성용액에 대한 노출시간을 조절하여 일 말단으로부터 다른 말단으로 증가하는 직경을 갖는 나노다공성 기공을 포함하는 음이온성 산화알루미늄(anodic aluminium oxide; AAO)를 이용하여 제조할 수 있다. 예컨대, 상기 음이온성 산화알루미늄은 알루미늄판을 인산용액에서 양극산화처리하고 크롬산 용액으로 식각하여 제조되는 것일 수 있다. 결과로 생성된 정렬된 기공을 갖는 AAO를 다시 양극산화처리하고 인산용액에 담금시간을 점진적으로 증가시키면서 처리하여 기공의 직경이 일정하게 증가하는 AAO 주형을 제작할 수 있다. 마지막으로, 상기 제조된 AAO 주형을 폴리스티렌 등의 세포독성을 갖지 않아 세포배양용기로 사용가능한 재질의 기판에 열각인(thermal imprinting)하여 제조할 수 있다. 상기 제조과정은 열각인 전에 AAO 주형 상에 자기조립에 의해 HDFS(heptadecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrodecyl trichlorosilane) 단일층을 코팅하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 기공크기가 일정하게 증가하는 AAO 주형을 제조하기 위한 인산용액에 담금시간은 바람직하게 0분으로부터 500분까지일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 제조한 직경이 일정하게 증가하는 기공을 포함하는 AAO를 열각인하여 나노구배패턴을 제조하기 위한 기판은 본 발명의 목적상 세포배양을 목적으로 하는 것이므로, 바람직하게 세포독성을 나타내지 않는 생체적합성 고분자 재질로 제조되는 것일 수 있다. 바람직하게 일반적으로 세포배양에 사용되는 세포배양용기의 재질인 폴리스티렌 재질일 수 있으며, 상용화되는 폴리스티렌 세포배양용기를 직접 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 폴리스티렌 기판을 사용하는 경우 열각인은 기판을 100 내지 150℃에서 7 내지 13분간 가열하고 2.5 내지 3.5 바(bar)로 80 내지 120초간 압축하여 수행될 수 있다.
바람직하게 본 발명에 따른 세포배양용기는 100 nm 내지 400 nm의 증가하는 직경 구배를 갖는 나노기둥이 350 nm 내지 50nm의 감소하는 간격으로 배열된 이중 나노구배패턴을 포함하도록 제조되는 것일 수 있다. 예컨대, 나노구배패턴의 일말단에는 평균직경 ~120 nm의 나노기둥이 ~320 nm 간격으로 배열되어 있으며, 패턴의 중심부 부근에는 평균직경 ~230 nm의 나노기둥이 ~220 nm 간격으로 배열되어 있으며, 패턴의 다른 말단에는 평균직경 ~350 nm의 나노기둥이 ~80 nm 간격으로 배열된, 패턴의 일 말단으로부터 다른 말단으로 진행함에 따라 나노기둥의 직경은 선형적으로 증가하는 동시에 간격은 선형적으로 감소하는 크기 및 직경이 일정하게 변화하는 나노기둥을 포함할 수 있다. 이때, 상기 나노기둥의 높이는 100 nm 내지 1 mm일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는 100 nm 내지 1000 nm일 수 있다.
상기 본 발명의 용어 "부착성(adhesive)"은 세포가 세포 부착 분자(cell adhesion molecule)을 통해 표면, 세포외 기질 또는 다른 세포에 결합하는 성질을 의미한다. 상기 세포 부착 분자로는 셀렉틴(selectins), 인테그린(integrins) 및 카데린(cadherins) 등이 있다. 적절한 세포부착성은 다세포구조(multicellular structure)의 유지에 필수적인 특성이다. 상기 세포부착성은 세포의 세포질을 연결할 수 있으며 신호전달에 관여할 수 있다. 이러한 세포의 표면에 대한 부착성으로 인해 상기 신호전달 등은 세포가 접합 표면의 형태에 의해서 영향을 받을 수 있다.
본 발명의 나노기둥 어레이를 포함하는 세포배양용기는 세포의 부착배양을 용이하게 하기 위해 당업계에 알려진 코팅물질을 코팅하여 이용할 수 있다. 바람직하게 상기 코팅물질은 콜라겐(collagen), 알긴산염(alginate), 폴리-D-라이신 또는 한천(agar)일 수 있으나, 세포독성을 나타내지 않으면서 배양접시에 대한 세포부착능을 향상시킬 수 있는 물질이면 제한없이 사용할 수 있다.
본 발명의 방법은 상기 직경 구배 나노기둥 어레이의 각기 다른 직경 및 간격의 나노기둥을 포함하는 영역에서 채취한 배아줄기세포의 특성을 분석하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 특성 분석을 통해 수집된 결과를 비교 분석하여 가장 바람직한 세포 특성을 나타내는 영역을 선별할 수 있다.
상기 본 발명의 용어 "배아줄기세포(embryonic stem cells)"는 발생 초기 배아에서 배반포(blastocyst)의 내세포괴(inner cell mass; ICM)로부터 유래된 전분화능(pluripotent) 줄기세포이다. 인간배아는 수정 후 4 내지 5일에 50 내지 150개 세포로 구성되는 배반포 단계에 이른다. 배아모체(embryoblast) 또는 내세포괴는 수정된 인간배아를 파괴하여 획득할 수 있다. 획득한 배아줄기세포는 인간의 경우 약 14 μm, 마우스의 경우 약 8μm의 크기를 갖는다. 상기 배아줄기세포의 두 가지 뚜렷한 특징은 1) 전분화능 및 2) 무한한 복제 능력에 있다. 배아줄기세포는 전분화능을 가지므로, 외배엽(ectoderm), 내배엽(endoderm) 및 중배엽(mesoderm)의 3가지 일차 배엽(primary germ layers)의 모든 유도체로 분화될 수 있다. 이는 성체에서 220여 종을 초과하는 세포 형태를 포함한다. 상기 전분화능은 성체에서 발견되는 성체줄기세포로부터 구별되는 배아줄기세포의 특징이다. 예컨대, 배아줄기세포는 체내의 모든 세포 형태로 분화될 수 있으나, 성체줄기세포는 다분화능을 가지므로 제한된 수의 세포 형태로만 분화될 수 있다. 또한 상기 배아줄기세포는 제한된 조건하에서 무제한적으로 자기증식할 수 있다. 따라서, 상기 배아줄기세포는 연구 및 재생의학에서 유용하게 사용될 수 있다.
따라서, 상기 채취한 배아줄기세포의 특성을 분석하는 단계는 전분화능 마커의 발현을 측정함으로써 수행될 수 있다. 이때, 상기 전분화능 마커는 Oct4인 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
상기 "Oct4(octamer-binding transcription factor 4)"는 POU5F1(POU 도메인, 클래스 5, 전사인자 1)이라고도 알려진 단백질로서, POU 패밀리의 호메오도메인 전사인자(homeodomain transcription factor)이다. 상기 단백질은 미분화 배아줄기세포의 자기재생에 임계적으로(critically) 관여한다. 전술한 이유에서 상기 단백질은 미분화세포에 대한 마커로써 자주 이용되고 있으며, 세포의 분화상태를 파악하기 위해서는 상기 마커에 대한 모니터링이 매우 중요하다.
상기한 줄기세포의 세포적 특성 이외에 미분화 배아줄기세포는 조밀한 집락을 형성하며 증식, 유지되는 형태적 특성을 갖는다. 상기 조밀한 집락을 형성하는 각각의 배아줄기세포는 높은 핵/세포질 비율을 갖는 것을 특징으로 한다. 따라서, 상기 세포의 특성을 분석하는 단계는 세포부착성 마커, 세포골격 마커 또는 병소부착 마커의 발현을 추가로 측정함으로써 수행될 수 있으며, 상기 세포부착성 마커는 E-카데린(E-cadherin), 세포골격 마커는 팔로이딘(phalloidin) 및 병소부착 마커는 빈쿨린(vinculin)일 수 있다.
상기 채취한 배아줄기세포의 세포적 및/또는 형태적 특성을 분석하는 단계는 해당 마커들에 특이적으로 결합하는 항체를 이용한 면역분석을 통해 수행할 수 있다. 상기 항체들은 검출을 용이하게 하기 위하여 형광표지한 것을 이용할 수 있으며, 서로 다른 파장에서 발광하는 형광체를 표지한 경우 두 개 이상의 마커를 동시에 검출할 수 있다. 또한 상기 면역분석을 수행함에 있어, 추가로 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)를 이용하여 DNA 즉, 세포핵을 염색함으로써 세포의 위치 및/또는 분포를 확인할 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 DAPI는 세포의 위치 및/또는 형태를 가늠하기 위하여 사용되는 것이므로, 이외에 당업계에 공지된 세포핵, 세포질 또는 미토콘드리아 염색에 사용되는 물질을 대신하여 사용할 수 있다. 이들의 비제한적인 예로는 세포핵을 염색하는 메틸렌블루(methylene blue), 아세트산카민(acetocarmine), 톨루이딘블루(toluidine blue), 헤마톡실린(hematoxylin) 또는 Hoechst 등, 세포질을 염색하는 에오신(eosin), 크리스탈바이올렛(crystal violet) 또는 오렌지 G(orange G) 등, 또는 미토콘드리아를 염색하는 로다민 123(rhodamine 123), 미토트랙커(MitoTracker), 야누스그린 B(janus green B), 테트라졸리움염(tetrazolium salt), DASPMI(Dimethylaminostyrylmethylpyridiniumiodine), DASPEI(2-(4-(dimethylamino)styryl)-N-Ethylpyridinium Iodide), DiOC6(3,3'-dihexyloxacarbocyanine iodide), DiOC7(3,3'-Diheptyloxacarbocyanine Iodide) 또는 JC-1(5,5,6,6-tetrachloro-1,1,3,3-tetraethyl-benzimidazolylcarbocyanine chloride) 등이 있다.
상기 "E-카데린(epithelial cadherin; E-cadherin)"은 카데린-1, CAM 120/80 또는 유보모룰린(uvomorulin)으로도 알려진 단백질로서, 인간에 있어서는 종양억제유전자(tumor suppressor gene)인 CDH1 유전자에 의해 인코딩된다. 상기 E-카데린은 카데린 수퍼패밀리의 대표적인 멤버로써, 인코딩된 단백질은 세포외 도메인에 존재하는 EC1 내지 EC5의 5개 카데린 반복단위(5 extracellular cadherin repeats), 하나의 막통과 영역(transmembrane region) 및 p120-카테닌(p120-catenin) 및 베타-카테닌(β-catenin)에 결합하는 세포내 도메인(intracellular domain)으로 구성된다. 상기 세포내 도메인은 베타-카테닌 결합에 필수적인 고도로 인산화된 영역(highly phosphorylated region)을 포함한다. 상기 베타-카테닌은 또한 알파-카테닌과 결합하며, 상기 알파-카테닌은 액틴을 포함한 세포골격 필라멘트의 조절에 관여한다. 따라서, 상기 E-카데린은 세포-세포 접합을 포함하며 액틴을 포함하는 세포골격 필라멘트에 이웃하여 존재한다. 상기 E-카데린은 포유류 발달의 2 세포기에서 최초로 발현되며 8 세포기에 인산화하여 조밀한 구조를 갖도록 유도한다.
상기 "팔로이딘"은 팔로톡신(phallotoxin)이라고 알려진 맹독성 흰버섯류로부터 유래하는 독소(toxin)의 일종으로, F-액틴(F-actin)에 특이적으로 결합한다. 특히 팔로이딘은 이웃한 아단위가 서로 맞물리는 F-액틴 아단위(subunit) 사이의 경계에 결합한다. 따라서, 상기 형광체를 표지한 팔로이딘은 세포 내에서 F-액틴의 분포를 확인하기 위한 유용한 도구로 사용될 수 있다. 한편 상기 "F-액틴"은 세포 분열시 세포의 수축 및 세포의 이동성과 같은 세포기능에 필수적인 선형 중합체 미세필라멘트(linear polymer microfilament)로서 세포골격을 구성하는 주된 요소이다. 따라서, 상기 F-액틴은 세포의 주위 및/또는 세포와 세포의 경계부분에 주로 분포하며, 세포접합 및 세포형태의 확립 및 유지, 세포 신호전달 등에 관여한다. 따라서, 상기 팔로이딘 염색은 세포-세포 경계 및 세포 형태에 대한 정보를 제공할 수 있다.
상기 "빈쿨린"은 액틴 세포골격에 대한 인테그린 부착 분자(integrin adhesion molecule)의 결합에 관여하는 병소 부착 플라크(focal adhesion plaque) 내의 막-세포골격 단백질로, 유사한 기능을 하는 알파-카테닌과는 20 내지 30%의 서열 유사성을 가진다. 탈린 또는 알파-액티닌에 결합하며 그에 따라 빈쿨린의 형태 및 결합능이 변화한다. 상기 빈쿨린은 세포-세포 및 세포-기질 접합(cell-cell and cell-matrix junction)에 관여하는 세포골격 단백질로서, 막에 F-액틴을 고정시키는데 관여하는 단백질 중 하나로써 작용하는 것으로 여겨진다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 DAPI에 의한 세포핵 염색과 세포골격을 형성 마커인 팔로이딘을 동시에 염색하여 관찰하였다. 대조표면에서는 단일 세포가 확산되어 세포골격 단백질인 F-액틴이 핵으로부터 보다 멀리 분리되어 존재하는 것을 확인하였고 이로부터 핵/세포질 비율이 크게 감소하였음을 확인하였다(도 5B). 반면, 본 발명에 따른 나노구배패턴을 갖는 배양용기에서 배양한 세포는 시료를 채취한 영역에 따라 약간의 차이는 있으나, 전반적으로, 핵과 세포골격 단백질인 F-액틴이 가깝게 위치하고 있으며, 따라서 핵/세포질 비율이 매우 높은 수준으로 유지되고 있음을 확인하였다(도 5B, 6A 및 7B). 또한 세포골격 필라멘트 형성에 관여하는 E-카데린의 경우, 본 발명에 따른 나노구배패턴을 포함하는 배양용기에서 배양한 세포의 경우 세포골격 단백질인 F-액틴의 위치와 중첩하여 세포-세포 경계부분에 풍부하게 분포하는 반면, 대조표면 상에서 배양한 세포의 경우 세포 경계부분에서 점상으로 나타날 뿐 아니라 발현량도 현저히 감소하였다(도 4E, 5A 및 5B).
바람직하게 상기 본 발명에 따른 세포배양에 적합한 표면구조를 스크리닝하는 방법은 지지세포 없이 줄기세포능을 유지하면서 배아줄기세포를 배양할 수 있는 조건을 검색하기 위하여 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 용어, "줄기세포능(stemness)"은 자기복제능력을 가지면서 두 가지 이상의 세포로 분화할 수 있는 체세포와 구분되는 줄기세포의 특성을 나타내는 용어이다. 즉, 상기 줄기세포능은 세포분열을 통한 우수한 자기복제능력 및 다양한 세포로 분화할 수 있는 전분화능을 모두 갖는 세포인 줄기세포의 특징을 나타내기 위하여 사용되는 용어일 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 나노구배패턴을 나노기둥의 직경에 따라 세가지 다른 영역으로 구분하여 각 영역 상에서 지지세포 없이 배양된 인간 배아줄기세포의 형태와 전분화능마커인 Oct4의 발현을 확인한 결과, 특정 직경 범위의 나노기둥을 포함하는 영역에서 배양된 세포가 다른 영역에서 배양된 세포에 비해 조밀하게 집락을 형성할 수 있으며 보다 높은 수준으로 Oct 발현률을 유지하는 것을 확인하였다(도 4C). 예컨대, 120 nm 내지 170 nm 범위의 직경을 갖는 나노기둥을 포함하는 영역(낮은 영역; Low)에서 지지세포 없이 인간 배아줄기세포를 배양한 경우 Oct4 발현률이 90%를 초과하는 수준으로 유지되는 것을 확인하였다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 120 nm 내지 170 nm의 직경을 갖는 나노기둥이 320 nm 내지 250 nm 간격으로 균일하게 배열된 나노기둥을 포함하는 줄기세포능 유지를 위한 세포배양용기를 제공한다. 상기 세포배양용기의 나노패턴의 규격은 본 발명에 따른 스크리닝 방법에 의해 선별하였으며, 상기 나노패턴은 지지세포 없이 배아줄기세포를 배양하였을 때 줄기세포능을 유지할 수 있는 최적의 조건에 해당한다.
따라서, 본 발명은 상기 세포배양용기에 세포를 배양하는 단계를 포함하는 지지세포 없이 줄기세포능을 유지하면서 배아줄기세포를 배양하는 방법을 제공한다.
상기 스크리닝 방법에 기술한 바와 같이, 지지세포 없이 배아줄기세포를 배양하는 경우 본 발명의 나노구배패턴의 특정 영역에서 배양된 세포는 다른 영역에서 배양된 세포에 비해 전분화능 마커인 Oct4를 현저히 높은 수준으로 유지하는 것을 확인하였다. 따라서 상기 스크리닝 방법에 의해 선택된 Oct4 발현이 가장 높은 수준으로 유지되는 범위의 나노기둥의 직경 및 간격을 갖는 부분을 선택하여, 상기한 범위의 직경 및 간격을 갖는 나노기둥을 포함하는 세포배양용기를 고안하여 지지세포 없이 배아줄기세포를 배양하기 위하여 사용할 수 있다.
바람직하게 상기 배아줄기세포는 90%를 초과하는 수준으로 Oct4 발현율이 유지되는 것일 수 있다.
본 발명의 일정하게 증가하는 직경(Diameter)을 갖는 나노기둥이 일정하게 감소하는 간격(Spacing)으로 균일하게 배열된 나노기둥을 포함하는 세포배양용기는 하나의 배양용기 내에서 다양한 표면 형태를 제공할 수 있으므로, 동일한 조건에서 수행되는 단일 배양에 의해 표면 형태의 변화가 세포특성에 미치는 영향을 동시에 모니터링할 수 있으며, 이를 이용하여 세포배양에 적합한 최적의 표면형태를 선별할 수 있다. 상기 스크리닝을 통해 선별된 인간 배아줄기세포를 배양하는 방법은 값비싼 세포외 기질을 코팅하거나 지지세포를 이용할 필요없이 줄기세포능을 유지하면서 증식시킬 수 있는 방법을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 나노구배표면(gradient nanopattern; G-Np)의 제조방법을 개략적으로 나타낸 도이다. (A)는 증가하는 기공 직경을 갖는 나노다공성 AAO 주형의 제조방법을 개략적으로 나타낸 도로써, 인산으로 주형을 양극산화하고 기공확장시간(pore-widening time)을 점진적으로 증가시켜 기공의 직경 구배를 획득하였다. (B)는 기공 확장 시간과 기공 직경 간의 관계를 나타낸 도로써, 기공 직경은 기공 확장 시간이 증가함에 따라 선형으로 증가하였다. 삽입된 SEM 이미지는 별로 표시한 기공 확장 시간에서의 기공 직경을 나타낸다(스케일 바= 1 Ym). (C)는 기공 구배를 갖는 AAO 주형을 이용하여 열나노각인법에 의해 PS 표면 상에 나노기둥을 형성하는 과정을 개략적으로 나타낸 도이다. (D)는 G-Np 상의 나노기둥 직경 구배 어레이로써, 나노기둥 직경의 증가는 동시에 사이 간격이 감소함을 나타낸다. 삽입된 SEM 이미지는 G-Np의 표시된 해당 영역에서 나노기둥의 특이적인 공간 배열을 나타낸다(스케일 바= 1 Ym).
도 2는 본 발명에 따른 G-Np 제조에 사용되는 나노다공성 AAO의 기공 확장 시간에 따른 기공크기를 정량적으로 나타낸 도이다. (A)는 기공 확장 시간에 따른 AAO의 SEM 이미지를 나타낸 도이다. (B)는 기공 확장 시간에 따른 기공의 직경 변화를 나타낸 도로써, 기공의 직경은 기공 확장 시간에 따라 선형적으로 증가하는 비례관계에 있음을 나타낸다.
도 3은 젤라틴을 코팅한 G-Np의 SEM 이미지를 나타낸 도이다.
도 4는 비구조적(unstructured) 대조표면(Control) 및 본 발명에 따른 G-Np 상에서 배양된 단일 hESCs의 성장 특성 및 Oct4 발현을 나타낸 도이다. (A)는 비구조적 대조표면 상에 배양한 hESC의 광학현미경 이미지를 나타낸 것으로, 4일째에는 넓게 펼쳐진(wide spread) 세포의 단일층이 관찰되었다(스케일 바= 200 Ym). (B)는 G-Np 상에 배양한 hESC의 광학현미경 이미지를 나타낸 것으로, 플레이팅 후 1일째에 어떠한 확산의 징후 없이 둥근 구형을 유지하였으며, 전형적인 조밀한 집락으로 조직화되었다(organized). (C)는 면역세포화학 분석결과를 나타낸 것으로, G-Np 상에서 배양된 집락이 대조표면 상에서 배양된 세포와 비교하여 더 높은 Oct4 발현수준을 나타냄을 확인하였다. (D)는 대조표면 및 G-Np 상에서 배양된 집락에서 Oct4 발현을 정량적으로 분석한 도이다. 대조표면 상에서 배양된 hESC는 G-Np의 각기 다른 영역 상에서 나타나는 것(low; ~94%, mid; ~81% and high; ~85%)과 비교하여 현저히 감소된 Oct4 발현수준(~48%)을 나타내었다. (E)는 qPCR 유전자 분석결과를 나타낸 것으로, G-Np 상에서 배양한 세포가 대조표면 상에서 배양한 세포와 비교하여 줄기세포능 관련 유전자 예컨대, Oct3/4, Nanog, Sox2 및 E-cad의 발현에 있어서, 보다 높은 수준의 유전자 발현수준을 나타냄을 확인하였다. 특히, 120 내지 170 nm 범위의 직경을 갖는 나노기둥을 포함하는 영역(낮은 영역; Low)에서 가장 발현수준이 높은 것을 확인할 수 있었다.
도 5는 비구조적(unstructured) 대조표면(Control) 및 본 발명에 따른 G-Np 상에서 배양된 hESCs의 E-카데린(E-cadherin) 및 세포골격단백질 발현을 나타낸 도이다. (A)는 E-카데린의 발현을, (B)는 팔로이딘(phalloidin) 염색 결과를 나타낸 것으로 대조표면 상에서 배양된 hESCs의 확산을 가시적으로 나타내눈 한편, G-Np 상에서 배양된 hESCs는 밀집된 집락형태를 나타내었다.
도 6은 hESCs의 상피간엽전환(endothelial-mesenchymal transition; EMT)을 나타내는 도이다. (A)는 EMT 현상이 발생하면서 발현되는 비멘틴(vimentin) 단백질을 면역세포화학 분석한 결과이다. 대조표면 상에서 배양된 hESCs는 비멘틴을 과발현하였지만, G-Np 상에서 배양한 hESCs는 3개 영역 모두에서 세포군 주변에 위치한 매우 극소량의 세포들에서만 비멘틴을 발현하였다. (B)는 EMT 현상에 의해 수반되는 특정 유전자 비멘틴, N-카데린 및 피브로넥틴(fibronectin)의 발현을 qPCR을 통해 분석한 결과이다. 대조표면 상에서 배양된 hESCs는 G-Np 상의 전 영역에서 배양된 hESCs 보다 높은 수준으로 상기 단백질들을 발현하였다.
도 7은 대조표면 및 G-Np 상에서 배양된 hESCs 집락의 병소 부착(focal adhesion) 형성 및 막 돌출(membrane protrusions)을 나타낸 도이다. (A)는 인테그린 및 ECM 상호작용에 대한 병소 부착 조립(focal adhesion assembly)을 개략적으로 나타낸 도로써, 다양한 국소 부착 단백질의 도입으로 확산과정 동안 세포질의 막편평화를 유도하는 액틴 스트레스 섬유(actin stress fibers)를 고정(anchor)시킴을 나타낸다. (B)는 빈쿨린(vinculin)과 팔로이딘 염색 결과를 나타낸 도로써, 상기 빈쿨린과 팔로이딘의 현저한 발현은 병소 부착에서 액틴 스트레스 섬유의 고정(anchorage)을 나타내며, 이는 집락이 이미 대조평면 상에서 확산하고 있음을 나타낸다. G-Np 상에서 사상족(filopodia) 염색의 말단(tip)에서 빈쿨린 발현이 hESC 집락의 말단에서 특이적으로(exclusively) 관찰되었다(흰색 화살표). 낮은 영역에서 관찰되는 hESCs 집락에 다수의 사상족이 존재하는 반면, 다른 영역에서 관찰되는 집락들은 라멜리포디아(lamellipodia)와 사상족을 형성함을 나타내었다. (C)는 G-Np의 3가지 다른 영역 중 가장 큰 효과를 나타내는 것으로 확인된 낮은 영역(Low) 상에서 배양된 hESCs의 형태; 미분화 줄기세포 마커인 Oct4 및 E-Cad 발현; 및 세포 확산을 나타내는 F-액틴 및 빈쿨린 발현을 대조표면 상에서 배양한 세포의 것과 비교하여 나타낸 도이다. 이로부터 낮은 영역의 G-Np는 매우 효율적으로 hESCs의 미분화 줄기세포능을 유지할 수 있으며, 세포확산을 방지함으로써 조밀한 집락을 유지할 수 있음을 확인하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 나노구배표면( gradient nanopattern ; G- Np )의 제조
초고순도 알루미늄판(Ultrapure aluminum plates, 99.999%, Goodfellow, UK)을 과염소산용액(perchloric acid:absolute ethanol=1:4)으로 7℃에서 20V 전압을 이용하여 전기화학적으로 세척하였다. 상기 세척한 알루미늄판을 0℃에서 12시간 동안 193V 전압을 적용하여 인산용액(DI water:methanol:phosphoric acid=59:40:1)으로 양극산화처리(anodizing)하고, 크롬산용액(9 g chromic acid and 20.3 ml phosphoric acid in 500 ml DI water)으로 식각(etching)하였다. 상기 제조된 잘 정렬된 기공을 포함하는 음이온성 산화알루미늄(anodic aluminum oxide; AAO)을 다시 4시간 동안 동일한 조건으로 양극산화처리하고 장력계(tensiometer; operating speed 1.0 mm/min)를 이용하여 인산용액에 처리하되, 담금(dipping) 시간을 점진적으로 증가시키면서 강도를 조절하였다. 조절된 구배 기공을 포함하는 AAO 주형을 자기조립된 HDFS(heptadecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrodecyl trichlorosilane) 단일층으로 코팅하였다. AAO의 표면을 먼저 피라냐 용액(piranha solution; 35% H2SO4:H2O2=7:3, vol/vol)으로 수산화하고 3 mM 무수(water-free) HDFS n-헥산용액을 이용하여 표면 상에 HDFS 자기조립 단일층이 형성되도록 하였다. 나노각인장치, NANOSISTM610(Nano & Device, Korea)를 사용하여 나노미터 단위의 구배 직경을 갖는 기공을 포함하는 AAO 주형을 열각인(thermally imprinting)시켜 폴리스티렌(polystyrene; PS) 나노구배표면(G-Np)을 제조하였다. 700 mm2(35 mm×20 mm) 크기의 PS 고분자 시트를 130℃에서 10분간 가열하고 3 bar로 100초간 압축하였다. 실온으로 온도를 낮춘 후 PS 시트로부터 AAO 주형을 분리하였다.
G-Np 제조를 위하여, 인산에서 2 단계 양극산화에 의해 440 nm의 중심-중심 피치를 갖는 기공의 규칙적인 어레이를 포함하는 음이온성 산화알루미늄을 제조하였다. 30℃에서 기공 확장을 위해 인산용액에서 담금시간을 0분으로부터 350분까지 서서히 증가시킴으로써 나노미터 규격의 기공 구배를 갖는 AAO를 획득하였다(도 1A). AAO에서 기공의 직경은 담금시간이 증가함에 따라 100 nm에서 320 nm까지 선형적으로 증가하였다(도 1B 및 도 2). 등방성 식각 비율은 0.65 nm/min으로 기존에 보고된 값과 유사함을 확인하였다(도 1B). 변화하는 직경의 나노기둥을 갖는 PS 표면 패턴화는 나노기공 구배를 갖는 AAO 주형의 열 나노각인에 의해 수행되었다(도 1C). 상용되는 세포배양 접시에 가장 널리 사용되는 물질인 PS를 바닥소재로써 선택하였다. SEM 이미지로부터 개재 간격(intervening spacing)을 감소시키는 일정한 피치 길이에서 나노기둥 직경의 연속적인 구배를 확인하였다(직경 D; 120-360 nm, 간격 S; 320-80 nm, 도 1D). 또한, 기둥의 직경은 몰드의 해당 기공의 직경과 일치하였다. G-Np의 다른 영역의 간편한 식별을 위하여 나노기둥의 직경 범위에 따라 "낮은"(low, D=120-170 nm), "중간"(mid, D=170-290 nm) 및 "높은"(high, D=290-360 nm) 영역으로 구분하여 표기하였다.
실시예 2: 세포 배양
기존에 보고된 공지의 방법으로 CHA 7 hESC(차병원, 성광의료재단)를 배양하였다. 구체적으로 인간배아줄기세포(human embryonic stem cells; hESC) 집락(colonies)의 작은 응괴(clumps)를 유리 파스퇴르피펫으로 절제하여 마이토마이신-C(mytomycin-C, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)로 불활성화시킨 MEF(mouse embryonic fibroblast) 상에 옮기고, 20%(v/v) 혈청대체물(serum replacement), 100 mM β-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol), 1 mM L-글루타민(L-glutamine), 1%(v/v) 비필수아미노산(non-essential amino acid) 및 4 ng/ml bFGF(Invitrogen, Grand Island, NY)를 포함하는 DMEM/F12(Gibco BRL, Gaithersburg, MD) 배지를 사용하였다. 매일 배지를 교환하면서 6일간 세포를 배양하였다. 단일세포(single cells)로 분리(dissociation)하기 위하여 hESC를 10 μM ROCK(rho associated protein kinase) 억제제 Y-27632(Tocris, MO)를 첨가하여 36℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 hESC 집락을 36℃에서 5분 동안 디스파제(Dispase, Gibco)로 처리하였다. 분리된(lifted) hESC 집락을 PBS(Sigma-Aldrich)로 세척하고 TrypLETM-select(Invitrogen)와 함께 실온에서 3분간 인큐베이션하였다. 부드럽게 파이펫팅하여 응괴를 물리적으로 분리시키고 900 rpm에서 2분간 원심분리하였다. 펠렛을 hESC 배양 배지에 재현탁시키고 마개에 세포여과기를 포함하는 5 ml 폴리스티렌 둥근-바닥 튜브(polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap, BD Falcon)에 여과하여 남아있는 세포 응집을 제거하였다. 혈구계(hemocytometer)를 이용하여 세포를 계수하고 10 ng/ml bFGF와 10 μM Y-27632를 함유하는 hESC 배지를 포함하는 비구조적 대조표면(unstructured control surface)과 상기 실시예 1에서 제조한 G-Np 상에 5,000 세포/cm2 농도로 분주하였다. 단일 hESC의 부착을 돕기 위하여 세포를 분주하기 전에 대조표면 및 G-Np를 0.1% 젤라틴(gelatin; Invitrogen)으로 실온에서 20분간 처리하여 코팅하였다. 상기 hESC의 배양은 매일 배지를 교환하면서 4 내지 5일간 유지하여 수행하였다.
증가하는 직경의 나노기둥 어레이가 hESC 집락 형성에 영향을 미치는지 확인하기 위하여, 먼저 G-Np를 0.1% 젤라틴으로 코팅하였다. SEM을 이용하여 젤라틴이 돌출된 나노기둥 형상을 가리지 않고 패턴에 걸쳐 균일하게 코팅된 것을 확인하였다(도 3). 이후 hESC 집락을 효소를 이용하여 단일세포로 분리하고 비구조적 대조표면 상에서 배양되는 세포의 성장 특성과 비교하기 위하여 G-Np 상에서 4일간 배양하였다. 대조표면에서, 플레이팅하고 1일이 지난 후 대부분의 부착성 단일 hESC는 납작해지고 길어져서 섬유아세포-유사 형태를 나타내었다(도 4A). 이후 세포는 집락을 형성하는 대신에 세포분열 하면서 이웃한 세포를 향해 이동하였고, 딸세포는 등방성 방식으로 서로로부터 확산되어나가면서 플레이팅 이후 4일째까지 세포의 넓게 확산된 단일층을 형성하였다(도 4A). 이와는 대조적으로, G-Np 상에 플레이트한 단일 hESC는 세포질의 최소 확장을 포함하는 조밀한 구형 형태를 나타내었다(도 4B). 이후 부착성 단일 hESC는 이웃 세포를 향해 이동하면서 응집을 형성하였으며, 세포분열을 시작하면서 개별 집락을 형성하였다(도 4B). 집락은 집락 내에서 세포 확산에 대한 어떠한 징후 없이 계속하여 증식하였다(도 4B). 플레이팅하고 4일 후 집락은 조밀하였으며 잘 구분된 경계를 나타내었으며, 이는 전분화능 hESC 집락의 형태적 판단기준으로 이용할 수 있다(도 4B).
실시예 3: SEM 이미징
G-Np 상에 3일간 배양한 hESC 집락을 PBS로 2회 세척하고 실온에서 4시간 동안 4% 파라-포름알데하이드(para-formaldehyde)로 처리하여 전고정하였다. 전고정된 hESC 집락을 1% 오스뮴 사산화물(Osmium tetroxide)로 2시간 동안 후고정하고 에탄올을 50%로부터 100%까지 농도를 변화시키면서 교환하여 탈수시켰다. 탈수된 hESC 집락을 t-부탄올로 3회 세척하고 -20℃에서 동결시킨 후 1일간 동결건조하였다. 완전히 동결건조된 hESC 집락을 5분간 백금으로 코팅하고 SEM(주사 전자 현미경; scanning electron microscopy, FE-SEM, JSM6701, JEOL, Japan)으로 관찰하였다. 모든 이미지는 40° 기울기로 획득하였다.
본 발명자들은 hESC 집락 주변에서 풍부한 사상족 병소 복합체는 낮은 영역(D=120-170 nm)에서 특정 나노기둥 직경 범위가 사상족 및 라멜리포디아의 신장에 대한 불리한 나노지형을 제공하기 때문이라는 가설을 제시하였다. 상기 가설을 검증하기 위하여, 본 발명자들은 G-Np 상에서 배양한 hESC에서 사상족 및 라멜리포디아의 형성을 SEM으로 분석하였다. 낮은 영역(D=120-170 nm)에서 hESC 집락은 사상족의 fine peripheral outgrowth 및 라멜리포디아의 제한된 돌출을 갖는 구형을 나타내었다. 중간(D=170-290 nm) 및 높은(D=290-360 nm) 영역에서 발견되는 집락들도 집락 중심에서 구형을 유지하지만 집락 주변에서 작은 사상족 증식(little filopodia outgrowth)을 포함하는 편평하고 넓은 라멜리포디아의 돌출은 집락이 확산되었음을 나타낸다. 막돌출구조가 나노기둥 어레이 상부에서 특이적으로 관찰되었으며, 이는 나노기둥이 사상족 병소 복합체 및 라멜리포디아 돌출에 대한 부착 영역(area)임을 나타낸다. 이로부터 직경이 120 내지 170 nm 범위에 있는 나노기둥 어레이는 병소 복합체 클러스터링에 대한 불충분한 영역을 제공하며 따라서 조밀한 집락 완전성을 유지하도록 hESC 라멜리포디아 돌출이 제한될 수 있다.
실시예 4: 면역세포화학분석( Immunocytochemistry assay )
대조표면 및 G-Np 상에서 4일간 배양한 세포를 PBS로 세척하고 실온에서 20분간 4% 파라포름알데하이드로 처리하여 고정하였다. 이후 시료를 투과화(permeablizing; 0.03% Triton-X in PBS for 10 minutes) 및 차단 용액(5% goat serum in permeablizing solution for 30 minutes)으로 실온에서 차례로 처리하였다. 상기 세포를 전분화능 마커인 Oct4(Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, 1:1000) 및 E-카데린(E-cadherin; BD, 1:200), 액틴 세포골격 마커인 ㅍ팔로이딘(palloidin; Invitrogen, 1:400) 및 국소 부착 마커인 빈쿨린(vinculin; Sigma-aldrich, 1:100)에 대한 일차항체를 포함하는 차단용액에 4℃에서 밤새도록 인큐베이션하였다. 상기 일차항체와 반응시킨 세포를 PBS로 3회 세척하고 알렉사 플루오르(Alexa Flour) 488- 또는 594-결합 이차항체(이상, Invitrogen)와 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하고 PBS로 5분씩 3회 세척하였다. 실온에서 3분간 PBS에 녹인 DAPI(6-diamidino-2-phenylindole, Sigma, 1:1000)로 대조염색시킨 후 형광현미경(Nikon TE2000-U, Nikon, Chiyoda-ku, Japan)을 사용하여 형광이미지를 얻었다.
hESC 확산이 본질적으로 전분화능 유지에 관여하는지를 확인하기 위하여 본 발명자들은 잘 알려진 전분화능 마커인 Oct4에 대한 항체를 이용한 면역세포화학분석을 수행하였다. 대조표면은 단일 hESC의 등방성 확산을 유도할 뿐만 아니라 Oct4 발현을 현저하게 감소시켰다(~58%). 반면, G-Np 상에 잘 정의된 집락으로 조직화된 hESC는 훨씬 더 높은 비율로 Oct4, E-카데린 및 다른 전분화능 마커를 발현하였다(도 4C 내지 4E 및 도 5A). Oct4 발현 수준은 G-Np의 다른 영역에서 관찰되는 hESC 집락 간에 현저한 차이를 나타내었다. G-Np의 낮은 영역(D=120-170 nm)에서 관찰되는 집락은 가장 높은 수준(94%)으로 Oct4를 발현하였으며, 그 뒤로 높은 영역(85%, D=290-360 nm) 및 중간 영역(81%, D=170-290 nm)의 차례로 발현이 다소 감소하였다(p≤0.05, 도 4). 이로부터 1) G-Np가 단일 hESC를 잘 조직화된 조밀한 집락으로 체계화하는 나노지형적 해법을 제공하고, 2) 조밀한 집락 완전성의 붕괴는 지지세포 유리 조건에서 hESC 전분화능에 유해하며, 3) 특정 나노기둥 직경 범위(D=120-170 nm)가 Oct4 발현을 위한 최적의 나노지형임을 확인하였다.
낮은 영역(D=120-170 nm)에서 관찰되는 hESC 집락이 또한 다른 영역에서 관찰되는 것들 것 비교하여 더 높은 Oct4 발현 수준을 나타낸다는 사실은 집락 내에서 단단한 세포 연계(tight cellular association)와 hESC 전분화능 유지가 밀접한 관계가 있음을 강조한다. hESC 집락 내에서 단단한 세포-세포 부착은 카데린 수퍼패밀리 중 E-카데린에 의해 매개되며, 이의 발현은 hESC 생존 및 전분화능 유지와 밀접하게 관련된다. 본 발명자들은 G-Np 상에서 관찰되는 집락 내의 세포-세포 경계에서 E-카데린의 강한 발현을 확인하였으며, 상기 E-카데린은 팔로이딘 염색과 중첩되었다(도 5). 이는 E-카데린의 부착성이 알파- 및 베타-카테닌을 통한 액틴 세포골격 결합에 의해 매개됨을 나타낸다. 반면, 세포 결합을 매개하는 E-카데린은 대조표면 상에서 배양된 단일 hESC가 서로로부터 확산되어갈 때, 현저히 감소하였다. 이는 세포 경계에서 E-카데린 발현 패치에 의해 확인되었다(도 5A). 또한 팔로이딘 염색으로부터 분리된 E-카데린 발현은 hESC가 확산되는 동안 액틴 세포골격 재조직화가 E-카데린과 액틴 세포골격 간의 결합을 파괴하여 E-카데린에 의해 매개되는 세포간 부착을 제거함을 나타낸다(도 5B). 도 4에 나타난 바와 같이, 1) hESC 확산은 물리적 민감성(mechanosensitive)을 가지며 나노기둥 직경의 함수로 증가하고, 2) 나노기둥 직경의 특정 범위(D=120-170 nm)는 조밀한 집락 완전성을 유지함으로써 hESC 전분화능을 가장 효과적으로 지지하며, 3) G-Np 상에서 제한된 hESC 확산은 hESC 전분화능에 필수적인 단단한 세포 결합을 매개하는 E-카데린을 지지함을 확인하였다.
다음으로, 본 발명자들은 hESC가 집락을 형성하는 동안 증가된 나노기둥 직경에 어떻게 반응하는지 확인하였다. 부착성 세포의 위상감지(topological sensing)는 사상족 말단에서 표면 막 인테그린(surface membrane integrin)을 통해 성취된다. 먼저, 고정의존적 세포(anchorage-dependent cell)는 국부적 위상을 감지하기 위하여 사상족을 돌출시키고 라멜리포디아 신장을 유도하는 신생접촉부착(nascent contact adhesion)(병소 복합체; focal complexs)을 형성하였다. 클러스터링과 병소 복합체 밀도 증가는 보다 안정한 부착부위(병소 부착; focal adhesion)를 형성하고 상기 부착부위에 액틴 스트레스 섬유(액틴 필라멘트 다발)가 고정되어 세포/표면 경계 면적을 최대화하여 추가적인 막 편평화를 유발한다(도 7A). 세포가 확산되는 동안 병소 부착 조립 및 액틴 세포골격 조직화는 기본 기질 표면의 지형에 의해 크게 영향을 받는다. 나노규격의 구조 간의 간격이 70 nm를 초과하는 경우 섬유아세포의 확산이 제한되는 한편 측면 간격이 100 nm인 나노튜브에서는 표면막 돌출구조(예컨대, 사상족 및 라멜리포디아)의 형성을 저해함으로써 세포확산을 제한하는 것으로 알려져 있다. hESC 집락 형성과정 동안 나노지형이 병소 부착 조립 및 액틴 세포골격 조직화에 어떻게 영향을 미치는지 확인하기 위하여 효소적으로 분리한 hESC를 비구조적 대조표면과 G-Np 상에 4일간 배양하였다. 면역세포화학분석을 통해 대조표면 상에서 팔로이딘 양성 액틴 세포골격의 말단에서 점상(punctate) 빈쿨린 발현에 의해 나타난 바와 같이 배양된 hESC는 확산하는 hESC의 말단에서 안정한 병소 부착을 형성하였다(도 7B, 흰색 점선 원). 팔로이딘의 현저한 염색은 병소 부착에 고정되어 막 확산을 유도하는 액틴 세포골격의 액틴 스트레스 섬유로의 조직화를 나타낸다. 이는 대조표면 상의 개별 hESC가 조밀한 집락으로 조직화하는 대신 확산됨을 나타내었다. hESC를 G-Np 상에서 배양할 경우 병소 부착 조립 및 액틴 세포골격 조직화의 상당한 변화가 관찰되었다(도 7B). 세포가 서로 조밀하게 연결된 경우 집락 내에서 점상 빈쿨린 발현은 관찰되지 않았다(도 4B). 이는 G-Np 상에서 관찰되는 제한된 hESC 집락 확산을 설명할 수 있다. hESC 집락 주변에서의 빈쿨린 발현은 사상족 말단에서 나타났으며, 이는 안정한 병소 부착 대신에 신생 병소 복합체 (nascent focal complexs)의 형성을 제시한다(도 7B, 흰색 화살표). G-Np의 다른 영역과 비교하여 낮은 영역 (D=120-170 nm)에서 배양된 hESC 집락의 주변에서 보다 많은 사상족 병소 복합체가 관찰되었다(도 7B, 흰색 화살표).
실시예 5: 정량분석( Quantitative analysis )
대조표면 및 G-Np 상의 3개 다른 영역으로부터 10개의 대표적인 팔로이딘-표지(phalloidin-labeled) 집락을 임의로 선택하여 hESC 집락의 확산정도를 분석하였다. ImageJ 소프트웨어(http://rsb.info.nih.gov/ij/)를 사용하여 집락의 중심으로부터 각 세포의 핵 거리를 측정하였다. 동일한 소프트웨어를 사용하여 상기 대조 및 G-Np로부터 임의로 선택된 10개의 대표적인 집락을 분석한 위치에서 Oct4의 발현 백분율을 측정하였다. 데이터는 평균±평균의 표준오차(standard error of the mean; S.E.M.)으로 표현하였으며, SPSS 소프트웨어(SPSS Inc., Chicage, IL)를 사용하여 변이의 일방분석(one-way analysis of variance, ANOVA)을 수행한 후, p≤0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
G-Np는 확산을 제한함으로써 단일 hESC를 조밀한 집락으로 조직화하므로, 본 발명자들은 집락 형성과정에서 hESC 확산에 대한 다양한(varing) 나노기둥 직경의 영향을 추가적으로 분석하였다. 세포골격 마커인 팔로이딘을 이용한 면역세포화학으로 대조표면 상에서 확산에 의해 비대해진 개별 hESC 및 제한된 확산을 나타내는 3가지 다른 G-Np 영역에서 hESC를 가시화하였다(도 5B). hESC의 확산 정도를 정량하기 위하여, 집락의 중심으로부터 각 세포 핵의 평균거리를 측정하였다. 대조표면 상에서 단일 hESC는 ~200 nm 확산하여 넓게 확산된 세포 단일층을 형성하였다(도 6B). 이와 대조적으로, G-Np 상에 배양한 hESC는 현저히 덜 확산하며, 특히 G-Np의 낮은 영역에서 관찰되는 집락들은 다른 영역에서 관찰되는 것들과 비교하여 가장 조밀한 집락을 나타내었다(도 5B).
실시예 6: 실시간 비디오 이미징( live video imaging )
대조표면 및 G-Np 상에서 배양하는 hESC의 성장을 2일간 2분 간격으로 시간경과 이미지를 촬영하여 기록하였다. 현미경 관찰을 위한 Tokai Hit 인큐베이션 시스템(Tokai Hit Co., Ltd., Shizuoka-ken, Japan)에 배양접시를 위치시키고 Nikon ECLIPSE TS 100 현미경을 이용하여 이미지를 촬영하였다.

Claims (12)

  1. 직경(Diameter) 또는 간격(Spacing)이 일정하게 변화하는 구배 나노기둥 어레이를 포함하는 세포배양용기에 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 지지세포 없이 줄기세포능(stemness)을 유지하면서 배아줄기세포를 배양할 수 있는 표면구조를 스크리닝하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 직경 또는 간격이 일정하게 변화하는 구배 나노기둥 어레이의 각기 다른 직경 및 간격의 나노기둥을 포함하는 영역에서 채취한 배양된 배아줄기세포의 특성을 분석하는 단계를 추가로 포함하는 것인 스크리닝 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 배양된 배아줄기세포의 특성을 분석하는 단계는 전분화능 마커의 발현을 측정함으로써 수행되는 것인 스크리닝 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 전분화능 마커는 Oct4인 것인 스크리닝 방법.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 배양된 배아줄기세포의 특성을 분석하는 단계는 세포부착성 마커, 세포골격 마커 또는 병소부착 마커의 발현을 추가로 측정함으로써 수행되는 것인 스크리닝 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 세포부착성 마커는 E-카데린(E-cadherin), 세포골격 마커는 팔로이딘(phalloidin) 및 병소부착 마커는 빈쿨린(vinculin)인 것인 스크리닝 방법.
  7. 삭제
  8. 일정하게 증가하는 직경을 갖는 나노기둥이 일정하게 감소하는 간격으로 균일하게 배열된 나노기둥을 포함하는, 지지세포 없이 줄기세포능(stemness)을 유지하면서 배아줄기세포를 배양할 수 있는 표면구조 스크리닝용 세포배양용기.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 나노기둥은 100 nm 내지 400 nm의 직경을 가지며 350 nm 내지 50nm의 간격으로 배열된 것인 세포배양용기.
  10. 120 nm 내지 170 nm의 직경을 갖는 나노기둥이 320 nm 내지 250 nm 간격으로 균일하게 배열된 나노기둥을 포함하는, 줄기세포능 유지를 위한 배아줄기세포 배양용기.
  11. 120 nm 내지 170 nm의 직경을 갖는 나노기둥이 320 nm 내지 250 nm 간격으로 균일하게 배열된 나노기둥을 포함하는 세포배양용기에 지지세포 없이 세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포능(stemness)을 유지하면서 배아줄기세포를 배양하는 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 배아줄기세포는 90%를 초과하는 수준으로 Oct4 발현율이 유지되는 것인 방법.
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017204518A2 (ko) * 2016-05-25 2017-11-30 동국대학교 산학협력단 나노지형을 이용한 유도만능줄기세포 배양 플레이트 및 이를 이용한 배양 방법
KR101838728B1 (ko) * 2016-08-23 2018-03-15 고려대학교 산학협력단 나노패턴을 이용한 줄기세포의 심근세포로의 분화방법
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KR102155868B1 (ko) 2018-11-06 2020-09-15 건국대학교 글로컬산학협력단 3차원 세포 형성용 미세유체칩 이용 방법
CN110684727B (zh) * 2019-10-12 2022-08-19 山东大学 一种氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底及其制备方法与应用
KR102663922B1 (ko) * 2021-10-26 2024-05-08 한국과학기술원 마이크로-나노 스케일의 계층적 패턴 기반 세포 배양 및 성숙 유도 기판

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20100039944A (ko) * 2008-10-09 2010-04-19 서울대학교산학협력단 줄기세포 증식용 나노패턴과 이를 이용하여 줄기세포의 증식을 증대시키는 방법
KR20110046397A (ko) * 2008-05-27 2011-05-04 오르후스 우니베르시테트 포유동물 줄기 세포 성장 및 분화를 위한 생체적합성 물질

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20100113461A (ko) * 2009-04-13 2010-10-21 서울대학교산학협력단 나노구조와 표면 패터닝을 이용한 줄기 세포의 모양, 생장, 극성 또는 분화를 조절하는 방법
KR101264243B1 (ko) * 2011-04-15 2013-05-22 주식회사 서린바이오사이언스 미분화능이 우수한 배아줄기세포의 배양방법 및 이를 위한 배아줄기세포 배양기

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20110046397A (ko) * 2008-05-27 2011-05-04 오르후스 우니베르시테트 포유동물 줄기 세포 성장 및 분화를 위한 생체적합성 물질
KR20100039944A (ko) * 2008-10-09 2010-04-19 서울대학교산학협력단 줄기세포 증식용 나노패턴과 이를 이용하여 줄기세포의 증식을 증대시키는 방법

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