CN112973655B - 一种离子交换色谱固定相及其制备和应用 - Google Patents

一种离子交换色谱固定相及其制备和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112973655B
CN112973655B CN201911240415.5A CN201911240415A CN112973655B CN 112973655 B CN112973655 B CN 112973655B CN 201911240415 A CN201911240415 A CN 201911240415A CN 112973655 B CN112973655 B CN 112973655B
Authority
CN
China
Prior art keywords
silica gel
uio
stationary phase
group
metal organic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201911240415.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112973655A (zh
Inventor
张丽华
孙悦
邵文亚
梁玉
王超
杨开广
赵宝锋
梁振
张玉奎
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Original Assignee
Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dalian Institute of Chemical Physics of CAS filed Critical Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority to CN201911240415.5A priority Critical patent/CN112973655B/zh
Publication of CN112973655A publication Critical patent/CN112973655A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112973655B publication Critical patent/CN112973655B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B01J20/286—Phases chemically bonded to a substrate, e.g. to silica or to polymers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
    • B01D15/361—Ion-exchange
    • B01D15/362—Cation-exchange
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
    • B01D15/361—Ion-exchange
    • B01D15/363—Anion-exchange
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/02—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material
    • B01J20/10—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material comprising silica or silicate
    • B01J20/103—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material comprising silica or silicate comprising silica
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/22—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/22—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material
    • B01J20/26—Synthetic macromolecular compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/18—Ion-exchange chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2220/00—Aspects relating to sorbent materials
    • B01J2220/40—Aspects relating to the composition of sorbent or filter aid materials
    • B01J2220/48—Sorbents characterised by the starting material used for their preparation
    • B01J2220/4806—Sorbents characterised by the starting material used for their preparation the starting material being of inorganic character
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2220/00—Aspects relating to sorbent materials
    • B01J2220/40—Aspects relating to the composition of sorbent or filter aid materials
    • B01J2220/48—Sorbents characterised by the starting material used for their preparation
    • B01J2220/4812—Sorbents characterised by the starting material used for their preparation the starting material being of organic character
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2220/00—Aspects relating to sorbent materials
    • B01J2220/50—Aspects relating to the use of sorbent or filter aid materials
    • B01J2220/52—Sorbents specially adapted for preparative chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2220/00—Aspects relating to sorbent materials
    • B01J2220/50—Aspects relating to the use of sorbent or filter aid materials
    • B01J2220/54—Sorbents specially adapted for analytical or investigative chromatography

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)

Abstract

本发明属液相色谱固定相材料和蛋白质分离领域，涉及一种离子交换色谱固定相及其制备方法和应用。以硅胶颗粒为基质，在硅胶表面修饰UiO‑66金属有机框架保护层后通过原子转移自由基聚合(ATRP)反应在表面接枝高密度聚合物刷(polymer brushes)，引入阴(阳)离子功能基团和酰胺亲水基团，并填装制备离子交换色谱柱，用于蛋白质的分离和纯化。本发明可以降低填料表面残余硅羟基对蛋白质分离造成的非特异性吸附等影响，并提供丰富的修饰位点。(提高峰容量和蛋白质回收率，并且表面的刷状构型和引入的酰胺亲水基团进一步提高色谱柱的抗污染性能。本发明中制成的离子交换色谱柱能够在非变性条件下实现蛋白质的分离和纯化。

Description

一种离子交换色谱固定相及其制备和应用
技术领域
本发明涉及色谱固定相并用于蛋白质的分离纯化，具体地说是一种UiO-66金属有机框架涂层保护的聚合物刷修饰的离子交换色谱固定相及其制备以及在蛋白质的分离纯化方面的应用。
背景技术
蛋白质作为生命活动的执行者具有重要的生理作用和经济价值，因此针对蛋白质的研究已经成为后基因时代生命科学所研究的核心内容之一。然而，生物样品中蛋白质及其酶解产物的复杂性通常阻碍了进一步的研究，因此蛋白质分离分析方法和材料的发展变得尤为重要。
蛋白质分离领域中使用最广泛的技术是高效液相色谱法，包括反向色谱、离子交换色谱、亲水作用色谱和体积排阻色谱等。其中，离子交换色谱柱具有回收率高，生物兼容性好等优点，因此被广泛用于蛋白质样品的分离中。然而，由于色谱固定相基质残留官能团(硅羟基、双键等)以及基质本身界面性质导致的蛋白质死吸附，会造成相邻级份间的重叠率高、分离重现性差以及色谱柱使用寿命短等问题。
由于金属有机框架(MOFs)具有孔道结构尺寸均一可调、结构多样、合成简单且易于后合成修饰等特点，文献中已有报道，通过在硅胶表面修饰MOFs制备有机-无机杂化core-shell结构材料用于高效液相色谱分离。UiO-66-NH2这种MOFs材料包含八面体中心孔笼和八个四面体角笼的三维微孔结构，具有良好的热稳定性，且在酸、碱、水、有机溶剂中都具有良好的稳定性。同时，其表面富含羧基和氨基，具有良好的亲水性，可在有效屏蔽硅球表面残留官能团的同时实现后修饰，有利于解决固定相对蛋白质的非特异性吸附问题。ATRP反应具有引发剂廉价易得、适用单体范围广、反应条件温和以及制备聚合物结构可设计性强等优点，可在材料表面修饰高密度的功能基团。
因此，我们设计了一种UiO-66金属有机框架涂层保护的聚合物刷修饰的离子交换色谱固定相，该固定相以无孔硅胶作为基质材料，以UiO-66-NH2金属有机框架材料在硅胶表面形成屏蔽层，通过ATRP反应在UiO-66金属有机框架表面接枝高密度聚合物刷，其中UiO-66金属有机框架层可有效屏蔽蛋白质在硅胶表面的非特异性吸附，且材料具有良好的亲水性，在蛋白质分离分析及纯化等领域有较好的实用价值和应用前景。
发明内容
本发明目的在于提供一种UiO-66金属有机框架涂层保护的聚合物刷修饰的离子交换色谱固定相及其制备方法和应用。该离子交换色谱固定相不仅可以减小蛋白质的非特异性吸附，而且可以实现蛋白质的非变性分离。
为实现上述目的，本发明的技术方案是：以硅胶颗粒为基质，第一步是通过硅烷化反应以及环氧基团的碱性开环反应在硅胶表面引入羧基基团；第二步是在硅胶表面修饰一层UiO-66金属有机框架保护层；第三步是通过ATRP反应在材料表面接枝高密度聚合物刷，形成表面具有刷状结构且富含功能基团的阳离子交换色谱固定相以及阴离子交换色谱固定相。
具体步骤如下：
(1)硅胶颗粒的烷基化：加硅球于反应容器，分散于甲苯溶剂中，超声分散均匀，加入硅烷化试剂，通氮气0-30分钟，机械搅拌，保持转速300rad/min，加热回流4-48小时，停止反应后，冷却至室温，使用高速离心机用2500～10000rad/min的速度离心3-5分钟，弃上清液，固体颗粒依次使用甲苯、无水乙醇抽滤洗涤，重复抽滤洗涤3-5遍，35℃真空干燥箱内真空干燥6-30小时，得到硅烷化修饰的硅胶颗粒。
其中，硅烷化试剂为含有环氧基团的三甲(乙)氧基硅烷。硅胶颗粒占总质量的0.1～10wt％，硅烷化试剂占总质量的0.1～10wt％，余量为反应溶剂。
(2)在硅胶颗粒表面引入羧基的过程：将谷氨酸溶于去离子水中，使用氢氧化钠溶液调节pH值至9-10；将(1)中得到的硅烷化修饰硅胶颗粒分散在上述水溶液中，40-60℃下磁力搅拌2-5h，停止反应后，冷却至室温，使用高速离心机用2500～10000rad/min的速度离心3-5分钟，弃上清液，固体颗粒依次使用水、乙醇抽滤洗涤，重复抽滤洗涤3-5遍，35℃真空干燥箱内真空干燥6-30小时，得到带有羧基的硅胶颗粒。
其中，硅胶颗粒占总质量的0.1～10wt％，谷氨酸占总质量的0.1～10wt％，余量为反应溶剂。
(3)硅胶表面修饰UiO-66金属有机框架保护层的过程：将带有羧基的硅胶颗粒分散在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入乙酸、四氯化锆，室温下磁力搅拌0.5-2小时，使锆离子充分配合在硅胶表面，然后升温至110-130℃，加入有机配体，磁力搅拌反应4-48小时，停止反应后，冷却至室温，使用高速离心机用2500～10000rad/min的速度离心3-5分钟，弃上清液，固体颗粒依次使用DMF、丙酮抽滤洗涤，重复抽滤洗涤3-8遍，之后置于二氯甲烷中2-5天，每天置换一次溶剂，35℃真空干燥箱内真空干燥6-30小时，得到UiO-66金属有机框架保护的硅胶颗粒。
其中有机配体为带有氨基的对苯二甲酸，四氯化锆和有机配体加入量的摩尔比为0.1:1-1:0.1。硅胶颗粒占总质量的0.1～2wt％，加入的中心离子金属盐和有机配体总量的占总质量的0.1～2wt％，余量为反应溶剂。
(4)在微球UiO-66金属有机框架保护层上键合聚合物刷的过程：第一步将上述UiO-66金属有机框架保护层包裹的硅胶微球分散在二氯甲烷中，机械搅拌；将三乙胺和2-溴异丁酰溴分别溶于二氯甲烷中，先向硅胶颗粒悬浮液中加入三乙胺溶液，接着在冰浴环境中缓慢滴加引发剂溶液，约1h滴加完毕，升温至40-60℃，反应4-48h。反应结束后，使用二氯甲烷充分洗涤微球之后，置于二氯甲烷中4-48h，离心去除上清后在35℃真空干燥箱中内真空干燥6-30小时，得到带有卤素引发基团的微球；第二步将带有引发基团的微球分散在反应溶剂中，机械搅拌，加入功能单体，通氮气10-30min以去除反应体系中的氧气，加入催化剂后继续通氮气10-30min，然后升温至50-70°C反应4-48h，使用反应溶剂充分洗涤，在35℃真空干燥箱中真空干燥3-60小时，分别得到阴离子交换色谱固定相材料和阳离子交换色谱固定相材料。
其中，第二步中所使用的反应溶剂为甲醇与水体积比为1:1的溶液；所使用的催化剂为卤化亚铜和联二吡啶，二者加入量的摩尔比为1:1-1:10。
所述的功能单体为含有阴(阳)离子交换基团以及酰胺亲水基团的烯类单体。功能单体在各自体系中的总摩尔数浓度为0.05-0.4mol/L；硅胶核颗粒加入质量与单体总质量比为1:0.1至1:10。
(5)将制备的阴、阳离子交换色谱固定相材料按照1:1比例均匀混合后装填成离子交换色谱柱用于色谱分离。
本发明具有如下优点：
1.在硅胶颗粒表面修饰UiO-66金属有机框架形成保护层，可以降低填料表面残余硅羟基对蛋白质分离造成的非特异性吸附等影响，并提供丰富的修饰位点；
2.基于ATRP反应在固定相材料表面修饰聚合刷，使色谱固定相带有高密度的离子交换功能基团，提高峰容量和蛋白质回收率，并且表面的刷状构型和引入的酰胺亲水基团进一步提高色谱柱的抗污染性能；
3.本发明中制成的离子交换色谱柱能够在非变性条件下实现蛋白质的分离和纯化。
附图说明
图1UiO-66金属有机框架保护的聚合物刷修饰的离子交换色谱固定相的制备流程；
图2修饰UiO-66金属有机框架保护层前后的硅胶颗粒扫描电镜图；
图3材料接触角测量结果图；
图4采用制备的离子交换色谱柱分离三种标准蛋白质混合物的色谱图(四次平行分析)；
图5采用制备的离子交换色谱柱分离Hela细胞胞浆提取蛋白的色谱图(两次平行分析)；
图6采用制备的离子交换色谱柱进行抗体药纯化的色谱图以及抗体药及其各纯化组分SDS-PAGE分析结果图；
图7采用制备的离子交换色谱柱分离四种蛋白质复合物的色谱图以及非变性质谱鉴定结果。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明提供的方法进行详述，但不以任何形式限制本发明。
实施例1
1.MOFs涂层保护的聚合物刷修饰的离子交换色谱固定相的制备
如图1所示，按如下流程制备：1)SiO2@COOH的制备：首先利用硅烷化试剂在硅胶表面引入环氧基团。称取粒径5μm无孔硅胶4.6g置于三口圆底烧瓶中，加入无水甲苯80mL，超声分散均匀。通氮气5分钟以去除反应装置内的氧气。打开机械搅拌，加入2.5mL硅烷化试剂3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷(GPS)，110℃下反应24小时，反应结束后，冷却至室温。3000rpm离心5min去除上清，产物依次用甲苯、无水乙醇各清洗3次，以去除杂质。经清洗后35℃真空干燥，得到4.6g表面带有环氧基团的硅胶颗粒，记作SiO2@epo，保存于4℃冰箱备用。
随后，通过环氧基团的碱性开环反应在硅胶表面引入羧基。称取1.02g谷氨酸，溶于60mL去离子水中，使用氢氧化钠调节pH值至9.4，加入3g上述方法制备的SiO2@epo颗粒，超声分散均匀。磁力搅拌，50℃下反应3.5h。反应结束后，3000rpm离心5min去除上清，产物依次用水、乙醇各清洗3次，以去除杂质。之后35℃真空干燥，记作SiO2@COOH，保存于4℃冰箱备用。
2)SiO2@UiO-66-NH2的制备：称取上述SiO2@COOH颗粒0.5g，置于100mL圆底烧瓶中，加入50mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，4mL醋酸，0.64g四氯化锆，室温磁力搅拌1小时，使锆离子充分配合在硅胶表面。之后升温至120℃，加入0.496g 2-氨基对苯二甲酸(H2bcd-NH2)圆底烧瓶中，磁力搅拌反应24小时。3000rpm离心去除上清，产物先用DMF清洗3次，以去除杂质。之后依次丙酮清洗6次，700rpm,1min离心，以去除UiO-66-NH2单体。之后置于二氯甲烷中3天，每天置换一次溶剂，然后35℃真空干燥，得到MOFs层保护的硅胶颗粒，编号SiO2@UiO-66-NH2，存于4℃冰箱备用。
3)SiO2@UiO-66-BiBB的制备：称取500mg SiO2@UiO-66-NH2颗粒置于三口烧瓶中，加入85mL无水二氯甲烷，超声分散均匀，机械搅拌。1.5mL的TEA和2mLα-溴异丁酰溴(BiBB)分别溶于20mL无水二氯甲烷中，首先，向SiO2@UiO-66-NH2悬浮液中加入TEA溶液，接着在冰浴环境中缓慢滴加BiBB溶液，约1h滴加完毕。升温至50℃，反应24h。反应结束后，使用二氯甲烷充分洗涤微球，之后置于二氯甲烷中24h，离心后真空干燥。编号SiO2@UiO-66-BiBB，存于4℃冰箱备用。
4)SiO2@IEX的制备：分别称取两份400mg SiO2@UiO-66-BiBB颗粒，置于圆底烧瓶中，加入100mL反应溶剂(水/甲醇体积比＝1:1)，超声分散均匀，机械搅拌，加入联二吡啶(bpy)366.81mg；其中1号烧瓶中加入1.2g N,N-二甲基烯丙基胺，0.4g丙烯酰胺，2号烧瓶加入1.2g丙烯酸，通氮气20min以去除反应体系中的氧气。之后分别加入氯化亚铜45mg，继续通氮气15min，然后升温至60℃，反应24h。反应结束后，采用反应溶剂充分洗涤，真空干燥。分别编号SiO2@WAX；SiO2@WCX，存于4℃冰箱备用。
5)将制备好的两种材料SiO2@WAX和SiO2@WCX按照1:1的比例均匀混合装填200mm×2.1mmii.d.的不锈钢WAX/WCX混合床层色谱柱。
2.所制备的修饰MOFs保护层前后的硅胶颗粒扫描电镜对比图如图2所示，说明了制备过程没有破坏硅球的球形结构，且UiO-66-NH2在硅胶表面形成了一层均匀致密、完全包裹硅球的屏蔽层。
3.所制备的固定相材料的亲水性采用测量接触角的方法进行表征，结果如图3所示。Sil由于表面具有丰富的硅羟基，因此表现出良好的亲水性(接触角为26°)；硅球表面包裹UiO-66金属有机框架后SiO2@UiO-66-NH2的疏水性增加(接触角为46.6°)，而这有利于表面亲水性聚合物刷高度伸展并保持“刷”状构象；接枝聚合物刷后，材料的亲水性得到了很大提高，SiO2@WCX接触角为15°，SiO2@WAX接触角为14°，这是由于表面高密度亲水性的聚合物链显著提高了材料的亲水性，有助于降低材料的非特异性吸附。
实施例2
将实施例1中制备的WAX/WCX混合床层色谱柱作为分离柱，采用液相色谱-紫外系统，用于标准蛋白质混合物的离子交换色谱分离。色谱分离条件如下：分离柱：200mm×2.1mm i.d.；样品：标准蛋白质混合物(中性蛋白肌红蛋白Myo、碱性蛋白溶菌酶Lys、酸性蛋白伴清蛋白CA均采用流动相A相配制成浓度为5mg·mL-1的蛋白溶液，取50μL，50μL，50μL混合均匀)；流动相A：10mMTris-HCl,pH 7.6+5％Glycerol；流动相B：A相中加入1.5MNaCl；梯度：0％B(0min)-0％B(10min)-60％B(50min)-0％B(51min)，流速为0.3mL·min-1；紫外检测波长280nm；柱温：25±1℃。
如图4所示，该WAX/WCX混合床层色谱柱能够实现酸性、中性和碱性蛋白质混合物的分离，且分离重现性较好，各蛋白质保留时间的RSD值均小于0.1％。
实施例3
将实施例1中制备的WAX/WCX混合床层色谱柱作为分离柱，采用液相色谱-紫外系统，用于Hela细胞胞浆提取蛋白的离子交换色谱分离。色谱分离条件如下：分离柱：200mm×2.1mm i.d.；样品：Hela细胞胞浆提取蛋白；流动相A：10mM Tris-HCl,pH 7.6+3mM NaN3+0.5mM DTT+5％Glycerol；流动相B：A相中加入1.5MNaCl；梯度：0％B(0min)-18％B(55min)-50％B(90min)-100％B(110min)-100％B(120min)，流速为0.3mL·min-1；紫外检测波长280nm；柱温：25±1℃。
如图5所示，Hela细胞胞浆提取蛋白得到了很好的分离，两次分离的出峰时间以及出峰形状均一致，出峰峰强度与进样体积相吻合，说明该色谱柱在复杂样品蛋白分离中具有很好的应用潜力。
实施例4
将实施例1中制备的WAX/WCX混合床层色谱柱作为分离柱，用于曲妥珠单抗抗体药的纯化中。将工业纯化之后的曲妥珠单抗用我们的WAX/WCX混合床层色谱柱进行进一步的纯化。
如图6所示，抗体药在该色谱柱上出现了三个峰，分别收集峰级份与原始样品进行SDS-PAGE分析，可看到抗体药的峰级份纯度特别高，说明该色谱柱在抗体药的纯化中有很大的应用潜力。
实施例5
将实施例1中制备的WAX/WCX混合床层色谱柱作为分离柱，采用液相色谱-紫外系统，用于蛋白质复合物混合物的非变性分离，后续采用FTICR-MS对蛋白复合物进行非变性鉴定。色谱分离条件如下：分离柱：200mm×2.1mm i.d.；样品：蛋白质复合物混合物(CbA、GPb、BSA、Avidin)；流动相A：10mMNH4Ac,pH 7.54；流动相B：1.5MNH4Ac，pH 7.54；梯度：0％B(0min)-0％B(10min)-100％B(50min)，流速：0.3mL·min-1；紫外检测波长：280nm；柱温：25±1℃。
如图7所示，4种蛋白质复合物达到基线分离，蛋白质复合物的质谱鉴定结果说明经色谱柱洗脱前后的蛋白质分子量基本相符，可以初步说明蛋白质在分离过程中保留了亚基之间的非共价作用，仍保持着非变性状态。

Claims (7)

1.一种离子交换色谱固定相的制备方法，其特征在于：其为UiO-66金属有机框架涂层保护的聚合物刷修饰的离子交换色谱固定相；其以硅胶颗粒为基质，通过在硅胶表面引入羧基基团，进而修饰一层UiO-66金属有机框架保护层；然后通过原子转移自由基聚合反应在材料表面接枝高密度聚合物刷，形成富含阳离子或阴离子功能基团的固定相材料；
修饰UiO-66金属有机框架保护层的过程：将带有羧基的硅胶颗粒分散在N,N-二甲基甲酰胺中，加入乙酸、四氯化锆，室温下磁力搅拌0.5-2小时；升温至110-130℃，加入有机配体，磁力搅拌反应4-48小时；洗涤后得到表面修饰UiO-66金属有机框架保护层的核-壳微球；硅胶表面引入羧基基团的方法是：先采用硅胶颗粒与带有环氧基团的硅烷化试剂在甲苯体系中在90-120℃下搅拌回流4-48小时，从而在硅胶表面引入环氧基团，再与含羧基的试剂反应制备得到；
微球的UiO-66金属有机框架涂层上修饰的聚合物刷由原子转移自由基聚合反应得到，先将UiO-66金属有机框架包裹的硅胶微球分散在二氯甲烷中， 0-4℃环境中加入三乙胺和引发剂2-溴异丁酰溴，升温至40-60℃下反应4-48 h，得到带有卤素引发基团的微球；再将上述微球与催化剂和功能单体在甲醇水溶液中无氧条件下50-70℃反应4-48 h，充分洗涤干燥后，分别得到阴离子交换色谱固定相材料或阳离子交换色谱固定相材料，所述的功能单体为含有阴或阳离子交换基团以及酰胺亲水基团的烯类功能单体。
2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
其中硅胶颗粒与硅烷化试剂的加入量质量比为1:0.05至1:1；羧基化反应在水或C1-C4的醇或甲苯中一种或二种以上的体系中进行，反应温度为30-120℃，反应时间为4-48小时。
3.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
硅胶颗粒与四氯化锆的加入量质量比为1:1至1:10；乙酸为有机助剂，四氯化锆与乙酸的加入量摩尔比为1:1至1:100；所述的有机配体为带有氨基的对苯二甲酸，其中有机配体与四氯化锆的摩尔比为1:0.1至1:10。
4.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
所述的引发剂2-溴异丁酰溴与三乙胺的加入量体积比为1:0.1至1:10，其中核壳微球与2-溴异丁酰溴的加入量质量比为1:0.1至1:10；
所述的甲醇水溶液为甲醇与水体积比为1:0.1至1:10的溶液；所使用的催化剂为卤化亚铜和联二吡啶，二者加入量的摩尔比为1:1至1:10。
5.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
功能单体在各自体系中的总摩尔数浓度为0.05-0.4 mol/L；UiO-66金属有机框架涂层的硅胶微球加入质量与单体总质量比为1:0.1至1:10；
含有阴离子基团的烯类单体包括含有磺酸基、羧基、磷酸基的烯类单体；含有阳离子基团的烯类单体包括含有咪唑环、仲氨基、叔胺基、季胺基、胍基的烯类单体；含有酰胺亲水基团的烯类单体包括丙烯酰胺类单体。
6.一种权利要求1-5任一所述制备方法制备获得的UiO-66金属有机框架涂层保护的聚合物刷修饰的离子交换色谱固定相。
7.一种权利要求6所述的UiO-66金属有机框架涂层保护的聚合物刷修饰的离子交换色谱固定相的应用，其用于蛋白质的分离与纯化。
CN201911240415.5A 2019-12-02 2019-12-02 一种离子交换色谱固定相及其制备和应用 Active CN112973655B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911240415.5A CN112973655B (zh) 2019-12-02 2019-12-02 一种离子交换色谱固定相及其制备和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911240415.5A CN112973655B (zh) 2019-12-02 2019-12-02 一种离子交换色谱固定相及其制备和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112973655A CN112973655A (zh) 2021-06-18
CN112973655B true CN112973655B (zh) 2022-07-19

Family

ID=76331338

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911240415.5A Active CN112973655B (zh) 2019-12-02 2019-12-02 一种离子交换色谱固定相及其制备和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112973655B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114146696A (zh) * 2021-11-12 2022-03-08 北京工商大学 基于后修饰技术的金属有机骨架复合材料手性色谱固定相
CN115814773A (zh) * 2022-12-07 2023-03-21 纳谱分析技术（苏州）有限公司 改性硅胶微球及其制备方法和应用
CN116272894A (zh) * 2023-02-08 2023-06-23 广西中医药大学 一种功能化多孔复合材料的液相色谱固定相及其色谱柱的制备方法与应用
CN116037071B (zh) * 2023-02-22 2024-05-14 西南科技大学 阳离子改性木基吸附剂及其制备方法、应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102011002540A1 (de) * 2011-01-11 2012-07-12 PORMAT UG (haftungsbeschränkt) PLOT-Säulen für die Gaschromatographie sowie Verfahren und Vorrichtung zu deren Herstellung
CN102631796A (zh) * 2012-04-10 2012-08-15 南开大学 一种基于金属有机骨架材料的液相色谱整体柱的制备方法
CN106632877A (zh) * 2015-08-26 2017-05-10 中国科学院大连化学物理研究所 蛋白质固相烷基化试剂的制备及固相烷基化试剂和应用
CN107138143A (zh) * 2017-05-18 2017-09-08 宁夏大学 具有阳离子交换功能的非离子型色谱固定相及其制备方法
CN109476491A (zh) * 2016-07-15 2019-03-15 沙特基础工业全球技术公司 多原子层状材料
CN110090634A (zh) * 2019-04-30 2019-08-06 吴培建 一种有机无机杂化整体柱的制备方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102011002540A1 (de) * 2011-01-11 2012-07-12 PORMAT UG (haftungsbeschränkt) PLOT-Säulen für die Gaschromatographie sowie Verfahren und Vorrichtung zu deren Herstellung
CN102631796A (zh) * 2012-04-10 2012-08-15 南开大学 一种基于金属有机骨架材料的液相色谱整体柱的制备方法
CN106632877A (zh) * 2015-08-26 2017-05-10 中国科学院大连化学物理研究所 蛋白质固相烷基化试剂的制备及固相烷基化试剂和应用
CN109476491A (zh) * 2016-07-15 2019-03-15 沙特基础工业全球技术公司 多原子层状材料
CN107138143A (zh) * 2017-05-18 2017-09-08 宁夏大学 具有阳离子交换功能的非离子型色谱固定相及其制备方法
CN110090634A (zh) * 2019-04-30 2019-08-06 吴培建 一种有机无机杂化整体柱的制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Construction of SiO2@UiO-66 core–shell microarchitectures through covalent linkage as flame retardant and smoke suppressant for epoxy resins;Wenwen Guo et al.;《Composites Part B》;20190811;第2页第2.2-2.4节和第10页第4部分结论 *
Polymer Brush Decorated MOF Nanoparticles Loaded with AIEgen, Anticancer Drug, and Supramolecular Glue for Regulating and In Situ Observing DOX Release;Shuai Chen et al.;《Macromolecular Bioscience》;20181017;第1页右栏第3段，第2页左栏第1段和Scheme 1以及Supporting Information中第2.2-2.4节 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112973655A (zh) 2021-06-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112973655B (zh) 一种离子交换色谱固定相及其制备和应用
Liu et al. Graphene oxide based molecularly imprinted polymers with double recognition abilities: The combination of covalent boronic acid and traditional non-covalent monomers
Gao et al. Preparation, characterization, and adsorption evaluation of chitosan-functionalized mesoporous composites
Zhou et al. Grafting of thermo-responsive polymer inside mesoporous silica with large pore size using ATRP and investigation of its use in drug release
CN106693909B (zh) 一种苯硼酸修饰的磁性纳米粒子及其制备方法和应用
KR101354476B1 (ko) 크로마토그래피 매질 성능을 향상시키기 위한 그라프팅 방법
KR101354473B1 (ko) 개선된 크로마토그래피 매질의 제조방법 및 사용방법
Erol et al. The effect of the chelator characteristics on insulin adsorption in immobilized metal affinity chromatography
CN114130374B (zh) 一种磁性羧基化共价有机骨架材料作为磁性固相萃取吸附剂的应用
KR20160097120A (ko) 선택적으로 기능화된 바이모달 다공성을 갖는 유리의 제조방법 및 상기 유리
Wang et al. Selective separation of bovine hemoglobin using magnetic mesoporous rare-earth silicate microspheres
Li et al. Characterization of poly (allylamine) as a polymeric ligand for ion-exchange protein chromatography
CN113195095A (zh) 大孔琼脂糖
Lidi et al. l-Cysteine modified metal–organic framework as a chiral stationary phase for enantioseparation by capillary electrochromatography
Sun et al. Surface modification of MCM-41 and its application in DNA adsorption
Salimi et al. Highly selective enrichment of phosphopeptides by titanium (IV) attached monodisperse-porous poly (vinylphosphonic acid-co-ethylene dimethacrylate) microspheres
Wang et al. Preparation and application of peptide molecularly imprinted material based on mesoporous metal-organic framework
Han et al. Pepsin immobilization on an aldehyde-modified polymethacrylate monolith and its application for protein analysis
Arabzadeh et al. Synthesis and characterization of molecularly imprinted polymers for selective solid-phase extraction of pseudoephedrine
CN104289209B (zh) 一种用于蛋白质分离的wcx/hic双功能混合模式聚合物基质色谱固定相及其制备方法
CN109174008A (zh) 在金属有机骨架中固载离子液体的吸附剂及其制备方法与应用
Yavuz et al. Affinity separation of immunoglobulin G subclasses on dye attached poly (hydroxypropyl methacrylate) beads
Zhang et al. Ionic liquid modification of metal-organic framework endows high selectivity for phosphoproteins adsorption
Zhai et al. Functional gigaporous polystyrene microspheres facilitating separation of poly (ethylene glycol)–protein conjugate
Chai et al. Combination of deep eutectic solvent and organic–inorganic hybrid monomer to prepare monolith for improvement of hydrophilic protein extraction

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant