CN104497144B - 一种介孔二氧化硅纳米微球复合物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种介孔二氧化硅纳米微球复合物及其制备方法与应用，属于纳米技术与生命科学技术领域。首先十六烷基三甲基溴化铵与正硅酸乙酯在室温下合成介孔二氧化硅纳米微球；将聚醚酰亚胺溶解在无水乙醇中，并加入介孔二氧化硅纳米微球，超声搅拌，得到聚醚酰亚胺修饰的介孔二氧化硅纳米微球；将聚醚酰亚胺修饰的介孔二氧化硅纳米微球与生长因子Activin A低温下搅拌，得到介孔二氧化硅纳米微球复合物；介孔二氧化硅纳米微球复合物用于胚胎干细胞定向分化，其能提高胚胎干细胞定向分化为肝样细胞的效率，并且分化的肝样细胞具有成熟肝细胞的功能。与现有技术相比，本发明的制备方法简单，并且该纳米微球具有良好的生物相容性。
Description
技术领域
本发明涉及一种介孔二氧化硅纳米微球复合物及其制备方法与应用，属于纳米技术与生命科学技术领域。
背景技术
干细胞具有自我复制、高度增殖和多向分化的潜能，被认为是人体内所有细胞、组织和器官的“种子”的“万能”细胞。干细胞在再生医学上具有无可估计的应用价值，因此干细胞的相关研究一直吸引着国际上生物与医学各领域科学家的极大关注。我国是世界第一人口大国，因创伤、疾病、遗传和衰老造成的组织器官缺损或功能障碍人数位居世界之首。在肝脏疾病方面，我国乙肝病毒携带者为1.3亿人，乙肝病人有3000万人，其中有相当一部分病人最终发展为肝硬化、肝衰竭等肝脏终末期疾病。这些疾病均缘于脏器在细胞、组织、器官水平上受到不同原因的损伤而导致的功能异常、缺陷和丧失。近年来，虽然在其诊疗方面取得了众多进展，但目前针对这些器官细胞和机能损伤的药物或处理手段远远不足以解决这一日益严重的问题，器官移植虽可挽救终末期病人的生命，但受限于供源短缺、术后后续治疗费用高昂等严峻问题。因此探寻由干细胞定向诱导分化为肝细胞以期替代受损的肝脏细胞组织已成为当今肝脏疾病治疗的研究热点。
过去几年中，已有一系列关于胚胎干细胞向多种特定细胞如血细胞、心肌以及神经上皮等主要细胞系分化的报道。但多数的报道仅限于在随机分化基础上不同程度的纯化，而非定向诱导分化。随着人们对胚胎干细胞定向分化的研究，目前干细胞定向诱导的主要方法有：(1)添加各种细胞因子；(2)与不同种类细胞共培养；(3)小分子化合物诱导；(4)染色体修饰等。但是这些方法仍然存在着分化率低、细胞混杂、不成熟等突出问题，还不能有效地定向诱导胚胎干细胞向单一方向分化和达到纯的分化细胞。而未分化的胚胎干细胞植入人体内会产生畸胎瘤，影响细胞移植治疗的应用，阻碍了它的临床应用。
目前一些经典的技术已成为干细胞研究面临的重要瓶颈，因此，新技术的引入对于推动干细胞相关研究具有非常重要的意义。纳米技术作为一门20世纪80年代末逐步发展起来的新兴学科，在材料学、环境科学、生物医学、化学等方面都有着广泛的应用前景(ZuoL，Wei W，Morris M，et al.New technology and clinical applications ofnanomedicine.Med Clin North Am，2007(91)：845-862)，为干细胞的研究和发展提供了新的契机。目前纳米技术在干细胞方面已经有了一些初步的研究，如：纳米材料作为载体向干细胞导入DNA及蛋白质等生物大分子物质以控制干细胞的增殖与分化(Hong Jinkee，ShahNisarg J，Drake Adam C，et al.Graphene multilayers as gates for multi-weeksequential release of proteins from surfaces.ACS Nano，2012(6)：81-88)；基于三维空间结构仿真模拟的纳米材料为干细胞的体外三维培养提供了良好载体(Jung SeungLee，Jisoo Shin，Hae-Min Park，Yun-Gon Kim，Byung-Gee Kim，Jong-Won Oh，Seung-WooCho.Liver extracellular matrix providing dual functions of two-dimensionalsubstrate coating and three-dimensional injectable hydrogel platform forliver tissue engineering.Biomacromolecules，2014(15)：206-218)。总之，纳米技术与干细胞研究的结合将会极大地推动人类更好地理解和控制干细胞命运并进一步开发新的干细胞技术，最终使干细胞在人类疾病的治疗与预防中发挥重要作用。目前，介孔二氧化硅纳米材料在干细胞方面应用的报道还十分有限。本发明提出的介孔二氧化硅纳米微球复合物不仅制备方法简单，而且能够提高体外定向分化胚胎干细胞的效率。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种介孔二氧化硅纳米微球复合物及其制备方法与应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种介孔二氧化硅纳米微球复合物，由介孔二氧化硅纳米微球与生长因子Activin A复合而成的复合物，其中，复合物中介孔二氧化硅质量分数为98.5-99.5％，生长因子Activin A质量分数为0.5-1.5％。
作为优选，复合物中介孔二氧化硅质量分数为99％，生长因子Activin A质量分数为1.0％。
所述的介孔二氧化硅纳米微球复合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)十六烷基三甲基溴化铵与正硅酸乙酯在室温下合成介孔二氧化硅纳米微球；
所述的十六烷基三甲基溴化铵以溶液形式进行反应，十六烷基三甲基溴化铵溶液的浓度为2.08-4.16mg/ml，且十六烷基三甲基溴化铵溶液与正硅酸乙酯的体积比100∶1；首先将十六烷基三甲基溴化铵溶解在纯化水中，将氢氧化钠溶液加入到上述溶液中，加热温度到80-90℃，将正硅酸乙酯加入，搅拌反应2-3h，冷却到室温，然后在70-80℃干燥处理，之后依次用无水乙醇与纯水溶解洗涤后，60-80℃烘干，得到介孔二氧化硅纳米微球，介孔二氧化硅纳米微球的形貌通过场发射投射电镜观察，粒度用动态激光光散射法检测，其粒径大小在100-150nm。
(2)将聚醚酰亚胺(PEI，分子量25000)溶解在无水乙醇中，并加入步骤(1)得到的介孔二氧化硅纳米微球，超声搅拌1-2h，得到聚醚酰亚胺修饰的介孔二氧化硅纳米微球；其中，介孔二氧化硅纳米微球与聚醚酰亚胺的重量比为(5-10)∶(2.5-5)，聚醚酰亚胺在无水乙醇中的浓度为1-5mg/ml。
(3)将聚醚酰亚胺修饰的介孔二氧化硅纳米微球依次通过无水乙醇与磷酸缓冲液离心洗涤后，分别洗涤3次，每次洗涤5-10分钟，然后溶解在磷酸缓冲液中；
(4)将步骤(3)处理后的聚醚酰亚胺修饰的介孔二氧化硅纳米微球与生长因子Activin A1～5℃下搅拌10～20小时，得到介孔二氧化硅纳米微球复合物，其中，聚醚酰亚胺修饰的介孔二氧化硅纳米微球与生长因子Activin A的加入量比例为50∶1～100∶1，聚醚酰亚胺修饰的介孔二氧化硅纳米微球在磷酸缓冲液中的浓度为10-20ug/ml。
所述的介孔二氧化硅纳米微球复合物用于胚胎干细胞定向分化。具体为：将所述的介孔二氧化硅纳米微球复合物加入到分化胚胎干细胞的分化培养基中，且介孔二氧化硅纳米微球复合物在分化培养基中的含量为1g/100ml。
本发明制备的介孔二氧化硅纳米微球复合物，实现了生长因子与介孔纳米材料载体的高效复合，这为干细胞定向分化移植提供了新的思路及理论基础，且制备工艺简单，生产成本低，所得的介孔二氧化硅纳米微球生物相容性好，能进一步满足生产和应用的需求。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
(1)本发明的制备方法简单，可操作性强，能进一步满足生产应用的需求。
(2)本发明制备的介孔二氧化硅纳米微球具有良好的生物相容性。
(3)本发明制备的介孔二氧化硅纳米微球复合物加入到胚胎干细胞分化培养基中，其定向分化为肝样细胞的效率为90％，比单独生长因子诱导分化胚胎干细胞为肝样细胞的效率提高了近30％。
附图说明
图1为介孔二氧化硅纳米微球投射电镜图；
图2为介孔二氧化硅纳米微球投射电镜图；
图3为介孔二氧化硅纳米微球粒径分布图；
图4为介孔二氧化硅纳米微球的氮气吸附-脱附等温线；
图5为介孔二氧化硅纳米微球的孔径分布图；
图6为实施例3中不同浓度介孔二氧化硅纳米微球的生物活性条形图；
图7为实施例4中细胞免疫荧光检测肝样细胞标记物AFP/ALB/CK18；
图8-1为实施例4中，自发分化情况下细胞流式分析内胚层和肝样细胞标记物的表达情况；
图8-2为实施例4中，加入介孔二氧化硅纳米微球情况下细胞流式分析内胚层和肝样细胞标记物的表达情况；
图8-3为实施例4中，加入生长因子情况下细胞流式分析内胚层和肝样细胞标记物的表达情况；
图8-4为实施例4中，加入介孔二氧化硅纳米微球复合物情况下细胞流式分析内胚层和肝样细胞标记物的表达情况；
图9为实施例4中糖原染色法检测诱导分化的肝样细胞糖原合成能力检测图；
图10为实施例4中靛青绿(indocyanine green，ICG)摄取能力检测图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
介孔二氧化硅纳米微球的制备
(1)取0.3g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶解在144ml纯化水中。
(2)将1.05ml 2M氢氧化钠溶液加入到上述溶液中，加热温度到80-90℃。
(3)加入1.5ml正硅酸乙酯(TEOS)，搅拌2-3小时，冷却到室温，在80℃进行干燥。
(4)用无水乙醇溶解，洗涤3次，每次10000rpm离心10分钟。
(5)用纯化水洗涤3次，每次10000rpm离心10分钟。
(6)1ml纯化水溶解，80℃烘干。
本实施例制得的介孔二氧化硅纳米微球投射电镜图如图1和图2所示，介孔二氧化硅纳米微球粒径分布图如图3所示，图1～图3表明该方法制备的纳米微球呈现良好的形貌，而且分散均匀，粒径在100-150nm之间。介孔二氧化硅纳米微球的氮气吸附-脱附等温线及相应的孔径分布如图4、图5所示。对制备得到的复合物进行检测，其中，复合物中介孔二氧化硅质量分数为98.5-99.5％，生长因子Activin A质量分数为0.5-1.5％。
实施例2
介孔二氧化硅纳米微球复合物的制备
(1)取聚醚酰亚胺(PEI，分子量25000)5mg，溶解在2ml无水乙醇。
(2)将10mg介孔二氧化硅纳米微球加入上述溶液中，超声搅拌1-2小时，得到PEI修饰好的介孔二氧化硅纳米微球。
(3)用无水乙醇，洗涤3次，每次5分钟。
(4)用磷酸缓冲液洗涤3次，每次5分钟。
(5)用5ml磷酸盐缓冲液重新超声PEI修饰好的介孔二氧化硅纳米微球。
(6)取PEI修饰好的介孔二氧化硅纳米微球，浓度为10ug/ml，加入生长因子Activin A，其终浓度为100ng/ml，4℃搅拌过夜，这时生长因子可以通过静电以及其他弱相互作用吸附在介孔二氧化硅纳米微球上。
实施例3
介孔二氧化硅纳米微球对干细胞的生物相容性
(1)小鼠胚胎干细胞培养
所用小鼠胚胎干细胞来源于同济大学，所用培养液为含15％胎牛血清(FBS)、1％谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、0.1Mβ-巯基乙醇、500-1000U/ml白血病抑制因子(LeukaemiaInhibitor Factor，LIF)和1％的青霉素-链霉素的DMEM培养液。小鼠胚胎干细胞生长于0.1％明胶包被的细胞培养皿，实验选用对数生长期细胞。
(2)MTT法检测细胞存活率
(a)收集对数生长期细胞，调整细胞悬液浓度，使细胞密度为5×103-1×104/孔，每孔加入100ul。
(b)5％CO2，37℃孵育，直至单层细胞铺满孔底，加入不同浓度介孔二氧化硅纳米微球溶液，每孔100ul。
(c)5％CO2，37℃分别孵育24、48小时。
(d)吸去96孔板中的培养液，每孔加入20ulMTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，继续培养4h。
(e)每孔加入100ul二甲基亚砜(DMSO)，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
如图6所示，该方法制备的介孔二氧化硅纳米微球在浓度小于0.5mg/ml时，其生物相容性很好。
实施例4
介孔二氧化硅纳米微球复合物用于干细胞定向分化为肝样细胞
(1)鼠胚胎干细胞的诱导分化
小鼠胚胎干细胞(MES)用0.125％胰酶消化离心后，37℃放置30min-1h，取上层MES，1000rpm离心5min，然后用含10％FBS的GMEM培养基悬浮细胞转至0.1％明胶包被的24孔培养板，密度为1×105个/ml，每孔1ml。第二天开始进行分化实验，加入下述分化培养基。首先在含有2％FBS的GMEM培养基中加入介孔二氧化硅纳米微球复合物，加入的量为10ug/ml，培养3天，接着在含有10％FBS的GMEM培养基中加入含有30ng/ml的aFGF和2.5M丁酸钠分化5天，再加入含有20ng/ml HGH的GMEM培养基继续分化5天，最后再加入10ng/ml Dex和0.4Um OSM的GMEM培养基继续分化5天。对照组为只加生长因子或者介孔二氧化硅纳米微球，自发分化为阴性对照。
(2)干细胞分化效率的检测
(a)免疫荧光检测：诱导分化18d后，免疫荧光检测肝样细胞标记物角蛋白CK18、甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)的表达。如图7所示，介孔二氧化硅纳米微球与生长因子的复合物能够提高小鼠胚胎干细胞分化为成熟肝细胞的效率。
(b)细胞流式分析：诱导分化3、18d后，细胞流式分析内胚层标记物Foxa2、Sox17的表达以及肝样细胞标记物甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)的表达。如图8所示，介孔二氧化硅纳米微球复合物组中各个标记物的表达都显著高于其它组。
(c)肝样细胞功能检测：诱导分化18天后，利用过碘酸-雪夫反应(periodicacid-Schiff，PAS)糖原染色法以及免疫荧光检测其糖原合成能力以及靛青绿(indocyaninegreen，ICG)的摄取能力。如图9所示，PAS染色明显可见胞浆内存在有红色颗粒，呈阳性反应，显示该分化的细胞有肝细胞特有的糖原合成和贮藏功能。并且介孔二氧化硅纳米微球复合物诱导分化后有更多的红色颗粒，说明其合成糖原能力比较强。另外诱导分化18d后，加入终浓度1mg/ml ICG的培养液，在37℃培养1h后，如图10所示，介孔二氧化硅纳米微球复合物诱导分化后有更多ICG阳性的细胞，表明分化的细胞具有成熟肝细胞的ICG代谢功能。
实施例5
介孔二氧化硅纳米微球复合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)十六烷基三甲基溴化铵与正硅酸乙酯在室温下合成介孔二氧化硅纳米微球；
十六烷基三甲基溴化铵以溶液形式进行反应，十六烷基三甲基溴化铵溶液的浓度为2.08mg/ml，且十六烷基三甲基溴化铵溶液与正硅酸乙酯的体积比100∶1；首先将十六烷基三甲基溴化铵溶解在纯化水中，将氢氧化钠溶液加入到上述溶液中，加热温度到80℃，将正硅酸乙酯加入，搅拌反应2h，冷却到室温，然后在70℃干燥处理，之后依次用无水乙醇与纯水溶解洗涤后，60℃烘干，得到介孔二氧化硅纳米微球，介孔二氧化硅纳米微球的形貌通过场发射投射电镜观察，粒度用动态激光光散射法检测，其粒径大小在100-150nm之间。
(2)将聚醚酰亚胺(PEI，分子量25000)溶解在无水乙醇中，并加入步骤(1)得到的介孔二氧化硅纳米微球，超声搅拌1h，得到聚醚酰亚胺修饰的介孔二氧化硅纳米微球；其中，介孔二氧化硅纳米微球与聚醚酰亚胺的重量比为2∶1，聚醚酰亚胺在无水乙醇中的浓度为1mg/ml。
(3)将聚醚酰亚胺修饰的介孔二氧化硅纳米微球依次通过无水乙醇与磷酸缓冲液离心洗涤后，分别洗涤3次，每次洗涤5分钟，然后溶解在磷酸缓冲液中；
(4)将步骤(3)处理后的聚醚酰亚胺修饰的介孔二氧化硅纳米微球与生长因子Activin A1℃下搅拌20小时，得到介孔二氧化硅纳米微球复合物，其中，聚醚酰亚胺修饰的介孔二氧化硅纳米微球与生长因子Activin A的加入量比例为50∶1，聚醚酰亚胺修饰的介孔二氧化硅纳米微球在磷酸缓冲液中的浓度为10ug/ml。
本实施例制得的介孔二氧化硅纳米微球复合物中介孔二氧化硅质量分数为98.5％，生长因子Activin A质量分数为1.5％。
实施例6
介孔二氧化硅纳米微球复合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)十六烷基三甲基溴化铵与正硅酸乙酯在室温下合成介孔二氧化硅纳米微球；
十六烷基三甲基溴化铵以溶液形式进行反应，十六烷基三甲基溴化铵溶液的浓度为4.16mg/ml，且十六烷基三甲基溴化铵溶液与正硅酸乙酯的体积比100∶1；首先将十六烷基三甲基溴化铵溶解在纯化水中，将氢氧化钠溶液加入到上述溶液中，加热温度到90℃，将正硅酸乙酯加入，搅拌反应3h，冷却到室温，然后在80℃干燥处理，之后依次用无水乙醇与纯水溶解洗涤后，80℃烘干，得到介孔二氧化硅纳米微球，介孔二氧化硅纳米微球的形貌通过场发射投射电镜观察，粒度用动态激光光散射法检测，其粒径大小在100-150nm之间。
(2)将聚醚酰亚胺(PEI，分子量25000)溶解在无水乙醇中，并加入步骤(1)得到的介孔二氧化硅纳米微球，超声搅拌2h，得到聚醚酰亚胺修饰的介孔二氧化硅纳米微球；其中，介孔二氧化硅纳米微球与聚醚酰亚胺的重量比为4∶1，聚醚酰亚胺在无水乙醇中的浓度为5mg/ml。
(3)将聚醚酰亚胺修饰的介孔二氧化硅纳米微球依次通过无水乙醇与磷酸缓冲液离心洗涤后，分别洗涤3次，每次洗涤10分钟，然后溶解在磷酸缓冲液中；
(4)将步骤(3)处理后的聚醚酰亚胺修饰的介孔二氧化硅纳米微球与生长因子Activin A5℃下搅拌10小时，得到介孔二氧化硅纳米微球复合物，其中，聚醚酰亚胺修饰的介孔二氧化硅纳米微球与生长因子Activin A的加入量比例为100∶1，聚醚酰亚胺修饰的介孔二氧化硅纳米微球在磷酸缓冲液中的浓度为20ug/ml。
本实施例制得的介孔二氧化硅纳米微球复合物中介孔二氧化硅质量分数为99.5％，生长因子Activin A质量分数为0.5％。
实施例7
介孔二氧化硅纳米微球复合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)十六烷基三甲基溴化铵与正硅酸乙酯在室温下合成介孔二氧化硅纳米微球；
十六烷基三甲基溴化铵以溶液形式进行反应，十六烷基三甲基溴化铵溶液的浓度为3.00mg/ml，且十六烷基三甲基溴化铵溶液与正硅酸乙酯的体积比100∶1；首先将十六烷基三甲基溴化铵溶解在纯化水中，将氢氧化钠溶液加入到上述溶液中，加热温度到85℃，将正硅酸乙酯加入，搅拌反应2.5h，冷却到室温，然后在75℃干燥处理，之后依次用无水乙醇与纯水溶解洗涤后，70℃烘干，得到介孔二氧化硅纳米微球，介孔二氧化硅纳米微球的形貌通过场发射投射电镜观察，粒度用动态激光光散射法检测，其粒径大小在100-150nm之间。
(2)将聚醚酰亚胺(PEI，分子量25000)溶解在无水乙醇中，并加入步骤(1)得到的介孔二氧化硅纳米微球，超声搅拌1.5h，得到聚醚酰亚胺修饰的介孔二氧化硅纳米微球；其中，介孔二氧化硅纳米微球与聚醚酰亚胺的重量比为3∶1，聚醚酰亚胺在无水乙醇中的浓度为2mg/ml。
(3)将聚醚酰亚胺修饰的介孔二氧化硅纳米微球依次通过无水乙醇与磷酸缓冲液离心洗涤后，分别洗涤3次，每次洗涤8分钟，然后溶解在磷酸缓冲液中；
(4)将步骤(3)处理后的聚醚酰亚胺修饰的介孔二氧化硅纳米微球与生长因子Activin A 3℃下搅拌12小时，得到介孔二氧化硅纳米微球复合物，其中，聚醚酰亚胺修饰的介孔二氧化硅纳米微球与生长因子Activin A的加入量比例为80∶1，聚醚酰亚胺修饰的介孔二氧化硅纳米微球在磷酸缓冲液中的浓度为15ug/ml。
本实施例制得的介孔二氧化硅纳米微球复合物中介孔二氧化硅质量分数为99％，生长因子ActivinA质量分数为1.0％。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种介孔二氧化硅纳米微球复合物的制备方法，其特征在于，所述的介孔二氧化硅纳米微球复合物为由介孔二氧化硅纳米微球与生长因子Activin A复合而成的复合物，其中，复合物中介孔二氧化硅质量分数为98.5-99.5％，生长因子Activin A质量分数为0.5-1.5％；
制备方法包括以下步骤：
(1)十六烷基三甲基溴化铵与正硅酸乙酯在80-90℃下搅拌反应2-3h，再冷却到室温，合成介孔二氧化硅纳米微球；
(2)将聚醚酰亚胺溶解在无水乙醇中，并加入步骤(1)得到的介孔二氧化硅纳米微球，超声搅拌，得到聚醚酰亚胺修饰的介孔二氧化硅纳米微球；
(3)将聚醚酰亚胺修饰的介孔二氧化硅纳米微球依次通过无水乙醇与磷酸缓冲液离心洗涤后，溶解在磷酸缓冲液中；
(4)将步骤(3)处理后的聚醚酰亚胺修饰的介孔二氧化硅纳米微球与生长因子ActivinA低温下搅拌，得到介孔二氧化硅纳米微球复合物。
2.根据权利要求1所述的一种介孔二氧化硅纳米微球复合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的十六烷基三甲基溴化铵以溶液形式进行反应，且十六烷基三甲基溴化铵溶液与正硅酸乙酯的体积比为100:1，十六烷基三甲基溴化铵溶液的浓度为2.08-4.16mg/ml。
3.根据权利要求1所述的一种介孔二氧化硅纳米微球复合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中冷却到室温后还包括以下步骤：在70-80℃干燥处理，之后依次用无水乙醇与纯水溶解洗涤后，60-80℃烘干。
4.根据权利要求1所述的一种介孔二氧化硅纳米微球复合物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，介孔二氧化硅纳米微球与聚醚酰亚胺的重量比为(5-10)：(2.5-5)，聚醚酰亚胺在无水乙醇中的浓度为1-5mg/ml。
5.根据权利要求1所述的一种介孔二氧化硅纳米微球复合物的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，聚醚酰亚胺修饰的介孔二氧化硅纳米微球与生长因子Activin A的加入量比例为50:1～100:1。
6.根据权利要求1所述的一种介孔二氧化硅纳米微球复合物的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，聚醚酰亚胺修饰的介孔二氧化硅纳米微球与生长因子Activin A在1～5℃下搅拌10～20小时，得到介孔二氧化硅纳米微球复合物。
7.根据权利要求1所述的一种介孔二氧化硅纳米微球复合物的制备方法，其特征在于，复合物中介孔二氧化硅质量分数为99％，生长因子Activin A质量分数为1.0％。
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