JPWO2010087015A1 - 神経再生誘導管 - Google Patents
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Abstract
Description
なお、原子吸光光度法による塩化ナトリウム濃度の測定は、試料1〜4gを石英ビーカーにとり、電熱器上で徐々に温度を上げて炭化させた後、最終的にマッフル炉で6〜8時間かけて灰化し(500℃)、残渣を10重量%塩酸水溶液で再溶解後、終濃度1重量%になるように希釈し、アセチレン−空気によるフレーム原子吸光法にて測定する。このときの測定波長は589.6nmである。
原子吸光光度法による塩化ナトリウム濃度の測定は、試料1〜4gを石英ビーカーにとり、電熱器上で徐々に温度を上げて炭化させた後、最終的にマッフル炉で6〜8時間かけて灰化する(500℃)。残渣を10重量%塩酸水溶液で再溶解後、終濃度1重量%になるように希釈し、アセチレン−空気によるフレーム原子吸光法にて測定する。なお、測定波長は589.6nmである。
1.本実験の目的
通常、細胞培養実験ではウェルプレート底面での二次元培養が基本である。しかし、三次元培養を行った場合は二次元培養時の細胞の挙動とは大きく異なると言われており、神経再生能を評価するならば三次元培養がより実際に近い系であると考えられる。そこで、本実験ではコラーゲンゲルで三次元培養を行い、コラーゲンの種類によって培養細胞の挙動が異なるかどうかを確認することを目的とした。
(1)比較例のコラーゲン
日本ハム(株)製の「NMPコラーゲンPS」を比較例のコラーゲンとして使用した。この比較例のコラーゲンは、豚皮を出発原料として脱脂処理及び精製処理を行うことにより製造されたものであり、脱脂処理には塩化ナトリウム溶液での繰り返しの洗浄工程が含まれており、精製処理には塩化ナトリウムによる塩析工程が含まれている。この比較例のコラーゲンは、原子吸光光度法(灰化)により測定すると、乾燥状態で4.0重量%の塩化ナトリウムを含有していた。
(2)本発明例のコラーゲン
上記の比較例のコラーゲンの一部を出発原料として利用し、これをpH8以上9未満の等電点沈殿により精製して本発明例のコラーゲンを調製した。この本発明例のコラーゲンは、原子吸光光度法(灰化)により測定すると、乾燥状態で1.0重量%の塩化ナトリウムを含有していた。
上記で準備した2種類のコラーゲンをそれぞれ常法に従って塩酸に溶解させ、0.5重量%コラーゲン−塩酸溶液を調製した。このうち、本発明例のコラーゲン溶液を24ウェルマイクロプレート(IWAKI製)の8個のウェルに300μlずつ加え、比較例のコラーゲン溶液を同じプレートの別の8個のウェルに300μlずつ加えた。その後、プレートをインキュベーター内で37℃で30分間静置した。
(1)PC12細胞(大日本製薬ラボラトリープロダクツ製のラット副腎褐色細胞腫由来の細胞)をDMEM培地で予め継代数6まで培養しておき、遠心分離で細胞を回収後、DMEM培地15mlに1×106個となるように細胞数を調整して懸濁し、50μg/mlNGF(細胞増殖因子、R&D systems Inc.製、リン酸緩衝溶液)を15μl加えて培養液を調製した。
なお、DMEM培地とは、RPMI 1640液体培地(大日本製薬ラボラトリープロダクツ製、グルタミン酸不含有、重曹含有)500mlにウシ胎児血清(大日本製薬ラボラトリープロダクツ製)25ml、ウマ血清(大日本製薬ラボラトリープロダクツ製)50ml、200mMグルタミン液(大日本製薬ラボラトリープロダクツ製、29.23mg/ml)5mlを添加して混合したものである。
(2)調製した培養液を予め作成したコラーゲンゲル培地のウェルに300μlずつ滴下した。
(3)ウェルプレートをインキュベーター内(37℃、CO2濃度5.0%)で4日間培養した。
4日間の培養後、コラーゲンゲル内の細胞の様子を顕微鏡で観察し、代表例を写真撮影した。その結果を図1及び図2に示す。
(1)4日間培養後の生存細胞数を測定するため、ウェルに1重量%コラーゲナーゼ溶液を50μlずつ滴下し、ウェルごと軽く攪拌しながら37℃、30分間でコラーゲンゲルを溶解させた。
(2)コラーゲンゲル溶解後、MTTアッセイ溶液を各ウェルに50μl加え、インキュベーター内で30分間静置した。
(3)30分間静置後、450nmでの吸光度を測定し、各コラーゲンゲルについて8個のウェルでの吸光度の値から平均値及び標準偏差を求め、図3にグラフとして表した。なお、図3のグラフでは本発明例のコラーゲンの吸光度は比較例のコラーゲンゲルの平均吸光度を100とした相対値として表されている。また、吸光度は生存細胞数と正比例する。
(1)細胞の様子の観察
図1及び図2の対比から明らかなように、本発明例のコラーゲンを使用した培養(図1)では比較例のコラーゲンを使用した培養(図2)より細胞が良く増殖しており、神経突起の伸長も著しい。
(2)生存細胞数の測定
図3から明らかなように、本発明例のコラーゲンを使用した培養の吸光度は比較例のコラーゲンを使用した培養の吸光度より平均39%高く、この差は統計学的にも有意な差であった(p<0.01)。従って、図3の結果から、本発明例のコラーゲンは比較例のコラーゲンより有意に高い細胞増殖能を有することがわかる。
(3)以上の結果から、本発明例のコラーゲンは比較例の従来のコラーゲンより細胞増殖能及び分化誘導能において優れているといえる。
1.本実験の目的
本発明例のコラーゲンと従来のコラーゲンの細胞接着性の比較を行うため、両コラーゲンでの培養後にアスピレーターで浮遊する細胞を吸引、除去し、プレートに接着する細胞のみを測定し、その数を比較することによりコラーゲンの種類によって細胞の接着性に有意な差があるかどうかを確認することを目的とした。
(1)実験1で使用した本発明例のコラーゲンと比較例のコラーゲンを0.05重量%になるように塩酸で希釈し、24ウェルマイクロプレート(IWAKI製)のそれぞれ8個のウェルにこれらのコラーゲン溶液を300μlずつ入れ、1時間冷蔵庫に静置した。
(2)1時間静置後、各ウェルのコラーゲン溶液をアスピレーターで吸引し、ウェルに付着しているコラーゲンコートをクリーンベンチ内で1時間自然乾燥させた。
(1)PC12細胞(大日本製薬ラボラトリープロダクツ製のラット副腎褐色細胞腫由来の細胞)をDMEM培地で予め継代数6まで培養しておき、遠心分離で細胞を回収後、DMEM培地25mlに5×106個となるように細胞数を調整して懸濁し、50μg/mlNGF(細胞増殖因子、R&D systems Inc.製、リン酸緩衝溶液)を25μl加えて培養液を調製した。
(2)予め作成していたコラーゲンコートウェルプレートの各ウェルに、調製した培養液を300μlずつ入れた。
(3)ウェルプレートをインキュベーター内(37℃、CO2濃度5.0%)で5日間培養した。
(1)浮遊細胞及びきちんと接着していない細胞を取り除くため、ウェルプレートを85度に傾けながら、培地をすべて吸引した。このとき、接着細胞を吸引しないように注意した。
(2)その後、DMEM培地300μlとMTTアッセイ溶液30μlを各ウェルに加え、インキュベーター内で30分静置した。
(3)30分静置後、450nmでの吸光度を測定し、各コラーゲンコートについて8個のウェルでの吸光度の値から平均値及び標準偏差を求め、図4にグラフとして表した。なお、図4のグラフでは本発明例のコラーゲンコートの吸光度は比較例のコラーゲンコートの平均吸光度を100とした相対値として表されている。
図4から明らかなように、本発明例のコラーゲンコートの接着細胞数を表す吸光度は比較例のコラーゲンコートの吸光度より平均で49%高く、この差は統計学的にも有意な差であった(0.01<p<0.05)。再生医療における足場の細胞接着性は非常に重要な要素であり、図4の結果から、本発明のコラーゲンは従来のコラーゲンに比べて神経再生の足場として用いるのに好適であることがわかる。
1.本実験の目的
コラーゲン中の塩化ナトリウム含有濃度の違いが細胞の生存および増殖にどれくらい影響があるかを調べることを目的とした。
(1)実験1で使用した本発明例のコラーゲン、これに塩化ナトリウムを加えて塩化ナトリウム濃度を5重量%、10重量%に調整したもの、実験1で使用した比較例のコラーゲン、これに塩化ナトリウムを加えて塩化ナトリウム濃度を5重量%、10重量%に調整したものを用意した(図5のコラーゲンコート1〜6参照)。各コラーゲンを0.01重量%塩酸溶液になるように調整し、24ウェルマイクロプレート(IWAKI製)を2枚使って、各コラーゲンを4個のウェルに300μlずつ滴下し、1時間冷蔵庫に静置した。
(2)1時間静置後、各ウェルのコラーゲン溶液をアスピレーターで吸引し、ウェルに付着しているコラーゲンコートをクリーンベンチ内で1時間自然乾燥させた。
(1)PC12細胞(大日本製薬ラボラトリープロダクツ製のラット副腎褐色細胞腫由
来の細胞)をDMEM培地で予め継代数6まで培養しておき、遠心分離で細胞を回収後、DMEM培地15mlに1×106個となるように細胞数を調整して懸濁し、50μg/mlNGF(細胞増殖因子、R&D systems Inc.製、リン酸緩衝溶液)を15μl加えて培養液を調製した。
(2)調製した培養液を、予め作成したコラーゲンコートウェルプレートの各ウェルに300μlずつ滴下した。
(3)ウェルプレートをインキュベーター内(37℃、CO2濃度5.0%)で5日間培養した。
(1)MTTアッセイ溶液を各ウェルに30μlずつ加え、インキュベーター内で30分静置した。
(2)30分静置後、450nmでの吸光度を測定し、各コラーゲンコートについて8個のウェルでの吸光度の値から平均値及び標準偏差を求め、図6、7にグラフとして表した。なお、図6、7のグラフでは本発明例のコラーゲンコートの吸光度は比較例のコラーゲンコートの平均吸光度を100とした相対値として表されている。
図6及び7から明らかなように、吸光度はコラーゲンの塩化ナトリウム濃度が低いほど大きくなる傾向があり、本発明例のコラーゲン(コラーゲンコート1(塩化ナトリウム濃度1重量%))を使用した培養の吸光度は、比較例のコラーゲン(コラーゲンコート6(塩化ナトリウム濃度10重量%))を使用した培養の吸光度より平均で27%高く、この差は統計学的にも有意な差であった(p<0.01)。図6及び7の結果から、塩化ナトリウム濃度が低い本発明例のコラーゲンは比較例のコラーゲンに比べ細胞増殖能において優れていることがわかる。
1.本実験の目的
コラーゲンの等電点の違いが細胞分化にどの程度の影響があるかを調べることを目的とした。
(1)6gのNMPコラーゲンPSにMilliQ水を加え、Total1000mlの0.6重量%コラーゲン溶液を調製した。
(2)氷上で1〜3日攪拌し、コラーゲンを水に完全溶解させた。
(3)1N NaOHを滴下し、pH5.5の状態で沈殿を含むコラーゲン溶液200mlを別容器に回収した。
(4)1N NaOHの滴下を続け、同様にpH8.5の状態、及びpH10.2の状態で各々200mlを別容器に回収した。
(5)得られた3つのサンプルを遠沈管に移し、3,000rpmで45分間遠心分離を行なった。
(6)各遠沈管の上清を廃棄し、沈殿を−40℃で終夜凍結後、凍結乾燥機で2日間処理した。
(7)前記得られたサンプルを順に、サンプル1(pH5.5)、サンプル2(pH8.5)、サンプル3(pH10.2)とした。
なお、各コラーゲンサンプルにおいて、塩化ナトリウム濃度は1.2重量%であった。
(1)前記サンプル1、2、3の各300mgに0.001M HClを加え、Total 10mlの0.3重量%コラーゲン溶液を調製した。
(2)Voltexで混合した後、4℃で終夜放置しコラーゲンを完全溶解させた。
(3)0.3重量%濃度の各サンプル1mlに0.001M HCl9mlを加えよく混合し、0.03重量%コラーゲン溶液を調製した。
(4)24ウェルマイクロプレート(IWAKI製)の各ウェルに、前記0.03重量%コラーゲン溶液を200μlずつ分注し、室温(20℃)で10分間放置した。
(5)コラーゲン溶液を吸引し、1ml PBS(-)を添加後吸引して洗浄、更に再度洗浄を繰り返した。
(6)そのままクリーンベンチ内に静置して乾燥させた。
(1)神経冠由来色素細胞(クラボウ製、Code No.KM-4009MP)を専用培地(クラボウ製、Code No.M-254-500+Code No.S-002-5)で3.75×104cells/mlになるよう希釈し、各ウェルに500μlずつ播種した。
(2)37℃、CO2濃度5.0%中にて4日間培養した。
(3)培地を吸引後、新たに専用培地を500μl添加し、引き続き37℃、CO2濃度5.0%中にて3日間培養した。
(4)培地を吸引後、新たに専用培地を500μl添加して、37℃、CO2濃度5.0%中にてさらに4日間培養した後、各ウェルの細胞分化の度合いを観察した。
図8〜10から明らかなように、コラーゲンの等電点の違いにより細胞分化のレベルに顕著な差が見られ、サンプル2(pH8.5)において顕著に分化促進されていることが細胞形態の観察から確認できる。
さらに、図11、12より、生存する全細胞中における分化した細胞の割合を算出した場合、pH5.5、pH10.2に比べてpH8.5において細胞分化率(%)が高いことが確認できる。
細胞分化率(%)=分化した細胞数/生存する全細胞数
一般的に、コラーゲンは生体内では約2週間で代謝・吸収されることから鑑みて、培養11日後に40%以上の細胞分化率を有していれば、実際の神経再生の場において良好な結果が得られるものと考えられる。細胞分化率は50%以上がより好ましく、60%以上がさらに好ましく、70%以上がさらにより好ましい。
なお、原子吸光光度法による塩化ナトリウム濃度の測定は、試料1〜4gを石英ビーカーにとり、電熱器上で徐々に温度を上げて炭化させた後、最終的にマッフル炉で6〜8時間かけて灰化し(500℃)、残渣を10重量%塩酸水溶液で再溶解後、終濃度1重量%になるように希釈し、アセチレン−空気によるフレーム原子吸光法にて測定する。このときの測定波長は589.6nmである。
(1)PC12細胞(大日本製薬ラボラトリープロダクツ製のラット副腎褐色細胞腫由来の細胞)をDMEM培地で予め継代数6まで培養しておき、遠心分離で細胞を回収後、DMEM培地15mlに1×106個となるように細胞数を調整して懸濁し、50μg/mlNGF(神経成長因子、R&D systems Inc.製、リン酸緩衝溶液)を15μl加えて培養液を調製した。
なお、DMEM培地とは、RPMI 1640液体培地(大日本製薬ラボラトリープロダクツ製、グルタミン酸不含有、重曹含有)500mlにウシ胎児血清(大日本製薬ラボラトリープロダクツ製)25ml、ウマ血清(大日本製薬ラボラトリープロダクツ製)50ml、200mMグルタミン液(大日本製薬ラボラトリープロダクツ製、29.23mg/ml)5mlを添加して混合したものである。
(2)調製した培養液を予め作成したコラーゲンゲル培地のウェルに300μlずつ滴下した。
(3)ウェルプレートをインキュベーター内(37℃、CO2濃度5.0%)で4日間培養した。
(1)PC12細胞(大日本製薬ラボラトリープロダクツ製のラット副腎褐色細胞腫由来の細胞)をDMEM培地で予め継代数6まで培養しておき、遠心分離で細胞を回収後、DMEM培地25mlに5×106個となるように細胞数を調整して懸濁し、50μg/mlNGF(神経成長因子、R&D systems Inc.製、リン酸緩衝溶液)を25μl加えて培養液を調製した。
(2)予め作成していたコラーゲンコートウェルプレートの各ウェルに、調製した培養液を300μlずつ入れた。
(3)ウェルプレートをインキュベーター内(37℃、CO2濃度5.0%)で5日間培養した。
(1)PC12細胞(大日本製薬ラボラトリープロダクツ製のラット副腎褐色細胞腫由来の細胞)をDMEM培地で予め継代数6まで培養しておき、遠心分離で細胞を回収後、DMEM培地15mlに1×106個となるように細胞数を調整して懸濁し、50μg/mlNGF(神経成長因子、R&D systems Inc.製、リン酸緩衝溶液)を15μl加えて培養液を調製した。
(2)調製した培養液を予め作成したコラーゲンコートウェルプレートの各ウェルに300μlずつ滴下した。
(3)ウェルプレートをインキュベーター内(37℃、CO2濃度5.0%)で5日間培養した。
図8〜10から明らかなように、コラーゲンの等電点の違いにより細胞分化のレベルに顕著な差が見られ、サンプル2(pH8.5)において顕著に分化促進されていることが細胞形態の観察から確認できる。
さらに、図11、12より、生存する全細胞中における分化した細胞の割合を算出した場合、pH5.5、pH10.2に比べてpH8.5において細胞分化率(%)が高いことが確認できる。
細胞分化率(%)=(分化した細胞数/生存する全細胞数)×100
一般的に、コラーゲンは生体内で約2週間で代謝・吸収されることから鑑みて、培養11日後に40%以上の細胞分化率を有していれば、実際の神経再生の場において良好な結果が得られるものと考えられる。細胞分化率は50%以上がより好ましく、60%以上がさらに好ましく、70%以上がさらにより好ましい。
Claims (4)
- コラーゲンを神経再生の足場として使用する神経再生誘導管において、塩化ナトリウム含有濃度を乾燥状態で2.0重量%以下になるように処理したコラーゲンを使用することを特徴とする神経再生誘導管。
- 塩化ナトリウム含有濃度を乾燥状態で0.1〜1.5重量%になるように処理したコラーゲンを使用することを特徴とする請求項1に記載の神経再生誘導管。
- コラーゲンがpH6.0以上、10.0未満の等電点沈殿により精製処理されたものであることを特徴とする請求項1又は2に記載の神経再生誘導管。
- 生分解性ポリマーからなる管状体にコラーゲンを被覆し、さらに管状体の内部にコラーゲンを充填して形成されることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の神経再生誘導管。
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