CN102108341A - 一种细胞培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体公开一种细胞培养方法。本发明所述细胞培养方法用片状纤维载体作为细胞生长载体，所述片状纤维载体的材料为聚乙烯无纺布，所述片状纤维载体为圆形，直径1.5-6mm，所述片状纤维载体厚度为0.2-0.5mm。本发明所述方法可提供细胞的三维生长空间，可以直接往溶液中通气，供氧充分，细胞生长、代谢环境极佳，容易实施连续灌流，收获大量的代谢产物，放大潜能好，具有工业应用前景。

Description

一种细胞培养方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种细胞培养方法。

背景技术

微载体培养是目前常用的一种动物细胞大规模培养技术，其兼具悬浮培养和贴壁培养的优点，放大容易。目前微载体培养广泛用于培养各种类型细胞，生产疫苗、蛋白质产品，如293细胞、成肌细胞、Vero细胞、CHO细胞。其原理是将微载体加入到培养容器的培养液中，使细胞在微载体表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。

微载体是指直径在60-250μm，能适用于贴壁细胞生长的微珠。一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成。自Van Wezel用DEAE-SephadexA50研制的第一种微载体问世以来，国际市场上出售的微载体商品的类型已经达十几种以上，包括液体微载体、大孔明胶微载体、聚苯乙烯微载体、PHEMA微载体、甲壳质微载体、聚氨酯泡沫微载体、藻酸盐凝胶微载体以及磁性微载体等。

增大微载体单位体积内表面积(S/F)对细胞的生长非常有利。因此微载体直径一般控制在100-200μm之间。微载体的密度一般为1.03-1.05g/cm²，随着细胞的贴附及生长，密度逐渐增大。

细胞与微载体的相融性，与微载体表面理化性质有关。一般细胞在生理PH值时，表面带负电荷。若微载体带正电荷，则利用静电引力可加快细胞贴壁速度。若微载体带负电荷，因静电斥力使细胞难于黏附贴壁，但培养液中溶有或微载体表面吸附着二价阳离子作为媒介时，则带负电荷的细胞也能贴附。另外，微载体表面光滑时细胞扩展快，表面多孔则扩展慢。

用微载体培养方法进行细胞培养时，细胞贴附在微载体表面单层生长，微载体颗粒小，质量轻，因此在培养过程中营养补给特别是空气补给过程中，产生的气泡会吸附微载体，使其粘附在发酵罐罐体内壁上，或随气泡聚集到出气口，造成出气口堵塞。

发明内容

本发明针对现有微载体培养方法中微载体质量轻，可供细胞生长的表面积小的缺陷，提供一种新的细胞培养方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种细胞培养方法，包含以下步骤白点：

步骤1：在细胞培养容器内填充片状纤维载体，加入PBS缓冲液，高压灭菌；

步骤2：排空缓冲液，添加培养液；

步骤3：接种细胞，启动搅拌装置使片状纤维载体处于悬浮状态进行细胞培养。

优选的，所述片状纤维载体的材料为聚乙烯无纺布。

优选的，所述片状纤维载体为圆形，优选直径1.5-6mm。

优选的，所述片状纤维载体厚度为0.2-0.5mm。

本发明所述细胞培养方法利用片状纤维载体作为贴壁细胞或半贴壁细胞的载体，通过搅拌装置的搅拌，使得片状纤维载体悬浮于溶液中，可保证细胞快速良好生长。同时由于片状纤维载体由纤维丝交错而成，在微观上，纤维丝之间具有一定的空间供细胞生长，可供细胞生长的表面积增大，细胞大部分粘附在纤维载体内部空隙生长。

用本发明所述方法进行细胞培养时，由于片状纤维比较重，进行营养供应产生的气泡不会将其带到培养器壁上或出气口，没有载体的损失，同时保障了营养物质供应的通畅，解决了微载体培养的反应器进行放大培养时细胞营养不充分的问题，放大潜能好。

与现有技术相比，本发明所述方法的优点在于：

1.细胞接种量要求仅为最终细胞量的5％-10％。

2.细胞处于三维空间中，细胞生长、代谢环境佳，生长迅速。

3.可以直接往溶液中通气，供氧充分。

4.容易实施连续灌流培养，收获大量代谢产物。

5.放大潜能好。

具体实施方式：

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：本发明所述方法进行Marc145细胞培养

生物反应器：上海日泰CELLIPOWER08  10L

细胞：Marc145细胞

载体：片状纤维载体(40g/L)

培养基：Marc145细胞生物反应器专用培养基(MD900)

血清：小牛血清(8％)

方法：

称取300g本发明所述片状纤维载体(聚乙烯无纺布，圆形，直径1.5mm，厚度为0.2mm)，用常规方法洗涤，放入生物反应器中，注入PBS缓冲溶液，原位高压灭菌，降温后，放空PBS溶液，用MD900培养基洗涤片状纤维载体，备用。

取生长良好的Marc145细胞，制备为细胞悬液，按合适比例接种反应器中。开启反应器，设定适合的温度、PH、搅拌速度、氧含量等培养参数，进行反应器培养条件自动控制，使片状纤维载体悬浮于培养液中。反应器培养1-2天后，开启补液泵，向反应器中补加新鲜的培养基，以一倍的容积，进行灌流培养。

每天取反应器中片状纤维载体，用显微镜进行观察，并用结晶紫染液进行细胞计数。

Marc145细胞接种反应器中，细胞很快贴壁伸展；培养1天后细胞形态饱满、生长良好，每个微载体上平均生长10-15个细胞；培养第2天后细胞形态更加立体，轮廓清晰，细胞数量明显增加，少量片状纤维载体上细胞几乎长满；培养第3天后，片状纤维载体上细胞基本长满，细胞形态健康；培养第4天后，片状纤维载体上细胞更加致密，细胞密度达到15×10⁶个/ml以上；继续培养至第10天，片状纤维载体上细胞依然良好，没有明显细胞脱落现象。

实施例2：本发明所述方法进行Vero细胞培养

称取300g本发明所述片状纤维载体(聚乙烯无纺布，圆形，直径6mm，厚度为0.5mm)，用常规方法洗涤，放入生物反应器中，注入PBS缓冲溶液，原位高压灭菌，降温后，放空PBS溶液，用MD900培养基洗涤片状纤维载体，备用。

取生长良好的Vero细胞，制备为细胞悬液，按合适比例接种反应器中。开启反应器，设定适合的温度、PH、搅拌速度、氧含量等培养参数，进行反应器培养条件自动控制，使片状纤维载体悬浮于培养液中，片状纤维载体浓度为1mg/ml。

反应器培养1-2天后，开启补液泵，向反应器中补加新鲜的培养基，以一倍的容积，进行灌流培养。

每天取反应器中片状纤维载体，用显微镜进行观察，并用结晶紫染液进行细胞计数。

Vero细胞接种反应器中，细胞很快贴壁伸展；培养1天后细胞形态饱满、生长良好，每个微载体上平均生长10-15个细胞；培养第2天后细胞形态更加立体，轮廓清晰，细胞数量明显增加，少量片状纤维载体上细胞几乎长满；培养第3天后，片状纤维载体上细胞基本长满，细胞形态健康；培养第4天后，片状纤维载体上细胞更加致密，细胞密度达到15×10⁶个/ml以上；继续培养至第10天，片状纤维载体上细胞依然良好，没有明显细胞脱落现象。

实施例3：本发明所述方法进行293细胞培养

称取300g本发明所述片状纤维载体(聚乙烯无纺布，圆形，直径3.0mm，厚度为0.3mm)，用常规方法洗涤，放入生物反应器中，注入PBS缓冲溶液，原位高压灭菌，降温后，放空PBS溶液，用MD900培养基洗涤片状纤维载体，备用。

取生长良好的293细胞，制备为细胞悬液，按合适比例接种反应器中。开启反应器，设定适合的温度、PH、搅拌速度、氧含量等培养参数，进行反应器培养条件自动控制，使片状纤维载体悬浮于培养液中，片状纤维载体浓度为5mg/ml。

反应器培养1-2天后，开启补液泵，向反应器中补加新鲜培养基，以一倍的容积，，进行灌流培养。

每天取反应器中片状纤维载体，用显微镜进行观察，并用结晶紫染液进行细胞计数。

293细胞接种反应器中，细胞很快贴壁伸展；培养1天后细胞形态饱满、生长良好，每个微载体上平均生长10-15个细胞；培养第2天后细胞形态更加立体，轮廓清晰，细胞数量明显增加，少量片状纤维载体上细胞几乎长满；培养第3天后，片状纤维载体上细胞基本长满，细胞形态健康；培养第4天后，片状纤维载体上细胞更加致密，细胞密度达到20×10⁶个/ml以上；继续培养至第10天，片状纤维载体上细胞依然良好，没有明显细胞脱落现象。

以上仅是本发明的优选实施方式，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种细胞培养方法，包含以下步骤：

步骤1：在细胞培养容器内填充片状纤维载体，加入PBS缓冲液，高压灭菌；

步骤2：排空缓冲液，添加培养液；

步骤3：接种细胞，启动搅拌装置使片状纤维载体处于悬浮状态进行细胞培养。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述片状纤维载体的材料为聚乙烯无纺布。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述片状纤维载体为圆形。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述片状纤维载体的直径为1.5-6mm。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述片状纤维载体厚度为0.2-0.5mm。