CN107596432A - 负载介孔二氧化硅微球的壳聚糖多孔止血微球的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种负载介孔二氧化硅微球的壳聚糖多孔止血微球的制备方法，其包括如下步骤：分别制备分散相和连续相；将所述分散相滴加入连续相中，均质搅拌成乳液；将所述乳液进行热致相分离后，加入预冷的相反转溶液，得到壳聚糖多孔微球；将所述壳聚糖多孔微球加入含有十六烷基三甲基溴化铵和氢氧化钠的水溶液中，滴加正硅酸乙酯，在80℃下进行反应后，依次洗涤、中和和干燥，得到所述负载介孔二氧化硅微球的壳聚糖多孔止血微球。本发明在壳聚糖微球表面和内部孔壁上生成介孔二氧化硅。此结构特征有利于将壳聚糖与二氧化硅多孔止血材料的物理止血机理相结合以大幅提升壳聚糖的止血能力。
Description
技术领域
本发明涉及高分子多孔材料领域，具体涉及一种负载介孔二氧化硅微球的壳聚糖多孔止血微球的制备方法。
背景技术
壳聚糖是一种可生物降解的带正电荷的多糖，它具有来源丰富、结构稳定、生物相容性、生物降解、安全无毒、广谱抗菌等优点。由于其优异的生物相容性，组织或粘膜粘附性，以及疾病治疗功能，包括止血，抗微生物，抗肿瘤和抗炎活性，因此它是优良的生物医用材料的原材料，已经被用做伤口敷料。
由于其生物相容性和稳定性，二氧化硅材料在生物材料领域，特别是介孔二氧化硅微球领域得到了越来越多的认可。具有较高孔隙率和较大表面积，孔半径分布明确，吸附性能好等特点的介孔二氧化硅纳米粒子(MSN)在提高止血效果方面应具有很大的优势。同时，高浓度的极性硅烷醇基团和MSN表面的负电荷可以激活凝血因子XII和其他凝血蛋白，也有利于血液凝固。总的来说，MSN是一个很有前途的止血剂。
中国专利CN102772820A公开了一种烷基改性壳聚糖/介孔二氧化硅复合快速止血粉的制备方法，该方法包括如下操作：1)烷基改性壳聚糖制备；2)介孔二氧化硅颗粒制备；3)复合快速止血粉制备：将烷基改性壳聚糖溶于乙酸水溶液中，加入聚乙二醇20000，溶解后加入步骤2)制备的介孔二氧化硅颗粒，室温搅拌，将沉淀物冷冻干燥后悬浮于二甲基亚砜中，调pH值，离心、用去离子水洗涤后冷冻干燥，得到烷基改性壳聚糖/介孔二氧化硅复合快速止血粉。但是该专利的方法在制备复合止血粉的过程中，不易控制介孔二氧化硅颗粒在烷基改性壳聚糖中的分散；另外，介孔二氧化硅颗粒容易被烷基改性壳聚糖完全包覆，减弱或损失介孔二氧化硅的止血性能。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种负载介孔二氧化硅微球的壳聚糖多孔止血微球的制备方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种负载介孔二氧化硅微球的壳聚糖多孔止血微球的制备方法，其包括如下步骤：
分别制备分散相和连续相；
将所述分散相滴加入连续相中，均质搅拌成乳液；
将所述乳液进行热致相分离后，加入预冷的相反转溶液，得到壳聚糖多孔微球；
将所述壳聚糖多孔微球加入含有十六烷基三甲基溴化铵和氢氧化钠的水溶液中，滴加正硅酸乙酯，在80℃下进行反应后，依次洗涤、中和和干燥，得到所述负载介孔二氧化硅微球的壳聚糖多孔止血微球；
其中，所述分散相的制备方法为：将壳聚糖溶于稀酸中，得到壳聚糖溶液；所述连续相的制备方法为：将乳化剂与水不溶性有机溶剂混匀，即可。
作为优选方案，所述稀酸为醋酸溶液，所述醋酸溶液的质量分数为1～2％。
作为优选方案，所述壳聚糖溶液的质量分数为1～2％。
作为优选方案，所述有机溶剂选自石油醚、液体石蜡中的一种或两种。
作为优选方案，所述乳化剂为油包水型乳化剂。
作为优选方案，所述油包水型乳化剂选自司班-80和吐温-60中的一种或两种。
作为优选方案，所述热致相分离的温度为-196℃。
作为优选方案，所述相反转溶液为无水乙醇，所述无水乙醇的预冷温度为-20℃。无水乙醇是壳聚糖的凝固再生剂，同时又能溶解水、乳化剂和有机分散相。使用-20℃的乙醇是为了使在-196℃形成的壳聚糖冰粒仍然维持冰粒形态，而不会融化。
作为优选方案，在含有壳聚糖多孔微球、溴化十六烷基三甲铵、氢氧化钠和正硅酸乙酯的水溶液中，溴化十六烷基三甲铵的质量分数为0.2～0.5％，氢氧化钠的质量分数为0.05～0.06％，正硅酸乙酯的体积分数为0.6～1.2％。
作为优选方案，所述中和的操作使用无水乙醇和质量分数为37％盐酸的混合溶液，其中，无水乙醇和盐酸的体积比为100：1。
本发明通过乳液法，热致相分离和反相再生相结合，无需交联剂和致孔剂，将多孔结构引入壳聚糖止血微球中，再通过表面活性剂模板法，在壳聚糖微球表面和内部孔壁上生成介孔二氧化硅。此结构特征有利于将壳聚糖与二氧化硅多孔止血材料的物理止血机理相结合以大幅提升壳聚糖的止血能力。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1、壳聚糖未被改性，保留了尽可能多的胺基；壳聚糖上的胺基在生理体液中呈正电性，可以通过静电作用吸引血液中呈负电性的红细胞，从而引起红细胞大量聚集，使血栓快速增大，胺基越多，止血越快；
2、壳聚糖多孔微球的形成不需要添加交联剂和致孔剂，既避免了交联剂可能带来的生物毒性也不会引入杂质，工艺简单，易于操作；
3、壳聚糖多孔微球的表面和内部为连通性良好的多孔结构，且壳聚糖多孔微球的大小分布均匀，直径均为100～500μm，介孔二氧化硅微球在壳聚糖多孔微球的孔壁上原位生成，并均匀地粘附在壳聚糖微球的表面和内部，大大地增加了材料的比表面积和吸水率，且微球表面粗糙，增强了微球的吸附能力，可用作快速止血材料；
4、综合了壳聚糖和介孔二氧化硅的止血能力，止血效果高效。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明实施例1制备的负载介孔二氧化硅微球的壳聚糖多孔微球表面形貌的扫描电镜图；
图2为本发明实施例1制备的负载介孔二氧化硅的壳聚糖多孔微球截面形貌的扫描电镜图；
图3为本发明实施例1制备负载介孔二氧化硅的壳聚糖多孔微球在血栓动力学中的止血性能；
图4为本发明实施例1制备负载介孔二氧化硅的壳聚糖多孔微球在肝切模型中的止血性能。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例涉及一种负载介孔二氧化硅微球的壳聚糖多孔微球的制备方法，包括如下步骤：
1、将1g壳聚糖溶解于100mL的1wt％的醋酸水溶液中，搅拌混合均匀，然后除泡，得到壳聚糖溶液，即分散相；
2、将0.2g Tween 60和4.8g Span 80溶解于100mL石油醚溶液中，混匀，得到均一溶液，即连续相；
3、取步骤1所得的壳聚糖溶液20mL作为分散相缓慢加入步骤2所得的连续相溶液中，并高速搅拌得到乳液。
4、将步骤3所得的乳液用液氮淬火；
5、将-20℃的无水乙醇倒入淬火后的乳液中，搅拌1小时后，收集微球，用无水乙醇和水洗涤，真空干燥得到壳聚糖多孔微球；
6、将步骤5所得的壳聚糖多孔微球加入含有1g溴化十六烷基三甲铵和0.28g氢氧化钠的水溶液中，再滴加3mL正硅酸乙酯，80℃匀速搅拌反应后，离心收集微球，用水和无水乙醇洗涤；
7、将收集的微球加入到无水乙醇-盐酸(250mL:2.5mL)混合溶液中搅拌，然后离心收集，真空干燥得到产品。
本实施例制备的负载介孔二氧化硅的壳聚糖多孔微球(记为CSMS-S3)，直径为113.2±14.1μm，比表面积为143.2m2/g。它的表面和截面形貌示于图1a、图1b和图2a、图2b所示，可以看出微球表面为多孔结构，孔径不大于3μm，微球的表面和内部孔壁附着许多50～200nm之间的二氧化硅微球。
实施例2
本实施例涉及一种负载介孔二氧化硅微球的壳聚糖多孔微球的制备方法，包括如下步骤：
1、将1g壳聚糖溶解于100mL的1wt％的醋酸水溶液中，搅拌混合均匀，然后除泡，得到壳聚糖溶液，作为分散相；
2、将0.2g Tween 60和4.8g Span 80溶解于100mL石油醚溶液中，混匀，得到均一溶液，即连续相；
3、取步骤1所得的壳聚糖溶液20mL作为分散相缓慢加入步骤2所得的连续相溶液中，并高速搅拌得到乳液，
4、将步骤3所得的乳液用液氮淬火；
5、将-20℃的无水乙醇倒入淬火后的乳液中，搅拌1小时后，收集微球，用无水乙醇和水洗涤，真空干燥得到壳聚糖多孔微球；
6、将步骤5所得的壳聚糖多孔微球加入含有1g溴化十六烷基三甲铵和0.28g氢氧化钠的水溶液中，再滴加4mL正硅酸乙酯，80℃匀速搅拌反应后，离心收集微球，用水和无水乙醇洗涤；
7、将收集的微球加入到乙醇-盐酸(250mL:2.5mL)混合溶液中搅拌，然后离心收集，真空干燥得到产品。
本实施例制备的负载介孔二氧化硅的壳聚糖多孔微球(记为CSMS-S4)，直径为115.2±10.7μm，比表面积为196.2m2/g。
实施例3
本实施例涉及一种负载介孔二氧化硅微球的壳聚糖多孔微球的制备方法，包括如下步骤：
1、将1g壳聚糖溶解于100mL的1wt％的醋酸水溶液中，搅拌混合均匀，然后除泡，得到壳聚糖溶液，即分散相；
2、将0.2g Tween 60和4.8g Span 80溶解于100mL石油醚溶液中，混匀，得到均一溶液，即连续相；
3、取步骤1所得的壳聚糖溶液20mL作为分散相缓慢加入步骤2所得的连续相溶液中，并高速均质搅拌得到乳液；
4、将步骤3所得的乳液用液氮淬火；
5、将-20℃的无水乙醇倒入淬火后的乳液中，搅拌1小时后，收集微球，用无水乙醇和水洗涤，真空干燥得到壳聚糖多孔微球；
6、将步骤5所得的壳聚糖多孔微球加入含有1g溴化十六烷基三甲铵和0.28g氢氧化钠的水溶液中，再滴加5mL正硅酸乙酯，80℃匀速搅拌反应后，离心收集微球，用水和无水乙醇洗涤；
7、将收集的微球加入到乙醇-盐酸(250mL:2.5mL)混合溶液中搅拌，然后离心收集，真空干燥得到产品。
本实施例制备的负载介孔二氧化硅的壳聚糖多孔微球(记为CSMS-S5)，直径为126.3±12.1μm，比表面积为394.5m2/g。
实施例4
本实施例涉及一种负载介孔二氧化硅微球的壳聚糖多孔微球的制备方法，包括如下步骤：
1、将1g壳聚糖溶解于100mL的1wt％的醋酸水溶液中，搅拌混合均匀，然后除泡，得到壳聚糖溶液；
2、将0.2g Tween 60和4.8g Span 80溶解于100mL石油醚溶液中，混匀，得到均一溶液，即连续相；
3、取步骤1所得的壳聚糖溶液20mL作为分散相缓慢加入步骤2所得的连续相溶液中，并高速均质搅拌得到乳液；
4、将乳液用液氮淬火；
5、将-20℃的无水乙醇倒入淬火后的乳液中，搅拌1小时，收集微球，用无水乙醇和水洗涤，真空干燥得到壳聚糖多孔微球；
6、将步骤5所得的壳聚糖多孔微球加入含有1g溴化十六烷基三甲铵和0.28g氢氧化钠的水溶液中，再滴加6mL正硅酸乙酯，80℃匀速搅拌反应后，离心收集微球，用水和无水乙醇洗涤；
7、将收集的微球加入到乙醇-盐酸(250mL:2.5mL)混合溶液中搅拌，然后离心收集，真空干燥得到产品。
本实施例制备的负载介孔二氧化硅的壳聚糖多孔微球(记为CSMS-S6)，直径为132±10.7μm，比表面积为535.3m2/g。
对比例1
本对比例的制备方法与实施例1的不同之处仅在于，在制备过程中未进行介孔二氧化硅微球的原位生长步骤，从而得到了一种壳聚糖多孔微球，记为CSMS。
对比例2
本对比例的制备方法与实施例1的不同之处仅在于，在制备过程中直接进行了介孔二氧化硅微球的原位生长，从而得到了一种介孔二氧化硅微球，记为SiO2。
实施例5
本实施例涉及一种负载介孔二氧化硅的壳聚糖多孔微球的止血效果检验，包括如下步骤：
1.取各样品5mg置于试管中，由动物静脉取血(3.8％柠檬酸钠：血＝1:9抗凝)，每5mL血液中加入500μL，0.1M的CaCl2溶液；
2.混合均匀后迅速吸取100μL血液加入负载介孔二氧化硅的壳聚糖多孔微球样品(分别利用CSMS-S3、CSMS-S4、CSMS-S5、CSMS、SiO2和市售的止血剂Celox进行实验)中以形成血栓；
3.在5，20，35，50min时向样品中加入3mL蒸馏水并放置5min以溶解未形成血栓的红细胞；
4.然后取200μL红细胞蒸馏水溶液加入孔板中一式三份，用BioTek.Synergy HT型酶标仪在540nm处读取溶液吸光度。
各样品的全血凝血动力学示于图3。吸收值越小，表明吸附红细胞的能力越强。可以看出，介孔二氧化硅的壳聚糖多孔微球的止血能力均优于市售的止血剂Celox，其中实施例1制备的负载介孔二氧化硅的壳聚糖多孔微球的凝血能力明显优于壳聚糖多孔微球。
实施例6
本实施例涉及一种负载介孔二氧化硅的壳聚糖多孔微球的止血效果检验，包括如下步骤：
1、在大鼠腹腔内注射1mL 7％的水合氯醛使其麻醉；
2、将其胸部打开，在右肝叶上切出1cm×0.5cm的切口；
3、立即将10mg负载介孔二氧化硅的壳聚糖多孔微球(分别利用CSMS-S3、CSMS-S4、CSMS-S5、CSMS-S6、CSMS和市售止血剂Celox进行实验)置于肝脏切口处，开始记录时间；
4、用标准医用纱布按压切口处，直到出血停止，最后记录止血时间，称量出血量；
5、在不使用任何止血材料的条件下，重复上述实验操作，作为空白对照；
6、空白对照实验、市售止血剂Celox以及本实施例所用的负载介孔二氧化硅的壳聚糖多孔微球的止血时间分别如表1所示。
表1
| 样品 | 止血时间/s |
| 空白 | 204±14.1 |
| Celox | 149.2±10.5 |
| CSMS | 114.2±8.7 |
| CSMS-S3 | 97±8.6 |
| CSMS-S4 | 105±10.9 |
| CSMS-S5 | 134±10.5 |
| CSMS-S6 | 147±9.1 |
本实施案例中样品的止血时间结果如图4所示。止血时间越短，表明微球的止血性能越好。从图4可以看出，负载介孔二氧化硅的壳聚糖多孔微球CSMS-S系列样品的止血能力明显优于市售止血剂Celox，且实施例1的多孔微球(CSMS-S3)的止血能力最好。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
Claims (10)
1.一种负载介孔二氧化硅微球的壳聚糖多孔止血微球的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
分别制备分散相和连续相；
将所述分散相滴加入连续相中，均质搅拌成乳液；
将所述乳液进行热致相分离后，加入预冷的相反转溶液，得到壳聚糖多孔微球；
将所述壳聚糖多孔微球加入含有十六烷基三甲基溴化铵和氢氧化钠的水溶液中，滴加正硅酸乙酯，在80℃下进行反应后，依次洗涤、中和和干燥，得到所述负载介孔二氧化硅微球的壳聚糖多孔止血微球；
其中，所述分散相的制备方法为：将壳聚糖溶于稀酸中，得到壳聚糖溶液；所述连续相的制备方法为：将乳化剂与水不溶性有机溶剂混匀，即可。
2.如权利要求1所述的负载介孔二氧化硅微球的壳聚糖多孔止血微球的制备方法，其特征在于，所述稀酸为醋酸溶液，所述醋酸溶液的质量分数为1～2％。
3.如权利要求1所述的负载介孔二氧化硅微球的壳聚糖多孔止血微球的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖溶液的质量分数为1～2％。
4.如权利要求1所述的负载介孔二氧化硅微球的壳聚糖多孔止血微球的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂选自石油醚、液体石蜡中的一种或两种。
5.如权利要求1所述的负载介孔二氧化硅微球的壳聚糖多孔止血微球的制备方法，其特征在于，所述乳化剂为油包水型乳化剂。
6.如权利要求5所述的负载介孔二氧化硅微球的壳聚糖多孔止血微球的制备方法，其特征在于，所述油包水型乳化剂选自司班-80和吐温-60中的一种或两种。
7.如权利要求1所述的负载介孔二氧化硅微球的壳聚糖多孔止血微球的制备方法，其特征在于，所述热致相分离的温度为-196℃。
8.如权利要求1所述的负载介孔二氧化硅微球的壳聚糖多孔止血微球的制备方法，其特征在于，所述相反转溶液为无水乙醇，所述无水乙醇的预冷温度为-20℃。
9.如权利要求1所述的负载介孔二氧化硅微球的壳聚糖多孔止血微球的制备方法，其特征在于，在含有壳聚糖多孔微球、溴化十六烷基三甲铵、氢氧化钠和正硅酸乙酯的水溶液中，溴化十六烷基三甲铵的质量分数为0.2～0.5％，氢氧化钠的质量分数为0.05～0.06％，正硅酸乙酯的体积分数为0.6～1.2％。
10.如权利要求1所述的负载介孔二氧化硅微球的壳聚糖多孔止血微球的制备方法，其特征在于，所述中和的操作使用无水乙醇和质量分数为37％浓盐酸的混合溶液，其中，无水乙醇和盐酸的体积比为100：1。
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