CN110787321A - 功能胶原支架locs+cbd-nt3在修复脊髓损伤中的应用 - Google Patents

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陈冰
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Abstract

本发明公开了功能胶原支架LOCS+CBD‑NT3在修复脊髓损伤中的应用。本发明的发明人首次利用恒河猴建立脊髓全横断损伤模型，通过长时间点(10个月)的观察评价功能胶原支架LOCS+CBD‑NT3在脊髓损伤修复中的作用。结果表明，功能胶原支架LOCS+CBD‑NT3能够更好的促进恒河猴损伤部位组织有序再生、神经轴突再生、髓鞘再生和突触形成。本发明提供的功能胶原支架LOCS+CBD‑NT3对脊髓损伤修复具有重要意义，并为未来功能胶原支架应用于临床提供了理论支撑，具有重要的应用价值。

Description

功能胶原支架LOCS+CBD-NT3在修复脊髓损伤中的应用
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及功能胶原支架LOCS+CBD-NT3在修复脊髓损伤中的应用，功能胶原支架LOCS+CBD-NT3由融合蛋白CBD-NT3与神经再生胶原支架特异结合而成。
背景技术
脊髓损伤(Spinal cord injury，SCI)是一种严重的中枢神经系统损伤，往往导致损伤平面以下的运动、感觉和反射功能部分或完全丧失，致残率高。不仅给患者带来严重的身心伤害，还给家庭和社会造成巨大负担。脊髓损伤后，损伤区域边缘逐渐形成致密的胶质瘢痕，脊髓神经纤维无法越过由其构成的物理化学屏障再生。同时，轴突生长微环境中缺乏支持引导神经生长的基质以及神经营养因子分泌不足，都使得神经再生非常困难。目前临床上尚无有效的干预和治疗方法，是最具挑战性的医学难题。
发明内容
本发明的目的是修复脊髓损伤。
本发明首先保护功能胶原支架LOCS+CBD-NT3的应用，为如下C1)至C14)中的至少一种：C1)修复脊髓损伤；C2)治疗脊髓损伤；C3)促进脊髓损伤部位组织的有序再生；C4)降低脊髓损伤部位硫酸软骨素蛋白多糖的沉积；C5)促进脊髓损伤部位的神经轴突再生；C6)促进脊髓损伤部位的髓鞘再生；C7)促进脊髓损伤部位的突触形成；C8)制备用于修复脊髓损伤的产品；C9)制备用于治疗脊髓损伤的产品；C10)制备用于促进脊髓损伤部位组织的有序再生的产品；C11)制备用于降低脊髓损伤部位硫酸软骨素蛋白多糖的沉积的产品；C12)制备用于促进脊髓损伤部位的神经轴突再生的产品；C13)制备用于促进脊髓损伤部位的髓鞘再生的产品；C14)制备用于促进脊髓损伤部位的突触形成的产品；
所述功能胶原支架LOCS+CBD-NT3包括胶原结合区、神经营养因子和神经再生胶原支架。
所述功能胶原支架LOCS+CBD-NT3可为神经营养因子经胶原结合区特异结合至神经再生胶原支架而成。
所述神经营养因子可为神经营养因子-3。
所述神经营养因子-3的氨基酸序列可如序列表中序列2自N末端起第42至180位所示。
所述胶原结合区的氨基酸序列可如序列表中序列2自N末端起第22至28位所示。
所述神经再生胶原支架的制备方法可为：取牛筋膜，除去脂类和杂蛋白，得到神经再生胶原支架。
所述“除去脂类”可通过磷酸三丁酯溶液处理实现。
所述“除去杂蛋白”可通过加入含NaCl的Tris-HCl缓冲液和含胰蛋白酶的Tris-HCl缓冲液处理实现。
所述磷酸三丁酯溶液可为磷酸三丁酯水溶液。所述磷酸三丁酯水溶液可为1-1.5％(v/v)的磷酸三丁酯水溶液。
所述含NaCl的Tris-HCl缓冲液可为含0.5-1.5mol/L NaCl的pH7.6-8.5、25-100mmol/L的Tris-HCl缓冲液。
含胰蛋白酶的Tris-HCl缓冲液可为含0.5-1.5g/100mL胰蛋白酶的pH为7.0-8.0、25-100mmol/L的Tris-HCl缓冲液。
上述任一所述神经再生胶原支架的制备方法具体可如下：
(1)取牛筋膜，加入1-1.5％(v/v)的磷酸三丁酯溶液，14-18℃浸泡24-72h；
(2)取完成步骤(1)的牛筋膜，加入含0.5-1.5mol/L NaCl的pH7.6-8.5、25-100mmol/L的Tris-HCl缓冲液，14-18℃浸泡24-72h；
(3)取完成步骤(2)的牛筋膜，加入含0.5-1.5g/100mL胰蛋白酶的pH为7-8、25-100mmol/L的Tris-HCl缓冲液，浸泡48-96h，获得神经再生胶原支架。
所述步骤(1)中，磷酸三丁酯溶液可为磷酸三丁酯水溶液。
上述任一所述功能胶原支架LOCS+CBD-NT3具体可为将神经再生胶原支架置于融合蛋白CBD-NT3溶液，孵育而成；所述融合蛋白CBD-NT3的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
所述融合蛋白CBD-NT3溶液具体可为含融合蛋白CBD-NT3的水溶液。
上述任一所述PBS缓冲液可为将8.0g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24gKH2PO4溶于蒸馏水，然后用蒸馏水定容至1L，调节pH值至7.2-7.4。
非人灵长类作为与人类最为接近的实验动物，是推动脊髓损伤治疗方法临床转化的重要验证模型。非人灵长类动物在解剖、生理以及行为学方面较其它动物模型具有显著优势。本发明的发明人首次利用恒河猴建立脊髓全横断损伤模型，通过长时间点(10个月)的观察评价功能胶原支架LOCS+CBD-NT3在脊髓损伤修复中的作用。结果表明，功能胶原支架LOCS+CBD-NT3能够更好的促进恒河猴损伤部位组织有序再生、神经轴突再生、髓鞘再生和突触形成。本发明提供的功能胶原支架LOCS+CBD-NT3对脊髓损伤修复具有重要意义，并为未来功能胶原支架应用于临床提供了理论支撑。
附图说明
图1为神经再生胶原支架的外观及其线性有序微观结构。
图2为融合蛋白CBD-NT3的活性测定。
图3为恒河猴T9脊髓全横断损伤模型的建立。
图4为功能胶原支架LOCS+CBD-NT3使恒河猴脊髓全横断损伤部位的再生组织展现出良好的有序结构。
图5为功能胶原支架LOCS+CBD-NT3降低恒河猴脊髓全横断损伤部位的CSPGs沉积。
图6为功能胶原支架LOCS+CBD-NT3促进恒河猴脊髓全横断损伤部位的神经轴突再生。
图7为功能胶原支架LOCS+CBD-NT3促进恒河猴脊髓全横断损伤部位的髓鞘再生。
图8为功能胶原支架LOCS+CBD-NT3促进恒河猴脊髓全横断损伤部位的突触形成。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
PBS缓冲液：将8.0g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4溶于蒸馏水，然后用蒸馏水定容至1L，调节pH值至7.2-7.4。
DMEM/F12基础培养基为Gibeco公司的产品。anti-CS56为Abcam公司的产品。Alexa568标记的驴抗小鼠二抗为Invitrogen公司的产品。Alexa488标记的驴抗兔二抗为Invitrogen公司的产品。兔来源的多抗NF为Abcam公司的产品。鼠来源单抗MAG为Abcam公司的产品。兔来源的多抗Syn为Abcam公司的产品。Alexa568标记的驴抗兔二抗为Invitrogen公司的产品。
实施例1、功能胶原支架LOCS+CBD-NT3的制备
一、神经再生胶原支架(Linear-ordered collagen scaffold，LOCS)的获得
1、取牛筋膜，加入1-1.5％(v/v)的磷酸三丁酯水溶液，16℃浸泡24-72h。
2、取完成步骤1的牛筋膜，加入含0.5-1.5mol/L NaCl的pH7.6-8.5、25-100mmol/L的Tris-HCl缓冲液，16℃浸泡24-72h。
3、取完成步骤2的牛筋膜，加入含0.5-1.5g/100mL胰蛋白酶的pH为7.0-8.0、25-100mmol/L的Tris-HCl缓冲液，常温浸泡48-96h，获得神经再生胶原支架。
神经再生胶原支架的外观见图1中A。
取神经再生胶原支架，在干燥状态下喷金，然后扫描电镜观察。结果见图1中B。结果表明，神经再生胶原支架具有线性有序的纤维状结构。
二、融合蛋白CBD-NT3的表达和纯化
1、将载体pET-28a(+)的限制性内切酶NcoI和XhoI识别序列间的小片段替换为序列表中序列1所示的DNA分子，得到重组质粒pET-CBD-NT3。序列1自5’末端起第13至30位为his-tag标签的核苷酸序列，第64至84位为胶原结合区(Collagen binding doman，CBD)的核苷酸序列，第124至480位为神经营养因子-3(Neurotrophin-3，NT3)的核苷酸序列。
重组质粒pET-CBD-NT3表达序列表中序列2所示的融合蛋白CBD-NT3。序列2自N末端起第5至10位为his-tag标签(6个组氨酸残基组成)，第22至28位为CBD，第42至180位为NT3。
2、完成步骤1后，将重组质粒pET-CBD-NT3导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组大肠杆菌。
3、完成步骤2后，将重组大肠杆菌接种至LB液体培养基，37℃、180rpm振荡培养，得到OD600nm值为0.6的培养菌液。
4、完成步骤3后，向所述培养菌液中加入IPTG并使IPTG在体系中的浓度为1μM，37℃、200rpm振荡培养5h。
5、取完成步骤4的体系，4℃、8000g离心10min，收集沉淀1。
6、完成步骤5后，取沉淀1，加入PBS缓冲液重悬，然后超声破碎(100W，总时间15min，单次超声时间5s，单次间隔时间5s)，4℃、12000g离心20min，收集沉淀2(即包涵体)。
7、完成步骤6后，取沉淀2，加入含8M尿素和0.4％(v/v)β-巯基乙醇的Tris-HCl缓冲液(pH8.0、50mM)充分溶解，4℃、12000g离心20min，收集上清液。
8、完成步骤7后，将上清液，滴加于复性液(含0.5M NaCl、1mM氧化谷胱苷肽和2mM还原谷胱苷肽的pH7.5、50mM的Tris缓冲液)中，滴加于复性液中，16℃、80rpm振荡72h，然后用0.22μm滤膜过滤，收集滤液。
9、完成步骤8后，取装有Chelating Sepharose Fast Flow亲和层析填料的PD-10柱，先加入步骤8收集的滤液，再用10倍柱体积的含50mM咪唑和0.5M NaCl的PBS缓冲液洗脱(目的为去除未结合的蛋白)，最后用3倍柱体积的含300mM咪唑和0.5M NaCl的PBS缓冲液洗脱，收集过柱后溶液。
10、完成步骤9后，取装有Sephadex G-25S填料的HiTrap Desalting脱盐柱，先加入步骤9收集的过柱后溶液，再用1.5倍柱体积的PBS缓冲液洗脱，在1/3柱体积时出峰，出峰时开始收集过柱后溶液。收集的过柱后溶液即为融合蛋白CBD-NT3的溶液。
三、融合蛋白CBD-NT3的活性测定
1、取6孔细胞培养板，用胶原包被，包被浓度为10μg/mL。
2、完成步骤1后，从鸡胚(37℃培养第8天)中取出背根神经节，接种于所述6孔细胞培养板中，接种密度为3-5个/孔。
3、完成步骤2后，贴壁培养2h。
4、完成步骤3后，加入含1μg/mL融合蛋白CBD-NT3、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和2mM L-谷氨酰胺的DMEM/F12基础培养基，37℃培养24h，然后置于倒置显微镜观察鸡胚背根神经节轴突的生长状况。
将步骤4中“含1μg/mL融合蛋白CBD-NT3、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和2mML-谷氨酰胺的DMEM/F12基础培养基”替换为含100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和2mM L-谷氨酰胺的DMEM/F12基础培养基，其它步骤均不变，作为对照。
结果见图2(A为对照；B为加入含融合蛋白CBD-NT3的培养基)。结果表明，与对照相比，加入含融合蛋白CBD-NT3的培养基的鸡胚背根神经节轴突的生长较快。
四、制备功能胶原支架LOCS+CBD-NT3
1、取步骤一制备的神经再生胶原支架，加入步骤二获得的融合蛋白CBD-NT3的溶液(含50μg融合蛋白CBD-NT3)，室温孵育30min，得到功能胶原支架LOCS+CBD-NT3。
实施例2、功能胶原支架LOCS+CBD-NT3在修复恒河猴脊髓全横断损伤中的应用
一、恒河猴T9脊髓全横断损伤模型的建立
将10只3-4岁、体重为4.8-5.2kg的雄性恒河猴随机分成LOCS+CBD-NT3组和Control组(每组5只)，分别进行如下处理：
LOCS+CBD-NT3组：将雄性恒河猴麻醉，先打开T8-T10椎板暴露脊髓组织(图3中A)，将T9段恒河猴的脊髓切除6mm(图3中B)；然后将实施例1制备的功能胶原支架LOCS+CBD-NT3填充至脊髓缺损处(图3中C)；最后严密缝合硬脊膜(图3中D)。
Control组：将雄性恒河猴麻醉，先打开T8-T10椎板暴露脊髓组织，将T9段恒河猴的脊髓切除6mm；然后严密缝合硬脊膜。
二、评价移植功能胶原支架LOCS+CBD-NT3对恒河猴T9脊髓全横断损伤后的修复效果
完成步骤一后10个月，评价移植功能胶原支架LOCS+CBD-NT3对恒河猴T9脊髓全横断损伤后的修复效果。
1、功能胶原支架LOCS+CBD-NT3使恒河猴脊髓全横断的损伤部位的再生组织展现出良好的有序结构
(1)完成步骤一后10个月，将恒河猴安乐死，迅速将手术部位再生组织取出，然后置于4％(m/v)多聚甲醛的PBS缓冲液中4℃固定，梯度蔗糖脱水，OCT冷冻包埋后冰冻切片机切片。
(2)完成步骤(1)后，将切片进行HE染色，观察损伤部位的组织形态。具体步骤依次如下：取切片，二甲苯I处理10min；二甲苯II处理10min；二甲苯/乙醇(体积比为1:1)处理5min；无水乙醇处理5min；95％乙醇水溶液处理5min；80％乙醇水溶液处理5min；70％乙醇水溶液处理5min；50％乙醇水溶液处理5min；蒸馏水浸泡3次，每次5min；苏木素染色10min；自来水冲洗15min；蒸馏水浸泡2次，每次5min；酸性水分化，变红即可(约3秒)；蒸馏水浸泡2次，每次5min；碱性水分化，重新变蓝即可；蒸馏水浸泡2次，每次5min；50％乙醇水溶液处理5min；70％乙醇水溶液处理5min；80％乙醇水溶液处理5min；95％乙醇水溶液处理5min；无水乙醇I处理5min；无水乙醇II处理5min；二甲苯/乙醇(体积比为1:1)处理5min；二甲苯I处理10min；二甲苯II处理5min；中性树胶封片，显微镜观察，照相。
(3)完成步骤(2)后，统计两组脊髓损伤部位的空腔面积和总面积，计算空腔率。空腔率＝脊髓损伤部位的空腔面积/脊髓损伤部位的总面积×100％。
将Control组的空腔率设定为100％，计算LOCS+CBD-NT3组的相对空腔率(LOCS+CBD-NT3组的空腔率/Control组的空腔率×100％)。
实验结果见图4(A为两组脊髓损伤部位的HE染色(A中的右图为左图中方框的放大图)，B为两组脊髓损伤部位的相对空腔率的统计)。结果表明，Control组损伤部位的空腔面积大；LOCS+CBD-NT3组的空腔面积较小，而且再生组织展现出良好的有序结构。
2、功能胶原支架LOCS+CBD-NT3降低恒河猴脊髓全横断损伤部位的硫酸软骨素蛋白多糖(CSPGs)沉积
CSPGs是损伤后形成的胶质瘢痕中抑制神经再生的主要分子之一，是轴突和神经细胞再生的化学屏障。
(1)完成步骤一后10个月，将恒河猴安乐死，迅速将手术部位再生组织取出，然后置于4％(m/v)多聚甲醛的PBS缓冲液中4℃固定，梯度蔗糖脱水，OCT冷冻包埋后冰冻切片机切片。
(2)完成步骤(1)后，将切片进行硫酸软骨素蛋白多糖(CSPGs)的免疫染色，从而检测损伤部位胶质瘢痕的沉积情况。具体步骤依次如下：取切片，冷丙酮固定10min；PBS缓冲液漂洗3次，每次5min；1％(v/v)triton X-100透膜10min；PBS缓冲液漂洗3次，每次5min；10％(v/v)牛血清室温封闭1h，弃去，勿洗；滴加适当比例小鼠来源的单抗CSPGs(简称anti-CS56；工作浓度为1：500)，4℃孵育过夜后，PBS缓冲液漂洗3次，每次5min；滴加Alexa568标记的驴抗小鼠二抗(工作浓度为1：800)，37℃避光孵育1h，PBS缓冲液漂洗3次，每次5min。荧光封片剂封片；激光共聚焦显微镜下观察，照相。每个组织在脊髓损伤部位随机选取9个不同视野，通过Image J软件对CSPGs阳性染色面积百分比进行定量，统计两组脊髓损伤部位CSPGs的阳性染色面积比率。
实验结果见图5(A为两组脊髓损伤部位的CSPGs的免疫染色，B为两组脊髓损伤部位CSPGs的阳性染色面积比率)。结果表明，Control组中CSPGs的阳性染色面积比率>LOCS+CBD-NT3组中CSPGs的阳性染色面积比率。由此可见，功能胶原支架LOCS+CBD-NT3可以显著降低恒河猴脊髓全横断的损伤部位的CSPGs沉积。
3、功能胶原支架LOCS+CBD-NT3促进恒河猴脊髓全横断损伤部位的神经轴突再生
(1)完成步骤一后10个月，将恒河猴安乐死，迅速将手术部位再生组织取出，然后置于4％(m/v)多聚甲醛的PBS缓冲液中4℃固定，梯度蔗糖脱水，OCT冷冻包埋后冰冻切片机切片。
(2)完成步骤(1)后，将切片进行神经丝蛋白NF的免疫染色，从而检测损伤部位神经轴突的再生情况。具体步骤依次如下：取切片，冷丙酮固定10min；PBS缓冲液漂洗3次，每次5min；1％(v/v)triton X-100透膜10min；PBS缓冲液漂洗3次，每次5min；10％(v/v)牛血清室温封闭1h，弃去，勿洗；滴加适当比例兔来源的多抗NF(工作浓度为1：1000)，4℃孵育过夜后，PBS缓冲液漂洗3次，每次5min；滴加Alexa488标记的驴抗兔二抗(工作浓度为1：600)，37℃避光孵育1h，PBS缓冲液漂洗3次，每次5min；荧光封片剂封片；激光共聚焦显微镜下观察，照相。每个组织在脊髓损伤部位随机选取9个不同视野，通过Image J软件对NF阳性染色面积百分比进行定量，统计两组脊髓损伤部位NF的阳性染色面积比率。
实验结果见图6(A为Control组脊髓损伤部位的神经丝蛋白NF的免疫染色，B为LOCS+CBD-NT3组脊髓损伤部位的神经丝蛋白NF的免疫染色，C为两组脊髓损伤部位神经丝蛋白的阳性染色面积比率)。结果表明，Control组损伤中心几乎没有可见的NF阳性神经丝，而LOCS+CBD-NT3组损伤中心有大量的神经丝长入，而且再生轴突成有序排列，与支架材料填充方向一致；统计结果显示，LOCS+CBD-NT3组神经丝的密度显著高于Control组，说明功能胶原支架LOCS+CBD-NT3能很好的促进和引导神经轴突再生。
4、功能胶原支架LOCS+CBD-NT3促进恒河猴脊髓全横断损伤部位的髓鞘再生和突触形成
髓鞘对维持轴突正常功能及神经冲动传导起着重要作用。
(1)完成步骤一后10个月，将恒河猴安乐死，迅速将手术部位再生组织取出，然后置于4％(m/v)多聚甲醛的PBS缓冲液中4℃固定，梯度蔗糖脱水，OCT冷冻包埋后冰冻切片机切片。
(2)完成步骤(1)后，将切片进行髓鞘相关糖蛋白(Myelin-associatedglycoprotein，MAG)和神经丝蛋白NF的免疫荧光染色，从而检测损伤部位的髓鞘再生情况。具体步骤依次如下：取切片，冷丙酮固定10min；PBS缓冲液漂洗3次，每次5min；1％(v/v)triton X-100透膜10min；PBS缓冲液漂洗3次，每次5min；10％(v/v)牛血清室温封闭1h，弃去，勿洗；滴加适当比例鼠来源单抗MAG(工作浓度为1:500)和兔来源的多抗NF(工作浓度为1:1000)，4℃孵育过夜后，PBS缓冲液漂洗3次，每次5min；滴加Alexa488标记的驴抗兔二抗(工作浓度为1：600)以及Alexa568标记的驴抗鼠二抗(1：800)，37℃避光孵育1h，PBS缓冲液漂洗3次，每次5min；荧光封片剂封片；激光共聚焦显微镜下观察，照相。
(3)完成步骤(2)后，统计两组脊髓损伤部位的髓鞘数目。
实验结果见图7(A为Control组，B为LOCS+CBD-NT3组，C为每0.1mm2的面积内NF/MAG阳性共染色的髓鞘数目)。结果表明，LOCS+CBD-NT3组在损伤部位有大量MAG阳性染色髓鞘包裹轴突，而Control组在损伤部位几乎没有MAG阳性染色髓鞘包裹轴突；统计结果显示，LOCS+CBD-NT3组髓鞘数目显著高于Control组，说明功能胶原支架LOCS+CBD-NT3可以促进恒河猴脊髓全横断损伤部位的髓鞘再生。
为了证实再髓鞘化的轴突能否形成神经元环路，本发明的发明人对组织学标本进行突触素免疫荧光染色，在损伤区域内寻找是否有功能性突触形成。
(4)完成步骤(1)后，将切片进行突触素(Synaptophysin，Syn)的免疫荧光染色。具体步骤依次如下：取切片，冷丙酮固定10min；PBS缓冲液漂洗3次，每次5min；1％(v/v)triton X-100透膜10min；PBS缓冲液漂洗3次，每次5min；10％(v/v)牛血清室温封闭1h，弃去，勿洗；滴加适当比例的兔来源的多抗Syn(工作浓度为1:500)，4℃孵育过夜后，PBS缓冲液漂洗3次，每次5min；滴加Alexa568标记的驴抗兔二抗(工作浓度为1：800)，37℃避光孵育1h，PBS缓冲液漂洗3次，每次5min；荧光封片剂封片；激光共聚焦显微镜下观察，照相。每个组织在脊髓损伤部位随机选取9个不同视野，通过Image J软件对Syn阳性染色面积百分比进行定量，统计两组脊髓损伤部位突触素阳性染色面积比率。
实验结果见图8(A为两组的突触素免疫荧光染色结果，B和C为LOCS+CBD-NT3组突触素免疫荧光染色单个视野的放大图，D为两组脊髓损伤部位突触素阳性染色面积比率)。
结果表明，LOCS+CBD-NT3组在损伤部位有大量的Syn染色信号，而Control组在损伤部位只有极少量的Syn染色信号；统计结果显示，LOCS+CBD-NT3组的突触素阳性染色面积比率显著高于Control组，说明功能胶原支架LOCS+CBD-NT3可以促进恒河猴脊髓全横断损伤部位的突触形成。
<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所
<120> 功能胶原支架LOCS+CBD-NT3在修复脊髓损伤中的应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 483
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60
atgactaaga aaaccctgcg tactggtagc gcgggcagtg ctgcgggttc tggcggtaag 120
ctttacgcgg agcataagag tcaccgaggg gagtactcgg tatgtgacag tgagagtctg 180
tgggtgaccg acaagtcatc ggccatcgac attcggggac accaggtcac ggtgctgggg 240
gagatcaaaa cgggcaactc tcccgtcaaa caatattttt atgaaacgcg atgtaaggaa 300
gccaggccgg tcaaaaacgg ttgcaggggt attgatgata aacactggaa ctctcagtgc 360
aaaacatccc aaacctacgt ccgagcactg acttcagaga acaataaact cgtgggctgg 420
cggtggatac ggatagacac gtcctgtgtg tgtgccttgt cgagaaaaat cggaagaaca 480
tga 483
<210> 2
<211> 160
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Thr Lys Lys Thr Leu Arg Thr Gly Ser Ala Gly
20 25 30
Ser Ala Ala Gly Ser Gly Gly Lys Leu Tyr Ala Glu His Lys Ser His
35 40 45
Arg Gly Glu Tyr Ser Val Cys Asp Ser Glu Ser Leu Trp Val Thr Asp
50 55 60
Lys Ser Ser Ala Ile Asp Ile Arg Gly His Gln Val Thr Val Leu Gly
65 70 75 80
Glu Ile Lys Thr Gly Asn Ser Pro Val Lys Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr
85 90 95
Arg Cys Lys Glu Ala Arg Pro Val Lys Asn Gly Cys Arg Gly Ile Asp
100 105 110
Asp Lys His Trp Asn Ser Gln Cys Lys Thr Ser Gln Thr Tyr Val Arg
115 120 125
Ala Leu Thr Ser Glu Asn Asn Lys Leu Val Gly Trp Arg Trp Ile Arg
130 135 140
Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Ala Leu Ser Arg Lys Ile Gly Arg Thr
145 150 155 160

Claims (10)

1.功能胶原支架LOCS+CBD-NT3的应用，为如下C1)至C14)中的至少一种：C1)修复脊髓损伤；C2)治疗脊髓损伤；C3)促进脊髓损伤部位组织的有序再生；C4)降低脊髓损伤部位硫酸软骨素蛋白多糖的沉积；C5)促进脊髓损伤部位的神经轴突再生；C6)促进脊髓损伤部位的髓鞘再生；C7)促进脊髓损伤部位的突触形成；C8)制备用于修复脊髓损伤的产品；C9)制备用于治疗脊髓损伤的产品；C10)制备用于促进脊髓损伤部位组织的有序再生的产品；C11)制备用于降低脊髓损伤部位硫酸软骨素蛋白多糖的沉积的产品；C12)制备用于促进脊髓损伤部位的神经轴突再生的产品；C13)制备用于促进脊髓损伤部位的髓鞘再生的产品；C14)制备用于促进脊髓损伤部位的突触形成的产品；
所述功能胶原支架LOCS+CBD-NT3包括胶原结合区、神经营养因子和神经再生胶原支架。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述功能胶原支架LOCS+CBD-NT3为神经营养因子经胶原结合区特异结合至神经再生胶原支架而成。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述神经营养因子为神经营养因子-3。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述神经营养因子-3的氨基酸序列如序列表中序列2自N末端起第42至180位所示。
5.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述胶原结合区的氨基酸序列如序列表中序列2自N末端起第22至28位所示。
6.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述神经再生胶原支架的制备方法为：取牛筋膜，除去脂类和杂蛋白，得到神经再生胶原支架。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述“除去脂类”通过磷酸三丁酯溶液处理实现。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述“除去杂蛋白”通过加入含NaCl的Tris-HCl缓冲液和含胰蛋白酶的Tris-HCl缓冲液处理实现。
9.如权利要求1或2或7或8所述的应用，其特征在于：所述神经再生胶原支架的制备方法如下：
(1)取牛筋膜，加入1-1.5％(v/v)的磷酸三丁酯溶液，14-18℃浸泡24-72h；
(2)取完成步骤(1)的牛筋膜，加入含0.5-1.5mol/L NaCl的pH7.6-8.5、25-100mmol/L的Tris-HCl缓冲液，14-18℃浸泡24-72h；
(3)取完成步骤(2)的牛筋膜，加入含0.5-1.5g/100mL胰蛋白酶的pH为7-8、25-100mmol/L的Tris-HCl缓冲液，浸泡48-96h，获得神经再生胶原支架。
10.如权利要求1至9任一所述的应用，其特征在于：所述功能胶原支架LOCS+CBD-NT3为将神经再生胶原支架置于融合蛋白CBD-NT3溶液，孵育而成；所述融合蛋白CBD-NT3的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
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