CN110732038A

CN110732038A - 一种丝素蛋白纤维中空神经导管及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN110732038A
Application number: CN201911066992.7A
Authority: CN
Inventors: 魏亮; 孙润军; 刘呈坤; 张昭环; 毛雪; 董洁
Original assignee: Xian Polytechnic University
Current assignee: Xian Polytechnic University
Priority date: 2019-11-04
Filing date: 2019-11-04
Publication date: 2020-01-31
Anticipated expiration: 2039-11-04
Also published as: CN110732038B

Abstract

本发明公开的一种丝素蛋白纤维中空神经导管及其制备方法和应用，属于生物医用材料技术领域。采用天然的丝素蛋白丝作为原料，具有良好的生物相容性和生物可降解性。利用聚二氧环己酮/甲酸溶液对丝素蛋白纤维进行溶胀制备出的中空神经导管具有良好的压缩回弹性。原料价格低廉，来源广泛，操作方法简便，工艺流程短，能够快速方便的制备不同尺寸要求的中空神经导管，能够批量生产。制得的丝素蛋白纤维中空神经导管具有非常好的力学性能和压缩回弹性能，不易造成支架材料的坍塌，可以保证神经细胞的正常生长。支架材料孔隙率高且有较多的连通孔道，神经细胞能够在神经导管材料上粘附、增殖、迁移和生长，能够促进损伤神经的再生修复。

Description

一种丝素蛋白纤维中空神经导管及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种丝素蛋白纤维中空神经导管及其制备方法和应用。

背景技术

交通事故、自然灾害及各种意外伤害通常会导致人体的周围神经受到损伤，这会严重影响到患者的运动和感知神经系统，给患者带来极大的痛苦，降低了他们的生活质量。根据患者受到外伤程度可以将周围神经损伤分为小段神经损伤和长段神经损伤。周围神经系统本身具有再生和自修复的功能，因此小段神经损伤自动修复，无需进行人工手术。但是对于长段神经损伤由于近端和远端距离较长，周围神经系统无法自动修复，同时损伤神经截面的神经胶质和神经周围的结缔组织也会阻碍神经的生长，最终会导致患者运动和感知功能的丧失。因此，如何进行长段损伤神经的再生修复仍是目前临床上的医学难题之一。

目前进行长段损伤神经再生修复的主要方法有自体移植、异体移植和人工神经支架材料三种。自体移植被认为是神经损伤治疗的黄金标准，但是存在供体神经损伤、供体部位功能丧失、二次手术和供体神经来源有限等问题；采用异体移植方法修复损伤神经后存在机体免疫排斥反应的问题，需要服用大量药物来减小再生修复神经的免疫反应，这会给患者造成极大经济负担；与前两种方法相比，人工神经支架材料是长段神经损伤再生修复的理想方法。人工神经支架材料主要是将设计的神经导管桥接在长段损伤神经的近端和远端，神经细胞能够在支架材料上粘附、增殖并迁移生长，再生的神经会将长段损伤神经的近端和远端搭接起来，实现损伤神经的再生修复，与此同时，神经导管支架材料逐渐降解，神经细胞逐渐迁移生长完成整个修复过程，最终实现患者运动和感知功能的恢复。但是，目前的神经导管支架材料存在力学性能和压缩回弹性能差、孔隙率低细胞难以生长和制备工艺复杂等问题。

发明内容

为了解决上述现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种丝素蛋白纤维中空神经导管及其制备方法和应用，原料易得、制备方法简单，能够得到一种非常理想的生物医用支架材料。

本发明是通过以下技术方案来实现：

本发明公开了丝素蛋白纤维中空神经导管的制备方法，分为以下步骤：

步骤1：将脱胶后的蚕丝晾干，得到脱胶后干燥的丝素蛋白纤维待用；

步骤2：以质量份数计，称取0.1～1份的聚对二氧环己酮加入到1～20份的体积浓度为98％的甲酸溶液中，搅拌至聚二氧环己酮完全溶解，得到聚二氧环己酮/甲酸溶液；

步骤3：以质量份数计，将0.5～5份丝素蛋白纤维加入到1.1～21份聚二氧环己酮/甲酸溶液中，搅拌，得到凝胶状的丝素蛋白纤维溶胀物；

步骤4：将丝素蛋白纤维溶胀物放入模具中进行冷冻、冷冻干燥，去除模具后洗涤，得到丝素蛋白纤维中空神经导管。

优选地，步骤1的具体步骤为：

1.1将去除蚕蛹后的蚕茧剪碎待用；

1.2以质量份数计，将0.5～2份去离子水加热至沸腾，将1～10份剪碎的蚕茧投入沸腾的去离子水中，搅拌；搅拌过程中加入0.1～10份碳酸钠，煮练10～60min，得到脱胶后的丝素蛋白纤维；

1.3将丝素蛋白纤维取出并挤出水分，以质量份数计，使用1～3份去离子水洗涤1～5次；

1.4挤出丝素蛋白纤维中的水分，分散平铺自然晾干，得到脱胶后干燥的丝素蛋白纤维。

优选地，步骤2中，搅拌的速度为100～1000r/min，搅拌的时间为1～5h。

优选地，步骤3中，搅拌的速度为600～800r/min，搅拌的时间为1～5h。

优选地，步骤4中，冷冻的温度为-80℃～-60℃，冷冻的时间为24～72h。

优选地，步骤4中，冷冻干燥的温度为-50℃～-70℃，冷冻干燥的时间为24～72h。

优选地，步骤4中，洗涤是在磷酸盐缓冲溶液中洗涤1～5次，每次持续10～60min。

本发明公开了采用上述丝素蛋白纤维中空神经导管的制备方法所制备的丝素蛋白纤维中空神经导管。

优选地，丝素蛋白纤维中空神经导管由直径为1～2μm的纤维组成，孔隙率为70％，孔径为20μm，压缩回弹率大于95％。

本发明公开了上述丝素蛋白纤维中空神经导管作为神经导管的应用。

本发明还公开了采用上述丝素蛋白纤维中空神经导管的制备方法所制备的丝素蛋白纤维中空神经导管。

本发明还公开了上述丝素蛋白纤维中空神经导管作为神经导管的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明公开的一种丝素蛋白纤维中空神经导管的制备方法，采用天然的丝素蛋白丝作为原料，具有良好的生物相容性和生物可降解性。利用聚二氧环己酮/甲酸溶液对丝素蛋白纤维进行溶胀制备出的中空神经导管具有良好的压缩回弹性。原料价格低廉，来源广泛，操作方法简便，工艺流程短，能够快速方便的制备不同尺寸要求的中空神经导管，能够批量生产。

本发明公开的采用上述制备方法制得的丝素蛋白纤维中空神经导管，由直径为1～2μm的纤维构成了三维多孔立体结构，孔隙率为70％，孔径为20μm，能够为细胞的粘附增长及组织的再生提供空间，并且有利于营养物质的输送；压缩回弹率大于95％，力学性能好，不易变形，能够提供可靠的支撑。

本发明公开的采用上述制备方法制得的丝素蛋白纤维中空神经导管作为神经导管的应用，采用天然的蚕丝作为原料，生物相容性好，可生物降解，非常适合细胞的粘附生长；另外神经导管支架材料具有非常好的力学性能和压缩回弹性能，在植入体内不易造成支架材料的坍塌，可以保证神经细胞在支架上的正常生长。支架材料孔隙率高且有较多的连通孔道，神经细胞能够在神经导管材料上粘附、增殖、迁移和生长，能够促进损伤神经的再生修复，是一种非常理想的生物医用支架材料。

附图说明

图1为本发明制备得到的丝素蛋白纤维中空神经导管的实物图；

图2为本发明制备得到的丝素蛋白纤维中空神经导管横截面的扫描电镜照片；

图3为本发明制备得到的丝素蛋白纤维中空神经导管剖面的扫描电镜照片；

图4为施旺细胞在本发明制备得到的丝素蛋白纤维中空神经导管上生长增殖示意图；

图5为本发明制备丝素蛋白纤维中空神经导管的模具示意图；

图6为用模具制备丝素蛋白纤维中空神经导管的示意图。

其中，1为模具外壳，2为芯柱，3为固定孔，4为气孔，5为堵板，6为丝素蛋白纤维溶胀物。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细描述，涉及份数的均以质量份数计，所作是对本发明的解释而不是限定：

实施例1：

步骤1：蚕茧采用家蚕蚕茧，将家蚕蚕茧去除，用剪刀将蚕茧剪碎，称取剪碎的蚕茧1份备用；用量筒量取去离子水0.5份加入不锈钢铁锅内，置于微波炉上加热直到去离子水沸腾；将剪碎蚕茧1份投入到沸腾的去离子水中并用玻璃棒不断搅拌，称取碳酸钠0.1份加入到不锈钢锅内，煮练蚕茧10min去除丝胶；用玻璃棒捞出丝素蛋白纤维挤出多余水分，使用1份去离子水洗涤丝素蛋白纤维1次以去除蚕丝纤维中多余的碳酸钠；挤干丝素蛋白纤维中多余的水分，用手把丝素蛋白纤维撕开使之松散平铺在铝箔上，然后放置在通风橱中1天，使丝素蛋白纤维自然晾干，所得到脱胶后丝素蛋白纤维为0.5份；

步骤2：称取0.1份聚二氧环己酮加入到1份98％甲酸溶液中，置于磁力搅拌器上搅拌直到聚二氧环己酮颗粒完全溶解，搅拌速度是100r/min，搅拌时间是1h，最后可得到聚二氧环己酮/甲酸溶液1.1份；

步骤3：称取脱胶后干燥丝素蛋白纤维0.5份加入到1.1份聚二氧环己酮/甲酸溶液中，用玻璃棒快速搅拌使之成为凝胶状的丝素蛋白纤维溶胀物；

步骤4：将0.1份丝素蛋白纤维溶胀物装入模具中，放置在零下60℃的冰箱中冷冻24h，冷冻好之后再放在冻干机上于零下50℃下干燥24h；将冻干好的丝素蛋白纤维管状材料浸泡在pH＝7的磷酸盐缓冲溶液中1h，移除模具，再将丝素蛋白纤维管状材料放置在磷酸盐缓冲水溶液中持续洗涤10min，干燥后得到丝素蛋白纤维中空神经导管。

实施例2：

步骤1：蚕茧采用家蚕蚕茧，将家蚕蚕茧去除，用剪刀将蚕茧剪碎，称取剪碎的蚕茧5份备用；用量筒量取去离子水1份加入不锈钢铁锅内，置于微波炉上加热直到去离子水沸腾；将剪碎蚕茧5份投入到沸腾的去离子水中并用玻璃棒不断搅拌，称取碳酸钠5份加入到不锈钢锅内，煮练蚕茧30min去除丝胶；用玻璃棒捞出丝素蛋白纤维挤出多余水分，使用2份去离子水洗涤丝素蛋白纤维3次以去除蚕丝纤维中多余的碳酸钠；挤干丝素蛋白纤维中多余的水分，用手把丝素蛋白纤维撕开使之松散平铺在铝箔上，然后放置在通风橱中2天，使丝素蛋白纤维自然晾干，所得到脱胶后丝素蛋白纤维为3份；

步骤2：称取0.5份聚二氧环己酮加入到10份98％甲酸溶液中，置于磁力搅拌器上搅拌直到聚二氧环己酮颗粒完全溶解，搅拌速度是500r/min，搅拌时间是3h，最后可得到聚二氧环己酮/甲酸溶液10份；

步骤3：称取脱胶后干燥丝素蛋白纤维3份加入到10份聚二氧环己酮/甲酸溶液中，用玻璃棒快速搅拌使之成为凝胶状的丝素蛋白纤维溶胀物；

步骤4：将5份丝素蛋白纤维溶胀物装入模具中，放置在零下70℃的冰箱中冷冻48h，冷冻好之后再放在冻干机上于零下70℃下干燥48h；将冻干好的丝素蛋白纤维管状材料浸泡在pH＝7的磷酸盐缓冲溶液中2.5h，移除模具，再将丝素蛋白纤维管状材料放置在磷酸盐缓冲水溶液中洗涤3次，每次持续30min，干燥后得到丝素蛋白纤维中空神经导管。

实施例3：

步骤1：蚕茧采用家蚕蚕茧，将家蚕蚕茧去除，用剪刀将蚕茧剪碎，称取剪碎的蚕茧10份备用；用量筒量取去离子水2份加入不锈钢铁锅内，置于微波炉上加热直到去离子水沸腾；将剪碎蚕茧10份投入到沸腾的去离子水中并用玻璃棒不断搅拌，称取碳酸钠10份加入到不锈钢锅内，煮练蚕茧60min去除丝胶；用玻璃棒捞出丝素蛋白纤维挤出多余水分，使用3份去离子水洗涤丝素蛋白纤维3次以去除蚕丝纤维中多余的碳酸钠；挤干丝素蛋白纤维中多余的水分，用手把丝素蛋白纤维撕开使之松散平铺在铝箔上，然后放置在通风橱中3天，使丝素蛋白纤维自然晾干，所得到脱胶后丝素蛋白纤维为5份；

步骤2：称取1份聚二氧环己酮加入到20份98％甲酸溶液中，置于磁力搅拌器上搅拌直到聚二氧环己酮颗粒完全溶解，搅拌速度是1000r/min，搅拌时间是5h，最后可得到聚二氧环己酮/甲酸溶液21份；

步骤3：称取脱胶后干燥丝素蛋白纤维5份加入到21份聚二氧环己酮/甲酸溶液中，用玻璃棒快速搅拌使之成为凝胶状的丝素蛋白纤维溶胀物；

步骤4：将10份丝素蛋白纤维溶胀物装入模具中，放置在零下80℃的冰箱中冷冻72h，冷冻好之后再放在冻干机上于零下60℃下干燥72h；将冻干好的丝素蛋白纤维管状材料浸泡在pH＝7的磷酸盐缓冲溶液中5h，移除模具，再将丝素蛋白纤维管状材料放置在磷酸盐缓冲水溶液中洗涤5次，每次持续60min，干燥后得到丝素蛋白纤维中空神经导管。

实施例4：

步骤1：蚕茧采用家蚕蚕茧，将家蚕蚕茧去除，用剪刀将蚕茧剪碎，称取剪碎的蚕茧2份备用；用量筒量取去离子水0.6份加入不锈钢铁锅内，置于微波炉上加热直到去离子水沸腾；将剪碎蚕茧2份投入到沸腾的去离子水中并用玻璃棒不断搅拌，称取碳酸钠3份加入到不锈钢锅内，煮练蚕茧60min去除丝胶；用玻璃棒捞出丝素蛋白纤维挤出多余水分，使用1.5份去离子水洗涤丝素蛋白纤维3次以去除蚕丝纤维中多余的碳酸钠；挤干丝素蛋白纤维中多余的水分，用手把丝素蛋白纤维撕开使之松散平铺在铝箔上，然后放置在通风橱中3天，使丝素蛋白纤维自然晾干，所得到脱胶后丝素蛋白纤维为2份；

步骤2：称取0.3份聚二氧环己酮加入到5份98％甲酸溶液中，置于磁力搅拌器上搅拌直到聚二氧环己酮颗粒完全溶解，搅拌速度是1000r/min，搅拌时间是5h，最后可得到聚二氧环己酮/甲酸溶液5份；

步骤3：称取脱胶后干燥丝素蛋白纤维2份加入到5份聚二氧环己酮/甲酸溶液中，用玻璃棒快速搅拌使之成为凝胶状的丝素蛋白纤维溶胀物；

步骤4：将2.5份丝素蛋白纤维溶胀物装入模具中，放置在零下80℃的冰箱中冷冻72h，冷冻好之后再放在冻干机上于零下60℃下干燥72h；将冻干好的丝素蛋白纤维管状材料浸泡在pH＝7的磷酸盐缓冲溶液中5h，移除模具，再将丝素蛋白纤维管状材料放置在磷酸盐缓冲水溶液中洗涤5次，每次持续60min，干燥后得到丝素蛋白纤维中空神经导管。

实施例5：

步骤1：蚕茧采用家蚕蚕茧，将家蚕蚕茧去除，用剪刀将蚕茧剪碎，称取剪碎的蚕茧8份备用；用量筒量取去离子水1.6份加入不锈钢铁锅内，置于微波炉上加热直到去离子水沸腾；将剪碎蚕茧8份投入到沸腾的去离子水中并用玻璃棒不断搅拌，称取碳酸钠7.5份加入到不锈钢锅内，煮练蚕茧60min去除丝胶；用玻璃棒捞出丝素蛋白纤维挤出多余水分，使用2.5份去离子水洗涤丝素蛋白纤维3次以去除蚕丝纤维中多余的碳酸钠；挤干丝素蛋白纤维中多余的水分，用手把丝素蛋白纤维撕开使之松散平铺在铝箔上，然后放置在通风橱中3天，使丝素蛋白纤维自然晾干，所得到脱胶后丝素蛋白纤维为4份；

步骤2：称取0.75份聚二氧环己酮加入到15份98％甲酸溶液中，置于磁力搅拌器上搅拌直到聚二氧环己酮颗粒完全溶解，搅拌速度是1000r/min，搅拌时间是4h，最后可得到聚二氧环己酮/甲酸溶液15份；

步骤3：称取脱胶后干燥丝素蛋白纤维4份加入到15份聚二氧环己酮/甲酸溶液中，用玻璃棒快速搅拌使之成为凝胶状的丝素蛋白纤维溶胀物；

步骤4：将7.5份丝素蛋白纤维溶胀物装入模具中，放置在零下80℃的冰箱中冷冻72h，冷冻好之后再放在冻干机上于零下60℃下干燥72h；将冻干好的丝素蛋白纤维管状材料浸泡在pH＝7的磷酸盐缓冲溶液中5h，移除模具，再将丝素蛋白纤维管状材料放置在磷酸盐缓冲水溶液中洗涤5次，每次持续60min，干燥后得到丝素蛋白纤维中空神经导管。

如图5为本发明制备丝素蛋白纤维中空神经导管的模具示意图，包括模具外壳1、芯柱2、固定孔3、气孔4和堵板5，芯柱2通过模具外壳1上的固定孔3固定在模具内腔的中心，模具外壳1上开有气孔4，模具外壳1一端为堵板5，如图6，用于将丝素蛋白纤维溶胀物6封堵在模具外壳1内。

下面以一个具体的模具构成为例对模具进行进一步地解释：

采用医用注射器作为模具外壳1，铁钉作为芯柱2，医用注射器的容量是3ml，铁钉的长度2mm，直径3ml；将铁钉从医用注射器的注射孔插入，铁钉直径与医用注射器的注射孔直径相同，铁钉可与医用注射器形成紧密配合将铁钉固定在医用注射器的中心位置，在医用注射器附近开设气孔4；将凝胶状的丝素蛋白纤维溶胀物6装入到医用注射器中后，采用活塞作为堵板5将丝素蛋白纤维溶胀物6推至铁钉的位置。

如图1，为本发明制备得到的丝素蛋白纤维中空神经导管的实物图，可以看出形貌状态良好，中空清晰可见，能够作为丝素蛋白纤维中空神经导管。

如图2，为本发明制备得到的丝素蛋白纤维中空神经导管横截面的扫描电镜照片，可以看出中空神经导管内部通道非常通畅，支架材料外部光滑均匀，神经导管外径4mm，内径2mm，壁厚1mm，满足生物医用领域中神经导管支架材料的要求。实验测得的压缩回弹率大于95％。

如图3，为本发明制备得到的丝素蛋白纤维中空神经导管剖面的扫描电镜照片，可以看出神经导管由直径为1～2μm的纤维组成，内部具有较多的三维立体微孔结构，而且微孔结构内部连通，孔隙率为70％，孔径为20μm，这非常有利于神经细胞的粘附、生长和迁移，能够满足神经细胞生长和增殖的要求。

如图4，为施旺细胞在本发明制备得到的丝素蛋白纤维中空神经导管上生长增殖示意图，施旺细胞主要分布于周围神经系统中神经元的突起周围，细胞呈不规则形，将施旺细胞种植在中空神经导管支架材料上观察细胞生长状态能够准确评估支架材料的可靠性。从图中可以看出施旺细胞在支架材料上生长状态良好，绿色(颜色较浅处)代表活细胞，红色代表死细胞，几乎所有施旺细胞都呈现活的状态，沿支架材料进行生长和增殖。因此，细胞活性实验也进一步证明再生丝素蛋白纤维中空神经导管支架材料有助于周围神经细胞的迁移生长，对于周围神经损伤的再生修复提供了一种良好生物医学材料。

Claims

1.一种丝素蛋白纤维中空神经导管的制备方法，其特征在于，分为以下步骤：

2.根据权利要求1所述的丝素蛋白纤维中空神经导管的制备方法，其特征在于，步骤1的具体步骤为：

1.1将去除蚕蛹后的蚕茧剪碎待用；

3.根据权利要求1所述的丝素蛋白纤维中空神经导管的制备方法，其特征在于，步骤2中，搅拌的速度为100～1000r/min，搅拌的时间为1～5h。

4.根据权利要求1所述的丝素蛋白纤维中空神经导管的制备方法，其特征在于，步骤3中，搅拌的速度为600～800r/min，搅拌的时间为1～5h。

5.根据权利要求1所述的丝素蛋白纤维中空神经导管的制备方法，其特征在于，步骤4中，冷冻的温度为-80℃～-60℃，冷冻的时间为24～72h。

6.根据权利要求1所述的丝素蛋白纤维中空神经导管的制备方法，其特征在于，步骤4中，冷冻干燥的温度为-50℃～-70℃，冷冻干燥的时间为24～72h。

7.根据权利要求1所述的丝素蛋白纤维中空神经导管的制备方法，其特征在于，步骤4中，洗涤是在磷酸盐缓冲溶液中洗涤1～5次，每次持续10～60min。

8.采用权利要求1～7任意一项所述的丝素蛋白纤维中空神经导管的制备方法所制备的丝素蛋白纤维中空神经导管。

9.根据权利要求8所述的丝素蛋白纤维中空神经导管，其特征在于，丝素蛋白纤维中空神经导管由直径为1～2μm的纤维组成，孔隙率为70％，孔径为20μm，压缩回弹率大于95％。

10.权利要求8或9所述的丝素蛋白纤维中空神经导管作为神经导管的应用。