CN107510862A - 担载梯度浓度生物活性分子的有序纤维支架、制法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种担载梯度浓度生物活性分子的有序纤维支架、制法及应用。所述有序纤维支架包括：主要由复数根纤维组成的支架基体，所述支架基体中心处的纤维密度大于外周部的纤维密度，所述纤维主要由胶原蛋白和高分子聚合物组成；以及，负载于所述支架基体上的生物活性分子，所述生物活性分子具有胶原特异结合区。所述有序纤维支架材料可以是利用静电纺丝技术制备得到的放射状静电纺丝材料。本发明的有序纤维支架材料可以在定向诱导神经干细胞(NSCs)迁移过程中发挥重要作用，能显著提高NSCs的迁移数量与迁移距离，且其制备工艺简单可控，经济有效，在脊髓损伤治疗等领域具有广泛应用前景。

Description

担载梯度浓度生物活性分子的有序纤维支架、制法及应用
技术领域
本发明属于生物医学材料领域，涉及一种利用放射状胶原纤维担载胶原特异结合区修饰的生物活性分子，形成含有连续浓度梯度生物活性分子的有序纤维支架。
背景技术
神经诱导支架材料在脊髓损伤中的治疗具有巨大应用潜能。有序排列的神经导管在桥接间隙与诱导神经生长的过程中提供结构支撑作用。另外，稳定的梯度分布的生物信号可为神经诱导再生及功能性连接提供更加有利的生物微环境。
静电纺丝制备的纳米纤维诱导材料在脊髓损伤修复中的应用意义深远。通过静电纺丝技术制备的纳米到微米级的纤维材料可模拟天然细胞外基质的大小与结构，尤其是有序电纺纤维在神经组织工程应用中，可从空间上诱导神经突的生长以及轴突的延伸。此外，具有有序排列的纳米级电纺纤维在许多细胞中(包括神经干细胞，NSCs)可引导细胞极化和迁移。
生物信号的浓度梯度在神经再生过程中发挥重要作用。轴突通过生长锥(growthcone)感知到浓度梯度的诱导信号后向更远端延伸生长。研究发现，体内存在着梯度趋化因子，例如，SDF1α梯度可诱导干细胞迁移，在组织再生修复过程中具有重要作用。脊髓损伤后，增生的星形胶质细胞组成的微环境，分泌SDF1α形成浓度梯度可长距离募集内源性神经干细胞迁移到损伤部位。内源性NSCs可分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，并促进神经功能的恢复。然而，天然存在的SDF1α在损伤部位浓度低且保留时间短，导致NSCs向损伤部位迁移缓慢，不能形成足够的群落形成网络连接，这是脊髓损伤功能恢复不理想的原因之一。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种担载梯度浓度生物活性分子的有序纤维支架、其制备方法、制备装置及应用，以克服现有技术中的不足。
为了达到上述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种担载梯度浓度生物活性分子的有序纤维支架，其包括：
主要由复数根纤维组成的支架基体，所述支架基体中心处的纤维密度大于外周部的纤维密度，所述纤维主要由胶原蛋白和聚合物组成；
以及，负载于所述支架基体上的生物活性分子，所述生物活性分子具有胶原特异结合区。
在一些实施方案中，所述生物活性分子采用修饰有胶原特异结合区的趋化因子，所述趋化因子包括SDF1α。
本发明实施例还提供了一种制备前述担载梯度浓度生物活性分子的有序纤维支架的方法，包括：
提供静电纺丝装置，包括与纺丝溶液供给系统连通的喷嘴和接收装置，所述喷嘴和接收装置间隔设置，所述接收装置包括点电极和环形电极，所述点电极设置于所述环形电极中心处，并对应于所述喷嘴设置；
在所述喷嘴和接收装置之间施加8～12kV的电压，并以所述喷嘴将纺丝溶液向所述接收装置喷射，使形成的纤维在所述接收装置上有序聚集，从而获得支架基体；
以及，在所述支架基体上负载生物活性分子，所述生物活性分子具有胶原特异结合区。
本发明实施例还提供了前述任一种担载梯度浓度生物活性分子的有序纤维支架于培养细胞中的用途，所述细胞包括CXCR4高表达的干细胞，所述干细胞包括神经干细胞和/或骨髓间充质干细胞。
本发明实施例还提供了一种细胞培养设备，其包括基材、前述的任一种担载梯度浓度生物活性分子的有序纤维支架、中间阻挡物以及细胞池壁，所述有序纤维支架固定在基材上，所述细胞池壁环绕所述中间阻挡物设置，所述细胞池壁、中间阻挡物与基材之间围合形成细胞培养池，所述有序纤维支架设置于所述细胞培养池内。
本发明实施例还提供了一种细胞培养设备的制备方法，其包括：
依据前述的任一种方法制备支架基体，并将所述支架基体固定在基材表面，
在所述支架基体周围环绕设置具有设定高度的细胞池壁，并在在所述支架基体中央放置中间阻挡物，从而在所述中央阻挡物与细胞池壁之间围合形成细胞培养池，且使所述支架基体分布于细胞培养池内，
采用前述的任一种方法在所述支架基体上负载生物活性分子。
本发明实施例还提供了一种细胞迁移方法，其包括：
提供前述的任一种细胞培养设备；
将待培养的细胞接种在所述有序纤维支架的外围部分，细胞贴壁后，将所述中央阻挡物去除，并在适合培养所述细胞的环境中使所述细胞迁移。
本发明实施例还提供了前述担载梯度浓度生物活性分子的有序纤维支架作为神经诱导支架材料的用途。
与现有技术相比，本发明至少具有以下优点：
(1)提供的担载梯度浓度生物活性分子的有序纤维支架可形成连续性生物信号梯度，同时包含的取向纤维可提供良好的有序拓扑结构，并且所述纤维支架材料可缓慢释放生物活性因子，稳定性好，能极大的满足干细胞迁移过程中所需的信号分子，具有广泛应用前景；
(2)提供的所述有序纤维支架的制备工艺简单可控，利于规模化实施。
附图说明
为了更清楚地说明本发明结构特征和技术要点，下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
图1为本发明实施例中放射状有序密度梯度支架材料制备工艺原理图。
图2为本发明实施例中放射状有序密度梯度支架材料的照片。
图3a-图3b为本发明实施例中放射状有序密度梯度支架材料的荧光显微镜照片和荧光强度梯度变化曲线图。
图4a是本发明一典型实施例中无规电纺纤维膜与放射状有序纤维膜的力学性能对照图。
图4b是本发明一典型实施例中放射状有序纤维膜担载5g砝码的照片。
图5a-图5c为本发明实施例中CBD-SDF1α浓度梯度支架材料释放曲线图。
图6a-图6c为本发明实施例中NSCs培养方法示意图。
图7为本发明实施例中NSCs在浓度梯度支架材料上培养1天后的分布图。
具体实施方式
本发明实施例的一个方面提供的一种担载梯度浓度生物活性分子的有序纤维支架包括：
主要由复数根纤维组成的支架基体，所述支架基体中心处的纤维密度大于外周部的纤维密度，所述纤维主要由胶原蛋白和聚合物组成；
以及，负载于所述支架基体上的生物活性分子，所述生物活性分子具有胶原特异结合区。
进一步的，至少部分纤维以所述支架基体的中心为放射原点呈放射状延伸，并且所述支架基体内的纤维密度从中心向外周部逐渐降低。
较为优选的，所述胶原蛋白与聚合物的质量比为5：5～3：7。其中，适当提高聚合物的含量可以提高所述纤维支架的力学性能。
进一步的，所述聚合物可优选自聚己内酯或聚(乳酸-乙醇酸)共聚物等，且不限于此。
较为优选的，所述纤维采用直径为1～5μm的静电纺丝纤维。
较为优选的，所述生物活性分子采用修饰有胶原特异结合区的趋化因子，所述趋化因子包括SDF1α。
例如，本发明中所述的生物活性分子可以是一种融合表达因子，其主要是通过对生物活性因子，例如基质细胞衍化生长因子1α(SDF1α)、脑源性神经营养因子BDNF等进行基因改造，使其与具有胶原特异结合能力的短肽collagen binding domain(CBD)融合表达而获得(参考“Linear ordered collagen scaffolds loaded with collagen-bindingbrain-derived neurotrophic factor improve the recovery of spinal cord injuryin rats”，Tissue engineering:Part A,2009,15(10):2927-2935.)。
例如，所述CBD融合表达因子可包含：SDF1α，以及，与SDF1α连接的、具有胶原特异结合能力的多肽。又例如，所述CBD融合表达因子可包含：BDNF，以及，与BDNF连接的、具有胶原特异结合能力的多肽。例如，在一些实施例中，一种CBD融合表达因子(CBD-SDF-1α)可以包含基质细胞衍化生长因子1α(SDF1α)及具有胶原特异结合能力的多肽。
本发明实施例的另一个方面提供的一种担载梯度浓度生物活性分子的有序纤维支架的制备方法包括：
提供静电纺丝装置，包括与纺丝溶液供给系统连通的喷嘴和接收装置，所述喷嘴和接收装置间隔设置，所述接收装置包括点电极和环形电极，所述点电极设置于所述环形电极中心处，并对应于所述喷嘴设置；
在所述喷嘴和接收装置之间施加电压(优选为8～12kV)，并以所述喷嘴将纺丝溶液向所述接收装置喷射，使形成的纤维在所述接收装置上有序聚集，从而获得支架基体；
以及，在所述支架基体上负载生物活性分子，所述生物活性分子具有胶原特异结合区。
较为优选的，所述的制备方法可以包括：通过将所述喷嘴与高压直流电源连接，并将所述接收装置接地，从而在所述喷嘴和接收装置之间形成8～12kV的电势差。
较为优选的，所述纺丝溶液供给系统包括微量注射泵，且所述微量注射泵向喷嘴供给纺丝溶液的速率为0.1～0.2mL/h。
较为优选的，所述喷嘴喷射纺丝溶液的速率为0.1～0.2mL/h。
进一步的，所述环形电极的直径可以为2～4cm。
进一步的，所述喷嘴与接收装置之间的距离可以为10～15cm。
进一步的，所述制备方法中采用的静电纺丝接收时间可以为2～8min。
进一步的，在所述制备方法中，所述点电极及环形电极均接地；或者，所述点电极接负电，环状电极接地，且点电极与环形电极之间的电势差为0～3kV。
较为优选的，所述纺丝溶液选自含有胶原蛋白及聚合物的流体，所述胶原蛋白与聚合物的质量比为5：5～3：7。
较为优选的，所述纺丝溶液的浓度(即胶原蛋白及聚合物两者的浓度之和)为18wt％～22wt％。
较为优选的，所述制备方法包括：将所述支架基体与与具有胶原特异结合区的生物活性分子在缓冲液中孵育，从而在所述支架基体上负载生物活性分子；其中所述生物活性分子在缓冲液中的浓度为0.2～1.5μM。
本发明实施例的另一个方面还提供了前述的任一种担载梯度浓度生物活性分子的有序纤维支架于培养细胞中的用途，所述细胞包括CXCR4高表达的干细胞，所述干细胞包括神经干细胞和/或骨髓间充质干细胞。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种细胞培养设备，其包括基材、所述的担载梯度浓度生物活性分子的有序纤维支架、中间阻挡物以及细胞池壁，所述有序纤维支架固定在基材上，所述细胞池壁环绕所述中间阻挡物设置，所述细胞池壁、中间阻挡物与基材之间围合形成细胞培养池，所述有序纤维支架设置于所述细胞培养池内。
其中，所述中间阻挡物可以采用直径为0.5～1.5cm的圆环形阻挡物。
其中，所述细胞池壁应是具有一定高度的。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种细胞培养设备的制备方法，其包括：
依据前述的方法制备支架基体，并将所述支架基体固定在基材表面，
在所述支架基体周围环绕设置具有设定高度的细胞池壁，并在在所述支架基体中央放置中间阻挡物，从而在所述中央阻挡物与细胞池壁之间围合形成细胞培养池，且使所述支架基体分布于细胞培养池内，
采用前述的方法在所述支架基体上负载生物活性分子。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种细胞迁移方法，其包括：
提供所述的细胞培养设备；
将待培养的细胞接种在所述有序纤维支架的外围部分，细胞贴壁后，将所述中央阻挡物去除，并在适合培养所述细胞的环境中使所述细胞迁移。
本发明实施例的另一个方面还提供了所述担载梯度浓度生物活性分子的有序纤维支架作为神经诱导支架材料的用途。
本发明实施例的另一个方面还提供了前述的任一种担载梯度浓度生物活性分子的有序纤维支架于治疗脊髓损伤中的用途。
以下将结合附图及较佳实施例对本发明的技术方案作进一步的说明：
(一)密度梯度支架材料的制备方法
1)利用静电纺丝技术制备放射状有序纤维。采用装置与传统电纺装置相似，包括：高压直流电源，微量注射泵以及接受装置。不同之处是将以往接收装置改变为点电极与环形电极的组合装置，其中点电极可用一根尖针实现，环形电极可用一个不锈钢金属圆环实现(参阅图1所示)。纺丝溶液采用胶原蛋白与PCL的混合物，其量比为3:7。将混合物溶于六氟异丙醇中，浓度为20％。采用微量注射泵控制聚合物溶液的速率为0.15mL/h。高压直流电源应用于喷嘴与接地收集器之间，电压为10kV，喷嘴与接地收集器之间的距离约为13cm。所得支架材料中心纤维密度高，外周纤维密度低可形成一种具有有序排列的密度梯度支架材料(参阅图2所示)。在纺丝溶液中加入罗丹明所得的荧光纤维镜照片呈现荧光强度梯度变化的有序电纺纤维(参阅图3a-图3b所示)。
2)将收集到的胶原/PCL密度梯度支架材料在1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)交联剂中交联。其中EDC浓度为2.0～2.5mg/mL，NHS浓度为1.0～1.5mg/mL，在37℃下交联2h。无规电纺纤维膜(采用常用接收装置制备)与放射状有序纤维膜的中间部分进行力学测试(图4a)，可见放射状有序纤维膜的力学性能有很大提高。放射状有序纤维膜可支撑5克砝码很长时间，没有破裂，说明放射状有序纤维膜具有很好的力学性能(图4b)。
(二)浓度梯度支架材料的制备方法
将浓度为1.5μM，体积500μL的CBD-SDF1α和NAT-SDF1α孵育在胶原/PCL密度梯度支架材料上，并在37℃培养箱中培养2h。CBD-SDF1α结合在胶原/PCL密度梯度支架材料后用PBS清洗3遍。形成具有连续性的CBD-SDF1α和NAT-SDF1α浓度梯度的支架材料。将复合梯度分布CBD-SDF1α、NAT-SDF1α的胶原电纺纤维支架在300mL PBS缓冲液中进行释放，隔天取液，使用SDF1αElisa试剂盒进行检测，图5a可见CBD-SDF1α能够实现缓慢释放。此外，将复合梯度分布CBD-SDF1α、NAT-SDF1α的胶原电纺纤维膜分成3个区域，加入anti-His(1:2000)100μL,37℃孵育2h,接着PBS洗5次后加入anti-mouse IgG-FITC(1:2000)避光孵育30min。然后PBS洗5次，然后加入TMB进行显色,2M H2SO4终止反应后,用酶标仪读取A450的值。图5b可见实现了梯度浓度的结合，证实了CBD-SDF1α梯度支架的形成。进一步，将复合CBD-SDF1α的梯度纤维膜分成3个区域，加入PBS中进行释放，隔天取液，使用SDF1αElisa试剂盒进行检测，图5c可见CBD-SDF1α梯度涂层能够实现不同区域的浓度梯度。
(三)诱导神经干细胞的迁移
1)小鼠NSCs的提取与培养。选取1d的ICR小鼠，解剖分离其大脑海马区，使用胰酶替代物在37℃培养箱中消化其海马区10min。将消化后的细胞重悬在增殖培养基中(包括无血清的DMEM/F12基础培养基、EGF、bFGF以及2％FBS)，在37℃的培养箱中培养。
2)NSCs种植在浓度梯度支架材料上。参阅图6a-图6c所示，将体积为200μL的5x105个NSCs分别种植在中央放置有直径1cm的圆环形阻挡物的浓度梯度支架材料的外围部分，置于37℃培养箱中培育4h，待其贴壁后用PBS清洗3遍，然后撤去阻挡物并添加分化培养基在37℃培养箱中培养。
3)经过一段时间的培养后，将支架材料上的NSCs在4％多聚甲醛中固定30分钟后，用0.08％triton X-100透膜，用5％BSA封闭。然后，在4℃时过夜孵育一抗后在室温条件下孵育二抗和DAPI，约30min。采用共聚焦荧光显微镜观察NSCs的分布情况。参阅图7所示，CBD-SDF1α梯度支架可显著促进NSCs向中心位置即含有更高浓度SDF1α的区域迁移。
综上所述，本发明提供的担载CBD-SDF1α浓度梯度的有序电纺纤维，能够缓慢、梯度释放生物活性因子，稳定性好，形成一种连续性的生物因子浓度梯度，提供梯度诱导和接触引导，可极大地提高内源性NSCs的迁移数量与迁移距离，并引导轴突再生，因此可以作为具有极大应用潜能的新一代神经诱导支架在脊髓损伤修复中定向诱导神经干细胞迁移。
应当理解，上述具体实施方式仅为说明本发明的技术构思和结构特征，目的在于让熟悉此项技术的相关人士能够据以实施，但以上所述内容并不限制本发明的保护范围，凡是依据本发明的精神实质所作的任何等效变化或修饰，均应落入本发明的保护范围之内。

Claims (15)

1.一种担载梯度浓度生物活性分子的有序纤维支架，其特征在于包括：
主要由复数根纤维组成的支架基体，所述支架基体中心处的纤维密度大于外周部的纤维密度，所述纤维主要由胶原蛋白和聚合物组成；
以及，负载于所述支架基体上的生物活性分子，所述生物活性分子具有胶原特异结合区。
2.根据权利要求1所述的有序纤维支架，其特征在于：至少部分纤维以所述支架基体的中心为放射原点呈放射状延伸，并且所述支架基体内的纤维密度从中心向外周部逐渐降低。
3.根据权利要求1所述的有序纤维支架，其特征在于：所述胶原蛋白与聚合物的质量比为5：5～3：7；和/或，所述聚合物包括聚己内酯和聚(乳酸-乙醇酸)共聚物；和/或，所述纤维采用直径为1～5μm的静电纺丝纤维；和/或，所述生物活性分子采用修饰有胶原特异结合区的趋化因子，所述趋化因子包括SDF1α。
4.权利要求1-3中任一项所述担载梯度浓度生物活性分子的有序纤维支架的制法，其特征在于包括：
提供静电纺丝装置，包括与纺丝溶液供给系统连通的喷嘴和接收装置，所述喷嘴和接收装置间隔设置，所述接收装置包括点电极和环形电极，所述点电极设置于所述环形电极中心处，并对应于所述喷嘴设置；
在所述喷嘴和接收装置之间施加8～12kV的电压，并以所述喷嘴将纺丝溶液向所述接收装置喷射，使形成的纤维在所述接收装置上有序聚集，从而获得支架基体；
以及，在所述支架基体上负载生物活性分子，所述生物活性分子具有胶原特异结合区。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于包括：通过将所述喷嘴与直流电源连接，并将所述接收装置接地，从而在所述喷嘴和接收装置之间形成8～12kV的电势差。
6.根据权利要求4所述的制法，其特征在于：所述纺丝溶液供给系统包括微量注射泵，且所述微量注射泵向喷嘴供给纺丝溶液的速率为0.1～0.2mL/h；和/或，所述环形电极的直径为2～4cm；和/或，所述喷嘴与接收装置之间的距离为10～15cm；和/或，静电纺丝接收时间为2～8min。
7.根据权利要求4所述的制法，其特征在于：所述点电极及环形电极均接地；或者，所述点电极接负电，环状电极接地，且点电极与环形电极之间的电势差为0～3kV。
8.根据权利要求4所述的制法，其特征在于：所述纺丝溶液选自含有胶原蛋白及聚合物的流体，所述胶原蛋白与聚合物的质量比为5：5～3：7；和/或，所述纺丝溶液的浓度为18wt％～22wt％。
9.根据权利要求4所述的制法，其特征在于包括：将所述支架基体与具有胶原特异结合区的生物活性分子在缓冲液中孵育，从而在所述支架基体上负载生物活性分子；其中所述生物活性分子在缓冲液中的浓度为0.2～1.5μM。
10.权利要求1-3中任一项所述的担载梯度浓度生物活性分子的有序纤维支架于培养细胞中的用途，所述细胞包括CXCR4高表达的干细胞，所述干细胞包括神经干细胞和/或骨髓间充质干细胞。
11.一种细胞培养设备，其特征在于包括基材、权利要求1-3中任一项所述的担载梯度浓度生物活性分子的有序纤维支架、中间阻挡物以及细胞池壁，所述有序纤维支架固定在基材上，所述细胞池壁环绕所述中间阻挡物设置，所述细胞池壁、中间阻挡物与基材之间围合形成细胞培养池，所述有序纤维支架设置于所述细胞培养池内。
12.根据权利要求11所述的细胞培养设备，其特征在于：所述中间阻挡物采用直径为0.5～1.5cm的圆环形阻挡物。
13.一种细胞培养设备的制备方法，其特征在于包括：
依据权利要求4-8中任一项所述的方法制备支架基体，并将所述支架基体固定在基材表面，
在所述支架基体周围环绕设置具有设定高度的细胞池壁，并在在所述支架基体中央放置中间阻挡物，从而在所述中央阻挡物与细胞池壁之间围合形成细胞培养池，且使所述支架基体分布于细胞培养池内，
采用权利要求4或9所述的方法在所述支架基体上负载生物活性分子。
14.一种细胞迁移方法，其特征在于包括：
提供权利要求11-12中任一项所述的细胞培养设备；
将待培养的细胞接种在所述有序纤维支架的外围部分，细胞贴壁后，将所述中央阻挡物去除，并在适合培养所述细胞的环境中使所述细胞迁移。
15.权利要求1-3中任一项所述的担载梯度浓度生物活性分子的有序纤维支架作为神经诱导支架材料的用途。
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