CN108714247A - 一种易缝合高仿真组织工程神经修复支架的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种易缝合高仿真组织工程神经修复支架的制备方法。包括制备混悬液的步骤、制备阵列微管内芯的步骤、制备胶原外皮的步骤以及裁切并组装的步骤；制备混悬液的步骤包括：称取胶原蛋白和壳聚糖，混匀后溶于乙酸溶液；制备阵列微管内芯的步骤包括将混悬液注入模具、插入导温棒、浸入液氮进行梯度冷却、冻干、交联、清洗、冷冻存储和再次冻干；制备胶原外皮的步骤包括将混悬液注入模具、清洗、烘干、交联、再次清洗、冷冻存储和再次烘干；裁切并组装的步骤包括裁切和组装。本发明提供了一种合理的制备方法，解决以往支架产品缺乏内部三维结构、易塌陷的问题，同时解决多孔支架平齐末端不易缝合的问题。

Description

一种易缝合高仿真组织工程神经修复支架的制备方法
技术领域
本发明属于神经修复组织工程技术领域，尤其涉及一种易缝合高仿真组织工程神经修复支架的制备方法。
背景技术
周围神经损伤，尤其是周围神经缺损，是临床上最严重的创伤类型，常导致患者感觉和运动功能障碍或丧失，严重影响患者的日常生活和工作。对于短节段的神经损伤，可以将断裂的神经直接对端吻合，使近端再生的神经纤维长入远端。但对于长节段的神经缺损，临床上无法进行无张力缝合，长期以来都采取自体神经游离移植修复周围神经缺损，但会受到供区神经来源不足、继发的供区神经功能丧失以及供受神经在组织结构和尺寸上不匹配等因素的限制。因此，研发能够有效代替自体神经的移植替代物是目前亟待解决的难题
结构及成分仿生是周围神经修复支架制备的关键，理想的神经修复支架需要具备以下要素才能成功修复长节段神经缺损：①微管阵列仿生结构；②细胞外基质仿生成分(胶原蛋白等)。目前，应用和研究较多的神经移植材料的内部结构主要包括大空管状结构、空管加内容凝胶状结构和平行纵管状结构。比如，已经商品化的Neurotube为中空神经导管，Avance为脱细胞神经支架。这些商品在使用时均存在各种问题：①中空神经导管壁易塌陷，缺乏内部三维结构，无法引导长距离神经缺损；②脱细胞支架在制备过程中基底膜管三维结构易塌陷，机械性能显著降低，存在交叉感染、潜在免疫排斥等风险，稀缺的供体来源限制了大规模生产和应用。
目前，通过梯度冷凝工艺能够制备出内部空间结构高度仿生正常神经的组织工程支架。这种支架材料，是在梯度冷淋过程中受到重力和温度梯度的影响，冰晶在溶液中成核并沿热梯度方向生成，经真空低温冷冻干燥作用后冰晶升华而生成的一种轴定向三维多孔支架结构。孔的大小可通过改变冷淋速率来调节，孔的方向可通过冷凝过程中控制热梯度的几何方向来取向。
但是，通过梯度冷淋工艺制备的组织工程支架两端是平齐的，并且支架内部为多孔结构，与神经断端直接缝合难度较大。因此，研发一种易缝合的高仿真组织工程支架是非常有必要的，有望提高临床神经缺损修复效果，同时便于临床修复手术的开展，减少手术时间。
发明内容
本发明为解决公知技术中存在的技术问题而提供一种易缝合高仿真组织工程神经支架的制备方法，解决以往支架产品缺乏内部三维结构、易塌陷的问题，同时解决多孔支架平齐末端不易缝合的问题。
本发明为解决公知技术中存在的技术问题所采取的技术方案是：一种易缝合高仿真组织工程神经修复支架的制备方法包括制备混悬液的步骤、制备阵列微管内芯的步骤、制备胶原外皮的步骤以及裁切并组装的步骤，
制备混悬液的步骤包括：称取胶原蛋白和壳聚糖，混匀后溶于乙酸溶液中制得胶原蛋白-壳聚糖混悬液；
制备阵列微管内芯的步骤包括：a、将混悬液从内芯模具的一端注入，注入的过程中避免气泡产生，之后在内芯模具的注入端塞入与内径相匹配的导温棒，将多个注入后的内芯模具连接到匀速下降设备上；b、以1×10-6～1×10-4m/s的速度将内芯模具浸入液氮中进行梯度冷淋；c、待内芯模具完全浸入液面后取出，拔掉导温棒，将内芯模具置于真空冷冻干燥机中于-60℃、100mtorr条件下冻干24h；d、将冻干后的支架材料与内芯模具分离，浸于质量浓度为0.5～2％的京尼平溶液中于室温条件下交联12～72h；e、将交联后的支架材料用蒸馏水反复清洗；f、将清洗后的支架材料在-80℃超低温条件下冷冻储存30～ 60min；g、将支架材料置于真空冷冻干燥机中于-60℃、100mtorr条件下冻干24h，得到阵列微管内芯；
制备胶原外皮的步骤包括：a、将混悬液从外皮模具的一端注入，注入的过程中避免气泡产生，之后在外皮模具内插入中轴棍并设置固定帽；b、将外皮模具浸于pH为6～ 9的蒸馏水中，每6h更换一次蒸馏水，重复8～10次；c、将外皮模具取出，去除外皮模具的外壳，将携带胶原凝胶的中轴棍置于干燥箱中烘干处理，干燥后将胶原外皮与中轴棍分离；d、将胶原外皮浸于质量浓度为0.5～2％的京尼平溶液中于室温条件下交联2～72h； e、将交联后的外皮材料用蒸馏水反复清洗；f、将清洗后的外皮材料置于干燥箱中烘干处理，得到成型的胶原外皮；
裁切并组装的步骤包括：裁切阵列微管内芯得到支架内芯，裁切胶原外皮得到支架外皮，将支架内芯塞入支架外皮。
本发明的优点和积极效果是：本发明提供了一种易缝合高仿真组织工程神经修复支架的制备方法，与现有的制备方法和支架产品相比具有如下优点，
(1)支架制备所用材料胶原蛋白和壳聚糖均为天然生物材料，来源广泛，具有良好的生物相容性，在体内可被降解吸收或被排出体外，不需要二次手术取出，有利于减轻患者痛苦；(2)结合梯度冷凝干燥技术，使支架内部形成一种轴定向三维多孔结构，高度仿生正常神经组织结构，能够更好的引导神经组织再生，解决目前支架材料缺乏内部三维结构、易塌陷的问题；(3)本发明提供了一种胶原外皮制备方法，通过该方法制备的胶原外皮与阵列微管内芯结合后得到易缝合高仿真组织工程神经支架，解决了支架平齐末端不易与神经断端缝合的难题，可以节约手术时间；(4)本发明中提供的支架制备方法流程简单，降低了支架产品的生产成本，具有巨大的潜在应用价值。
优选地：在制备混悬液的步骤中，胶原蛋白与壳聚糖两者之间的重量配比为1：0～5；乙酸溶液的质量浓度为3～8mg/mL，胶原蛋白与壳聚糖两者的重量和与乙酸溶液的重量比为1～10：200。
优选地：在制备混悬液的步骤中，胶原蛋白与壳聚糖原料溶于乙酸溶液后，用匀浆器在冰水浴条件下间歇性搅拌，搅拌速度控制在2500～3500rpm；混匀后用离心机在10000rpm的条件下离心30min处理，去除气泡。
优选地：内芯模具包括中空管状结构的内模外壳，内径为1～8mm、外径为3～20mm；导温棒的外径等于内模外壳的内径。
优选地：外皮模具包括两个外模半壳体，在每个外模半壳体的侧壁上均设有多个长条形的开孔，在各开孔上均由半透膜封闭；固定帽设置在扣合后的两个外模半壳体的两端，在固定帽的中部设有固定孔，固定孔的内径等于中轴棍的外径。
优选地：在制备胶原外皮的步骤中，其中c步骤和f步骤中的干燥温度均不高于37℃。
优选地：在裁切并组装的步骤中，支架外皮的长度比支架内芯的长度大2～10mm。
附图说明
图1是本发明中内芯模具的结构示意图；
图2是本发明中外皮模具的结构示意图；
图3是本发明中形成的神经修复支架的结构示意图；
图4是图3中支架内芯的横切面扫描电镜图；
图5是图3中支架内芯的轴向切面扫描电镜图。
图中：1、内模外壳；2、导温棒；3、外模半壳体；4、中轴棍；5、固定帽；6、开孔；7、支架内芯；8、支架外皮。
具体实施方式
为能进一步了解本发明的发明内容、特点及功效，兹举以下实施例详细说明如下：
本发明的易缝合高仿真组织工程神经修复支架及其制备方法包括：制备混悬液的步骤、制备阵列微管内芯的步骤、制备胶原外皮的步骤以及裁切并组装的步骤。其中，
制备混悬液的步骤包括：称取胶原蛋白和壳聚糖，混匀后溶于乙酸溶液中制得胶原蛋白-壳聚糖混悬液；此步骤中，胶原蛋白与壳聚糖两者之间的重量配比为1：0～5；乙酸溶液的质量浓度为3～8mg/mL，胶原蛋白与壳聚糖两者的重量和与乙酸溶液的重量比为1～10：200。将胶原蛋白与壳聚糖原料溶于乙酸溶液后，用匀浆器在冰水浴条件下进行间歇性搅拌，搅拌速度控制在2500～3500rpm；混匀后用离心机在10000rpm的条件下离心 30min处理，去除气泡。
制备阵列微管内芯的步骤包括：a、将混悬液从内芯模具的一端注入，注入的过程中避免气泡产生，之后在内芯模具的注入端塞入与内径相匹配的导温棒2，将多个注入后的内芯模具连接到匀速下降设备上；b、以1×10-6～1×10-4m/s的速度将内芯模具浸入液氮中进行梯度冷淋；c、待内芯模具完全浸入液面后取出，拔掉导温棒2，将内芯模具置于真空冷冻干燥机中于-60℃、100mtorr条件下冻干24h；d、将冻干后的支架材料与内芯模具分离，浸于质量浓度为0.5～2％的京尼平溶液中于室温条件下交联12～72h；e、将交联后的支架材料用蒸馏水反复清洗；f、将清洗后的支架材料在-80℃超低温条件下冷冻储存 30～60min；g、将支架材料置于真空冷冻干燥机中于-60℃、100mtorr条件下冻干24h，得到阵列微管内芯。
制备阵列微管内芯的步骤用到内芯模具，图1中展示了内芯模具的结构：可以看出内芯模具包括中空管状结构的内模外壳1，最好是采用透明的材料制成，这样便于观察内部混悬液流动情况。内模外壳1的内径为1～8mm、外径为3～20mm；导温棒2的外径等于内模外壳1的内径。
制备胶原外皮的步骤包括：a、将混悬液从外皮模具的一端注入，注入的过程中避免气泡产生，之后在外皮模具内插入中轴棍并设置固定帽；b、将外皮模具浸于pH为6～9 的蒸馏水中，每6h更换一次蒸馏水，重复8～10次；c、将外皮模具取出，去除外皮模具的外壳，将携带胶原凝胶的中轴棍置于干燥箱中烘干处理，干燥后将胶原外皮与中轴棍分离；d、将胶原外皮浸于质量浓度为0.5～2％的京尼平溶液中于室温条件下交联2～72h；e、将交联后的外皮材料用蒸馏水反复清洗；f、将清洗后的外皮材料置于干燥箱中烘干处理，得到成型的胶原外皮。
本实施例中，在制备胶原外皮的步骤的c步骤和f步骤中，干燥温度均不高于37℃。
制备胶原外皮的步骤用到外皮模具，图2中展示了外皮模具的结构，可以看出：外皮模具包括两个外模半壳体3，在每个外模半壳体3的侧壁上均设有多个长条形的开孔6，在各开孔6上均由半透膜封闭；固定帽5设置在扣合后的两个外模半壳体3的两端，在固定帽5的中部设有固定孔，固定孔的内径等于中轴棍4的外径。
裁切并组装的步骤包括：裁切阵列微管内芯得到支架内芯7，裁切胶原外皮得到支架外皮8，将支架内芯7塞入支架外皮8，支架外皮8的长度比支架内芯7的长度大2～10mm，支架产品结构参见图3中所示。
实施例一
一种易缝合高仿真组织工程神经修复支架的制备方法，按照以下步骤进行：
(1)混悬液制备：称取200mg胶原蛋白溶于质量浓度为6mg/mL的4g乙酸溶液中，用匀浆器在冰水浴条件下间歇性搅拌，搅拌速度控制在2500～3500rpm，充分混匀后采用离心机以10000rpm的转速离心30min，去除气泡；
(2)阵列微管内芯制备：将去除气泡后的混悬液于内芯模具的一端注入，注入过程中防止气泡产生，然后在内芯模具的注入端塞入与内模外壳的内径相匹配的导温棒，之后将多个注入后的内芯模具连接到匀速下降设备上；以2×10-5m/s的速度将内芯模具浸入液氮中进行梯度冷淋，待完全浸入液面后取出，拔掉导温棒2，将内芯模具置于真空冷冻干燥机中，于-60℃、100mtorr条件下冻干24h；将冻干后的支架材料与内芯模具分离，浸于质量浓度为2％的京尼平溶液中于室温交联24h，然后将交联后的支架材料用蒸馏水反复清洗；将清洗后的支架材料置于-80℃超低温条件下(如冰箱中)冷冻储存30～60min，然后置于真空冷冻干燥机中于-60℃、100mtorr条件下冻干24h，得到成型的阵列微管内芯。
(3)支架外皮制备：将混悬液从外皮模具的一端注入，在注入过程中防止气泡的产生，插入中轴棍4，塞好固定帽5，然后将外皮模具浸于pH为7的蒸馏水中，每6h更换一次蒸馏水，重复10次；将外皮模具取出，去除外皮模具的外模半壳体3，将携带胶原凝胶的中轴棍4置于干燥箱中37℃烘干处理，干燥后将胶原外皮与中轴棍4分离；将外皮材料浸于质量浓度为2％的京尼平溶液中于室温交联6h，然后将交联后的外皮用蒸馏水反复清洗；将清洗后的外皮置于干燥箱中37℃烘干处理，得到成型的支架外皮。
(4)易缝合高仿真组织工程神经支架制备：将制得的阵列微管内芯用刀片进行切割形成支架内芯7，长度可根据实际需要而定；将制得的胶原外皮用刀片进行切割形成支架外皮8，支架外皮8的长度比支架内芯7的长度大4mm；将支架内芯7塞入支架外皮8中，两端各留出2mm的外皮长度，得到易缝合高仿真组织工程神经支架。
实施例二
与实施例一的不同之处在于：混悬液制备时，称取280mg胶原蛋白和70mg壳聚糖，混匀后溶于5mg/mL的28g乙酸溶液中搅拌处理；阵列微管内芯制备时，注模后以1× 10-6m/s的速度进行梯度冷淋，然后将冻干后的阵列微管内芯浸于1％京尼平溶液中交联 12h；支架外皮制备时，注模后浸于pH为8的蒸馏水中，烘干后浸于1％京尼平中交联24h；易缝合高仿真组织工程神经支架制备时，将支架内芯7塞入支架外皮8后两端各留出3mm 的外皮长度。
实施例三
与实施例一的不同之处在于：混悬液制备时，称取210mg胶原蛋白和140mg壳聚糖，混匀后溶于4mg/mL的35g乙酸溶液中搅拌处理；阵列微管内芯制备时，注模后以1× 10-5m/s的速度进行梯度冷淋，然后将冻干后的阵列微管内芯浸于1.5％京尼平溶液中交联 36h；支架外皮制备时，注模后浸于pH为7.5的蒸馏水中，烘干后浸于1.5％京尼平中交联36h；易缝合高仿真组织工程神经支架制备时，将支架内芯7塞入支架外皮8后两端各留出1mm的外皮长度。
实施例四
与实施例一的不同之处在于：混悬液制备时，称取150mg胶原蛋白和150mg壳聚糖，混匀后溶于5mg/mL的36g乙酸溶液中搅拌处理；阵列微管内芯制备时，注模后以1× 10-4m/s的速度进行梯度冷淋，然后将冻干后的阵列微管内芯浸于2％京尼平溶液中交联24h；支架外皮制备时，注模后浸于pH为7.5的蒸馏水中，烘干后浸于2％京尼平中交联24h；易缝合高仿真组织工程神经支架制备时，将支架内芯7塞入支架外皮8后两端各留出4mm的外皮长度。
实施例五
与实施例一的不同之处在于：混悬液制备时，称取100mg胶原蛋白和250mg壳聚糖，混匀后溶于5mg/mL的70g乙酸溶液中搅拌处理；阵列微管内芯制备时，注模后以5× 10-5m/s的速度进行梯度冷淋，然后将冻干后的阵列微管内芯浸于1.5％京尼平溶液中交联 48h；支架外皮制备时，注模后浸于pH为7.5的蒸馏水中，烘干后浸于1.5％京尼平中交联48h；易缝合高仿真组织工程神经支架制备时，将支架内芯7塞入支架外皮8两端各留出1mm的外皮长度。
需要说明的是以上实施例仅是对本发明的进一步详细说明，并不对本发明进行限定。
图4和图5从微观的角度展示了形成的支架产品(支架内芯7)的情况，可以看出：支架内芯7内部为蜂巢样结构，内部孔径较为均一，与正常神经内部微观结构极为类似；支架内芯7内部轴向为平行的管状结构，并且微管间有广泛的微孔结构相互沟通，可以保证营养物质及代谢产物的运输。
试验验证说明：
比格犬22只，雌雄各半，体重10-13kg，分为3组：自体神经移植组9只，实施例 1支架材料组9只、空白对照组4只。3％戊巴比妥钠1mg/kg和速眠新注射液(846合剂) 0.08ml/kg肌肉注射麻醉，常规备皮消毒。左股后部正中切口彻底暴露坐骨神经及其主要分支，尖刀切除坐骨神经制备30mm长神经缺损。自体神经移植组将切除的坐骨神经翻转 180°缝合。空白对照组常规显露坐骨神经，切除后两神经断端旷置。实施例1支架材料组使用30mm的神经支架材料桥接两神经断端，显微镜下用10/0无损伤缝线将支架外皮两端分别与两断端神经外膜各间断缝合3针。逐层缝合肌肉、筋膜、皮下及皮肤，常规消毒包扎。术后三天均肌肉注射80万单位青霉素，预防感染。
术后常规给予分笼饲养。分别于术后12周和术后24周，通过神经电生理检查、透射电镜、免疫荧光染色、逆行示踪标记等方法，从形态学、功能学等角度进行考量。
实验结果证实支架材料修复效果接近自体神经移植，可以有效促进比格犬这类大型动物周围神经损伤的修复，为进一步进入临床研究提供实验依据。

Claims (7)

1.一种易缝合高仿真组织工程神经修复支架的制备方法，其特征是：包括制备混悬液的步骤、制备阵列微管内芯的步骤、制备胶原外皮的步骤以及裁切并组装的步骤，
制备混悬液的步骤包括：称取胶原蛋白和壳聚糖，混匀后溶于乙酸溶液中制得胶原蛋白-壳聚糖混悬液；
制备阵列微管内芯的步骤包括：
a、将混悬液从内芯模具的一端注入，注入的过程中避免气泡产生，之后在内芯模具的注入端塞入与内径相匹配的导温棒，将多个注入后的内芯模具连接到匀速下降设备上；
b、以1×10-6～1×10-4m/s的速度将内芯模具浸入液氮中进行梯度冷淋；
c、待内芯模具完全浸入液面后取出，拔掉导温棒，将内芯模具置于真空冷冻干燥机中于-60℃、100mtorr条件下冻干24h；
d、将冻干后的支架材料与内芯模具分离，浸于质量浓度为0.5～2％的京尼平溶液中于室温条件下交联12～72h；
e、将交联后的支架材料用蒸馏水反复清洗；
f、将清洗后的支架材料在-80℃超低温条件下冷冻储存30～60min；
g、将支架材料置于真空冷冻干燥机中于-60℃、100mtorr条件下冻干24h，得到阵列微管内芯；
制备胶原外皮的步骤包括：
a、将混悬液从外皮模具的一端注入，注入的过程中避免气泡产生，之后在外皮模具内插入中轴棍并设置固定帽；
b、将外皮模具浸于pH为6～9的蒸馏水中，每6h更换一次蒸馏水，重复8～10次；
c、将外皮模具取出，去除外皮模具的外壳，将携带胶原凝胶的中轴棍置于干燥箱中烘干处理，干燥后将胶原外皮与中轴棍分离；
d、将胶原外皮浸于质量浓度为0.5～2％的京尼平溶液中于室温条件下交联2～72h；
e、将交联后的外皮材料用蒸馏水反复清洗；
f、将清洗后的外皮材料置于干燥箱中烘干处理，得到成型的胶原外皮；
裁切并组装的步骤包括：裁切阵列微管内芯得到支架内芯，裁切胶原外皮得到支架外皮，将支架内芯塞入支架外皮。
2.如权利要求1所述的易缝合高仿真组织工程神经修复支架的制备方法，其特征是：在制备混悬液的步骤中，胶原蛋白与壳聚糖两者之间的重量配比为1：0～5；乙酸溶液的质量浓度为3～8mg/mL，胶原蛋白与壳聚糖两者的重量和与乙酸溶液的重量比为1～10：200。
3.如权利要求2所述的易缝合高仿真组织工程神经修复支架的制备方法，其特征是：在制备混悬液的步骤中，胶原蛋白与壳聚糖原料溶于乙酸溶液后，用匀浆器在冰水浴条件下间歇性搅拌，搅拌速度控制在2500～3500rpm；混匀后用离心机在10000rpm的条件下离心30min处理，去除气泡。
4.如权利要求1所述的易缝合高仿真组织工程神经修复支架的制备方法，其特征是：内芯模具包括中空管状结构的内模外壳，内径为1～8mm、外径为3～20mm；导温棒的外径等于内模外壳的内径。
5.如权利要求1所述的易缝合高仿真组织工程神经修复支架的制备方法，其特征是：外皮模具包括两个外模半壳体，在每个外模半壳体的侧壁上均设有多个长条形的开孔，在各开孔上均由半透膜封闭；固定帽设置在扣合后的两个外模半壳体的两端，在固定帽的中部设有固定孔，固定孔的内径等于中轴棍的外径。
6.如权利要求1所述的易缝合高仿真组织工程神经修复支架的制备方法，其特征是：在制备胶原外皮的步骤中，其中c步骤和f步骤中的干燥温度均不高于37℃。
7.如权利要求1-6任一项所述的易缝合高仿真组织工程神经修复支架的制备方法，其特征是：在裁切并组装的步骤中，支架外皮的长度比支架内芯的长度大2～10mm。
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