CN108659159A - 一种用于检测替考拉宁的分子印迹微球及其制备与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测替考拉宁的分子印迹微球及其制备与应用，本发明选用和替考拉宁分子结构中糖基部分相似的分子作为模板分子，4－乙烯基苯硼酸和甲基丙烯酸甲酯为功能单体，二乙烯基苯为交联剂，制备用于检测替考拉宁的分子印迹微球，在pH值为9.0时，所合成的分子印迹微球会与目标糖肽类抗生素结合，当pH值降到4.0以下时，所结合的糖肽类抗生素会被释放出来，基于这种原理制备的糖基分子印迹固相萃取柱可以使糖肽类抗生素在弱碱性条件下截留在固相萃取柱中，再在酸性条件下洗脱下来。基于上述糖基分子印迹固相萃取柱可以有效检测血清和尿液样品中的替考拉宁，具有较高的回收率以及较低的检出限，具有良好的应用前景。

Description

一种用于检测替考拉宁的分子印迹微球及其制备与应用
技术领域
本发明涉及分子印迹微球领域，尤其涉及一种用于检测替考拉宁的分子印迹微球及其制备与应用。
背景技术
自1928年英国科学家亚历山大弗莱明发现青霉素以来，抗生素在全球广泛用于治疗和预防感染性疾病。随着抗生素的大量应用，病原微生物对抗生素等药物产生了耐受和抵抗能力。这种耐药性的产生使正常剂量的药物不再发挥应有的杀菌效果，甚至使药物完全无效，从而给疾病的治疗造成困难，并容易使疾病蔓延。因此耐抗生素的细菌感染已成为最严重的公共卫生问题之一。糖肽类抗生素主要用于治疗耐药革兰氏阳性细菌所致的严重感染。它们的作用机制是通过作用于革兰氏阳性细菌的细胞壁，与细胞壁黏肽合成中的D-丙氨酰-D-丙氨酸形成复合物，从而抑制了细胞壁的合成。糖肽类抗生素中，在临床上应用最多的是万古霉素和替考拉宁。因此，实现对替考拉宁的快速准确检测显得尤为重要。
现有的生物样品前处理方法包括有机溶剂沉淀法、液液萃取法和固相萃取法等。有机溶剂沉淀和液液萃取往往步骤繁琐，消耗大的溶剂量大。固相萃取法主要是通过采用选择性吸附、选择性洗脱的方式对样品进行富集、分离、净化，可同时完成样品富集与净化，大大提高检测灵敏度，减少样品预处理过程，操作简单、省时、省力，因此固相萃取在样品前处理中的应用最为广泛。常用的固相萃取吸附剂，如C18硅微球、亲水/亲脂平衡聚合物和离子交换聚合物，它们的选择性较低，在许多情况下，基质干扰会导致离子抑制或增强。
分子印迹技术是在聚合物表面形成对目标分子的特定识别位点。当模板分子与聚合物单体接触时会形成多重作用点，通过聚合过程这种作用就会被记忆下来，当模板分子除去后，聚合物中就形成了与模板分子空间构型相匹配的具有多重作用点的空穴，这样的空穴将对模板分子及其类似物具有选择识别特性。与大多数具有非特异性作用的分离材料不同，分子印记聚合物有一个选择性的合成识别位点，它与一个特定的分析物或一类分析物在空间和化学组成上完全匹配。分子印迹聚合物模拟抗体的作用并且在不同的领域得到了广泛的应用，包括色谱分离、样品制备、膜分离、固相萃取、药物控制释放、化学传感等。然而，基于氢键的分子印迹技术经常表现出强烈的非特异性识别。强烈的非共价键的相互作用也可以由带相反电荷的聚合物和模板静电作用产生。因此，在水基质中合成具有良好的分子识别能力的分子印迹聚合物一直是一个挑战。共价键分子印迹技术是模板与功能单体之间通过共价键的作用相互结合，由于共价键的稳定性更强，因此它具有更均匀的结合位点分布。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种用于检测替考拉宁的分子印迹微球及其制备与应用。
一种用于检测替考拉宁的分子印迹微球(MIMs)的制备方法，主要包括以下步骤：
(1)将甲基丙烯酸甲酯、二乙烯基苯和偶氮二异丁腈溶解于乙腈和甲苯的混合溶剂中(75/25，v/v)，在室温和氮吹的条件下搅拌8-12min；
(2)将模板分子和4-乙烯基苯硼酸溶解于pH为9.5缓冲溶液中；
(3)将步骤(2)所得反应物逐滴加入到步骤(1)所得混合溶液中；然后超声脱气3-6min，通氮气除氧5-15min；
(4)将步骤(3)所得的混合溶液(9:1，v/v)密封后搅拌，再将温度升高至50-60℃，聚合反应12-24h后，离心处理；
(5)用甲醇和乙酸的混合溶液反复清洗直到洗脱液中检测不到模板分子。
优先的，步骤(2)中所述模板剂分子结构式如下：
选用和替考拉宁分子结构中糖基部分相似的分子作为模板、这种做法也称作替代模板或假模板印迹方法。主要是用来解决研究的对象分子量大、结构复杂，难以进行有效分子印迹和对象分子价格昂贵等难题。
优先的，步骤(1)中甲基丙烯酸甲酯、二乙烯基苯和偶氮二异丁腈的重量比为2：7：1；步骤(2)中为每100μg的模板分子和0.242g 4-乙烯基苯硼酸溶解于5.0mL0.01mol/L pH9.5的磷酸盐缓冲溶液。
上述方法制备的用于检测替考拉宁的分子印迹微球MIMs。
一种包含上述用于检测替考拉宁的分子印迹微球的固相萃取柱。
优先的，包含用于检测替考拉宁的分子印迹固相萃取柱和非分子印迹固相萃取柱；所述非分子印迹微球(NIMs)的制备与除了步骤(2)中没有加模板分子以外，其他步骤与所述用于检测替考拉宁的分子印迹微球的制备方法一样。
上述固相萃取柱的制备，主要包括以下步骤：
分子印迹固相萃取柱(MISPE)柱的制备：在3mL的空管柱内部直接填充填料60mg干燥的MIMs，填料两端由筛板封住，防止混合填料外漏，柱子一端为样品或溶剂注入口，柱子另一端为样品或溶剂流出口。
非分子印迹固相萃取柱(NISPE)柱的制备：在3mL的空管柱内部直接填充填料60mg干燥的NIMs，填料两端由筛板封住。
上述固相萃取柱的应用，主要用于检测替考拉宁，主要包括以下步骤：
(S1)活化：将3mL甲醇和3mL 0.05mol/L磷酸盐缓冲剂(pH 7.0)加入上述固相萃取柱；
(S2)上样：将处理好的尿液样品注入活化好的固相萃取柱；
(S3)洗脱：用2.0mL去离子水清洗，再用3mL pH 4.0缓冲液+甲醇混合液(1/1,v/v)对上样后的MISPE柱进行淋洗。收集所得的洗脱液，在40℃下氮吹，然后分别溶解在400μL(血浆样品)和500μL(尿液样品)0.1％的甲酸溶液中；
(S4)上机：将得到的洗脱液直接进样到UPLC-MS/MS分析仪中检测替考拉宁的含量。
血浆样品的处理为：将100μL血浆样品与2.0mL 0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH9.0)混合后注入活化好的固相萃取柱。
尿液样品的处理为：向1.0mL的尿液样品中加入300μL 0.01mol/L乙酸铵缓冲溶液(pH 5.0)和15μLβ-葡萄糖醛酸酶水溶液(≥100000units/mL)，在37℃水浴中反应过夜。
与现有技术相比，本发明本发明选用和替考拉宁分子结构中糖基部分相似的分子作为模板分子，4-乙烯基苯硼酸和甲基丙烯酸甲酯为功能单体，二乙烯基苯为交联剂。在pH值为9.0时，所合成的分子印迹微球会与目标糖肽类抗生素结合，当pH值降到4.0以下时，所结合的糖肽类抗生素会被释放出来，基于这种原理制备的糖基分子印迹固相萃取柱可以使糖肽类抗生素在若碱性条件下截留在固相萃取柱中，再在酸性条件下洗脱下来。基于上述糖基分子印迹固相萃取柱可以有效检测血清和尿液样品中的替考拉宁，具有较高的回收率以及较低的检出限，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明制备糖基分子印迹微球的反应路线图；
图2为本发明检测的替考拉宁的结构式；
图3为本发明制备的MIMs的透射电镜(TEM)和扫描电镜(SEM)图；
其中A和B为透射电镜，C和D为扫描电镜图；
图4为本发明制备的MIMs的热重分析(TG)；
图5为本发明制备的MIMs的红外光谱(FT-IR)图；
图6为MIMs和NIMs在不同pH值下对替卡拉宁的吸附量图；
图7为洗脱液pH对替考拉宁回收率的影响；
图8为洗脱液的体积对替考拉宁回收率的影响；
图9为不同固相萃取柱对替考拉宁回收率的影响；
图10为经过MISPE柱处理过的加标血浆样品的替考拉宁多反应监测色谱图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
实施例1
糖基分子印迹微球的反应路线如图1所示，主要包括以下步骤：在250mL的圆底烧瓶中，将200mg甲基丙烯酸甲酯、700mg二乙烯基苯和100mg偶氮二异丁腈溶解于128mL乙腈和甲苯的混合溶剂中(75/25，v/v)。在室温和氮吹的条件下搅拌10min。将100μg的模板分子和0.242g 4-乙烯基苯硼酸溶解于5.0mL磷酸盐缓冲溶液(0.01mol/L，pH 9.5)，再逐滴加入到上述溶液中。然后超声脱气5min，氮吹净化10min。接着将所得的混合溶液密封并用电磁搅拌器进行搅拌，再将温度升高至60℃，聚合反应24h。将所得的MIMs在9000rpm下离心10min。随后，用甲醇和乙酸的混合溶液(9:1，v/v)反复清洗上述MIMs直到在洗脱液中检测不到模板分子。MIMs的透射电镜(TEM)和扫描电镜(SEM)如图3所示，MIMs呈现出规则的球形且分布窄，微球直径约为4.0μm。
MIMs的热重分析(TG)如图4所示，在200℃的质量减少，主要是由于水和溶剂的去除，在300℃有一个大的质量减少，主要是由于聚合物的分解造成的。MIMs的红外光谱(FT-IR)图如图5所示，在3432cm-1和2930cm-1的峰是甲基丙烯酸中的C＝O和C-H的伸缩振动产生的，在1600cm-1和1450cm-1的峰是由于二乙烯基苯中的苯环或者甲基丙烯酸中的C＝C的伸缩振动产生的，在709cm-1和789cm-1的峰是由于芳香族化合物C-H的面外弯曲振动产生的。
非分子印迹微球(NIMs)除了在聚合的过程中没有加模板分子以外，其他步骤和MIMs一样。
实施例2
MIMs和NIMs微球通过实施例1的方法制备得到，将10mg MIMs(NIMs)加入到2mL含有100μg/L替考拉宁的不同pH值缓冲溶液中，在室温下水平振动2h，然后离心分离，应用UPLC-MS/MS法检测上清液中替考拉宁的浓度。
图6为MIMs和NIMs在不同pH值下对替卡拉宁的吸附量。硼酸能与顺式二醇在碱性水溶液中发生共价反应生成环酯，当介质变成酸性后，环酯则游离出来。因此，pH会影响MIMs的吸附量。当pH为9.0时，MIMs的吸附量最大。
实施例3
MIMs微球通过实施例1的方法制备得到，在3mL的空管柱内部直接填充填料60mg干燥的MIMs，填料两端由筛板封住，所得的柱子即为MISPE柱。然后用3mL甲醇和3mL 0.05mol/L磷酸盐缓冲剂(pH 7.0)将柱子进行活化，接着上样，再用2.0mL去离子水清洗，用洗脱液对上样后的MISPE柱进行淋洗。收集所得的洗脱液，在40℃下氮吹，再溶解在0.1％的甲酸溶液中，应用UPLC-MS/MS进行检测。
通过改变洗脱剂的种类和体积，进而对固相萃取柱的萃取条件进行优化，从而得出最佳的洗脱剂和洗脱体积。
图7和图8分别表示洗脱液的pH值及其体积对替考拉宁回收率的影响，得到最佳的洗脱剂是pH＝4.0缓冲液+甲醇(1/1)，最佳的洗脱体积是3.0mL。
实施例4
MIMs微球通过实施例1的方法制备得到，在3mL的空管柱内部直接填充填料60mg干燥的MIMs，填料两端由筛板封住，所得的柱子即为MISPE柱。取8根不同的固相萃取柱柱(C18,HLB,MAX,MCX,WAX,WCX,MISPE和NISPE)，然后用3mL甲醇和3mL 0.05mol/L磷酸盐缓冲剂(pH 7.0)将柱子进行活化，将8份100μL 10.0μg/L替考拉宁的血浆样品分别注入上述柱子内，再用2.0mL去离子水清洗，用3mL pH 4.0缓冲液+甲醇混合液(1/1,v/v)淋洗柱子。收集所得的洗脱液，在40℃下氮吹，再溶解在0.1％的甲酸溶液中，应用UPLC-MS/MS进行检测。
图9为不同固相萃取柱对替考拉宁回收率的影响，经MISPE柱萃取的血浆样品中，替考拉宁的回收率最高。
图10为经过MISPE柱处理过的加标血浆样品中替考拉宁的多反应监测色谱图。
实施例5
MIMs微球通过实施例1的方法制备得到，在3mL的空管柱内部直接填充填料60mg干燥的MIMs，填料两端由筛板封住，所得的柱子即为MISPE柱。
取9根MISPE固相萃取柱，用3mL甲醇和3mL 0.05mol/L磷酸盐缓冲剂(pH 7.0)将柱子进行活化，取加标量为1.0μg/L，2.0μg/L和5.0μg/L 100μL血浆样品各三份与2.0mL0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH 9.0)混合后注入活化好的MISPE固相萃取柱。再用2.0mL去离子水清洗，用3mL pH 4.0缓冲液+甲醇混合液(1/1,v/v)淋洗柱子。收集所得的洗脱液，在40℃下氮吹，再溶解在0.1％的甲酸溶液中，应用UPLC-MS/MS进行检测。
表1为用MISPE柱处理过的血浆和尿液的加标回收率
表2为本发明方法与最近报道的关于替考拉宁检测方法的比较
以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

Claims (9)

1.一种用于检测替考拉宁的分子印迹微球的制备方法，其特征在于，主要包括以下步骤：
(1)将甲基丙烯酸甲酯、二乙烯基苯和偶氮二异丁腈溶解于乙腈和甲苯的混合溶剂中，在室温和氮吹的条件下搅拌8-12min；
(2)将模板分子和4-乙烯基苯硼酸溶解于pH为9.5缓冲溶液中；
(3)将步骤(2)所得反应物逐滴加入到步骤(1)所得混合溶液中；然后超声脱气3-6min，通氮气除氧5-15min；
(4)将步骤(3)所得的混合溶液密封后搅拌，再将温度升高至50-60℃，聚合反应12-24h后，离心处理；
(5)用甲醇和乙酸的混合溶液反复清洗直到洗脱液中检测不到模板分子。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述模板分子的分子结构式如下：
3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤(1)中甲基丙烯酸甲酯、二乙烯基苯和偶氮二异丁腈的重量比为2：7：1；步骤(2)中为每100μg的模板分子和0.242g 4-乙烯基苯硼酸溶解于5.0mL0.01mol/L pH 9.5的磷酸盐缓冲溶液。
4.根据权利要求1-3任一项所述方法制备的用于检测替考拉宁的分子印迹微球。
5.一种包含权利要求4所述用于检测替考拉宁的分子印迹微球的固相萃取柱。
6.根据权利要求5所述固相萃取柱，其特征在于，包含用于检测替考拉宁的分子印迹固相萃取柱和非分子印迹固相萃取柱；所述非分子印迹微球的制备与除了步骤(2)中没有加模板分子以外，其他步骤与所述用于检测替考拉宁的分子印迹微球的制备方法一样。
7.根据权利要求6所述固相萃取柱的应用，其特征在于，主要用于检测替考拉宁，主要包括以下步骤：
(S1)活化：将甲醇和pH 7.0的缓冲剂加入所述固相萃取柱；
(S2)上样：将处理好的样品注入活化好的固相萃取柱；
(S3)洗脱：先用去离子水清洗，再用pH 4.0缓冲液+甲醇混合液(1/1,v/v)对上样后的用于检测替考拉宁的分子印迹固相萃取柱进行淋洗；收集所得的洗脱液，在40℃下氮吹，然后溶解在含样品0.1％的甲酸溶液中；
(S4)上机：将得到的洗脱液直接进样到UPLC-MS/MS分析仪中检测替考拉宁的含量。
8.根据权利要求7所述固相萃取柱的应用，其特征在于，所述样品为血浆样品时，血浆样品的处理方法为将血浆样品与pH 9.0磷酸盐缓冲溶液混合。
9.根据权利要求7所述固相萃取柱的应用，其特征在于，所述样品为尿液样品时，尿液样品的处理为向的尿液样品中加入pH 5.0的乙酸铵缓冲溶液和≥100000units/mL的β-葡萄糖醛酸酶水溶液，在37℃水浴中反应过夜。
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