CN115161793B - 一种胶原蛋白水凝胶纤维材料及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种胶原蛋白水凝胶纤维材料及其制备方法和应用。所述方法为：采用醋酸盐缓冲液将I型胶原和水溶性高分子聚合物分别配制成胶原纺丝液和高分子聚合物纺丝液；以胶原纺丝液作为芯层纺丝液并以高分子聚合物纺丝液作为壳层纺丝液，通过同轴静电纺丝，制得具有芯壳结构的纤维材料；将所述具有芯壳结构的纤维材料置于含有乙醇的碱性缓冲液中处理0.5～1h，再经洗涤以去除壳层，得到胶原蛋白水凝胶纤维材料。本发明制得了具有与天然胶原相似的生物活性的胶原蛋白水凝胶纤维，保持了胶原的三螺旋结构，还可以使得胶原蛋白水凝胶具有取向性。

Description

一种胶原蛋白水凝胶纤维材料及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，尤其涉及一种胶原蛋白水凝胶纤维材料及其制备方法和应用。
背景技术
胶原蛋白是细胞外基质的主要成分，广泛存在于皮肤、血管和肌腱等组织中，它由三股螺旋的原胶原组成，原胶原由两条α1链和一条α2链构成，三条肽链都具有螺旋构象，三股螺旋常有4-羟脯氨酸，产生氢键和氧桥，形成强度很高的原胶原纤维，使结构相对牢固，5根原胶原纤维轴向平行地聚集在一起形成微纤维，微纤维进一步组装成胶原纤维，二价交联再形成三价交联，进而连接微纤维构成纤维网状结构。这种结构提供了具有高强度和各向异性机械性能的细胞外基质。
从活组织中提取的胶原蛋白具有良好的生物相容性和生物活性，以水凝胶的形式被广泛应用于再生医学中的细胞支架，然而这种胶原水凝胶不同于天然活组织的各向异性的三维结构，具有各向同性和均匀的结构，大量研究证实细胞外基质不仅仅是细胞粘附的支架，其结构还会影响细胞的排列和形态，进而影响细胞的功能，如增殖和分化。
有研究通过在柱状管中冻干胶原溶液，制备具有各向异性的胶原水凝胶，然而这种方法胶原凝胶的性状和纤维直径均受到限制；静电纺丝也是获得各向异性纳米纤维束的一种简便方法，然而，必须使用高极性有机溶剂，如六氟异丙醇或2,2,2-三氟乙醇，然而，这些溶剂干扰了胶原分子之间的氢键，破坏了有序的三螺旋结构，通过静电纺丝获得的胶原纤维变性为明胶纤维，同时，如果不使用交联剂处理，明胶纤维会溶解在水中。
综上，非常有必要提供一种新的胶原蛋白水凝胶纤维材料及其制备方法和应用。
发明内容
为了解决现有技术中存在的一个或者多个技术问题，本发明提供了一种胶原蛋白水凝胶纤维材料及其制备方法和应用。
本发明在第一方面提供了一种胶原蛋白水凝胶纤维材料的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)采用醋酸盐缓冲液将I型胶原和水溶性高分子聚合物分别配制成胶原纺丝液和高分子聚合物纺丝液；
(2)以胶原纺丝液作为芯层纺丝液并以高分子聚合物纺丝液作为壳层纺丝液，通过同轴静电纺丝，制得具有芯壳结构的纤维材料；
(3)将所述具有芯壳结构的纤维材料置于含有乙醇的碱性缓冲液中处理0.5～1h，再经洗涤以去除壳层，得到胶原蛋白水凝胶纤维材料。
优选地，在步骤(1)中：所述I型胶原为胶原蛋白海绵；所述水溶性高分子聚合物为聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、聚氧乙烯、聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种；所述醋酸盐缓冲液的浓度为12～18mM优选为15mM，pH为3.5～4优选为3.6；所述胶原纺丝液的浓度为0.8～1.4w/v％优选为1w/v％；和/或所述高分子聚合物纺丝液的浓度为7.5～40w/v％优选为40w/v％。
优选地，在步骤(2)中：在进行同轴静电纺丝时，芯层纺丝液的流速为0.2～1mL/h优选为0.4mL/h，壳层纺丝液的流速为0.3～2mL/h优选为0.6mL/h，更优选的是，所述芯层纺丝液与所述壳层纺丝液的流速比为1：(1.5～3)。
优选地，在步骤(2)中：在进行同轴静电纺丝时，以圆柱形接收器或不锈钢管作为接收装置，所述圆柱形接收器上包覆有铝箔；所述圆柱形接收器或不锈钢管的转速为1500～2200r/min，所述圆柱形接收器的直径为6～10cm，所述不锈钢管的直径为2～5mm；在进行同轴静电纺丝时，接收距离为5～10cm，高压直流电源的电压为18～36kV优选为22kV，进行同轴静电纺丝的时间为2～4h优选为3h。
优选地，在步骤(2)中：进行同轴静电纺丝采用的同轴注射针头由内外两个不同直径的金属针头组成，其中，内层针头的内径为0.21mm，外径为0.61mm，外层针头的内径为0.84mm，外径1.24mm。
优选地，在步骤(3)中：所述含有乙醇的碱性缓冲液为含有乙醇的PBS缓冲液；所述含有乙醇的碱性缓冲液含有的乙醇的体积百分含量为15～75％；所述含有乙醇的碱性缓冲液的pH为8～10.5。
优选地，所述含有乙醇的碱性缓冲液为缓冲液I、缓冲液II、缓冲液III、缓冲液IV中的一种；所述缓冲液I的pH为8.4，所述缓冲液I为含有体积百分含量为20％的乙醇的PBS缓冲液，所述PBS缓冲液含有浓度为110mM的NaCl、47mM的Na2HPO4、2.1mM的KCl和1.2mM的KH2PO4；所述缓冲液II的pH为8.7，所述缓冲液II为含有体积百分含量为20％的乙醇的浓度为3mM的Na2HPO4溶液；所述缓冲液III的pH为9.6，所述缓冲液III为含有体积百分含量为50％的乙醇的浓度为3mM的Na2HPO4溶液；所述缓冲液IV的pH为10.3，所述缓冲液IV为含有体积百分含量为70％的乙醇的浓度为3mM的Na2HPO4溶液。
优选地，在步骤(3)中：所述洗涤为：采用纯化水在37℃恒温摇床中进行洗涤，每隔1h换一次纯化水，重复洗涤三次。
本发明在第二方面提供了由本发明在第一方面所述的制备方法制得的胶原蛋白水凝胶纤维材料；优选的是，所述胶原蛋白水凝胶纤维材料具有如下一个或者多个性质：所述胶原蛋白水凝胶纤维材料保持了胶原的三螺旋结构；所述胶原蛋白水凝胶纤维材料具有与天然胶原蛋白相似的生物活性；和/或所述胶原蛋白水凝胶纤维材料具有取向结构。
本发明在第三方面提供了由本发明在第一方面所述的制备方法制得的胶原蛋白水凝胶纤维材料作为生物组织工程支架材料、引导组织再生膜材料、神经导管修复材料或血管修复材料的应用。
本发明与现有技术相比至少具有如下有益效果：
(1)本发明分别以胶原蛋白水溶液和水溶性高分子聚合物的水溶液作为芯层纺丝液和壳层纺丝液通过同轴静电纺丝制备了具有芯壳结构的纤维材料，其中胶原蛋白水溶液为芯层，高分子聚合物为壳层，通过在碱性溶液中孵育使核心中的胶原蛋白凝胶化，然后洗涤除去壳层，无需使用化学或热交联获得了具有与天然胶原相似的生物活性的胶原蛋白水凝胶纤维，同时保持了胶原的三螺旋结构，还可通过接收器高速单向旋转来收集具有取向的胶原蛋白水凝胶纤维材料，有利于细胞增殖、分化以及控制细胞生长方向。
(2)本发明在一些优选的实施方案中，在进行同轴静电纺丝时，所述芯层纺丝液的流速为0.2～1mL/h，所述壳层纺丝液的流速为0.3～2mL/h，并且芯层纺丝液与壳层纺丝液的流速比为1：(1.5～3)，才能保证得到壳层将芯层很好包裹的芯壳结构。
(3)本发明在一些优选的实施方案中，在进行同轴静电纺丝时，圆柱形接收器的转速为1500～2200r/min，本发明发现，1500～2200r/min的高转速有利于形成具有取向结构的胶原蛋白水凝胶纤维材料。
附图说明
图1是本发明实施例1和实施例2中的具有芯壳结构的纤维材料的激光共聚焦照片；图(a)表示实施例1在转速1500r/min下获得的具有芯壳结构的纤维材料；(b)表示实施例2在转速2200r/min下获得的具有芯壳结构的纤维材料。
图2是本发明实施例2制得的胶原蛋白水凝胶纤维材料的扫描电镜图。
图3是本发明实施例5制得的胶原蛋白水凝胶纤维材料的扫描电镜图。
图4是本发明对比例2制得的胶原蛋白材料的扫描电镜图。
图5是本发明实施例2制得的胶原蛋白水凝胶纤维材料的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明在第一方面提供了一种胶原蛋白水凝胶纤维材料的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)采用醋酸盐缓冲液将I型胶原和水溶性高分子聚合物分别配制成胶原纺丝液和高分子聚合物纺丝液；
(2)以胶原纺丝液作为芯层纺丝液并以高分子聚合物纺丝液作为壳层纺丝液，通过同轴静电纺丝，制得具有芯壳结构的纤维材料；在本发明中，所述具有芯壳结构的纤维材料，指的是该纤维材料中含有的纤维包括芯层和包裹在所述芯层的外侧的壳层；
(3)将所述具有芯壳结构的纤维材料置于含有乙醇的碱性缓冲液中处理0.5～1h，再经洗涤以去除壳层，得到胶原蛋白水凝胶纤维材料；本发明对含有乙醇的碱性缓冲液的用量没有特别的限制，使得所述具有芯壳结构的纤维材料完全浸泡在含有乙醇的碱性缓冲液中即可；本发明得到的所述胶原蛋白水凝胶纤维材料的平均直径在纳米级或者亚微米级别，优选为平均直径为0.4～1.2μm，更优选平均直径为400～800nm。
本发明分别以胶原蛋白水溶液和水溶性高分子聚合物的水溶液作为芯层纺丝液和壳层纺丝液通过同轴静电纺丝制备了具有芯壳结构的纤维材料，其中胶原蛋白水溶液为芯层，高分子聚合物为壳层，通过在碱性溶液中孵育使核心中的胶原蛋白凝胶化，然后洗涤除去壳层，无需使用化学或热交联获得了具有与天然胶原相似的生物活性的胶原蛋白水凝胶纤维，同时保持了胶原的三螺旋结构，还可通过接收器高速单向旋转来收集具有取向的胶原蛋白水凝胶纤维材料，使得含有的胶原纤维具有取向性，更有利于细胞的生长、增殖和迁移，并且有利于控制细胞生长方向，例如促进神经组织的再生，为神经组织的再生性修复创造了良好的微环境；本发明避免使用了高极性有机溶剂，如六氟异丙醇或2,2,2-三氟乙醇等，有效保持了胶原的三螺旋结构，本发明在制备所述胶原蛋白水凝胶纤维材料时，不仅仅是胶原蛋白水溶液进行静电纺丝的，而是分别以胶原蛋白水溶液和水溶性高分子聚合物的水溶液作为芯层纺丝液和壳层纺丝液通过同轴静电纺丝的方式得到了具有芯壳结构的纤维材料，本发明的利用芯层较低流速以及壳层的较高流速以及在同轴静电纺丝过程中，壳层能够对芯层提供一定的支撑和固定作用，使得具有良好的电纺性能，从而有利于电纺成连续的纤维；而若仅以胶原蛋白水溶液作为纺丝液通过静电纺丝电纺胶原蛋白纤维，则会由于胶原蛋白水溶液的导电性和极性以及溶液的表面张力等因素很难电纺成连续的纤维，即使能够电纺成纤维，电纺过程也很不稳定，具有很大的随机性与不可控性。
本发明中的胶原蛋白水凝胶纤维材料中含有的胶原纤维具有取向性，纤维的取向结构对某些细胞的生长是有利的，例如，取向线性排列的纤维膜，可以诱导神经细胞沿纤维轴向迁移，还能进一步增强细胞的黏附和增殖；这一特性对于神经修复具有特殊意义，因为神经细胞的取向生长可加快功能性神经再生，进而加快受损神经组织的生长恢复与重新连接等；并且，本发明中的胶原蛋白水凝胶纤维材料含有的胶原纤维为凝胶态的胶原纤维，具有一定的膨胀和松动，有利于营养物质的输送以及细胞的长入，有利于细胞再生。
根据一些优选的实施方式，在步骤(1)中：所述I型胶原为胶原蛋白海绵；本发明对所述胶原蛋白海绵的制备方法没有特别的要求，例如可以通过如下的步骤制备得到：
S1、剔除牛跟腱上多余的筋膜、脂肪、肌肉等，用自来水冲洗干净，整齐的排放在冷冻盒中，进行冷冻，在-20℃至少冷冻12h；
S2、将冷冻的牛跟腱切成1mm左右的薄片，置于滤网中进行翻洗(清洗)至液体澄清；
S3、酶解：将清洗干净的牛跟腱薄片在酶解液中进行酶解，充分搅拌，酶解时间不少于72h；其中，酶解液与牛跟腱的质量比为130:1，所述酶解液由纯化水、乙酸和胃蛋白酶配制而成，在酶解液中，纯化水与乙酸的体积比为25:1，纯化水与胃蛋白酶的质量比为15:1；
S4、盐析：将酶解后的溶液离心，取其上清液，将上清液加入到氯化钠溶液(所述氯化钠溶液的质量浓度例如为0.9wt％)中，析出白色絮状胶原蛋白，过滤清洗后沥干水分；
S5、透析：将盐析后的材料灌入透析袋中，灌入体积为透析袋的1/3左右；将透析袋置于0.057mol/L的乙酸水溶液中透析液中6天，透析温度10-20℃，每3天更换一次透析液；再将透析袋置于0.00057mol/L的乙酸水溶液中透析5天，透析温度为10-20℃，每1天更换一次透析液；从第12天开始置于0.0000057mol/L的乙酸溶液中透析至pH为5.2-5.5之间，透析温度为10-20℃，根据需要可每天换一次透析液；
S6、冻干：
将透析后的样品按如下冷冻干燥工艺进行冻干，所述冷冻干燥包括预冻阶段、第一升华阶段、第二升华阶段和降温阶段，各个阶段的工艺条件如下：
预冻阶段：目标温度为-12～-8℃，速率为3～4.0℃/min，恒温时长为280～320min；
第一升华阶段：抽真空，掺气90～110Pa，目标温度为-4～-2℃，速率为0.6～0.8℃/min，恒温时长为1300～1340min；
第二升华阶段，抽真空，掺气90～110Pa，包括五个升温阶梯，分别为：
-1～1℃，速率为0.2～0.3℃/min，恒温时长为110～130min；
8～12℃，速率为1.0～1.2℃/min，恒温时长为110～130min；
18～22℃，速率为1.0～1.2℃/min，恒温时长为110～130min；
28～32℃，速率为1.0～1.2℃/min，恒温时长为110～130min；
38～42℃，速率为1.0～1.2℃/min，恒温时长：每隔10分钟进行终点判断，至终点判断合格为止；终点判断为≤0.9Pa/10min；
降温阶段：降至室温，速率为1.4～1.6℃/min；得到胶原蛋白海绵。
根据一些优选的实施方式，本发明对水溶性高分子聚合物的种类以及分子量不做具体的限定，优选的是，所述水溶性高分子聚合物为聚丙烯酰胺(PAM)、聚乙烯醇(PVA)、聚氧乙烯(PEO)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)中的一种或多种，更优选为聚乙烯吡咯烷酮。
根据一些优选的实施方式，所述醋酸盐缓冲液的浓度为12～18mM优选为15mM，pH为3.5～4优选为3.6；本发明配制所述醋酸盐缓冲液时，可以将醋酸盐先溶解在水中，然后加入酸调节pH至3.5～4的目标范围即可；在本发明一些具体的实施例中，所述醋酸盐缓冲液例如由醋酸和醋酸钠混合而成，所述醋酸盐缓冲液的浓度指的是含有的醋酸钠和醋酸的浓度之和；在本发明中，单位“mM”指的是“mmol/L”。
根据一些优选的实施方式，所述胶原纺丝液的浓度为0.8～1.4w/v％(例如0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3或1.4w/v％)优选为1w/v％；和/或所述高分子聚合物纺丝液的浓度为7.5～40w/v％(例如7.5、8、10、12、15、18、20、22、25、28、30、32、35、38或40w/v％)优选为40w/v％；在本发明中，单位“w/v％”表示的是“g/100mL”；在本发明中，所述胶液纺丝液的浓度指的是含有I型胶原的浓度，所述高分子聚合物纺丝液的浓度指的是含有水溶性高分子聚合物的浓度；在本发明中，优选的是，所述胶原纺丝液的浓度为0.8～1.4w/v％，本发明发现，若胶原纺丝液的浓度过高，例如大于1.4w/v％，将很难进行推注，而若胶原纺丝液的浓度太低，过稀，推注时容易滴液，这些均不利于得到连续的纤维；在本发明中，优选的是，所述高分子聚合物纺丝液的浓度为7.5～40w/v％，本发明发现，同样地，若所述高分子聚合物纺丝液的浓度过低，在静电纺丝过程中会出现滴液的现象，而若所述高分子聚合物纺丝液的浓度过高，则在静电纺丝过程中会出现不易推注的问题，这些均不利于得到连续的纤维。
根据一些具体的实施方式，将胶原蛋白海绵和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)分别溶解在15mM的醋酸盐缓冲液中(pH＝3.6)，配制浓度分别为1w/v％胶原纺丝液和40w/v％的PVP纺丝液；为了便于对产品的形貌进行荧光观察，例如可以将荧光活性染料Dio(绿色)加入到PVP纺丝液中，直接采用含有荧光活性染料Dio(绿色)的PVP纺丝液进行静电纺丝；当加入了荧光活性染料Dio(绿色)时，本发明对其含量不做具体的限定，采用常规用量即可。
根据一些优选的实施方式，在步骤(2)中：在进行同轴静电纺丝时，芯层纺丝液的流速为0.2～1mL/h(例如0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1mL/h)优选为0.4mL/h，壳层纺丝液的流速为0.3～2mL/h(例如0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2mL/h)优选为0.6mL/h，更优选的是，所述芯层纺丝液与所述壳层纺丝液的流速比为1：(1.5～3)(例如1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.1、1:2.2、1:2.3、1:2.4、1:2.5、1:2.6、1:2.7、1:2.8、1:2.9或1:3)；在本发明中，优选为在进行同轴静电纺丝时，所述芯层纺丝液的流速为0.2～1mL/h，所述壳层纺丝液的流速为0.3～2mL/h，并且芯层纺丝液与壳层纺丝液的流速比为1：(1.5～3)，才能保证得到壳层将芯层很好包裹的芯壳结构。
根据一些优选的实施方式，在步骤(2)中：在进行同轴静电纺丝时，以圆柱形接收器或不锈钢管作为接收装置，所述圆柱形接收器上包覆有铝箔；所述圆柱形接收器(即圆柱形旋转接收器)或不锈钢管的转速为1500～2200r/min，所述圆柱形接收器的直径为6～10cm，所述不锈钢管的直径为2～5mm；在进行同轴静电纺丝时，接收距离为5～10cm，高压直流电源的电压为18～36kV优选为22kV，进行同轴静电纺丝的时间为2～4h优选为3h；本发明在进行同轴静电纺丝时，优选为圆柱形接收器或不锈钢管的转速为1500～2200r/min，本发明发现，1500～2200r/min的高转速单向旋转有利于形成具有取向结构的胶原蛋白水凝胶纤维材料；在本发明中，在进行同轴静电纺丝时，高压直流电源的电压优选为18～36kV最优22kV，本发明发现，随着电压的增加，复合纤维平均直径减小，这主要是由于随着纺丝电压的升高，电场强度增强，使得溶液射流的电荷密度变大，液体中电荷之间的相互排斥作用增强，纤维的分化能力提高，从而导致纤维直径减小，本发明发现，增加纺丝电压可以有效地降低复合纤维的平均直径；在本发明中，在进行同轴静电纺丝时，接收距离优选为5～10cm；额定电压下，收集距离增加，虽然导致电场强度降低，但溶剂在空气中的挥发路程变长，挥发时间更加充足，使纤维分化环境变优，分化时间增加，导致纤维直径变小；在本发明中，优选为得到的所述胶原蛋白水凝胶纤维材料的平均直径在纳米级或者亚微米级别，例如平均直径为0.4～1.2μm，更优选平均直径为400～800nm。
根据一些优选的实施方式，在步骤(2)中：进行同轴静电纺丝采用的同轴注射针头由内外两个不同直径的金属针头组成，其中，内层针头的内径为0.21mm，外径为0.61mm，外层针头的内径为0.84mm，外径1.24mm。
根据一些具体的实施方式，所述同轴静电纺丝包括如下步骤：
a、通过调节纺丝室的加湿器和抽湿器控制纺丝室的湿度维持在40-50％，调节空调维持纺丝室内温度在25℃左右；将两个微型注射泵分别置于接收器的一侧，同时将接收器和高压电源与地线相连。
b、分别将配制好的胶原纺丝液和高分子聚合物纺丝液(高分子聚合物为PVP，(Mw＝360000))装入10mL注射器中，注射器内径为14.90mm，其中胶原纺丝液作为芯层纺丝液，PVP纺丝液作为壳层纺丝液，所使用的同轴注射针头由两个不同直径的金属针头组成，其中外层采用的针头，其内径为0.84mm，外径1.24mm，内层采用的针头，其内径为0.21mm，外径为0.61mm；将连接高压直流电源的夹头与注射器的针头相连；设置芯层纺丝液的流速为0.4mL/h，壳层纺丝液的流速为0.6mL/h(设置芯层和壳层的流速比为1:1.5)，固定在微型注射泵上并设置参数，电压18-36kV，接收距离5-10cm，调整接收器的转速1500-2200r/min，电纺时间2-4h。接收器可以是包覆有铝箔的圆柱形接收器，圆柱形接收器的直径6-10cm，电纺结束后将得到的材料沿轴心方向划开，得到膜状材料，用于骨科、口腔科引导组织再生等，接收器也可以是直径2-5mm的不锈钢管，电纺结束后脱管，形成内径2-5mm的管状材料，可用于神经导管、血管的修复；当得到的材料为膜状材料或管状材料时，其含有的纤维均包括芯层和包裹在所述芯层的外侧的壳层；在本发明中，当得到的材料为膜状材料时，所述膜状材料的厚度例如为0.2～2mm，当得到的材料为管状材料时，所述管状材料的壁厚例如为0.2～2mm。
根据一些优选的实施方式，在步骤(3)中：所述含有乙醇的碱性缓冲液为含有乙醇的PBS缓冲液；所述含有乙醇的碱性缓冲液含有的乙醇的体积百分含量为15～75％；所述含有乙醇的碱性缓冲液的pH为8～10.5。
根据一些优选的实施方式，所述含有乙醇的碱性缓冲液为缓冲液I、缓冲液II、缓冲液III、缓冲液IV中的一种；所述缓冲液I的pH为8.4，所述缓冲液I为含有体积百分含量为20％的乙醇的PBS缓冲液，所述PBS缓冲液含有浓度为110mM的NaCl、47mM的Na2HPO4、2.1mM的KCl和1.2mM的KH2PO4；所述缓冲液II的pH为8.7，所述缓冲液II为含有体积百分含量为20％的乙醇的浓度为3mM的Na2HPO4溶液；所述缓冲液III的pH为9.6，所述缓冲液III为含有体积百分含量为50％的乙醇的浓度为3mM的Na2HPO4溶液；所述缓冲液IV的pH为10.3，所述缓冲液IV为含有体积百分含量为70％的乙醇的浓度为3mM的Na2HPO4溶液。
在本发明中，优选为所述含有乙醇的碱性缓冲液为缓冲液I，用低浓度的乙醇溶液处理，通过除去蛋白质上的水分使得三螺旋结构更加稳定，相反，用高浓度的乙醇溶液处理，则会由于胶原蛋白与乙醇的疏水作用，使得胶原结构被破坏；本发明在没有特别说明的情况下，涉及到的溶液都是以水作为溶剂的。
根据一些优选的实施方式，在步骤(3)中：所述洗涤为：采用纯化水在37℃恒温摇床中进行洗涤，每隔1h换一次纯化水，重复洗涤三次。
根据一些具体的实施方式，步骤(3)为：将步骤(2)获得的材料取下后切割成适当的大小，放入烧杯中，用含乙醇的碱性缓冲液(使胶原纤维凝胶化)进行处理0.5～1h，随后用纯化水在37℃恒温摇床中进行洗涤，每隔1h换一次水，重复3次，以除去壳层，并获得胶原蛋白水凝胶纤维材料；在一些具体的实施例中，当获得的是膜状材料时，可以切割成例如30mm×40mm，50mm×50mm或25mm×25mm等大小的样品；当获得的是管状材料时，例如可以切割成长度为2～5cm的样品。
本发明在第二方面提供了由本发明在第一方面所述的制备方法制得的胶原蛋白水凝胶纤维材料；优选的是，所述胶原蛋白水凝胶纤维材料具有如下一个或者多个性质：所述胶原蛋白水凝胶纤维材料保持了胶原的三螺旋结构；所述胶原蛋白水凝胶纤维材料具有与天然胶原蛋白相似的生物活性；和/或所述胶原蛋白水凝胶纤维材料具有取向结构。
本发明中的取向结构是宏观层面的，而胶原蛋白的各向同性和各向异性相对来说是一个微观的层次，微观到胶原蛋白分子本身的结构，比如，胶原有三螺旋结构，分子链有长短，如受外界因素影响，分子间相互作用和外力(如磁场和机械拉伸)等，可破坏其微观结构，如解螺旋成为更低级结构，使各向异性降低；而本发明中的取向结构是指经静电纺丝使得胶原蛋白水凝胶纤维材料中含有的胶原纤维的排列具有一定的取向性，是一个相对宏观结构，为纳米级或亚微米级，具有一定取向结构的胶原蛋白水凝胶纤维材料有利于细胞分化以及控制细胞生长方向。
本发明在第三方面提供了由本发明在第一方面所述的制备方法制得的胶原蛋白水凝胶纤维材料作为生物组织工程支架材料、引导组织再生膜材料、神经导管修复材料或血管修复材料的应用。
下文将通过举例的方式对本发明进行进一步的说明，但是本发明的保护范围不限于这些实施例。
实施例1
①I型胶原的制备
S1、剔除牛跟腱上多余的筋膜、脂肪、肌肉等，用自来水冲洗干净，整齐的排放在冷冻盒中，进行冷冻，在-20℃冷冻24h；
S2、将冷冻的牛跟腱切成1mm左右的薄片，置于滤网中进行翻洗(清洗)至液体澄清；
S3、酶解：将清洗干净的牛跟腱薄片在酶解液中进行酶解，充分搅拌，酶解时间96h；其中，酶解液与牛跟腱的质量比为130:1，所述酶解液由纯化水、乙酸和胃蛋白酶配制而成，在酶解液中，纯化水与乙酸的体积比为25:1，纯化水与胃蛋白酶的质量比为15:1；
S4、盐析：将酶解后的溶液离心，取其上清液，将上清液加入到浓度为0.9wt％的氯化钠溶液中，析出白色絮状胶原蛋白，过滤清洗后沥干水分；
S5、透析：将盐析后的材料灌入透析袋中，灌入体积为透析袋的1/3左右；将透析袋置于0.057mol/L的乙酸水溶液中透析液中6天，透析温度15℃，每3天更换一次透析液；再将透析袋置于0.00057mol/L的乙酸水溶液中透析5天，透析温度为15℃，每1天更换一次透析液；从第12天开始置于0.0000057mol/L的乙酸溶液中透析至pH为5.5，透析温度为15℃，每天换一次透析液；
S6、冻干：
将透析后的样品按如下冷冻干燥工艺进行冻干，所述冷冻干燥包括预冻阶段、第一升华阶段、第二升华阶段和降温阶段，各个阶段的工艺条件如下：
预冻阶段：目标温度为-10℃，速率为3.5℃/min，恒温时长为300min；
第一升华阶段：抽真空，掺气100Pa，目标温度为-3℃，速率为0.7℃/min，恒温时长为1300min；
第二升华阶段，抽真空，掺气100Pa，包括五个升温阶梯，分别为：
0℃，速率为0.2℃/min，恒温时长为120min；
10℃，速率为1.0℃/min，恒温时长为120min；
20℃，速率为1.0℃/min，恒温时长为120min；
30℃，速率为1.0℃/min，恒温时长为120min；
40℃，速率为1.0℃/min，恒温时长：每隔10分钟进行终点判断，至终点判断合格为止；终点判断为≤0.9Pa/10min；
降温阶段：降至室温，速率为1.5℃/min；得到胶原蛋白海绵。
②纺丝液的配制：
将胶原蛋白海绵和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)分别溶解在15mM的醋酸盐缓冲液中(pH＝3.6)，配制浓度分别为1w/v％胶原纺丝液和40w/v％的PVP纺丝液；为了便于对产品的形貌进行荧光观察，将荧光活性染料Dio(绿色)加入到PVP纺丝液中。
③同轴静电纺丝：
a、通过调节纺丝室的加湿器和抽湿器控制纺丝室的湿度维持在45％，调节空调维持纺丝室内温度在25℃左右；将两个微型注射泵分别置于接收器的一侧，同时将接收器和高压电源与地线相连。
b、分别将配制好的胶原纺丝液和PVP纺丝液(Mw＝360000)装入10mL注射器中，注射器内径为14.90mm，其中胶原纺丝液作为芯层纺丝液，PVP纺丝液作为壳层纺丝液，所使用的同轴注射针头由两个不同直径的金属针头组成，其中外层采用的针头，其内径为0.84mm，外径1.24mm，内层采用的针头，其内径为0.21mm，外径为0.61mm。将连接高压直流电源的夹头与注射器的针头相连，固定在微型注射泵上并设置参数；设置芯层纺丝液的流速为0.4mL/h，壳层纺丝液的流速为0.6mL/h(设置芯层和壳层的流速比为1:1.5)，电压22kV，接收距离8cm，调整接收器(圆柱形接收器)的转速1500r/min，电纺时间3h。接收器采用的是包覆有铝箔的圆柱形接收器，圆柱形接收器的直径8cm，电纺结束后将得到的材料沿轴心方向划开，得到膜状材料(具有芯壳结构的纤维材料)。
④洗脱PVP壳层
将步骤③获得的材料取下后切割成适当的大小，放入烧杯中，用含乙醇的碱性缓冲液处理40min，随后用纯化水在37℃恒温摇床中进行洗涤，每隔1h换一次水，重复3次，以除去PVP壳层，并获得胶原蛋白水凝胶纤维材料；其中，含乙醇的碱性缓冲液为缓冲液I，所述缓冲液I的pH为8.4，所述缓冲液I为含有体积百分含量为20％的乙醇的PBS缓冲液，所述PBS缓冲液含有浓度为110mM的NaCl、浓度为47mM的Na2HPO4、浓度为2.1mM的KCl和浓度1.2mM的KH2PO4。
实施例2
实施例2与实施例1基本相同，不同之处在于：
在步骤③中，进行同轴静电纺丝时，接收器的转速为2200r/min。
本发明实施例1和实施例2中的具有芯壳结构的纤维材料的激光共聚焦照片如图1所示，实施例2中的具有芯壳结构的纤维材料的纤维取向度更高，取向结构越明显。
本发明通过扫描电镜对实施例2洗脱掉PVP壳层，得到的胶原蛋白水凝胶纤维材料的纤维形态进行了观察，如图2所示；从图2可以看出，本发明实施例2制得的胶原蛋白水凝胶纤维材料具有明显的取向性，取向度比洗脱掉PVP壳层前更高。
实施例3
实施例3与实施例2基本相同，不同之处在于：
在步骤③中，进行同轴静电纺丝时，接收器的转速为1000r/min。
实施例4
实施例4与实施例2基本相同，不同之处在于：
在步骤③中，进行同轴静电纺丝时，接收器的转速为500r/min。
实施例5
实施例5与实施例2基本相同，不同之处在于：
在步骤③中，进行同轴静电纺丝时，接收器的转速为200r/min。
本发明通过扫描电镜对实施例5洗脱掉PVP壳层，得到的胶原蛋白水凝胶纤维材料的纤维形态进行了观察，如图3所示；从图3可以看出，本发明实施例5制得的胶原蛋白水凝胶纤维材料不具有取向性。
实施例6
实施例6与实施例2基本相同，不同之处在于：
在步骤②纺丝液的配制中，将胶原蛋白海绵和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)分别溶解在15mM的醋酸盐缓冲液中(pH＝3.6)，配制浓度分别为2w/v％胶原纺丝液和40w/v％的PVP纺丝液。
本实施例中，胶原纺丝液的浓度过高，高为2w/v％，在同轴静电纺丝时，很难进行推注，无法得到连续的纤维。
对比例1
对比例1与实施例2基本相同，不同之处在于：
不包括步骤④。
本对比例制得的是具有芯壳结构的纤维材料，该纤维材料含有的纤维包括的胶原蛋白芯层没有进行凝胶化，无法实际应用，并且包括的PVP壳层的生物相容性较天然高分子胶原蛋白芯层差。
对比例2
对比例2与实施例2基本相同，不同之处在于：
②纺丝液的配制：
将胶原蛋白海绵溶解在15mM的醋酸盐缓冲液中(pH＝3.6)，配制浓度为1w/v％胶原纺丝液。
③静电纺丝：
a、通过调节纺丝室的加湿器和抽湿器控制纺丝室的湿度维持在45％，调节空调维持纺丝室内温度在25℃左右；将微型注射泵置于接收器的一侧，同时将接收器和高压电源与地线相连。
b、将配制好的胶原纺丝液装入10mL注射器中，注射器内径为14.90mm，进行静电纺丝采用的注射针头内径为0.21mm，外径为0.61mm。将连接高压直流电源的夹头与注射器的针头相连，固定在微型注射泵上并设置参数，设置胶原纺丝液的流速为0.4mL/h，电压22kV，接收距离8cm，调整接收器(圆柱形接收器)的转速2200r/min，电纺时间3h。接收器采用的是包覆有铝箔的圆柱形接收器，圆柱形接收器的直径8cm，电纺结束后将得到的材料沿轴心方向划开。
④将步骤③获得的材料取下后切割成适当的大小，放入烧杯中，用含乙醇的碱性缓冲液处理40min，随后用纯化水在37℃恒温摇床中进行洗涤，每隔1h换一次水，重复3次，获得胶原蛋白材料；其中，含乙醇的碱性缓冲液为缓冲液I，所述缓冲液I的pH为8.4，所述缓冲液I为含有体积百分含量为20％的乙醇的PBS缓冲液，所述PBS缓冲液含有浓度为110mM的NaCl、浓度为47mM的Na2HPO4、浓度为2.1mM的KCl和浓度为1.2mM的KH2PO4。
本对比例电纺不成连续均匀的纤维，得到的胶原蛋白材料的纤维形态(SEM图)如图4所示。
对比例3
①与实施例1的步骤①相同。
②纺丝液的配制：
将胶原蛋白海绵溶解在六氟异丙醇(HFIP)中，得到浓度为6w/v％的胶原纺丝液。
③静电纺丝：
a、通过调节纺丝室的加湿器和抽湿器控制纺丝室的湿度维持在45％，调节空调维持纺丝室内温度在25℃左右；将微型注射泵置于接收器的一侧，同时将接收器和高压电源与地线相连。
b、将配制好的胶原纺丝液装入10mL注射器中，注射器内径为14.90mm，进行静电纺丝采用21G注射针头。将连接高压直流电源的夹头与注射器的针头相连固定在微型注射泵上并设置参数，设置胶原纺丝液的流速为2mL/h，电压17kV，接收距离15cm，调整接收器(圆柱形接收器)的转速150r/min，电纺时间3h。接收器采用的是包覆有铝箔的圆柱形接收器，圆柱形接收器的直径8cm，电纺结束后将得到的材料沿轴心方向划开，得到胶原蛋白纤维材料。
本发明还将通过本发明步骤S1至S6制得的胶原蛋白海绵(原始胶原)、实施例2中电纺后脱PVP壳层的材料(胶原蛋白水凝胶纤维材料)和未脱PVP壳层的材料、对比例3中制得的胶原蛋白纤维材料分别溶解在醋酸盐缓冲液(pH＝3.6)中，并进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析，结果如图5所示。
从图5可以看出，实施例2中电纺后脱PVP壳层的材料和未脱PVP壳层的材料胶原分子由两个多肽组成，即分子量分别为110kDa和130kDa的α1和α2链，其二聚体和三聚体分别称为β链和γ链；如图5所示，在原始胶原样品的情况下，观察到与α1、α2和β链相关的三条不同条带(通道5)。未脱PVP壳层的胶原/PVP纤维(通道2)和脱PVP壳层的胶原蛋白水凝胶纤维材料(通道3)也显示相同的条带，说明本发明制得的胶原蛋白水凝胶纤维材料有效保持了胶原蛋白的三螺旋结构。PVP为通道4，未显示任何条带，而对比例3制得的胶原蛋白纤维的主链的条带被切割成涂抹的条带(通道6)，表明肽的断裂，三螺旋结构被破坏；1通道为标记条带。
本发明未详细说明部分为本领域技术人员公知技术。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (12)

1.一种胶原蛋白水凝胶纤维材料的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
（1）采用醋酸盐缓冲液将I型胶原和水溶性高分子聚合物分别配制成胶原纺丝液和高分子聚合物纺丝液；所述胶原纺丝液的浓度为0.8~1.4w/v%；所述高分子聚合物纺丝液的浓度为7.5~40w/v%；
（2）以胶原纺丝液作为芯层纺丝液并以高分子聚合物纺丝液作为壳层纺丝液，通过同轴静电纺丝，制得具有芯壳结构的纤维材料；在进行同轴静电纺丝时，芯层纺丝液的流速为0.2~1mL/h，壳层纺丝液的流速为0.3~2mL/h；在进行同轴静电纺丝时，以圆柱形接收器作为接收装置，所述圆柱形接收器的转速为1500~2200r/min；
（3）将所述具有芯壳结构的纤维材料置于含有乙醇的碱性缓冲液中处理0.5~1h，再经洗涤以去除壳层，得到胶原蛋白水凝胶纤维材料；所述含有乙醇的碱性缓冲液为缓冲液I，所述缓冲液I的pH为8.4，所述缓冲液I为含有体积百分含量为20%的乙醇的PBS缓冲液，所述PBS缓冲液含有浓度为110mM的NaCl、47mM的Na2HPO4、2.1mM的KCl和1.2mM的KH2PO4；
所述胶原蛋白水凝胶纤维材料保持了胶原的三螺旋结构；
所述胶原蛋白水凝胶纤维材料具有取向结构，所述胶原蛋白水凝胶纤维材料的取向度比所述具有芯壳结构的纤维材料更高。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤（1）中：
所述I型胶原为胶原蛋白海绵；
所述水溶性高分子聚合物为聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、聚氧乙烯、聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种；
所述醋酸盐缓冲液的浓度为12~18mM，pH为3.5~4；
所述胶原纺丝液的浓度为1w/v%；和/或
所述高分子聚合物纺丝液的浓度为40w/v%。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：
所述醋酸盐缓冲液的浓度为15mM，pH为3.6。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤（2）中：
在进行同轴静电纺丝时，芯层纺丝液的流速为0.4mL/h，壳层纺丝液的流速为0.6mL/h。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤（2）中：
所述芯层纺丝液与所述壳层纺丝液的流速比为1：（1.5~3）。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤（2）中：
所述圆柱形接收器上包覆有铝箔；
所述圆柱形接收器的直径为6~10cm；
在进行同轴静电纺丝时，接收距离为5~10cm，高压直流电源的电压为18~36kV，进行同轴静电纺丝的时间为2~4h。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：
高压直流电源的电压为22kV。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：
进行同轴静电纺丝的时间为3h。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤（2）中：
进行同轴静电纺丝采用的同轴注射针头由内外两个不同直径的金属针头组成，其中，内层针头的内径为0.21mm，外径为0.61mm，外层针头的内径为0.84mm，外径1.24mm。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤（3）中：
所述洗涤为：采用纯化水在37℃恒温摇床中进行洗涤，每隔1h换一次纯化水，重复洗涤三次。
11.由权利要求1至10中任一项所述的制备方法制得的胶原蛋白水凝胶纤维材料。
12.由权利要求1至10中任一项所述的制备方法制得的胶原蛋白水凝胶纤维材料作为生物组织工程支架材料、引导组织再生膜材料、神经导管修复材料或血管修复材料的应用。
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