CN106581754A - 一种高仿真组织工程神经修复支架及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高仿真组织工程神经修复支架的制备方法，包括：将Ι型胶原蛋白‑壳聚糖混悬液经注模及冷淋、冷冻干燥成型、包被保护薄膜和与京尼平交联得到。本发明制备过程无需特殊设备、反应条件温和、工艺成熟、适合于改性高仿真组织工程神经修复支架的规模化生产，制备的修复支架有利于手术中切口的缝合，并且具有良好的生物相容性和生物活性。

Description

一种高仿真组织工程神经修复支架及其制备方法
技术领域
本发明涉及神经修复组织工程技术领域，特别涉及一种组织工程神经修复支架及其制备方法。
背景技术
周围神经再生和功能修复是尚未解决的临床难题。对于短节段的神经损伤，可以将断裂的神经直接对端吻合，使近端再生的神经纤维能长入远端。但对于长节段的神经缺损，临床上无法进行无张力缝合，目前治疗的金标准是将未损伤区域的自体神经移植到损伤区域来桥接损伤的神经断端。然而，应用自体神经移植受到很多因素限制：获取供体神经需要二次手术，供区神经来源不足，继发的供区神经功能丧失，以及供受神经在组织结构和尺寸上不匹配等。因此，研发能够有效代替自体神经的移植替代物是目前亟待解决的难题。
近年来，组织工程周围神经修复成为研究的热点。应用组织工程学方法制备组织工程移植物桥接长节段神经缺损收到较好疗效，受到了越来越多的关注。组织工程移植物一般由生物支架材料、种子细胞和生物活性因子三部分构成。其中支架作为种子细胞和神经营养因子的载体，作为组成神经损伤修复微环境的主体，其构建和性能改进研究成为制约周围神经损伤修复的关键。支架材料的组成及内部微结构是影响组织工程移植物修复长节段神经损伤的关键因素。最近研究表明，内部具有定向微结构的支架，在桥接神经缺损时比无定向结构的支架更有利于引导再生轴突的定向生长，能够促进再生神经纤维通过损伤区到达远端，证实了支架内部结构的物理引导作用对于神经再生的重要性。分析原因，主要是因为其内部定向结构模拟了正常神经基底膜的轴向微管结构。但这些支架材料在原料组成以及内部结构上，与自体神经基底膜的组成和结构还有很大差距，需要进一步改进。
鉴于正常神经基底膜微管结构引导再生神经轴突定向生长的关键作用，如能够根据神经组织的真实组成和结构来选择和制备组织工程支架，将能够在一定程度上使该支架具备类似正常神经组织的特性，有可能会获得最理想的移植替代修复结果。然而，到目前为止，仅有少数具有类似结构的支架被报道，而应用其在体内修复实验动物长节段周围神经缺损至今未见研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是以往支架材料的制备方法都不能精确的控制孔隙的大小、空间分布和空间结构，提供一种高仿真组织工程神经修复支架及其制备方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
一种高仿真组织工程神经修复支架的制备方法，其特征在于：包括：将Ι型胶原蛋白-壳聚糖混悬液经注模及冷淋、冷冻干燥成型、包被保护薄膜和与京尼平交联得到。
进一步地，所述Ι型胶原蛋白-壳聚糖混悬液的制备，方法为：按照质量比为1～10:1的比例分别称取I型胶原蛋白和壳聚糖；将I型胶原蛋白加入浓度为0～4mg/ml醋酸或丙二酸溶液中溶解制成悬浊液；将壳聚糖加入浓度为0～4mg/ml醋酸或丙二酸溶液中溶解制成悬浊液；混合上述两种悬浊液，并保持4℃恒温搅拌，充分混合制成Ι型胶原蛋白-壳聚糖混悬液。
进一步地，所述注模及冷淋，方法为：将所述Ι型胶原蛋白-壳聚糖混悬液注入硅胶管中并密封两端，然后浸入深低温冷淋剂中，进入速度控制为1×10-6m/s～1×10-4m/s，进行梯度冷淋，当完全浸入液面后，继续保留30～60min，再转入－80℃冰箱中30～60min。
进一步地，所述冷冻干燥成型，方法为：在－60℃100mtorr条件下冻干24h，然后在真空状态下升温至0℃保持6h，再继续升温至22℃保持30～60min，解除真空，升至常温。
进一步地，所述包被保护薄膜，方法为：胶原蛋白、聚己内酯、聚乳酸中的一种或一种以上原料，在5～30kV的加载电压和0.5～3.0mL/h的进料速度下进行静电纺丝，覆盖于支架材料表面。
进一步地，所述与京尼平交联，方法为：将包被保护薄膜的支架材料浸于质量浓度为0.5％～2％的京尼平溶液中，于室温交联12～72h。
一种高仿真组织工程神经修复支架，所述支架由上述的制备方法制备得到。
本发明提供的一种高仿真组织工程神经修复支架的制备方法，在Ι型胶原蛋白-壳聚糖混悬液经注模冷淋、干燥成型基础上，在其外表面包被上一层保护薄膜，最后经京尼平交联固化制备而成，制备的材料具有微管轴向矩阵排列的神经仿生结构和致密的外表面结构，有利于保护材料的内部结构，有利于手术中切口的缝合，既可用于神经损伤修复的基础研究，也可用于临床人体脊髓和周围神经损伤或缺损的桥接修复，并且具有良好的生物相容性和生物活性。本发明的制备过程无需特殊设备、反应条件温和、工艺成熟、适合于改性高仿真组织工程神经修复支架的规模化生产。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的支架扫描电镜下轴向切面观察的图片。
图2为本发明实施例1提供的支架扫描电镜下横切面观察的图片。
图3为本发明实施例1提供的支架扫描电镜下轴向切面观察的图片。
图4为本发明实施例1提供的支架扫描电镜下横切面观察的图片。
图5为本发明实施例2提供的支架扫描电镜下横切面观察的图片。
图6为本发明实施例3提供的支架扫描电镜下横切面观察的图片。
图7为本发明对比实施例1提供的支架扫描电镜下横切面观察的图片。
图8为本发明对比实施例2提供的支架扫描电镜下横切面观察的图片。
具体实施方式
本发明提供的一种高仿真组织工程神经修复支架的制备方法，包括：
Ι型胶原蛋白-壳聚糖混悬液的制备：按照质量比为1～10:1的比例分别称取I型胶原蛋白和壳聚糖。将I型胶原蛋白放入浓度为0～4mg/ml醋酸或丙二酸溶液中溶2h后，在4℃恒温环境中搅拌制成悬浊液；另将壳聚糖加入0～4mg/ml醋酸或丙二酸溶液中充分溶解，混合两种悬浊液并保持4℃恒温搅拌，充分混合制成Ι型胶原蛋白-壳聚糖混悬液，抽真空静置12h。
注模及冷淋处理：将Ι型胶原蛋白-壳聚糖混悬液注入硅胶管中并密封两端，然后将注模的样品缓慢浸入深低温冷淋剂(液氮)中，进入速度控制为1×10-6m/s～1×10-4m/s，进行梯度冷淋，当完全浸入液面后，继续在液氮中保留30～60min，再转入－80℃冰箱中30～60min。
冷冻干燥成型：将Ι型胶原蛋白-壳聚糖悬浊液的硅胶管冰冻体切成短节段放置于预冷好的铝盘中，放入冷冻干燥机，在－60℃、100mtorr条件下冻干24h，然后在真空状态下升温至0℃保持6h，再继续升温至22℃保持30～60min，解除真空，升至常温，即可制得干燥成形的圆柱形高仿真Ι型胶原蛋白-壳聚糖支架材料。
包被保护薄膜：胶原蛋白、聚己内酯、聚乳酸中的一种或两种或三种原料按一定比例混合后，在5～30kV的加载电压和0.5～3.0mL/h的进料速度下进行静电纺丝，并覆盖于圆柱形支架材料的表面，形成支撑保护层。
与京尼平交联：将保护膜包被后的高仿真Ι型胶原蛋白-壳聚糖支架材料浸于质量浓度为0.5％～2％的京尼平溶液中，于室温交联12～72h，反复清洗后将支架材料放入－20℃进行冷淋处理，冷冻干燥机中冻干5h，得到改性的高仿真组织工程神经修复支架。
作为优选，将I型胶原蛋白与壳聚糖按照质量比为4:1的比例配成共混溶液。此两种材料生物相容性均极佳，其中神经细胞被证明更容易黏附在胶原蛋白的支架中，但是其体内降解周期过短(小于两周)，不满足神经再生周期需求，因此添加25％的壳聚糖，用以调节其降解周期在3～6个月，满足神经再生需求，同时保证支架强度。
作为优选，所用丙二酸溶液浓度为1.5mg/mL。采用丙二酸作为溶剂可以显著降低生产过程中的异味，加强对操作工人的保护，同时1.5mg/mL的浓度可以在保证胶原蛋白溶解度的同时，保护其特有的三股螺旋结构，从而加强其生物活性。
作为优选，注模样品浸入冷凝液的速度为2×10-5m/s。该速度可以保证神经支架形成特殊的阵列微孔结构，此结构是神经细胞生长的最优结构。
作为优选，神经支架包被保护膜材料为胶原蛋白与聚己内酯按质量比1:1混合，此时外皮材料的纤维连续性最好。
作为优选，静电纺丝所用加载电压为20kV，静电纺丝进料速度为1.0mL/h。
作为优选，所采用的京尼平质量浓度为1％，所选用的交联时间为48h。应用低生物毒性交联剂—京尼平化学交联，改善了支架性能并确定最佳交联参数：1wt％京尼平交联48h后，支架能够维持三维空间结构，对抗组织塌陷，机械性能基本满足在体移植需求。交联处理后，支架在各时间点上的重量丢失比率均小于未交联组，在神经再生过程中能够保持稳定的结构，配合神经轴突的再生。
本发明的制备方法结合了冰晶形成理论，改良了传统冷冻干燥技术，制备出高度仿真的神经支架材料，具有①长轴定向微管样仿生三维结构与正常神经基底膜结构高度相似，利于引导再生轴突定向生长；②平行微管间相互沟通的孔隙相连，利于营养物质和代谢产物的运输；③相对封闭的外壁结构，起到瘢痕屏障的作用，利于神经再生微环境的构建。
综上所述，本发明通过控制Ι型胶原蛋白和壳聚糖比例、冰醋酸或丙二酸浓度、梯度冷淋速度、静电纺丝电压和进料速度以及京尼平质量浓度和交联时间参数，制备的支架材料具有最佳的三维仿生结构和良好的性能，支架平均孔隙率达90％以上，能够满足理想支架对孔径的要求。
实施例1
实施例1提供一种高仿真组织工程神经修复支架的制备方法，按照以下步骤进行：
一、Ι型胶原蛋白-壳聚糖混悬液的制备：按照质量比为4:1的比例分别称取I型胶原蛋白和壳聚糖。将I型胶原蛋白放入浓度为1.5mg/ml丙二酸溶液中溶2h后，在4℃恒温环境中搅拌制成悬浊液；另将壳聚糖加入1.5mg/ml丙二酸溶液中充分溶解，混合两种悬浊液并保持4℃恒温搅拌，充分混合制成Ι型胶原蛋白-壳聚糖凝胶状混悬液，抽真空静置12h；
二、注模及改良冷淋处理：将悬浊液注入硅胶管中并密封两端，然后将注模的样品缓慢浸入深低温冷淋剂(液氮)中，进入速度控制为2×10-5m/s，进行梯度冷淋，当完全浸入液面后，继续在液氮中保留30～60min，再转入－80℃冰箱中30～60min；
三、冷冻干燥成型：将Ι型胶原蛋白-壳聚糖悬浊液的硅胶管冰冻体切成短节段放置于预冷好的铝盘中，放入冷冻干燥机，在－60℃、100mtorr条件下冻干24h，然后在真空状态下升温至0℃保持6h，再继续升温至22℃保持30～60min，解除真空，升至常温，即可制得干燥成形的高仿真Ι型胶原蛋白-壳聚糖支架材料；
四、包被保护薄膜：胶原蛋白与聚己内酯按质量比1:1混合，在20kV的加载电压和1.0mL/h的进料速度下进行静电纺丝，并覆盖于圆柱形支架材料的表面，形成保护层；
五、与京尼平交联：将干燥成型的高仿真Ι型胶原蛋白-壳聚糖支架材料浸于质量浓度为1％的京尼平溶液中，于室温交联48h，反复清洗后将支架材料放入－20℃进行冷淋处理，冷冻干燥机中冻干5h，得到改性的高仿真组织工程神经修复支架。
实施例2
实施例2提供一种高仿真组织工程神经修复支架的制备方法，按照实施例1的方法，不同之处在于：按照I型胶原蛋白与壳聚糖质量比为10:1，所采用丙二酸溶液浓度为0.5mg/mL，梯度冷淋速度控制在1×10-6m/s，保护薄膜原料组成为100％聚己内酯，静电纺丝所用加载电压为5kV，静电纺丝进料速度为0.5mL/h，采用的京尼平溶液质量浓度为0.5％，京尼平交联时间设置为12h。其余与实施例1相同。
实施例3
实施例3提供一种高仿真组织工程神经修复支架的制备方法，按照实施例1的方法，不同之处在于：按照I型胶原蛋白与壳聚糖质量比为1:1，所采用醋酸溶液浓度为0.5mg/mL，梯度冷淋速度控制在2×10-6m/s，静电纺丝所用加载电压为10kV，静电纺丝进料速度为1.5mL/h，采用的京尼平溶液质量浓度为1％，京尼平交联时间设置为24h。其余与实施例1相同。
实施例4
实施例4提供一种高仿真组织工程神经修复支架的制备方法，按照实施例1的方法，不同之处在于：按照I型胶原蛋白与壳聚糖质量比为3:1，所采用醋酸溶液浓度为2mg/mL，梯度冷淋速度控制在5×10-6m/s，静电纺丝所用加载电压为20kV，静电纺丝进料速度为2mL/h，采用的京尼平溶液质量浓度为2％，京尼平交联时间设置为48h。其余与实施例1相同。
实施例5
实施例5提供一种高仿真组织工程神经修复支架的制备方法，按照实施例1的方法，不同之处在于：按照I型胶原蛋白与壳聚糖质量比为5:1，所采用醋酸溶液浓度为4mg/mL，梯度冷淋速度控制在1×10-5m/s，静电纺丝所用加载电压为30kV，静电纺丝进料速度为3mL/h，采用的京尼平溶液质量浓度为2％，京尼平交联时间设置为72h。其余与实施例1相同。
实施例6
实施例6提供一种高仿真组织工程神经修复支架的制备方法，按照实施例1的方法，不同之处在于：所采用丙二酸溶液浓度为4mg/mL，梯度冷淋速度控制在5×10-5m/s，静电纺丝所用加载电压为30kV，静电纺丝进料速度为3mL/h，采用的京尼平溶液质量浓度为2％，京尼平交联时间设置为72h。其余与实施例1相同。
实施例7
实施例7提供一种高仿真组织工程神经修复支架的制备方法，按照实施例1的方法，不同之处在于：梯度冷淋速度控制在1×10-4m/s。其余与实施例1相同。
对比实施例1
对比实施例1提供一种高仿真组织工程神经修复支架的制备方法，按照实施例1的方法，不同之处在于：100％壳聚糖的比例制备混悬液。其余与实施例1相同。
对比实施例2
对比实施例2提供一种高仿真组织工程神经修复支架的制备方法，按照实施例1的方法，不同之处在于：按照100％I型胶原蛋白的比例制备混悬液。其余与实施例1相同。
实验结果与讨论
实施例1制备的支架的扫描电镜照片如图1所示，可以看出，材料内部为走向平行、孔径均一、排列规律的仿真轴向微管(图1标尺＝50μm)；图2可以看出，材料内部为蜂巢样结构，微孔内径较为均一(图2标尺＝100μm)；图3可以看出，材料内部轴向矩阵排列的微管间有广泛的微孔结构相互沟通(图3标尺＝250μm)；图4可以看出，其材料外表面为相对封闭结构。
实施例2制备的支架的扫描电镜照片见图5，保护薄膜原料组成为100％聚己内酯时，扫描电镜下观察到的保护薄膜其成纤性良好，纤维直径分布在0.78±0.54μm。
实施例3制备的支架的扫描电镜照片见图6，保护薄膜原料组成中胶原蛋白与聚己内酯比例为1：1时，扫描电镜下观察到的保护薄膜其成纤性良好，纤维直径分布在0.78±0.54μm。
对比实施例1制备的支架扫描电镜照片见图7，从图中可以看出，支架内部不存在轴向矩阵排列的微孔结构，孔径分布不均匀，孔径不通透。
对比实施例2制备的支架扫描电镜照片见图8，从图中可以看出，支架内部不存在轴向矩阵排列的微孔结构，孔径分布不均匀，孔径不通透。
生物有效性验证
取SD大鼠130只，雄性，体重200～220g，分为7组：自体神经移植组18只、实施例1支架材料组18只、实施例2支架材料组18只、对比实施例1支架材料组18只、对比实施例2支架材料组18只、对比实施例3支架材料组18只和空白对照组4只。以1％戊巴比妥钠40mg/kg腹腔麻醉，左股后部正中切口暴露坐骨神经，切除神经制备15mm长神经缺损。分别用长15mm的实施例1支架材料、实施例2支架材料、对比实施例1支架材料和对比实施例2支架材料桥接两神经断端，显微镜下用10/0无损伤缝线将支架材料两端分别与两断端神经外膜各缝合3针；自体神经移植组将切除的坐骨神经翻180°缝合；空白对照组常规显露坐骨神经，切除后两神经断端旷置。在移植手术后的第4周和12周，在实验动物的后足跟涂上无毒染料来记录神经损伤和去神经支配造成的步态改变，记录实验动物的步态改变，一直到获得5个以上可测量趾印为止。坐骨神经指数(SFI)按照以下公式计算获得：
SFI＝(-38.3×PLF)+(109.5×TSF)+(13.3×ITF)－8.8
PLF＝(EPL+NPL)/NPL
TSF＝(ETS－NTS)/NTS
ITF＝(EIT－NIT)/NIT
其中，PL代表从足跟至第三趾顶端的距离，IT代表第一趾和第三趾间距，TS代表第二趾和第四趾间距。NPL，NTS和NIT分别代表未行手术侧后肢的PL，IT和TS值。EPL，ETS，EIT代表实验动物手术侧的PL，IT和TS值。
表1坐骨神经指数测量结果
4周 12周
实施例1 -70.32±9.63 -61.81±11.01※
实施例2 -71.95±7.23 -64.79±10.17※
对比实施例1 -74.23±8.72 -69.12±9.85※
对比实施例2 -72.51±9.21 -66.54±10.58※
自体神经移植组 -64.48±5.35 -52.44±10.80※
阴性对照组 0.00 0.00
表1实验结果证明，自体神经移植组和实施例1组的实验动物术后足印质量较好，方便计算坐骨神经指数。术后4周和12周结果显示，自体神经移植组的坐骨神经指数略高于实施例1组，但两者之间并无明显统计学差异(p>0.05)。实施例1组和自体神经移植组在术后12周获得的坐骨神经指数均高于术后4周(p<0.05)。然而，未行桥接的阴性对照组，手术侧的足印大部分都不能被记录。这主要是由于实验动物在术后一直拖着术侧后肢，用其背面接触地面造成。在支架材料组中，实施例1组的坐骨神经指数略高于其他组，这主要是因为实施例1组采用了最合适的材料配比和最优的工艺参数，支架材料不但呈现轴向微管样结构，而且有沟通孔隙连接相邻的轴向微管，与坐骨神经基底膜结构相似。而实施例2组、对比实施例1组和对比实施例2组由于材料配比或制备工艺并非采用最佳参数，导致支架材料的微观结构与实施例1组存在差异，所以术后恢复效果略差于实施例1组。
最后所应说明的是，以上具体实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照实例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (7)

1.一种高仿真组织工程神经修复支架的制备方法，其特征在于：包括：将Ι型胶原蛋白-壳聚糖混悬液经注模及冷淋、冷冻干燥成型、包被保护薄膜和与京尼平交联得到。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述Ι型胶原蛋白-壳聚糖混悬液的制备，方法为：
按照质量比为1～10:1的比例分别称取I型胶原蛋白和壳聚糖；
将I型胶原蛋白加入浓度为0～4mg/ml醋酸或丙二酸溶液中溶解制成悬浊液；
将壳聚糖加入浓度为0～4mg/ml醋酸或丙二酸溶液中溶解制成悬浊液；
混合上述两种悬浊液，并保持4℃恒温搅拌，充分混合制成Ι型胶原蛋白-壳聚糖混悬液。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述注模及冷淋，方法为：
将所述Ι型胶原蛋白-壳聚糖混悬液注入硅胶管中并密封两端，然后浸入深低温冷淋剂中，进入速度控制为1×10-6m/s～1×10-4m/s，进行梯度冷淋，当完全浸入液面后，继续保留30～60min，再转入－80℃冰箱中30～60min。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述冷冻干燥成型，方法为：
在－60℃100mtorr条件下冻干24h，然后在真空状态下升温至0℃保持6h，再继续升温至22℃保持30～60min，解除真空，升至常温。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述包被保护薄膜，方法为：
胶原蛋白、聚己内酯、聚乳酸中的一种或一种以上原料，在5～30kV的加载电压和0.5～3.0mL/h的进料速度下进行静电纺丝，覆盖于支架材料表面。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述与京尼平交联，方法为：
将包被保护薄膜的支架材料浸于质量浓度为0.5％～2％的京尼平溶液中，于室温交联12～72h。
7.一种高仿真组织工程神经修复支架，其特征在于：所述支架由权利要求1-6任一项的制备方法制备得到。
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