CN108310461A - 具有定向释放功能的多孔丝素脊髓支架及其制备方法、制备模具和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于脊髓支架技术领域,具体涉及一种具有定向释放功能的多孔丝素脊髓支架及其制备方法、制备模具和应用。该方法包括步骤:1)制备丝素蛋白水溶液;制备透明质酸溶液;2)将丝素蛋白水溶液和透明质酸溶液混合,再依次加入EDC、NHS和MES在冰浴下进行交联反应,充分搅拌,并抽真空消泡,再将反应液注入到制备模具中,再将模具至于‑80℃以下进行冷冻成型,成型后除去模具的硅胶管得到样品,再将所述样品进行冷冻干燥,冷冻干燥后得到具有定向释放功能的多孔丝素脊髓支架。本发明利用针灸针制备通道,可以使通道均匀定向分布,得到材料孔径均一且孔径大小可调、孔隙率高、孔连通性好的丝素蛋白/透明质酸复合多孔支架。
Description
技术领域
本发明属于脊髓支架技术领域,具体涉及一种具有定向释放功能的多孔丝素脊髓支架及其制备方法、制备模具和应用。
背景技术
理想的支架应当具有合适的孔径、高孔隙率、良好的孔连通性、高的机械强度、良好的生物相容性等特点。国内外的研究已初步证明丝素蛋白(SF)用于修复神经组织缺损具有一定的优势,透明质酸(HA)以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能。丝素蛋白是一种从蚕茧中提取的具有机械强度高、韧性好、弹性高等优点的蛋白。因此,将丝素蛋白、纳透明质酸复合,可以克服单一材料的缺陷。
将丝素蛋白与透明质酸进行复合,制备复合多孔支架的方法常见的有冷冻干燥法。然而,定向冷冻具有操作复杂、耗时等缺点。在支架的制备过程中,定向冷冻不可控,这会影响支架的孔结构以及其在支架上的分布。如何使通道均匀分布在聚合物基质中,是制备丝素蛋白/透明质酸复合材料的关键性问题。
发明内容
为解决现有技术的不足,本发明提供了一种具有定向释放功能的多孔丝素脊髓支架及其制备方法、制备模具和应用。本发明利用针灸针制备通道,可以使通道均匀定向分布。该方法操作简单,可得材料孔径均一且孔径大小可调、孔隙率高、孔连通性好的丝素蛋白/透明质酸复合多孔支架。
本发明所提供的技术方案如下:
一种具有定向释放功能的多孔丝素脊髓支架的制备模具,包括:硅胶管、设置在所述硅胶管内底部的下固定塞、设置在所述硅胶管内上部的上固定塞以及固定在所述上固定塞和所述下固定塞之间的若干针灸针,其中,所述下固定塞的侧壁与所述硅胶管的内壁抵接,在所述上固定塞的侧壁与所述硅胶管的内壁之间留有空隙。硅胶管内的空间为圆柱形。
优选的,所述针灸针的直径为0.20~0.30mm。硅胶管内可同时竖向放置多根针灸针。
针灸针的数量和直径具体可根据需要进行调整。
本发明还提供了一种具有定向释放功能的多孔丝素脊髓支架的制备方法,包括以下步骤:
1)制备丝素蛋白水溶液;制备透明质酸溶液;
2)将步骤1)得到的丝素蛋白水溶液和步骤1)得到的透明质酸溶液混合,再依次加入EDC、NHS和MES在冰浴下进行交联反应,充分搅拌,并抽真空消泡,再将反应液注入到本发明所提供的制备模具中,再将所述模具至于-80℃以下进行冷冻成型,成型后除去所述模具的硅胶管得到样品,再将所述样品进行冷冻干燥,冷冻干燥后得到具有定向释放功能的多孔丝素脊髓支架。
上述技术方案利用针灸针制备通道,可以使通道均匀的沿着硅胶管模具的长度方向定向分布,得到材料孔径均一且孔径大小可调、孔隙率高、孔连通性好的丝素蛋白/透明质酸复合多孔支架。
具体的,步骤1)中:
丝素蛋白水溶液的质量百分数为4~6%;
丝素蛋白的分子量为8000~14000;
透明质酸溶液的质量百分数为1~2%。
具体的,步骤2)中:
丝素蛋白水溶液和透明质酸溶液的混合液中溶质的质量百分数为4~6%;
具体的,步骤2)中:步骤1)得到的丝素蛋白水溶液与步骤1)得到的透明质酸溶液的体积比为80~100:5~20。
具体的,步骤2)中:
EDC的用量与丝素蛋白水溶液的重量百分比为0.8~1.2%;
NHS的用量与丝素蛋白水溶液的重量百分比为0.4~0.6%;
MES的用量与丝素蛋白水溶液的重量百分比为1.25~1.5%。
具体的,步骤2)中:
冷冻成型的温度为-80℃以下,冷冻成型的时间为20~28小时;
冷冻干燥的温度为-50℃以下,冷冻干燥的时间为40~56小时。
本发明还提供了根据上述制备方法制备得到的具有定向释放功能的多孔丝素脊髓支架。
本发明还提供了具有定向释放功能的多孔丝素脊髓支架的应用,用作修复人体脊髓的支架。
本发明通过调节针灸针直径的大小与分布情况,制备出不同孔径大小的丝素蛋白/透明质酸复合多孔支架,所制备的复合多孔支架孔径均一,孔隙率高,孔连通性好,吸水率与膨胀率适中。实验结果表明,该支架具有良好的体外和体内生物相容性。
附图说明
图1是本发明实施例中各具有定向释放功能的多孔丝素脊髓支架的断面显微结构图。
图2是本发明实施例中各具有定向释放功能的多孔丝素脊髓支架的热水溶失率图。
图3是实施例4所提供的具有定向释放功能的多孔丝素脊髓支架的累计释药率图。
图4是实施例4所提供的具有定向释放功能的多孔丝素脊髓支架的释药速率图。
图5是本发明所提供的具有定向释放功能的多孔丝素脊髓支架的制备模具的结构示意图
附图5中,各标号所代表的结构列表如下:
1、硅胶管,2、下固定塞,3、上固定塞,4、针灸针。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述,所举实施例只用于解释本发明,并非用于限定本发明的范围。
在一个实施例中,如图5所示,具有定向释放功能的多孔丝素脊髓支架的制备模具包括:硅胶管1、设置在硅胶管1内底部的下固定塞2、设置在硅胶管1内上部的上固定塞3以及固定在上固定塞3和下固定塞2之间的若干针灸针4,其中,下固定塞2的侧壁与硅胶管1的内壁抵接,在上固定塞3的侧壁与硅胶管1的内壁之间留有空隙。针灸针4的直径为0.20~0.30mm,各针灸针沿着硅胶管的长度方向设置。
具体实施方式
1、制备丝素蛋白水溶液
取去蛹的蚕茧,加入其质量100倍的0.02mol/L Na2CO3水溶液,煮沸30分钟,取出拧干,用蒸馏水冲洗干净;再重复上述操作2次,60℃烘箱中干燥24h,中途不断扯松,得到脱胶蚕丝;将脱胶蚕丝置于9.3mol/L LiBr水溶液中,脱胶蚕丝与9.3mol/L LiBr水溶液的质量比为1:5,60℃保温至脱胶蚕丝完全溶解,装入截流分子量为8000-14000道尔顿的透析袋中,自来水4℃透析两天,去离子水4℃透析一天(第一天每1h换一次水,后两天每2小时,夜间换水时间间隔不要太长),透析后溶液经8层纱布过滤,离心分离,所得上清液为丝素蛋白水溶液,并测得其质量分数,用去离子水稀释至丝素蛋白的质量分数为5%,用蓝口瓶装取放入4℃冰箱保存备用;
2、制备透明质酸溶液
取透明质酸粉末1.5g,加入100ml去离子水中,缓慢搅拌12h,制得透明质酸的质量分数为1.5%的透明质酸溶液,放入4℃冰箱保存备用;
3、制备支架
配置一定比例的SF/HA的混合溶液,加入EDC、NHS、MES交联后于冰浴中充分搅拌,抽真空消泡,注入具有需要直径的硅胶和所需根数与直径的针灸针的制备模具中。将上述装置放入-80℃的冰箱,冷冻24小时。把上述冷冻后的样品从模具中取出后置于冷冻干燥机中,经48小时减压干燥,得到多通道的SF/HA多孔支架。
实施例1
在实施例1的制备支架步骤1中,配置混合溶液总浓度5%,SF/HA=95:5的混合溶液20ml,然后在混合溶液中加入占丝素质量20%的EDC、10%NHS、0.012gMES(EDC、NHS、MES的含量是相对于SF/HA混合溶液中SF的含量),冰浴下充分搅拌1h。用注射器注入模具中(针数为10),在-80℃的冰箱,冷冻24小时。把上述冷冻后的样品从模具中取出后置于冷冻干燥机中,经48小时减压干燥,得到多通道的SF/HA多孔支架。
实施例2
在实施例1的制备支架步骤1中,配置混合溶液总浓度5%,SF/HA=90:10的混合溶液20ml,然后在混合溶液中加入占丝素质量20%的EDC、10%NHS、0.012gMES(EDC、NHS、MES的含量是相对于SF/HA混合溶液中SF的含量),冰浴下充分搅拌1h。用注射器注入模具中(针数为10),在-80℃的冰箱,冷冻24小时。把上述冷冻后的样品从模具中取出后置于冷冻干燥机中,经48小时减压干燥,得到多通道的SF/HA多孔支架。
实施例3
在实施例1的制备支架步骤1中,配置混合溶液总浓度5%,SF/HA=85:15的混合溶液20ml,然后在混合溶液中加入占丝素质量20%的EDC、10%NHS、0.012gMES(EDC、NHS、MES的含量是相对于SF/HA混合溶液中SF的含量),冰浴下充分搅拌1h。用注射器注入模具中(针数为10),在-80℃的冰箱,冷冻24小时。把上述冷冻后的样品从模具中取出后置于冷冻干燥机中,经48小时减压干燥,得到多通道的SF/HA多孔支架。
实施例4
在实施例1的制备支架步骤1中,配置混合溶液总浓度5%,SF/HA=80:20的混合溶液20ml,然后在混合溶液中加入占丝素质量20%的EDC、10%NHS、0.012gMES(EDC、NHS、MES的含量是相对于SF/HA混合溶液中SF的含量),冰浴下充分搅拌1h。用注射器注入模具中(针数为10),在-80℃的冰箱,冷冻24小时。把上述冷冻后的样品从模具中取出后置于冷冻干燥机中,经48小时减压干燥,得到多通道的SF/HA多孔支架。
实施例5
在实施例1的制备支架步骤1中,配置浓度为5%的SF溶液20ml,然后在混合溶液中加入占丝素质量20%的EDC、10%NHS、0.012gMES(EDC、NHS、MES的含量是相对于SF/HA混合溶液中SF的含量),冰浴下充分搅拌1h。用注射器注入模具中(针数为10),在-80℃的冰箱,冷冻24小时。把上述冷冻后的样品从模具中取出后置于冷冻干燥机中,经48小时减压干燥,得到多通道的SF多孔支架。对得到的多孔支架进行测定:
为了确定本发明的最佳工艺条件,发明人进行了大量的实验室研究试验,对比试验情况如下:
SF和HA混合比例对支架形貌的影响
配置总浓度5%,SF/HA不同比例的混合溶液20ml,然后在混合溶液中加入占丝素质量20%的EDC、10%NHS、0.012gMES(EDC、NHS、MES的含量是相对于SF/HA混合溶液中SF的含量),冰浴下充分搅拌1h。用注射器注入模具中(针数为10),在-80℃的冰箱,冷冻24小时。把上述冷冻后的样品从模具中取出后置于冷冻干燥机中,经48小时减压干燥,得到多通道的多孔支架。
如图1所示,所制备的多通道的多孔支架采用扫描电子显微镜进行形貌表征,a-e部分分别对应实施例1-5,从图中可以看出,SF/HA对多孔支架的形貌具有明显影响。总体来说,HA含量较高会导致片层结构孔洞变大,成型更好,有利于后续载药。
如图2所示,各实施例中的具有定向释放功能的多孔丝素脊髓均具有较低且稳定的热水溶失率,说明均具有稳定的结构性质。
如图3、4所示,具有定向释放功能的多孔丝素脊髓支架两端的释药率和释药速率均远大于管身,说明具有定向释放性能。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种具有定向释放功能的多孔丝素脊髓支架的制备模具,其特征在于,包括:硅胶管(1)、设置在所述硅胶管(1)内底部的下固定塞(2)、设置在所述硅胶管(1)内上部的上固定塞(3)以及固定在所述上固定塞(3)和所述下固定塞(2)之间的若干针灸针(4),其中,所述下固定塞(2)的侧壁与所述硅胶管(1)的内壁抵接,在所述上固定塞(3)的侧壁与所述硅胶管(1)的内壁之间留有空隙。
2.根据权利要求1所述的具有定向释放功能的多孔丝素脊髓支架的制备模具,其特征在于:所述针灸针(4)的直径为0.20~0.30mm。
3.一种具有定向释放功能的多孔丝素脊髓支架的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)分别制备丝素蛋白水溶液和透明质酸溶液;
2)将步骤1)得到的丝素蛋白水溶液和步骤1)得到的透明质酸溶液混合,再依次加入EDC、NHS和MES在冰浴下进行交联反应,充分搅拌,并抽真空消泡,再将反应液注入到权利要求1或2所述的模具中,再将所述模具进行冷冻成型,成型后除去所述模具的硅胶管得到样品,再将所述样品进行冷冻干燥,冷冻干燥后得到具有定向释放功能的多孔丝素脊髓支架。
4.根据权利要求3所述的具有定向释放功能的多孔丝素脊髓支架的制备方法,其特征在于,步骤1)中:
丝素蛋白水溶液的质量百分数为4~6%;
丝素蛋白的分子量为8000~14000;
透明质酸溶液的质量百分数为1~2%。
5.根据权利要求3所述的具有定向释放功能的多孔丝素脊髓支架的制备方法,其特征在于,步骤2)中:
丝素蛋白水溶液和透明质酸溶液的混合液中溶质的质量百分数为4~6%。
6.根据权利要求5所述的具有定向释放功能的多孔丝素脊髓支架的制备方法,其特征在于,步骤2)中:步骤1)得到的丝素蛋白水溶液与步骤1)得到的透明质酸溶液的体积比为80~100:5~20。
7.根据权利要求6所述的具有定向释放功能的多孔丝素脊髓支架的制备方法,其特征在于,步骤2)中:
EDC的用量与丝素蛋白水溶液的重量百分比为0.8~1.2%;
NHS的用量与丝素蛋白水溶液的重量百分比为0.4~0.6%;
MES的用量与丝素蛋白水溶液的重量百分比为1.25~1.5%。
8.根据权利要求3至7任一所述的具有定向释放功能的多孔丝素脊髓支架的制备方法,其特征在于,步骤2)中:
冷冻成型的温度为-80℃以下,时间为20~28小时;
冷冻干燥的温度为-50℃以下,时间为40~56小时。
9.一种根据权利要求3至8任一所述的制备方法制备得到的具有定向释放功能的多孔丝素脊髓支架。
10.一种根据权利要求9所述的具有定向释放功能的多孔丝素脊髓支架的应用,其特征在于:作为修复人体脊髓的支架。
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