CN114504684A - 一种自修复丝素蛋壳膜神经支架的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医用组织工程材料制备技术领域，公开了一种自修复丝素蛋壳膜神经支架的制备方法。包括：高碘酸钠氧化硫酸软骨素(CS)，获得醛基化硫酸软骨素(CS‑CHO)；将多巴胺(DA)的酰胺接枝在醛基硫酸软骨素上，获得多巴胺‑醛基化硫酸软骨素(DA‑CS‑CHO)；通过辣根过氧化物酶(Hrp)诱导DA‑CS‑CHO接枝在蛋壳膜上；基于层层自组装技术，通过希夫碱相互作用，将柞蚕、家蚕丝素蛋白溶液和醛基化硫酸软骨素交替自组装在改性蛋壳膜上，获得自修复丝素蛋壳膜神经支架。本发明提供的方法简单有效，操作简便，该支架由于具有良好的自修复、力学强度和促进神经再生功能，可满足其更多实际应用。

Description

一种自修复丝素蛋壳膜神经支架的制备方法
技术领域
本发明属于医用组织工程材料制备技术领域，涉及一种自修复丝素蛋壳膜神经支架的制备方法。
背景技术
周围神经损伤是一种全球性临床疾病，严重影响人类的健康与生活。目前，采用自体神经或人工神经支架桥接修复是临床上治疗周围神经缺损的有效措施，但仍受供体移植物的来源有限、尺寸不匹配、术后功能障碍、再生能力差和二次手术风险等限制。因此，构建理想的神经支架是修复周围神经缺损的关键所在。
目前，组织工程化神经支架的研究主要集中在支架材料和制作工艺方面，其中在支架材料的选择上，研究者更倾向于天然高分子生物材料，如胶原蛋白、壳聚糖和丝素蛋白，通过将其加工成管状结构的神经引导通道，引导神经生长方向，同时为神经再生提供适当空间。特别是天然丝素蛋白，因其拥有优于其它天然纤维的拉伸和抗压机械性能、极好的生物相容性、生物降解性以及低免疫原性，在组织再生工程研究中深受广大研究人员的青睐。Yang等利用甲醇溶液处理丝素蛋白制备周围神经微导管，通过修复大鼠坐骨神经缺损实验，发现其能够促进神经的再生及损伤轴突的延伸。但这类由纯丝素蛋白通过物理、化学交联制备的组织支架材料仍然存在力学性能较差的缺点，从而限制了其进一步在组织再生工程方面的应用。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供一种自修复丝素蛋壳膜神经支架的制备方法，该方法操作简便，所制备的支架具有自修复性能，具有一定力学强度和良好的生物相容性。
本发明提供了一种自修复丝素蛋壳膜神经支架的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.将高碘酸钠加入硫酸软骨素溶液，避光反应10-12h，再加入乙二醇终止反应，透析，冷冻干燥，获得醛基化硫酸软骨素；
S2.将盐酸加入蒸馏水得到pH 5.0的水，取pH 5.0的水溶解多巴胺，得到多巴胺溶液，pH 5.0的水溶解醛基化硫酸软骨素和NHS、EDC，得到醛基化硫酸软骨素溶液，将多巴胺溶液和醛基化硫酸软骨素溶液混合，抽真空充氮气，在无氧环境下反应8-12h，透析，冷冻干燥，获得多巴胺-醛基化硫酸软骨素，制备多巴胺-醛基化硫酸软骨素溶液；
S3.在所述多巴胺-醛基化硫酸软骨素溶液中加入辣根过氧化物酶和H2O2溶液，得混合溶液，将蛋壳膜在所述混合溶液中37℃浸泡2h，取出后用家蚕丝素蛋白溶液浸泡30分钟，获得家蚕丝素蛋白改性蛋壳膜；
其中，所述多巴胺-醛基化硫酸软骨素溶液、所述辣根过氧化物酶、所述H2O2溶液的体积比为400:100:1；
S4.将家蚕丝素蛋白改性蛋壳膜依次在醛基硫酸软骨素溶液、柞蚕丝素蛋白溶液和家蚕丝素蛋白溶液中浸泡，重复该操作50-70次，获得自修复丝素蛋壳膜神经支架。
进一步的，步骤S1中，所述硫酸软骨素溶液的浓度为50-100mg/mL。
进一步的，步骤S1中，所述硫酸软骨素溶液中的硫酸软骨素与所述高碘酸钠的质量比为10:7。
进一步的，步骤S1中，所述硫酸软骨素溶液与所述乙二醇的用量比为100mL：(5-10)mL。
进一步的，步骤S2中，所述多巴胺溶液的浓度为5.125-10.25mg/mL。
进一步的，步骤S2中，所述多巴胺溶液与所述醛基化硫酸软骨素溶液的用量比为1mL:4mL。
进一步的，步骤S2中，所述醛基化硫酸软骨素溶液中，醛基化硫酸软骨素的浓度为6.25-12.5mg/mL；NHS的浓度为1.29-2.58mg/mL；EDC的浓度为2.15-4.31mg/mL。
进一步的，步骤S2中，所述透析具体为：pH 5.0的水透析2天，蒸馏水透析半天。
进一步的，其特征在于，步骤S3中，所述多巴胺-醛基化硫酸软骨素溶液中，多巴胺-醛基化硫酸软骨素的浓度为5-10mg/mL；所述辣根过氧化物酶的浓度为1-2mg/mL；所述H2O2溶液的浓度为0.85μL/mL。
进一步的，步骤S4中，所述柞蚕丝素蛋白溶液的浓度为15-20mg/mL；家蚕丝素蛋白溶液的浓度为15-20mg/mL；醛基化硫酸软骨素溶液的浓度为15-20mg/mL。
与现有技术相比，本发明提供的技术方案基于层层自组装技术，通过可逆席夫碱作用，将丝素蛋白与醛基化硫酸软骨素交替沉积在蛋壳膜上形成自修复涂层，以丝素蛋白和醛基化硫酸软骨素反应生成的可逆席夫碱键，作为涂层赋予了神经支架优良的自修复性能。其中，蛋壳膜含有丰富的胶原蛋白，作为一种神经支架的增强材料可改善丝素蛋白较差的力学性能和生物相容性，进一步增强支架稳定性，从而促进缺损神经修复。
附图说明
图1是实施例1制备方法中蛋壳膜、家蚕丝素蛋白改性蛋壳膜和自修复丝素蛋壳膜神经支架的实物示意图(从左至右的顺序)；
图2是光学显微镜下观察到的实施例1制备出的自修复丝素蛋壳膜神经支架的自修复过程示意图；
图3是实施例1制备出的自修复丝素蛋壳膜神经支架的力学示意图。
具体实施方式
为了进一步了解本发明，下面结合实施例对本发明的优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点而不是对本发明专利要求的限制。
实施例1
1)配置100mL浓度为50mg/mL的硫酸软骨素溶液，加入3.5g高碘酸钠，避光反应10h，再加入5mL乙二醇终止反应，蒸馏水透析3天，冷冻干燥，获得醛基化硫酸软骨素；
2)将盐酸加入蒸馏水得到pH 5.0的水，取20mL pH 5.0的水溶解0.205g多巴胺，得到浓度为10.25mg/mL的多巴胺溶液，取80mL pH 5.0的水溶解1g醛基化硫酸软骨素和0.207g NHS、0.345g EDC，得到醛基化硫酸软骨素溶液，将多巴胺溶液和醛基化硫酸软骨素溶液混合，抽真空充氮气，在无氧环境下反应12h，透析，冷冻干燥，获得多巴胺-醛基化硫酸软骨素；
3)将蛋壳膜浸泡在4mL浓度为5mg/mL多巴胺-醛基硫酸软骨素溶液，加入1mL浓度为1mg/mL辣根过氧化酶和10μL浓度为0.85μL/mL的H2O2溶液，37℃孵育2h，取出蛋壳膜，清洗后浸泡在15mg/ml家蚕丝素蛋白溶液30分钟，获得家蚕丝素蛋白改性蛋壳膜；
4)基于层层自组装技术，首先将家蚕丝素蛋白改性蛋壳膜浸泡在20mg/ml醛基硫酸软骨素溶液中15分钟，然后取出浸泡在20mg/ml柞蚕丝素蛋白溶液中15分钟，最后取出浸泡在20mg/ml家蚕丝素蛋白溶液中15分钟，重复以上步骤数次，周期为60，获得自修复丝素蛋壳膜神经支架。
图1是实施例1制备方法中蛋壳膜、家蚕丝素蛋白改性蛋壳膜和自修复丝素蛋壳膜神经支架的实物示意图，从左至右依次为蛋壳膜、家蚕丝素蛋白改性蛋壳膜和自修复丝素蛋壳膜神经支架的实物示意图；
光学显微镜观察下，在实施例1获得的自修复丝素蛋壳膜神经支架上划伤，在伤痕上滴蒸馏水，在水蒸发后发现伤痕愈合，过程如图2所示，证实该支架材料具有自修复性能。
实施例2
1)配置100mL浓度为100mg/mL的硫酸软骨素溶液，加入7g高碘酸钠，避光反应12h，再加入10mL乙二醇终止反应，蒸馏水透析3天，冷冻干燥，获得醛基化硫酸软骨素；
2)将盐酸加入蒸馏水得到pH 5.0的水，取20mL pH 5.0的水溶解0.1025g多巴胺，得到浓度为10.25mg/mL的多巴胺溶液，取80mL pH 5.0的水溶解0.5g醛基化硫酸软骨素和0.1035g NHS、0.1725g EDC，得到醛基化硫酸软骨素溶液，将多巴胺溶液和醛基化硫酸软骨素溶液混合，抽真空充氮气，在无氧环境下反应8h，透析，冷冻干燥，获得多巴胺-醛基化硫酸软骨素；
3)将蛋壳膜浸泡在4mL浓度为10mg/mL多巴胺-醛基硫酸软骨素溶液，加入1mL浓度为1mg/mL辣根过氧化酶和10μL浓度为0.85μL/mL的H2O2溶液，37℃孵育2h，取出蛋壳膜，清洗后浸泡在15mg/ml家蚕丝素蛋白溶液30分钟，获得家蚕丝素蛋白改性蛋壳膜；
4)基于层层自组装技术，首先将家蚕丝素蛋白改性蛋壳膜浸泡在20mg/ml醛基硫酸软骨素溶液中15分钟，然后取出浸泡在20mg/ml柞蚕丝素蛋白溶液中15分钟，最后取出浸泡在20mg/ml家蚕丝素蛋白溶液中15分钟，重复以上步骤数次，周期为60，获得自修复丝素蛋壳膜神经支架。
实施例3
1)配置100mL浓度为50mg/mL的硫酸软骨素溶液，加入3.5g高碘酸钠，避光反应10h，再加入5mL乙二醇终止反应，蒸馏水透析3天，冷冻干燥，获得醛基化硫酸软骨素；
2)将盐酸加入蒸馏水得到pH 5.0的水，取10mL pH 5.0的水溶解0.205g多巴胺，得到浓度为10.25mg/mL的多巴胺溶液，取40mL pH 5.0的水溶解1g醛基化硫酸软骨素和0.207g NHS、0.345g EDC，得到醛基化硫酸软骨素溶液，将多巴胺溶液和醛基化硫酸软骨素溶液混合，抽真空充氮气，在无氧环境下反应8h，透析，冷冻干燥，获得多巴胺-醛基化硫酸软骨素；
3)将蛋壳膜浸泡在4mL浓度为5mg/mL多巴胺-醛基硫酸软骨素溶液，加入1mL浓度为1mg/mL辣根过氧化酶和10μL浓度为0.85μL/mL的H2O2溶液，37℃孵育2h，取出蛋壳膜，清洗后浸泡在15mg/ml家蚕丝素蛋白溶液30分钟，获得家蚕丝素蛋白改性蛋壳膜；
4)基于层层自组装技术，首先将家蚕丝素蛋白改性蛋壳膜浸泡在20mg/ml醛基硫酸软骨素溶液中15分钟，然后取出浸泡在20mg/ml柞蚕丝素蛋白溶液中15分钟，最后取出浸泡在20mg/ml家蚕丝素蛋白溶液中15分钟，重复以上步骤数次，周期为60，获得自修复丝素蛋壳膜神经支架。
力学测试
将纯丝素蛋白膜(SF)和实施例1制备得到的自修复丝素蛋壳膜神经支架(60T)剪成相同大小，宽5mm，长4cm，再将材料的两端固定在传感器的夹具上，进行拉伸性能测试，记录从开始到材料断裂的力学数据并分析，结果如图3所示。可见，自修复丝素蛋壳膜增强了丝素膜延伸率，从而增强了丝素膜的韧性，提高其力学性能。
以上对本发明提供的一种高粘附天然蛋壳膜壳聚糖水凝胶的制备方法进行了详细的介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想，包括最佳方式，并且也使得本领域的任何技术人员都能够实践本发明，包括制造和使用任何装置或系统，和实施任何结合的方法。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。本发明专利保护的范围通过权利要求来限定，并可包括本领域技术人员能够想到的其他实施例。如果这些其他实施例具有不是不同于权利要求文字表述的结构要素，或者如果它们包括与权利要求的文字表述无实质差异的等同结构要素，那么这些其他实施例也应包含在权利要求的范围内。

Claims (10)

1.一种自修复丝素蛋壳膜神经支架的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.将高碘酸钠加入硫酸软骨素溶液，避光反应10-12h，再加入乙二醇终止反应，透析，冷冻干燥，获得醛基化硫酸软骨素；
S2.将盐酸加入蒸馏水得到pH 5.0的水，取pH 5.0的水溶解多巴胺，得到多巴胺溶液，pH 5.0的水溶解醛基化硫酸软骨素和NHS、EDC，得到醛基化硫酸软骨素溶液，将多巴胺溶液和醛基化硫酸软骨素溶液混合，抽真空充氮气，在无氧环境下反应8-12h，透析，冷冻干燥，获得多巴胺-醛基化硫酸软骨素，制备多巴胺-醛基化硫酸软骨素溶液；
S3.在所述多巴胺-醛基化硫酸软骨素溶液中加入辣根过氧化物酶和H2O2溶液，得混合溶液，将蛋壳膜在所述混合溶液中37℃浸泡2h，取出后用家蚕丝素蛋白溶液浸泡30分钟，获得家蚕丝素蛋白改性蛋壳膜；
其中，所述多巴胺-醛基化硫酸软骨素溶液、所述辣根过氧化物酶、所述H2O2溶液的体积比为400:100:1；
S4.将家蚕丝素蛋白改性蛋壳膜依次在醛基硫酸软骨素溶液、柞蚕丝素蛋白溶液和家蚕丝素蛋白溶液中浸泡，重复该操作50-70次，获得自修复丝素蛋壳膜神经支架。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述硫酸软骨素溶液的浓度为50-100mg/mL。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述硫酸软骨素溶液中的硫酸软骨素与所述高碘酸钠的质量比为10:7。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述硫酸软骨素溶液与所述乙二醇的用量比为100mL：(5-10)mL。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述多巴胺溶液的浓度为5.125-10.25mg/mL。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述多巴胺溶液与所述醛基化硫酸软骨素溶液的用量比为1mL:4mL。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述醛基化硫酸软骨素溶液中，醛基化硫酸软骨素的浓度为6.25-12.5mg/mL；NHS的浓度为1.29-2.58mg/mL；EDC的浓度为2.15-4.31mg/mL。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述透析具体为：pH 5.0的水透析2天，蒸馏水透析半天。
9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述多巴胺-醛基化硫酸软骨素溶液中，多巴胺-醛基化硫酸软骨素的浓度为5-10mg/mL；所述辣根过氧化物酶的浓度为1-2mg/mL；所述H2O2溶液的浓度为0.85μL/mL。
10.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S4中，所述柞蚕丝素蛋白溶液的浓度为15-20mg/mL；家蚕丝素蛋白溶液的浓度为15-20mg/mL；醛基化硫酸软骨素溶液的浓度为15-20mg/mL。
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