CN108114315A - 一种双丝素蛋白神经移植物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种双丝素蛋白神经移植物，其特征在于具有桑蚕丝丝素纤维编织而成的骨架和柞蚕丝素蛋白外壳。本发明结合桑蚕丝与柞蚕丝的性质特点，提高了丝素蛋白神经移植物的力学性能。本发明制得的移植物既具有高机械强度又具有良好柔韧性，可以承受缝合线的拉伸，导管形变50％时，抗压强度可达1.8N，对快速促进神经再生并实现长距离缺损神经修复具有非常重要的临床意义。

Description

一种双丝素蛋白神经移植物
技术领域
本发明属于生物医学材料领域，具体涉及一种用于桥接缺损神经的双丝素蛋白神经移植物。
背景技术
神经损伤是一种常见的临床病症，其引起的身体功能性缺失给患者带来很大的伤害与不便，也给家庭乃至整个社会带来了沉重的经济和精神负担。周围神经系统有一定的再生能力，对于短距离的神经缺损，损伤神经能自我再生，并重新建立相应的功能。但修复长距离的缺损，则需要借助于神经移植才能完成。虽然自体移植仍然是目前修复神经缺损的主要手段，但疗效有限，且也存在诸多不足，如来源匮乏、供体部位出现失神经功能障碍、供体尺寸和组织结构难以匹配等。因此，人们开始致力于寻找人工神经移植物来代替自体神经，桥接修复周围神经缺损。对于中枢神经系统中脊髓损伤的治疗，临床上所采取的手术干预、药物治疗等措施，虽然能使运动功能稍微得到改善，但不能完全治愈并恢复相应的功能。而自体神经移植物的治疗，疗效也是非常有限的。生物材料学、分子生物学、组织工程学等新兴学科的发展，为神经损伤的修复提供了新的思路。在过去几十年中，人们用天然的或合成的生物聚合物，制备了具有各种结构、含各种组分的神经移植物。但这些人工神经移植物的修复效果仍然不能满足临床需要，尤其是对于粗大神经缺损，因此，开发能快速促进神经再生并能实现长距离缺损神经修复的新型神经移植物具有非常重要的科学意义。
丝素蛋白是蚕丝的主要组成成分，因其良好的生物相容性、无毒、可控的生物降解能力受到人们广泛的关注。丝素蛋白作为一种常见的生物可降解的天然材料，已被广泛应用于组织工程领域，包括手术缝合线、药物载体、微胶囊等。目前用单一的传统方法(如冷冻干燥法、静电纺丝法、旋转蒸发法等)制备的丝素蛋白组织工程支架力学性能较差，尤其是柔韧性和强度方面相对欠缺，不能满足临床要求。
发明内容
本发明针对现有技术不足，利用桑蚕丝和柞蚕丝不同的性能特点，将冷冻干燥法和编织法相结合，得到了一种既具有高机械强度又具有良好柔韧性的神经移植物。
本发明具体技术方案如下：
一种双丝素蛋白神经移植物，具有桑蚕丝丝素纤维编织而成的骨架和柞蚕丝素蛋白外壳。优选的，所述骨架为网状纤维。优选的所述移植物为神经导管，所述导管的管壁具有疏松多孔的结构。导管的内径为1-5mm，导管壁厚为1-2mm。导管的长度为1-8cm。
优选的，所述移植物表面还包覆有营养因子和/或细胞。
所述细胞包括来源于自体或异体，为雪旺细胞、成纤维细胞、骨髓间充质干细胞、脐带血干细胞或者皮肤干细胞中的一种或几种组合。
所述营养因子为神经生长因子(NGF)、碱性成纤维生长因子(bFGF)、脑源神经营养因子(BDNF)、神经营养因子3(NT-3)、胶质细胞源神经营养因子(GDNF)中的一种或几种。
本发明另一目的在于提供本发明所述的双丝素蛋白神经移植物的制备方法，包括如下步骤：
(1)取桑蚕丝，脱去丝胶，制备桑蚕丝素纤维；
(2)制备再生柞蚕丝素蛋白溶液；
(3)以金属轴作为内芯，步骤(1)桑蚕丝素蛋白纤维绕在携纱器上，用编织机编织桑蚕丝丝素纤维骨架；
(4)将步骤(3)制得的桑蚕丝丝素纤维网状骨架置于模具中，将步骤(2)制得的再生柞蚕丝素蛋白溶液倒入模具，冷冻干燥形成导管。
优选的，步骤(4)使用质量体积百分比为5-10％再生柞蚕丝素蛋白溶液。
优选的，所述的制备方法还包括步骤(5)将步骤(4)制得的导管浸泡在乙醇溶液中使之变性，再用去离子水浸泡洗涤，自然晾干，即得双丝素蛋白神经移植物。优选乙醇溶液的浓度为60％。
进一步的，可将双丝素蛋白神经移植物浸泡在含有营养因子和/或细胞的溶液中，冷冻干燥，制得含营养因子和/或细胞的双丝素蛋白神经移植物。或者将含有营养因子和/或细胞的再生柞蚕丝素蛋白溶液倒入模具，冷冻干燥形成导管，再进行后续操作。
本发明的一个具体的制备方法：
(1)取桑蚕丝，在0.2％的Na2CO3溶液中煮沸以脱去外层丝胶，每次30分钟，重复3次，三蒸水充分洗涤，然后置于超净台晾干，得桑蚕丝素纤维；
(2)取柞蚕丝，放于0.2％的Na2CO3溶液中煮沸，每次30分钟，重复3次，三蒸水充分洗涤，然后置于超净台晾干，得柞蚕丝素蛋白。将柞蚕丝素蛋白溶解在硫氰酸锂溶液(9mol/L)中，将溶液装入截留分子量10-14KD的透析管中透析，得再生柞蚕丝素蛋白溶液；
(3)以金属轴作为内芯，将脱胶后的桑蚕丝素蛋白纤维绕在携纱器(16个)上，用编织机编织桑蚕丝丝素纤维骨架。编织物向上的牵拉速度为3.6-5.4cm/min，携纱器旋转速度为2.5-4.4rpm。通过力学性能的测试，确定最优牵拉速度和旋转速度；
(4)所得桑蚕丝丝素纤维骨架置于模具中，配置浓度为5-10％的再生柞蚕丝素蛋白溶液倒入模具，-70℃冷冻干燥形成导管；
(5)将导管浸泡在60％乙醇中12小时使之变性，再用去离子水浸泡洗涤，自然晾干，即得双丝素蛋白神经移植物。
本发明的产品所用原料为高纯度的丝素蛋白，产品不含有由于制备工艺引入的外源性毒、副作用物质。导管管壁是具有丰富微孔的三维结构，该结构有利于神经细胞的粘附、生长，有利于神经细胞生长过程中所需的营养物质的输送，也为神经细胞的生长提供了必要的诱导作用和必须的生长空间。
本发明所述的双丝素蛋白神经移植物在体外与神经组织细胞联合培养，形态观察、神经生长因子的表达测定等，均显示该产品具有良好的组织相容性。力学测试结果(包括拉伸、压缩、抗手术缝合线拉伸)表明产品具有良好的力学性能。
本发明优点：
桑蚕丝与柞蚕丝都是由蚕体内的绢丝腺分泌出的丝液通过吐丝口后凝固而成的蛋白质纤维，但是两者性质略有差异：桑蚕丝的单根纤维纤度约为2.5-3.0旦尼尔，柞蚕丝约为5.5-6旦尼尔；桑蚕丝的丝胶含量比柞蚕丝多；柞蚕丝纤维的横截面具有很多毛细孔，为多孔性构造。而桑蚕丝则为致密性构造，没有毛细孔；柞蚕丝纺织制品刚性更强。本发明通过研究，结合桑蚕丝与柞蚕丝的性质特点，以提高丝素蛋白神经移植物的力学性能。本发明制得的导管移植物可以承受缝合线的拉伸，导管形变50％时，抗压强度可达1.8N。
本发明制备过程中不添加任何发泡剂、交联剂或表面活性剂，所制得的神经移植物不含任何外源性毒副作用的物质。
此外，柞蚕丝素分子中分布着高度重复的精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸(RGD)三肽序列，该序列可作为细胞整合素与配体蛋白相互作用的识别位点，介导细胞与细胞外基质间的粘附作用，同时具有信号传导功能，可激发细胞的增殖、分化等。因此，将柞蚕丝素蛋白作为生物材料，制备成神经移植物，具有更好的生物学性能。
附图说明
图1为细胞粘附与生长性能考察结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的说明。
实施例一本发明所述双丝素蛋白神经移植物的制备
(1)桑蚕丝丝素纤维的制备：取桑蚕丝，在0.2％的Na2CO3溶液中煮沸以脱去外层丝胶，每次30分钟，重复3次，三蒸水充分洗涤，然后置于超净台晾干，得桑蚕丝素纤维。
(2)柞蚕丝丝素蛋白的制备：取25g柞蚕丝，放于1000ml0.2％的Na2CO3溶液中煮沸，每次30分钟，重复3次，三蒸水充分洗涤，然后置于超净台晾干，得柞蚕丝素蛋白。
再生柞蚕丝素蛋白的准备：取上述制备的柞蚕丝素蛋白6g溶解在25mL硫氰酸锂溶液(9mol/L)中，得褐色溶液，溶解温度为40℃，将溶液装入纤维素管(截留分子量：10-14KD)内，4℃条件下，用三蒸水透析3天，得到黄褐色柞蚕丝素蛋白溶液(浓度约3％)。将此溶液冷冻干燥，得再生柞蚕丝素蛋白固体。
(3)以金属轴作为内芯，将脱胶后的桑蚕丝素蛋白纤维绕在携纱器(16个)上，用编织机编织桑蚕丝丝素纤维网。编织物向上的牵拉速度为3.6-5.4cm/min，携纱器旋转速度为2.5-4.4rpm。通过力学性能的测试，确定最优牵拉速度和旋转速度。
(4)将所得桑蚕丝素蛋白纤维网置于模具中，将步骤(2)制得的3％的再生柞蚕丝素蛋白溶液浓缩至5-10％，倒入模具，-70℃冷冻干燥形成导管。
(5)将所得导管浸泡在60％乙醇中12小时使之变性，再用去离子水浸泡洗涤，自然晾干，即得本发明所述双丝素蛋白神经移植物。
实施例二对照组导管的制备
参照实施例一的方法制备具有桑蚕丝丝素骨架和外壳的导管(对照1)。
将3％的再生柞蚕丝素蛋白溶液浓缩至5-10％，倒入模具，-70℃冷冻干燥形成导管。将所得导管浸泡在60％乙醇中12小时使之变性，再用去离子水浸泡洗涤，自然晾干，得到仅具有柞蚕丝素蛋白外壳的导管(对照2)。
实施例三细胞粘附与生长性能考察
(1)桑蚕丝素蛋白膜的制备：将实施例一(1)所得桑蚕丝素纤维溶解在三元溶剂体系中(无水CaCl2：无水C2H5OH：三蒸水＝1:2:8)得到黄色透明溶液，溶解温度73±2℃。溶液置于纤维素管(截留分子量：12-14KD)内，用三蒸水透析3天。透析好的丝素溶液倒于培养皿，放在超净台中鼓风晾干。待晾干后揭下即形成桑蚕丝素膜。
(2)柞蚕丝素蛋白膜的制备：将实施例一(2)透析后的柞蚕丝素蛋白溶液倒于培养皿，放在超净台中鼓风晾干。待晾干后揭下即形成柞蚕丝素膜。
(3)细胞培养：将步骤(1)、(2)制备的丝素膜灭菌处理，然后将原代培养的雪旺氏细胞种植在丝素蛋白膜上，种植后1,3,5天拍照观察。结果如图1，可见柞蚕丝素蛋白膜更有利于细胞的粘附与生长。
实施例四力学性能考察
将实施例一和二制备的导管裁剪成3cm长度，然后分别将其在PBS溶液中浸泡10min，滤纸吸干水分。每种丝素蛋白导管至少保证成功获得5个平行数据以确保重复性和数据的准确性。室温下将制备的所有样品使用电子万能试验机(TFW-58)进行力学性能测试。
(1)神经导管拉伸测试
测试时为了保持导管的圆筒状，拉伸过程中夹头附近因应力集中而破坏导管的结构，我们在夹持时，将导管两端分别插入与其内径相匹配的柱形棒，外面包裹纱布保护，然后使用万能试验机的夹持板夹住，进行拉伸试验。初始试验力为0.5N，拉伸速度10mm/min。拉伸过程中，保证导管不发生倾斜和扭转。
(2)神经导管抗缝合线拉力测试
将样品一端插入与其内径相匹配的柱形棒，外面包裹纱布保护，用万能试验机的下端夹持板夹住，距另一端1.5mm处，用手术缝合线穿过管壁，缝合线固定在万能试验机上端，进行抗缝合线拉力测试，记录将缝合线从导管壁中拉出或者管壁破时的拉力大小。初始试验力为0.5N，拉伸速度1mm/min。
对神经导管，临床应用一个很重要的方面就是要能经得住手术缝合线的拉伸。抗手术缝合线强度常用拉力与2倍导管壁厚的比值(F拉/2t)来衡量，拉力即指按上述方法测得的拉力。
(3)神经导管抗压性能测试
取样品放于万能试验机两平行夹板之间进行抗压测试。下压速度1mm/min，记录导管形变10％、20％、30％、40％、50％时的荷重。
结果如表1所示。结果表明，本发明所述双丝素蛋白神经移植物具有优越的力学性能。
表1
注：表中t指导管壁厚。
实施例五含生长因子的双丝素蛋白神经移植物
室温下，将一定浓度(5mg/mL、10mg/mL、50mg/mL)的具有促进神经生长的因子(NGF、BDNF或GDNG)与实施例一步骤(4)中浓缩后的柞蚕丝素蛋白溶液混合反应，形成新的溶液，然后按实施例一的步骤制备含生长因子的柞蚕丝素蛋白神经移植物。

Claims (10)

1.一种双丝素蛋白神经移植物，其特征在于具有桑蚕丝丝素纤维编织而成的骨架和柞蚕丝素蛋白外壳。
2.根据权利要求1所述的移植物，其特征在于所述移植物为神经导管。
3.根据权利要求2所述的移植物，其特征在于所述导管的管壁具有疏松多孔的结构。
4.根据权利要求2所述的移植物，其特征在于所述导管的内径为1-5mm，导管壁厚为1-2mm。
5.根据权利要求2所述的移植物，其特征在于所述导管的长度为1-8cm。
6.根据权利要求1所述的移植物，其特征在于所述移植物表面还包覆有营养因子和/或细胞。
7.根据权利要求1-6所述的双丝素蛋白神经移植物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)取桑蚕丝，脱去丝胶，制备桑蚕丝素纤维；
(2)制备再生柞蚕丝素蛋白溶液；
(3)以金属轴作为内芯，步骤(1)桑蚕丝素蛋白纤维绕在携纱器上，用编织机编织桑蚕丝丝素纤维骨架；
(4)将步骤(3)制得的桑蚕丝丝素纤维骨架置于模具中，将步骤(2)制得的再生柞蚕丝素蛋白溶液倒入模具，冷冻干燥形成导管。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于步骤(4)使用质量体积百分比为5-10％再生柞蚕丝素蛋白溶液。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于还包括步骤(5)将步骤(4)制得的导管浸泡在乙醇溶液中使之变性，再用去离子水浸泡洗涤，自然晾干，即得双丝素蛋白神经移植物。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于乙醇溶液的浓度为60％。
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