CN111362271B - 一种细胞3d培养用微球的改性方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种细胞3D培养用微球的改性方法及其应用，本发明中的细胞3D培养用微球能够实现对细胞的高效培养，提高单位体积的细胞产量，能够有效解决细胞需要较大培养空间和需要较长预处理时间的瓶颈，为细胞更广泛的产业化应用奠定了基础。

Description

一种细胞3D培养用微球的改性方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种细胞3D培养用微球的改性方法及其应用。
背景技术
纳米材料是指孔径介于1-1000nm的一类材料。纳米材料具有传统材料所不具备的奇异或反常的物理、化学特性，如原本导电的铜到某一纳米级界限就不导电，原来绝缘的二氧化硅、晶体等，在某一纳米级界限时开始导电。这是由于纳米材料具有颗粒尺寸小、比表面积大、表面能高、表面原子所占比例大等特点，以及其特有的三大效应：表面效应、小尺寸效应和宏观量子隧道效应。
但是，不经过修饰的硅材料对蛋白和核酸的吸附和捕获的能力比较低，主要原因是硅材料表面主要是硅羟基，其在生理环境(pH6-8)下，主要呈负电性，因此对细胞生长不利。这主要是由于细胞表面也呈负电，对于细胞特别是贴壁细胞来说，不利于细胞的贴壁生长。由于硅材料表面的羟基极易发生取代，因此硅材料容易被修饰。通过对硅材料修饰上特定的基团，特别是烷基基团，能够提高细胞对材料的贴合，使得细胞可以在这些细胞表面进行生长。同时，通过修饰可以使得密度大于水的硅材料悬浮于培养基中，可以实现细胞在培养基中的悬浮培养。但是，在修饰过程中，需要对整个条件进行控制，以保证修饰效果。
干细胞(stem cell)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。间充质干细胞是干细胞的一种，因能分化为间质组织而得名，具有亚全能分化潜能，在特定的体内外环境下，能够诱导分化成为多种组织细胞。间充质干细胞具有干细胞的共性，即自我更新、多向分化和归巢的能力。
然而，对干细胞在实际应用中存在以下问题：1)干细胞生长需要贴壁，因此在培养过程中需要大量的培养瓶，占用大量的培养空间。2)干细胞传代比较麻烦，需要将干细胞用胰酶，然后再分到不同培养瓶，加入新鲜的培养基。整个操作过程比较麻烦。因此如果可以让干细胞在培养基中悬浮培养，就可以节省大量的培养空间和减少传代操作，因此需要一种可以悬浮在培养基中的材料进行干细胞的培养。
发明内容
本发明的目的在于提供一种细胞3D培养用微球的改性方法及其应用。
本发明所采取的技术方案是：
一种细胞3D培养用微球的改性方法，包括如下步骤：
1)取粒径在20～30nm，表面带有烷基的纳米硅球，分散在不溶于水的有机溶剂中，得到纳米硅球分散液；
2)取蛋白溶解于磷酸缓冲液中，得到蛋白液；
3)搅拌状态下，向蛋白液中滴加纳米硅球分散液；
4)反应完全至有机溶剂挥干，得到细胞3D培养用微球。
作为上述前处理方法的进一步改进，烷基为C1～C20的链烷基。
作为上述前处理方法的进一步改进，有机溶剂选自乙酸乙酯、苯、CCl4中的任意一种。
作为上述前处理方法的进一步改进，纳米硅球分散液中，纳米硅球的浓度为10～20mg/mL。
作为上述前处理方法的进一步改进，蛋白以10～15mg/mL的浓度溶解于磷酸缓冲液中。
作为上述前处理方法的进一步改进，磷酸缓冲液的pH为7.0～8.0，优选7.4。
作为上述前处理方法的进一步改进，蛋白液与纳米硅球分散液的体积比为(2～4)：1。
作为上述前处理方法的进一步改进，以不破坏蛋白液和纳米硅球分散液界面的速度搅拌，反应完全至有机溶剂挥干，得到细胞3D培养用微球。
作为上述前处理方法的进一步改进，蛋白为BSA、人血清白蛋白、多聚赖氨酸中的至少一种。
一种细胞3D培养方法，其特征在于：细胞培养基添加有按上述改性方法得到的细胞3D培养用微球。
本发明的有益效果是：
本发明公开的一种细胞3D培养用微球的改性方法及其应用，本发明中的细胞3D培养用微球能够实现对细胞的高效培养，提高单位体积的细胞产量，能够有效解决细胞需要较大培养空间和需要较长预处理时间的瓶颈，为细胞更广泛的产业化应用奠定了基础。
附图说明
图1是微球材料扫描电子显微镜图片；
图2是等体积培养基不同处理的干细胞培养效率对比，图中，A不加硅球；B直接添加纳米硅球；C增加了实施例1改性微球，B和C中的硅球含量相同。
具体实施方式
一种细胞3D培养用微球的改性方法，包括如下步骤：
1)取粒径在20～30nm，表面带有烷基的纳米硅球，分散在不溶于水的有机溶剂中，得到纳米硅球分散液；
2)取蛋白溶解于磷酸缓冲液中，得到蛋白液；
3)搅拌状态下，向蛋白液中滴加纳米硅球分散液；
4)反应完全至有机溶剂挥干，得到细胞3D培养用微球。
作为上述前处理方法的进一步改进，烷基为C1～C20的链烷基。
作为上述前处理方法的进一步改进，有机溶剂选自乙酸乙酯、苯、CCl4中的任意一种。
作为上述前处理方法的进一步改进，纳米硅球分散液中，纳米硅球的浓度为10～20mg/mL。
作为上述前处理方法的进一步改进，蛋白以10～15mg/mL的浓度溶解于磷酸缓冲液中。
作为上述前处理方法的进一步改进，磷酸缓冲液的pH为7.0～8.0，优选7.4。
作为上述前处理方法的进一步改进，蛋白液与纳米硅球分散液的体积比为(2～4)：1。
作为上述前处理方法的进一步改进，以不破坏蛋白液和纳米硅球分散液界面的速度搅拌，反应完全至有机溶剂挥干，得到细胞3D培养用微球。
蛋白的作用一方面在于提高硅球的分散性，避免硅球团聚；另一方面在于促进细胞在微球上的粘附生长。作为上述前处理方法的进一步改进，蛋白为BSA、人血清白蛋白、多聚赖氨酸等细胞培养领域常用蛋白中的至少一种。
一种细胞3D培养方法，其特征在于：细胞培养基添加有按上述改性方法得到的细胞3D培养用微球。
下面将结合实施例进一步阐述本发明，应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。
实施例1
一种用于细胞培养的微球材料，其制备方法包括以下步骤：
(1)将粒径在20～30nm，表面带有烷基的纳米硅球以10～20mg/mL的浓度，分散于乙酸乙酯溶液中，得到纳米硅球分散液，为了促进分散，可以超声处理15-30分钟，其中烷基为C1～C20的链烷基；
(2)取牛血清白蛋白，以10～15mg/mL浓度溶解于pH 7.4磷酸缓冲液中；
(3)取一个50mL的烧杯，先加入10mL牛血清白蛋白溶液，磁力搅拌，然后缓慢加入5mL纳米硅球分散液，可以看到二者分层，调整磁力搅拌，以不破坏二者界面的转速，搅拌24～48小时，反应完全至有机溶剂挥干，得到细胞3D培养用微球。
图1是微球材料扫描电子显微镜图片。
使用添加有实施例1中细胞3D培养用微球的干细胞培养基中进行干细胞培养，图2为干细胞培养效率对比，其中初始细胞数量均为10万个，图示为24小时后细胞数量，其中A为在25cm2培养瓶，培养基10mL，B为10mL培养基含有10mg未经改性的纳米硅球，C为10mL培养基含有10mg实施例1制备得到细胞3D培养用微球。

Claims (3)

1.一种细胞3D培养用微球的改性方法，包括如下步骤：
1)取粒径在20～30nm，表面带有烷基的纳米硅球，分散在不溶于水的有机溶剂中，得到纳米硅球分散液；纳米硅球分散液中，纳米硅球的浓度为10～20 mg/mL，有机溶剂选自乙酸乙酯、苯、CCl4中的任意一种，烷基为C1～C20的链烷基；
2)取蛋白溶解于磷酸缓冲液中，得到蛋白液，所述蛋白以10～15 mg/mL的浓度溶解于磷酸缓冲液中，蛋白为BSA、人血清白蛋白、多聚赖氨酸中的至少一种，磷酸缓冲液的pH为7.0～8.0
3)搅拌状态下，向蛋白液中滴加纳米硅球分散液，蛋白液与纳米硅球分散液的体积比为（2～4）：1；
4)以不破坏蛋白液和纳米硅球分散液界面的速度搅拌，反应完全至有机溶剂挥干，得到细胞3D培养用微球。
2.根据权利要求1所述的改性方法，其特征在于：磷酸缓冲液的pH为7.4。
3.一种细胞3D培养方法，其特征在于：细胞培养基添加有按权利要求1或2改性方法得到的细胞3D培养用微球。
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