CN113426427A - 一种分子印迹糖基介孔二氧化硅微球、制备方法与应用 - Google Patents

一种分子印迹糖基介孔二氧化硅微球、制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种分子印迹糖基介孔二氧化硅微球的制备方法：(1)合成硼酸化功能单体；(2)将250mg CTAB溶解在120ml H2O中，加入50mg模板分子和1.0ml、2mol/L NaOH溶液，加热至80℃；然后将1.25ml、6mmol的TEOS和硼酸化功能单体缓慢加入上述溶液中，水解4小时，并冷却至室温，离心，用水和甲醇洗涤，真空干燥，得到糖基印迹介孔二氧化硅微球；模板分子为糖肽类抗生素的糖基部分；硼酸化功能单体和正硅酸乙酯的摩尔比为0.3∶9.7。本发明的糖基印迹介孔二氧化硅微球呈规则球形，尺寸分布窄，多孔结构，并具有高的吸附能力和快速吸附动力学性能。介孔结构具有体积排阻效应，可防止大分子进入空腔，而糖基印迹空腔则对糖肽类抗生素具有选择性吸附。

Description

一种分子印迹糖基介孔二氧化硅微球、制备方法与应用
技术领域
本发明涉及材料合成技术领域，具体地说是一种分子印迹糖基介孔二氧化硅微球、制备方法与应用。
背景技术
分子印迹技术是指对特定模板分子具有特异性识别性能的高分子聚合物制备技术。利用模板分子与合适的功能单体在交联剂的作用下进行分子组装、聚合，从而在模板分子周围形成一个高度交联的高分子聚合物(MIPs)，再将模板分子洗脱，形成一个与模板分子在尺寸大小、结合位点及空间结构均高度互补的印迹空穴，特异性识别模板分子及其类似物。
MIPs在分子识别方面取得了巨大的成功。但是其性能方面的部分缺陷限制了它的广泛应用。通过本体和沉淀聚合方法制备的传统MIPs由于印迹空穴深嵌于基质中从而导致空穴利用率低，MIPs的孔隙度无序，扩散路径不直，导致扩散缓慢，严重阻碍了印迹空穴的利用率。但是，将MIPs放置在固体支撑物的表面可以使得MIPs能够和表面暴露位点相结合，而且，表面印迹可以降低传质阻力，加速结合动力学，使MIPs具有出色的光学、电学和磁学性能。然而，由于分子印迹壳层比较薄，表面印迹MIPs通常吸附能力较弱。为了克服MIPs的扩散速度慢和吸附能力低的问题，可以将MIPs基体制备成高度多孔有序结构，从而减小扩散距离并使模板分子更容易到达印迹空穴。介孔材料具有可调节的孔径和形状，较大的比表面积以及容易功能化的特点，在催化、传感和分离领域具有广泛的应用。特别是，由于介孔材料的孔径可调，因此可以实现对不同分子量分析物的选择性吸附。Zou和他的同事们探究了介孔材料的尺寸排阻效应在富集小分子多肽中的应用。结合分子印迹技术和介孔材料的尺寸排阻效应可使MIPs具有使模板分子到达印迹空穴的扩散通道，并消除大分子的干扰。但是，分子印迹介孔材料的制备存在以下缺点：疏水作用会消除氢键作用，导致模板分子被隔离在胶束中，而不会与功能单体形成复合物。已有研究表明可以通过在介孔材料的表面上嫁接印迹离子和有机小分子来解决上述问题。但是这种方法存在步骤繁琐，嫁接过程可能会堵塞介孔结构，从而降低吸附能力等缺点。另一种策略是构建能够原位形成印迹空穴的的介孔二氧化硅材料，这种方法步骤简单。Chang和他的同事首次报道了周期性介孔二氧化硅纳米粒子分子印迹聚合物，该模板分子通过热可逆的氨基甲酸酯键与3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基异氰酸酯共价作用形成。Lofgreen等通过共价键将双酚A印迹到SBA-15型介孔有机硅中，从而去除水中的双酚类物质。Tang团队利用金属配位和共缩合作用制备周期性离子印迹介孔二氧化硅材料的方法。双模板对接印迹技术用于带电小分子和离子的分子印迹介孔材料制备。通过静电相互作用将模板分子对接在表面活性剂胶束表面，形成双模板复合物。尽管分子印迹介孔材料在识别金属离子和带电小分子方面已取得成功，但它们在肽或蛋白质中的应用受到限制，印迹效果需要进一步提高。
多重耐药性细菌感染的出现和传播对全世界的传染病和公共卫生管理构成了严重威胁。糖肽类抗生素已用于临床治疗由革兰氏阳性细菌引起的复杂感染已有50多年了。不幸的是，在不到三十年的临床应用中，第一代糖肽类抗生素万古霉素的耐药性问题的出现给临床上敲响了警钟，迫切需要新的抗生素来应对细菌耐药性的发展。因此，需要高灵敏的分析方法实现对糖肽类抗生素在临床药物监测和环境分析中的应用。
综上，亟需开发一种分子印迹糖基介孔二氧化硅微球，用于选择性分离和富集加标血清样品中糖肽类抗生素。
发明内容
针对上述存在的问题，本发明的目的在于提供了一种分子印迹糖基介孔二氧化硅微球、制备方法与应用。本发明分子印迹糖基介孔二氧化硅微球呈规则球形，尺寸分布窄，多孔结构，并具有高的吸附能力和快速吸附动力学性能。介孔结构具有体积排阻效应，可防止大分子进入空腔，而糖基印迹空腔则对糖肽类抗生素具有选择性吸附。本发明用于选择性分离和富集加标血清样品中糖肽类抗生素，具备较高的回收率。
本发明为实现上述目的，采取以下技术方案予以实现：
一种分子印迹糖基介孔二氧化硅微球的制备方法，包括以下步骤：
(1)合成硼酸化功能单体：由4-巯基苯硼酸和3-(甲基丙烯酰氧基)丙基三甲氧基硅烷通过硫醇-烯点击反应合成硼酸化功能单体；
(2)将250mg十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶解在120ml H2O中，加入50mg模板分子和1.0ml、2mol/LNaOH溶液，加热至80℃；然后将1.25ml、6mmol的正硅酸乙酯(TEOS)和硼酸化功能单体缓慢加入上述溶液中，水解4小时，并冷却至室温，离心，用水和甲醇洗涤，真空干燥，得到糖基印迹介孔二氧化硅微球；
所述模板分子为糖肽类抗生素的糖基部分；所述硼酸化功能单体和正硅酸乙酯的摩尔比为0.3∶9.7；
(3)用体积比为9∶1的乙醇-盐酸溶液进行索氏提取去除糖基印迹介孔二氧化硅微球中的CTAB和模板分子，用甲醇洗涤糖基印迹介孔二氧化硅微球，并真空干燥。
优选地，步骤(1)合成硼酸化功能单体，具体为：将248.35μlγ-(甲基丙烯酰氧基)丙基三甲氧基硅烷和147.9mg的4-巯基苯硼酸溶解在5ml的无水乙醇中，用三乙胺调节溶液的pH至8.0，在60℃水浴中搅拌6小时，4℃保存。
本发明的另一目的在于公开上述方法制得的一种分子印迹糖基介孔二氧化硅微球。
本发明的又一目的在于公开上述一种分子印迹糖基介孔二氧化硅微球在血清样品中糖肽抗生素检测中的应用。
优选地，所述二氧化硅微球在血清样品中糖肽抗生素检测中的应用，具体包括以下步骤：
(1)将100μl血样加入2.0ml离心管中，再加入1.5ml、0.1mol/L、pH 8.5的磷酸盐缓冲溶液，振荡5分钟；
(2)将10mg分子印迹糖基介孔二氧化硅微球分散到上述混合物中，600rpm振荡20分钟，接着10000rpm离心分离微球，并用200μl水洗涤两次；
(3)用1.5ml、pH 4.0的体积比为1∶1的磷酸盐缓冲溶液/甲醇混合溶液洗脱目标糖肽类抗生素，10000rpm离心10分钟，并用离心浓缩机在真空条件下将洗脱液蒸发至干，再复溶于200μl的0.2wt％甲酸溶液中，0.22μm滤膜过滤，用于UPLC-MS/MS分析。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明的分子印迹糖基介孔二氧化硅微球呈规则球形，尺寸分布窄，多孔结构，并具有高的吸附能力和快速吸附动力学性能。介孔结构具有体积排阻效应，可防止大分子进入空腔，而糖基印迹空腔则对糖肽类抗生素具有选择性吸附。本发明用于选择性分离和富集加标血清样品中糖肽类抗生素，具备较高的回收率。
本发明采用表位印迹，选择糖肽类抗生素的糖基部分作为模板分子，合成了硼酸化功能单体，通过尺寸排阻效应和分子印迹技术制备了具有高选择性和吸附能力的MIPs。通过改变pH值来调节目标糖肽类抗生素的吸附和洗脱。通过比较糖肽抗生素和其他小分子抗生素之间的吸附能力差异来评估其特异性识别能力。
附图说明
图1为本发明一种分子印迹糖基介孔二氧化硅微球的制备示意图；
图2为本发明中合成的硼酸化功能单体的核磁共振氢谱法检测图；
图3为本发明中合成的硼酸化功能单体的核磁共振碳谱法检测图；
图4为本发明中索氏提取前后糖基印迹介孔二氧化硅微球的FT-IR光谱图；
图5是硼酸化功能单体和交联剂的摩尔比对雷莫拉宁的吸附能力和印迹因子(IF)的影响示意图。
图6为本发明分子印迹糖基介孔二氧化硅微球的小角度XRD图；
图7为本发明分子印迹糖基介孔二氧化硅微球的N2吸附-解吸等温线图；
图8为本发明分子印迹糖基介孔二氧化硅微球的孔径分布曲线图；
图9为本发明分子印迹糖基介孔二氧化硅微球的TEM(A和B)和SEM(C和D)表征图；
图10为本发明糖基印迹介孔微球和非印迹介孔二氧化硅微球的静态吸附实验图；
图11为本发明糖基印迹介孔微球和非印迹介孔二氧化硅微球对雷莫拉宁的吸附动力学曲线；
图12为本发明糖基印迹介孔微球和非印迹介孔二氧化硅微球对糖肽抗生素恩诺沙星、氯霉素磺胺嘧啶和土霉素的选择性吸附示意图；
图13为本发明糖基印迹介孔微球与达巴万星溶液的六次吸附-解吸实验示意图；
图14是采用乙腈沉淀蛋白、非印迹介孔微球、和糖基印迹介孔微球三种不同样品前处理方法加标血清样品得到的总离子色谱图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一种分子印迹糖基介孔二氧化硅微球的制备方法，如图1所示，包括以下步骤：
(1)合成硼酸化功能单体：
由4-巯基苯硼酸和3-(甲基丙烯酰氧基)丙基三甲氧基硅烷通过硫醇-烯点击反应合成硼酸化功能单体。反应式如下：
Figure BSA0000245472330000041
具体为：将248.35μlγ-(甲基丙烯酰氧基)丙基三甲氧基硅烷和147.9mg的4-巯基苯硼酸溶解在5ml的无水乙醇中，用三乙胺调节溶液的pH至8.0，在60℃水浴中搅拌6小时，4℃保存。
所得产物用1H-NMR(图2)和13C-NMR(图3)表征。1H NMR(400MHz，DMSO，250C，TMS)：δ＝7.92-7.49ppm(m，2H；H9)，δ＝7.24ppm(m，2H；H8)，δ＝4.68-3.77ppm(m，4H；H4，H10)，δ＝3.39ppm(t，J＝47.2Hz，11H；H1，H7)，δ＝2.54ppm(dt，J＝17.8，8.9Hz，1H；H5)，δ＝1.94-1.35ppm(m，2H；H3)，δ＝1.35-0.78ppm(m，3H；H6)，δ＝0.73-0.26ppm(m，2H；H2).13C NMR(400MHz，DMSO，250C，TMS)：δ＝176.04-172.61ppm(C5)，δ＝136.65ppm(C9)，δ＝127.87-126.16ppm(C10，C11)，δ＝126.16-125.26ppm(C12)，δ＝67.99-63.44ppm(C4)，δ＝51.74-47.71ppm(C1)，δ＝46.89-45.17ppm(C6)，δ＝39.82ppm(C7)，δ＝22.20ppm(C8)，δ＝15.77ppm(C3)，δ＝11.22ppm(C2).
(2)将250mg十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶解在120ml H2O中，加入50mg模板分子和1.0ml、2mol/L NaOH溶液，加热至80℃；然后将1.25ml、6mmol的正硅酸乙酯(TEOS)和不同量的硼酸化功能单体缓慢加入上述溶液中，水解4小时，并冷却至室温，离心，用水和甲醇洗涤，真空干燥，得到糖基印迹介孔二氧化硅微球；
所述模板分子为糖肽抗生素的糖基部分；所述硼酸化功能单体和正硅酸乙酯的摩尔比从0.1∶9.9到1.0∶9.0；
(3)用体积比为9∶1的乙醇-盐酸溶液进行索氏提取去除糖基印迹介孔二氧化硅微球中的CTAB和模板分子，用甲醇洗涤糖基印迹介孔二氧化硅微球，并真空干燥。
图4是硼酸化功能单体和交联剂的摩尔比对雷莫拉宁的吸附能力和印迹因子(IF)的影响示意图。使用不同摩尔比的硼酸化功能单体和交联剂制得的糖基印迹介孔微球对雷莫拉宁进行吸附研究，发现：糖基印迹介孔微球的吸附能力随着功能单体/交联剂的摩尔比从0.1∶9.9到1.0∶9.0的增加而增加。但是，当比率在0.5∶9.5至1.0∶9.0范围内时，印迹因子(IF)反而降低。因此，当功能单体与交联剂的比例为0.3∶9.7显示出相对较高的吸附容量和最高的IF值，选择此比例为最佳配比。
索氏提取前后糖基印迹介孔二氧化硅微球的FT-IR光谱如图5所示。在2800-3000cm-1区域显示的吸收带由于C-H的对称和不对称振动引起的。经索氏提取后，C-H特征吸收峰消失，表明CTAB被完全洗脱。同时Si-O-Si在1050cm-1特征峰和Si-O-H在964cm-1特征峰也能观察到。
图6是糖基印迹介孔微球的小角度XRD图。从图中可见到2θ＝2.1°处有一个强的衍射峰以及在2θ＝3.5°和4.1°处有两个低强度宽峰，它们是MCM-41的特征平面(100)，(110)和(200)。这三个衍射峰表明形成了高度有序的MCM-41介孔材料。
图7和8分别是N2吸附-解吸等温线图和孔径分布曲线图，通过Barrett-Joyner-Halenda(BJH)方法计算糖基印迹介孔微球的平均孔径为2.0nm，孔体积约为1.05cm3/g，从氮气吸附等温线图中获得的Brunauer-Emmett-Teller(BET)表面积为944.28m2/g。
图9是糖基印迹介孔二氧化硅微球的TEM(A和B)和SEM(C和D)表征图，如图所示：微球呈规则的球形，直径约为200nm。结果表明，糖基印迹介孔二氧化硅微球具有中空虫状介孔结构。
对比例1
非印迹介孔二氧化硅微球的合成方法，同实施例1，除了步骤(2)不添加模板分子。
对实施例1的糖基印迹介孔微球和对比例1的非印迹介孔二氧化硅微球分别进行静态吸附实验，实验结果如图10所示，糖基印迹介孔微球的最大吸附量(Qmax)约为非印迹介孔微球的三倍。图11是糖基印迹介孔微球和非印迹介孔二氧化硅微球对雷莫拉宁的吸附动力学曲线，吸附时间的延长，其吸附容量显着增加，并在15分钟时达到平衡。用Scatchard方程进一步评估了糖基印迹介孔微球的吸附等温线，得到了两条线性回归方程：q/c＝-0.01802X+168.7(r＝0.9998)和q/c＝-0.0009017X+114.7(r＝0.9556)，通过线性方程的斜率和截距，可计算出Kd值为55.49μg/mL和119.02μg/mL，Qmax分别为9.32mg/g和127.20mg/g。糖基印迹介孔微球的两个斜率说明存在两种不同的结合位点，较高的为硼酸亲和印迹空穴，较低的为介孔通道的非特异性吸附。
为了考察糖基印迹介孔微球对糖肽类抗生素的选择性，选择了恩诺沙星、氯霉素磺胺嘧啶和土霉素进行选择性吸附实验。如图12所示，糖基印迹介孔微球由于结构相似而对糖肽类抗生素表现出较高的吸附能力。然而，糖肽类抗生素显示出相对低水平的与其他抗生素的非特异性结合。结果表明，MIP固有的交叉反应性已成功用于识别具有共同分子特征的目标糖肽抗生素。
为了研究糖基印迹介孔微球的重复性，用10mg糖基印迹介孔微球通过与达巴万星溶液反复的反应和洗脱。如图13所示，通过六次吸附-解吸实验评估糖基印迹介孔微球的再生性能，其吸附容量相对稳定，从14.6mg/g到13.5mg/g，这主要归因于糖基印迹介孔微球具有高的洗脱效率和高的印迹空穴亲。
实施例3
将实施例1制得的糖基印迹介孔微球用于血清样品中糖肽抗生素的检测(功能单体与交联剂的比例为0.3∶9.7)。
经广州市疾病预防控制中心伦理委员会批准，采取健康志愿者血样。100μL血样加入2.0mL离心管中，再加入1.5mL磷酸盐缓冲溶液(0.1mol/L，pH 8.5)，振荡5分钟。然后，将10mg糖基印迹介孔微球分散到上述混合物中，600rpm振荡20分钟，接着10000rpm离心分离微球，并用200μL水洗涤两次。然后，用1.5mL pH 4.0缓冲液/甲醇(1/1，V/V)洗脱目标糖肽类抗生素，10000rpm离心10分钟，并用离心浓缩机在真空条件下将洗脱液蒸发至干，再复溶于200μL的0.2％甲酸溶液中，0.22μm滤膜过滤，用于UPLC-MS/MS分析。
图14是采用乙腈沉淀蛋白、非印迹介孔微球、和糖基印迹介孔微球三种不同样品前处理方法加标血清样品得到的总离子色谱图。只添加乙腈时，糖肽类抗生素会和蛋白质发生共沉淀。非印迹介孔微球不会特异性的吸附目标物，并且会抑制糖肽类抗生素的电离。但是，当经糖基印迹介孔微球预处理后，6种目标糖肽类抗生素在10分钟内完全分离且没有明显的干扰峰。
表1 UPLC-MS/MS法测定糖肽类抗生素的实验参数优化(星号标记的为定量子离子)
Figure BSA0000245472330000071
表1是UPLC-MS/MS法测定糖肽类抗生素的实验参数优化结果。如表1所示，该方法的线性范围，相关系数，检测限(LOD)，基质效应，准确性和精密度均得到验证。该方法对血清样品中的六种糖肽抗生素均呈现良好的线性，较低的检出限(0.03～0.2μg/L)。
如表2所示，加标血清样品中糖肽抗类生素的日内和日间加标回收率为81％～108％，日内和日间精密度分别为2.5％～11％和3.7％～13％。通过比较基质和溶剂的标准曲线的斜率来估计基质效应，测得的糖肽类抗生素的基质效应为90.2％～96.4％。结果表明该方法对测定血清样品中的糖肽类抗生素具有广阔的前景。
表2 加标血清样品中糖肽类抗生素的基质效应、准确性和精密度(n＝3).
Figure BSA0000245472330000081
以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (5)

1.一种分子印迹糖基介孔二氧化硅微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)合成硼酸化功能单体：由4-巯基苯硼酸和3-(甲基丙烯酰氧基)丙基三甲氧基硅烷通过硫醇-烯点击反应合成硼酸化功能单体；
(2)将250mg十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶解在120ml H2O中，加入50mg模板分子和1.0ml、2mol/L NaOH溶液，加热至80℃；然后将1.25ml、6mmol的正硅酸乙酯(TEOS)和硼酸化功能单体缓慢加入上述溶液中，水解4小时，并冷却至室温，离心，用水和甲醇洗涤，真空干燥，得到糖基印迹介孔二氧化硅微球；
所述模板分子为糖肽类抗生素的糖基部分；所述硼酸化功能单体和正硅酸乙酯的摩尔比为0.3∶9.7；
(3)用体积比为9∶1的乙醇-盐酸溶液进行索氏提取去除糖基印迹介孔二氧化硅微球中的CTAB和模板分子，用甲醇洗涤糖基印迹介孔二氧化硅微球，并真空干燥。
2.根据权利要求1所述的一种分子印迹糖基介孔二氧化硅微球的制备方法，其特征在于，步骤(1)合成硼酸化功能单体，具体为：将248.35μlγ-(甲基丙烯酰氧基)丙基三甲氧基硅烷和147.9mg的4-巯基苯硼酸溶解在5ml的无水乙醇中，用三乙胺调节溶液的pH至8.0，在60℃水浴中搅拌6小时，4℃保存。
3.权利要求1或2所述方法制得的一种分子印迹糖基介孔二氧化硅微球。
4.权利要求3所述一种分子印迹糖基介孔二氧化硅微球在血清样品中糖肽抗生素检测中的应用。
5.根据权利要求4所述的一种分子印迹糖基介孔二氧化硅微球在血清样品中糖肽抗生素检测中的应用，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)将100μl血样加入2.0ml离心管中，再加入1.5ml、0.1mol/L、pH 8.5的磷酸盐缓冲溶液，振荡5分钟；
(2)将10mg分子印迹糖基介孔二氧化硅微球分散到上述混合物中，600rpm振荡20分钟，接着10000rpm离心分离微球，并用200μl水洗涤两次；
(3)用1.5ml、pH 4.0的体积比为1∶1的磷酸盐缓冲溶液/甲醇混合溶液洗脱目标糖肽类抗生素，10000rpm离心10分钟，并用离心浓缩机在真空条件下将洗脱液蒸发至干，再复溶于200μl的0.2wt％甲酸溶液中，0.22μm滤膜过滤，用于UPLC-MS/MS分析。
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