CN110078563A - 纳米纤维素在矫治梨树缺铁黄化病方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及纳米纤维素在矫治梨树缺铁黄化病方面的应用，其将经硫酸水解纤维素原料制备成纳米纤维素，与硫酸亚铁螯合后，喷施叶片矫治梨树缺铁黄化病。纳米纤维素水悬浮剂是具有聚阴离子性质的颗粒，其晶须的平均尺寸为长度50‑250 nm，宽度15‑30 nm，综合表面带电荷密度量20‑100 mmol/kg。在硫酸亚铁喷施浓度为0.002‑0.01 M时，纳米纤维素与铁元素电荷密度比于1:300‑1:30000的范围内喷施叶片后，能够显著提高缺铁黄化杜梨苗叶片的叶绿素含量与有效铁含量。

Description

纳米纤维素在矫治梨树缺铁黄化病方面的应用

技术领域

本发明属于纤维素应用技术领域，具体涉及一种新型生物纳米材料（纳米纤维素）在农业生产上用于矫治梨树缺铁黄化病的应用，其能够提高叶片叶绿素含量、有效铁含量，降低硫酸亚铁的用量，提高梨树缺铁黄化病的矫治效果。

背景技术

纤维素（Cellulose）是自然界中最丰富的可再生的天然有机高分子资源，占植物界碳含量的50%以上，主要来源于植物，如木材、棉花、一年生禾本科植物等；除植物纤维外，细菌、动物也产生纤维素，如木醋杆菌可以合成细菌纤维素，从被囊类动物中也可提取出纤维素。纤维素的化学结构是由D-吡喃葡萄糖环彼此以β-（1,4）糖苷键以C1椅式构象连接而成的线性高分子，其结构如图1所示。

如图2所示，纤维素的超分子结构是形成一种由结晶区和无定形区交错结合的体系，从结晶区到无定形区是逐步过渡的，无明显界限。天然纤维素的分子链长度约为5000nm，结晶区部分的长度为100-200 nm，纤维素结晶区的特点是其分子链取向良好、密度较大、分子间的结合力强、对强度的贡献大；无定形区的纤维素分子链取向差、分子排列无秩序、分子间距大、密度低、分子间氢键数量少、对强度的贡献小。通过化学或其他方法将结晶区分离出来，就是要制备的纳米微晶纤维素。这些晶体、向列有序的和无定型的纤维素，依靠其分子内和分子间的氢键以及范德华力，维持着自组装的超分子结构和原纤维的形态。

制备纳米纤维素常用的方法是酸水解。国内外以木材、棉花、麻类、细菌纤维素和被囊动物等不同原料通过可控的化学酸水解方法制备纳米纤维素。目前，超声波在制备纳米纤维素的过程中，大多是辅助用于改善酸水解制备纳米纤维素后悬浮液的分散性。已有的报道显示，纳米纤维素的制备方法还有酶处理法、物理法、微生物合成法、溶剂法、离子液体制备法等。在不改变纤维素自身特性的前提下，通过磺化、羧化、硅烷化、接枝、聚电解质等表面改性的方法提高其化学相容性，使其在基质中兼具良好的分散性和对疏水机制的粘附力，为进一步拓展纳米纤维素的应用范围提供条件。

由于纤维素的天然性质和独特的分子结构，越来越受到科学界的重视。除用于纺织、造纸、精细化工等传统的工业领域之外，由于其可自然分解、可再生、化学性质稳定、无毒、生物相容等优良的性能，在纳米医疗、药物、能源、环境、生物和农业等领域中也得到了极大的发展。进一步有效地利用纤维素资源，开拓纤维素在纳米精细化工、纳米医药、纳米食品、纳米复合材料和新能源中的应用，是国内外研究的热点。

与传统纤维素相比，纳米纤维素作为新一代的纳米材料，具有很多优异的性能，比如高纯度、高结晶度、巨大的比表面积等特性，加之其具有生物材料的轻质、可降解、水中优异的分散性、表面羟基可改性、良好的生物相容性及可再生等特性，使其在高性能复合材料中显示出巨大的应用前景。利用硫酸水解法制备成的纳米纤维素，比表面积较大且携带一定量的聚阴离子，其纳米颗粒比纤维素具有更显著的生物活性。有研究表明纳米二氧化钛、多层碳纳米管、金属纳米颗粒及以纳米材料为基础的纳米感应器等材料在农业上均有应用，然而有着良好生物特性和应用价值的纳米纤维素在农业上的应用还没有被系统研究。

梨是世界四大水果之一，全世界有88个国家和地区生产梨。我国是世界梨生产和消费大国，梨栽培面积和产量居世界第一。发生缺铁黄化病的梨树，轻者树势衰弱，果实产量和品质明显下降，重者造成树体残缺甚至整株死亡，还常导致其他病害发生。针对果树遭受缺铁胁迫现象，目前主要通过植物遗传改良、栽培措施和微生物技术三个途径解决或最大程度上减少缺铁对果树造成的不良影响。选育适应性强的品种和砧木及改良土壤，是防治梨树缺铁黄化病的最根本途径，但在短期内难以实现，只有给树体补充有效铁才是应急措施。在梨树生产中，通常采用叶面喷施或土施螯合铁、改良土壤、增施有机肥、挖根埋瓶、树干注射、叶面喷施硫酸亚铁等措施防治缺铁黄化症。但大多对防治梨树缺铁黄化病无明显效果，有的也只是短暂和局部的效果。少部分有较好的防治效果，但成本太高而且对环境污染较大。因此现代农业迫切需要高效、环境友好的新型制剂取代或减少化学农药和肥料的使用。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种新型生物纳米材料纳米纤维素在农业生产上用于矫治梨树缺铁黄化病的应用，其能够提高叶片叶绿素含量和有效铁含量，降低硫酸亚铁的用量，提高梨树缺铁黄化病的矫治效果。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

纳米纤维素在矫治梨树缺铁黄化病方面的应用。

进一步的，本发明提供了纳米纤维素水悬浮液在矫治杜梨缺铁黄化病方面的应用。

本发明中，纳米纤维素水悬浮液为具有聚阴离子性质的颗粒，颗粒的平均尺寸为长度50-250 nm，宽度15-30 nm。

上述纳米纤维素水悬浮液在矫治杜梨缺铁黄化病方面的应用，具体的，将纳米纤维素水悬浮液与硫酸亚铁复配后，形成的纳米纤维素与铁螯合物喷施于杜梨黄化苗，以提高叶片叶绿素含量和有效铁含量。

上述纳米纤维素水悬浮液在矫治杜梨缺铁黄化病方面的应用，进一步优选的，在硫酸亚铁喷施浓度为0.002-0.01M时，纳米纤维素与铁元素电荷密度比在1:300-1:30000的范围内，可防治杜梨缺铁黄化病。

本研究采用硫酸水解法制备纳米纤维素，其典型的结果是纤维的表面发生了部分磺化反应。硫酸处理后纤维表面形成具有双层排斥力的作用，最终使得悬浮液成为一种稳定的胶体物质。同时纤维素表面由于挂有磺酸基而带有负电荷，这就能够使悬浮液良好地分散在水中而不发生絮凝和团聚现象，并且可以与带有正电荷的亚铁离子由于静电作用相互吸引而结合形成纳米纤维素-铁螯合物。

生物纳米材料被公认为是21世纪最有前途的科研领域，是国际生物技术领域的前沿和热点学科，纳米技术正在引发这一场新的产业技术革命。纳米科技与农业技术的相互渗透，也催生了农业纳米科技等新兴学科，为农业科学提供新的理论、方法和技术手段，必将对未来农业的发展产生广泛而深远的影响。纳米材料有着特殊的四大效应：表面效应、体积效应、量子效应和宏观量子隧道效应。这些特殊的效应使纳米材料具有传统材料所不具备的奇异或反常的物理、化学特性。

和现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明经试验表明：纳米生物材料纳米纤维素可以调节植物生长，矫治生理性病害、有利于补充植物必要的营养元素、减少肥料的用量，降低农用化学品使用对土壤和地下水的污染。本发明是利用自然资源生产的新型纳米生物材料纳米纤维素，该制剂具有以下特点：一是此制剂为一种环境友好型纳米制剂与无机盐螯合的水悬浮液，无需任何其他助剂；二是在作物上微量应用，能显著提高梨叶片叶绿素和有效铁含量，又能减少对土壤、水以及环境的影响；三是这种制剂对使用者的技术要求不高，并能省时、省工、省力，符合当前农村社会经济现实；四是其作为一种天然生物材料，环境相容性好，不仅有利于植物生长，而且在自然界容易被降解，不易对环境造成压力，在农业上具有广泛的应用潜力。

附图说明

图1为纤维素的分子结构；

图2为纤维素结晶结构图解；

图3为纤维素原料的SEM检测（标尺100 μm）；

图4为纳米纤维素的SEM 检测（标尺100 nm）；

图5为纳米纤维素的SEM 检测（标尺1 μm）；

图6为纳米纤维素的粒度分布图；

图7为纳米纤维素的电位检测图；

图8为纳米纤维素的电导率滴定结果滴定曲线图（示意图），X轴代表滴定NaOH的滴定量，Y轴代表电导率；

图9为纳米纤维素-铁处理杜梨黄化苗72小时后表型。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。

本发明是利用新型生物纳米材料纳米纤维素与硫酸亚铁螯合用于矫治梨树叶片缺铁黄化，从而解决大量使用Fe-EDTA后，在自然条件下EDTA转化成乙二胺三乙酸，然后经过环化变成二酮哌嗪，成为持久性有机污染物而导致环境污染等重大问题。

下述试验中，所用的纳米纤维素水悬浮液经下述步骤制备获得（具体也可参照文献制备：Dong, S.; Bortner, M. J.; Roman, M., Analysis of the sulfuric acidhydrolysis of wood pulp for cellulose nanocrystal production: a centralcomposite design study. Industrial Crops and Products 2016,93, 76-87.）：

本发明将溶解级软木纤维素（可购买普通市售产品，纤维素原料见图3）和55-65%硫酸按料液比1 g：10 mL进行混合，在45-60℃条件下水解45分钟。水解结束后，产物在4 ℃条件下高速（4500-9000 rpm）离心10-15 分钟，去除上清液后，常温下用即用型透析袋（截留分子量12-14kD）在去离子水中透析，以释放游离的酸至析出液中的pH稳定（即pH值无变化）；透析后的产品在0 ℃条件下，超声破碎（设置35 %输出功率，工作5 s，间歇5 s，超声处理25分钟），即获得纳米纤维素水悬浮液。

通过SEM扫描镜多次检测样品液，图4和图5分别展示了纳米纤维素在扫描电镜下放大50000 倍和20000 倍的形态，图中可以看出：得到纳米纤维素颗粒的平均尺寸为长度50-250 nm，宽度15-30 nm。图6和图7分别展示了通过Malvern Nanosizer（Nano-ZS90）纳米粒度仪检测的粒度分布与电位结果图，结果显示：纳米纤维素水悬浮液有效粒度为90-250nm；纳米纤维素水悬浮液的Zeta 电势电位为-44.5±0.97 mV。用电导滴定法测得其纳米粒子的综合表面电荷密度为20-100 mmol/kg（见图8）。

应用试验：纳米纤维素-铁螯合物能使杜梨黄化苗复绿且提高叶片叶绿素（SPAD）含量

a）获取杜梨黄化苗

杜梨种子与一定湿度河沙1:10混合，4 ℃ 冰箱中层积25天左右，杜梨种子露白后，播种于原阳基地梨示范园大棚温室中，基质为V _草炭：V _珍珠岩：V _蛭石=3:1:1。杜梨苗生长至6-8 片真叶时，选择高度均一的幼苗至8个水培槽培养杜梨黄化苗，水培槽中营养液为含1×10^-8 MFe-EDTA的改良Hogland营养液（见表1），每小时通气15 min。

当株高长至20 cm左右时，将杜梨幼苗移至实验室人工气候箱，设定16 h光照（26℃），8 h黑夜（18 ℃）。利用SPAD-502便携式叶绿素仪测定每株缺铁处理后SPAD值在10-30范围的叶片并做标记，每盆3株黄化杜梨苗，在做标记的范围内，以SPAD值为准均匀分布每株于盆中，每盆叶片SPAD值在20左右，共6盆。营养液为0 M Fe-EDTA的Hogland营养液。适应48 h左右，可开始处理。

表1 改良Hoagland营养液的组成

b）杜梨黄化苗不同处理方式

试验共6个处理，喷施浓度为0.002 M Fe/L，其中纳米纤维素（CNC）与硫酸亚铁的不同比例螯合有3个处理（T2、T3、T4、），CNC:Fe电荷密度比分别为：1:300，1:3000，1:30000；还有0.002 M Fe/L FeSO₄（T1）和Fe-EDTA（T5），喷施时加0.15%吐温以增加吸附度，以喷施去离子水为对照（CK）。每个处理设3个重复。将纳米纤维素水悬浮液与FeSO₄混合进行螯合后喷施，每盆喷施纳米纤维素-铁螯合物10 ml，喷施1次（见表2）。为防止药液进入根系，影响实验结果，所以在喷施时采取将根部套袋的方法隔绝药液。由于叶片下表皮的气孔比上表皮多，喷施时尽量使下表皮接收的药液更多。待叶片上残留药液晾干后再放入人工气候箱中继续培养。72 h后观察表型，并取样测定相关生理指标。

表2 不同处理方式

。

c）不同处理后杜梨黄化苗的表型

处理72 小时后，与CK表型相比，T2-T5处理组均恢复至正常水平，T1表型部分恢复（见图9）。其中单独用硫酸亚铁处理的T 1处理组叶片明显有叶片复绿分布不均匀的情况出现，即黄色叶片上呈现出斑斑点点的绿色；而用CNC与硫酸亚铁螯合处理的T2-T4处理组叶片复绿较均匀。这种情况说明单独用硫酸亚铁喷施处理的叶片，其中的亚铁离子很容易就被固定而不能移动，而被螯合处理的叶片由于纳米纤维素携带亚铁离子可以在植物体内运输而使叶片复绿较均匀。单独用Fe-EDTA处理的叶片复绿程度介于前述二者之间。

d）不同处理对杜梨黄化苗叶片叶绿素含量（SPAD）的影响

表3给出了不同处理对杜梨黄化苗叶片叶绿素含量影响结果。由表3中可知：处理72小时后，叶绿素含量由高到低顺序为：1：3000（T3）＞1：30000（T4）＞1:300（T2）＞Fe-EDTA（T5）＞FeSO₄（T1）＞CK。T1-T5均比对照CK高，且差异显著。T2、T3、T4、T5无显著性差异；T1与T2-5差异显著。

表3 不同处理对杜梨黄化苗叶片叶绿素含量影响

上述试验结果说明：用纳米纤维素-铁螯合、Fe-EDTA或单独的硫酸亚铁处理后叶片均有一定程度的复绿，且纳米纤维素-铁螯合与Fe-EDTA的复绿程度高于单独施用硫酸亚铁。纳米纤维素-铁螯合中电荷密度比为1:3000的复绿效果最好，可提高叶绿素含量高达72.91%。说明矫治黄化病效果取决于纳米纤维素与铁合适的电荷密度比例。

应用试验：纳米纤维素-铁螯合物提高杜梨叶片有效铁含量

表4给出了不同处理对杜梨黄化苗叶片有效铁含量的影响结果。由表4可知，处理72小时后，有效铁含量由高到低顺序为：1：3000（T3）＞1：30000（T4）＞1:300（T2）＞FeSO₄（T1）＞Fe-EDTA（T5）＞CK。T1-T5均显著高于对照；T1-4均显著高于T5；T3最高且与其他所有处理都有显著性差异；T1、T2、T4间无显著差异。

表4 不同处理对杜梨黄化苗叶片有效铁含量影响

上述试验结果说明：纳米纤维素与铁螯合后均能使处理后叶片有效铁含量显著高于FeSO₄处理，其中当纳米纤维素与铁元素的电荷密度比为1：3000叶片有效铁含量最高，纳米纤维素具有明显提高叶片保持有效铁含量的能力。

应用试验：不同浓度的纳米纤维素-铁对杜梨叶片叶绿素荧光参数的影响

表5给出了不同处理对杜梨黄化苗叶片叶绿素荧光参数的影响。由表5可知，CK初始荧光（Fo）显著高于T1-T5、非光化学猝灭系数（NPQ）增高，而最大荧光（Fm）、最大光化学效率（Fv/Fm）、实际光化学效率（Φ_PSⅡ）、光化学猝灭系数（qP）、PSⅡ吸收光能用于光化学反应的相对份额（P）显著低于T1-T5，说明CK受缺铁胁迫加重使杜梨的光合作用受到干扰，导致光能过剩发生光抑制。而T1-T5处理均能不同程度地改善缺铁胁迫造成的光抑制，其中纳米纤维素与铁的电荷密度比为1：3000的Φ_PSⅡ、qP 、P最高，改善光抑制效果最好。

表5 不同处理对杜梨黄化苗叶片叶绿素荧光参数的影响

Claims (5)

1.纳米纤维素在矫治梨树缺铁黄化病方面的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，纳米纤维素水悬浮液在矫治杜梨缺铁黄化病方面的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，纳米纤维素水悬浮液为具有聚阴离子性质的颗粒，颗粒的平均尺寸为长度50-250 nm，宽度15-30 nm。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，纳米纤维素水悬浮液与硫酸亚铁复配喷施于杜梨黄化苗，以提高叶片叶绿素含量和有效铁含量。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，在硫酸亚铁喷施浓度为0.002-0.01 M时，纳米纤维素与铁元素电荷密度比在1:300-1:30000的范围内，可防治杜梨缺铁黄化病。