CN107629166A

CN107629166A - 一种热敏型大环内酯类抗生素分子印迹固相微萃取纤维的制备方法及应用

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Publication number: CN107629166A
Application number: CN201711081120.9A
Authority: CN
Inventors: 纪顺利; 李腾飞; 李多; 丁黎; 杨文�
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2017-11-01
Filing date: 2017-11-01
Publication date: 2018-01-26
Anticipated expiration: 2037-11-01
Also published as: CN107629166B

Abstract

本发明公开了一种应用于测定动物源食品中痕量大环内酯类抗生素残留量的高选择性分子印迹固相微萃取纤维及其制备方法。以螺旋霉素作为模板分子，采用管套管热引发聚合的方法，得到本发明的合成包衣厚度可控的分子印迹固相微萃取纤维。它对螺旋霉素、替米考星、交沙霉素等大环内酯类抗生素的立体结构具有“记忆”功能。用此分子印迹固相微萃取纤维可对残留分析样品溶液中螺旋霉素、替米考星、交沙霉素等大环内酯类抗生素进行高选择性富集。本发明的制备方法简单，制备的萃取纤维化学、机械和热稳定好，萃取容量高，选择性好，具有温度敏感性，使用寿命长，在分析化学、环境分析领域有广阔的应用前景。

Description

一种热敏型大环内酯类抗生素分子印迹固相微萃取纤维的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及分析化学前处理领域，具体说是应用于测定动物源食品中大环内酯类抗生素残留量的高选择性分离的分子印迹固相微萃取纤维的制备方法及应用。

背景技术

样品前处理的目的是为了分离基质和共存的干扰物，富集待测组分，提高检查灵敏度，以弥补现有分离技术和仪器检测灵敏度的不足。样品前处理所需时间约占全部分析时间的60％～70％，前处理过程引入的误差约占整个误差的70％～80％，因此样品前处理方法的先进与否，直接关系到整个分析方法的成败优劣。固相微萃取(SPME)是一种较新型的样品前处理技术。与传统的样品前处理技术相比，SPME具有样品用量少、处理时间短、操作简单、无二次污染、易与气相色谱、液相色谱联用、适合于现场或野外采集等优点。SPME技术的核心是涂有特定涂层的萃取头。常用的萃取头是以熔融石英纤维为载体，涂上一层固定相如聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯(PDMS/DVB)、聚丙烯酰胺(PA)、聚乙二醇/聚二甲基硅氧烷(CAR/PDMS)等，与其他组件组合而成。由于传统涂层以非特异性吸附为主，选择性不好，因此高选择性的微萃取纤维涂层的制备成为近年来的研究热点。

分子印迹技术(Molecular Imprinting Technique，MIT)是近几年来出现的一种对特定目标分子或其结构类似物具有专一识别性能的新材料，具有高选择性、化学和热稳定性好的优点，因此非常适合作为SPME纤维的涂层(称为MISPME)用于复杂样品预处理与富集过程。

大环内酯类抗生素是由链霉菌产生的一类弱碱性抗生素，对革兰氏阳性菌和支原体有较强的抑制能力，可用作动物的生长促进剂。此类抗生素在全球饲料添加剂中的使用量仅次于四环素类抗生素，因此食品中大环内酯类抗生素残留的检测形势非常严峻。由于大环内酯类抗生素多数为一类缺乏特征紫外吸收或紫外吸收弱的化合物，如果使用紫外检测器，含量低的样品是无法实现定量检测的。如何有效的从复杂的食品基质中将痕量大环内酯类抗生素富集，浓缩提高检测限目前仍然是个挑战。鉴于MISPME的高选择性的识别能力和富集浓缩能力，发展出大环内酯类抗生素分子印迹固相微萃取纤维将有利于对其进行选择性富集浓缩，从而有利于后续的分离分析。迄今为止，尚未见有关热敏型大环内酯类抗生素分子印迹固相微萃取纤维制备及其应用的报道。

因此，一种利用螺旋霉素为模板制备热敏型大环内酯类抗生素分子印迹固相微萃取纤维并将其应用于固相微萃取同时富集动物源食品中多种大环内酯类抗生素的方法被提出。

发明内容

本发明的目的在于提供一种热敏型大环内酯类抗生素分子印迹固相微萃取纤维的制备方法，该分子印迹固相微萃取纤维对具有十四至十六元内酯环结构的大环内酯类抗生素均有良好的识别性能。

本发明技术方案如下：

一种热敏型大环内酯类抗生素分子印迹固相微萃取纤维的制备方法，其特征在于按如下步骤进行：

(1)长度约为4～10cm的毛细管，火烧去除长度为1～5cm的外壁保护层，其外壁依次进行碱洗、酸洗、水洗、氮气吹干、硅烷化、烘干；

(2)截取长度约为1～5cm的玻璃管，烘干；

(3)称取0.1～0.5mmol的模板分子溶于1～5mLDMSO和2～10mL氯仿组成的混合溶剂中(所述的模板分子为螺旋霉素)，加入热敏型和非热敏型功能单体各0.4～2.5mmol(所述的热敏型功能单体为N-异丙基丙烯酰胺，非热敏型功能单体为非共价化合物)，将此混合溶液于室温下超声，使模板分子与功能单体充分混合；然后加入交联剂1～5mmol(所述的交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯)，再加入偶氮二异腈10～50mg，超声混匀、氮气脱氧，获得预聚合物溶液A；

(4)将步骤(1)制备的毛细管经硅烷化的一端插入步骤(2)制备的玻璃管装入4～15mL的离心管中，加入预聚合物溶液A，60℃水浴反应12～24h；

(5)将步骤(4)反应后的毛细管从玻璃管中推出，得到长度为1～5cm、表面光滑的聚合物纤维，再将整个毛细管浸入20％乙酸-甲醇中振荡24h，去除模板分子，放入甲醇中保存待用；

所述的功能单体可以是甲基丙烯酸、甲基丙烯酰胺或二乙烯基苯；

所述的硅烷化试剂为10％3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基丙烯酸酯/丙酮溶液；

与已有技术相比，本发明有益效果体现在：

1.将分子印迹聚合物和固相微萃取的优点有效结合起来，使该萃取纤维不仅具有分子印迹聚合物的高选择性，同时具有SPME样品用量少、处理时间短、操作简单、液相色谱联用、适合于现场或野外采集等优点。

2.热敏型功能单体的加入显著增加了萃取纤维伸缩性和温度敏感性，从而提高萃取纤维的选择性。

3.采用管套管的方式进行聚合制备包衣纤维，不仅操作简单，而且纤维包衣层的厚度易于控制。

4.多根毛细管可同时放入同一反应液中聚合，提高了微萃取纤维间的重复性和均一性。

附图说明

图1为MIPs与NIPs的红外光谱图

图2为MIPs纤维的扫描电镜图

图3为MIPs与NIPs纤维对螺旋霉素的静态吸附图

图4为不同萃取体积下MIPs与NIPs纤维对螺旋霉素的富集效果图

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明技术方案做进一步说明。实施例中的试验步骤和试验所用产品及试验器材，若无特别说明均为本领域常规技术手段、市购常规产品及公知仪器。

实施例1.热敏型大环内酯类抗生素分子印迹固相微萃取纤维的制备方法

(1)长度约为4cm，外径为350m的毛细管，火烧去除长度为2cm的外壁保护层，其外壁依次用1M氢氧化钠和0.1M盐酸浸泡1h、水洗至中性、氮气吹干、体积比为10％3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基丙烯酸酯/丙酮溶液硅烷化、100℃烘干；截取长度约为2cm，内径为1mm的玻璃管，烘干；(2)称取0.1mmol的螺旋霉素、0.4mmol N-异丙基丙烯酰胺、0.42mmol甲基丙烯酸溶于1mL DMSO和2mL氯仿组成的混合溶剂中，将此混合溶液于室温下超声，使模板分子与功能单体充分混合；然后加入交联剂2mmol乙二醇二甲基丙烯酸酯和10mg偶氮二异腈，超声混匀、氮气脱氧，获得预聚合物溶液；将步骤(1)制备的毛细管经硅烷化的一端插入步骤(2)制备的玻璃装入4mL的离心管中，加入预聚合物溶液，60℃水浴反应24h；

(3)将步骤(2)反应后的毛细管从玻璃管中推出，得到长度为2cm、表面光滑的聚合物纤维，再将整个毛细管浸入20％乙酸-甲醇中振荡24h(每8h换一次洗脱液)，去除模板分子，放入甲醇中保存待用；

实施例2.MIPs对大环内酯类富集浓缩效果验证

(1)经在不同配比下测定分子印迹聚合物对模板分子的吸附性能，见表1。最终确立了以模板分子∶热敏型功能单体∶非热敏型功能单体∶交联剂＝1∶3.5∶4.2∶20为最佳配比，其中非热敏型功能单体为甲基丙烯酸时富集效果最好。所得到的分子印迹聚合物(MIPs)用红外光谱进行表征，见图1。由红外谱图可知经洗脱模板分子的MIPs材料与无模板印迹聚合物(NIPs)中所含有波数相同，说明所得到的MIPs材料中模板分子已经去除完全。

表1功能单体的类型及比例的优化

(2)分子印迹固相微萃取纤维的电镜照片

MIPs材料扫描电镜图片见图2所示。可以看出MIPs纤维具有很强的收缩性，干燥的情况下可发生断裂，粗糙的表面具有大量的孔穴，因此具有较大的比表面积和孔径体积，从而有较高吸附容量。

(3)为了验证制备的热敏型分子印迹微萃取纤维对大环内酯类抗生素的高萃取容量，分别以MIPs和NIPs纤维作为微萃取材料，以5mL分别溶有30～900μg/mL的螺旋霉素溶液样品为萃取溶液进行萃取量的平行对比实验，剩余液用液相色谱-紫外检测器(HPLC-UV)的方法进行分析检测。结果如图3所示。结果显示在实验的浓度范围内MIPs微萃取纤维的萃取量要比NIP微萃取纤维高，最大的相对印迹因子出现在浓度为600μg/mL时，a_max＝2.17。

(4)为了验证制备的热敏型分子印迹微萃取纤维对大环内脂类抗生素的富集浓缩能力，分别以MIPs和NIPs纤维作为微萃取材料，以质量为10μg，体积分别为200mL、20mL、5mL的螺旋霉素(SPI)溶液(即浓度为0.05μg/mL、0.5μg/mL、2μg/mL的螺旋霉素标准溶液)，富集后用1.35mL甲醇-乙酸(8/1，v/v，即1.2mL甲醇，150μL乙酸)涡旋1min后吹干，用20％甲醇/水溶液定容100μL后进液相检测。结果如图4所示。结果显示MIPs材料对体积为200mL、20mL、5mL的螺旋霉素溶液的富集倍数分别为502，140，23，NIPs材料为183，79，13，在三个体积下MIPs都较NIPs具有更高的富集倍数并且随着溶液体积的增大差距越明显。

实例3.热敏型分子印迹微萃取纤维的温度敏感性特点

(1)为了验证热敏型分子印迹材料的温度敏感性，以将热敏型分子印迹纤维为固相微萃取材料，分别以体积为5mL，浓度为20μg/mL的螺旋霉素、替米考星、交沙霉素的溶液样品为萃取溶液，进行不同温度下萃取量的平行对比实验，见表2。结果显示，热敏型分子印迹纤维对不同的目标化合物的最佳萃取温度不同。

表2热敏型分子印迹纤维的温度敏感性实验

实施例4.热敏型分子印迹微萃取纤维检测市售蜂蜜

(1)将上述得到的热敏型分子印迹微萃取纤维作为固相微萃取(SPME)材料。用浓度为20mmol/L K₂HPO₄缓冲溶液(pH＝7.4)上样，1.5mL水淋洗，最后用FA/ACN＝1/8(v/v)的混合液洗脱后，氮气吹干，定容到200μL。洗脱物通过液相色谱联同紫外检测器进行分析检测。

(2)准确称取空白蜂蜜样品各2g，置于10mL聚丙烯塑料管中，再加入5mL浓度为20mmol K₂HPO₄(用6mol/L的HCl溶液调pH值为7.4)缓冲溶液，涡旋30s后，4500rpm下离心10min，将离心后的溶液作为固相萃取的上样液。

(3)结果

分别向空白蜂蜜中添加浓度为1.25、12.5和125μg/kg，3个浓度水平的大环内酯类抗生素的混合标准液，按上述的方法提取、净化后用HPLC-UV进行分析检测，每个添加水平重复测定6次，结果见表3。

表3不同添加水平下各目标物的添加回收率和相对标准偏差(n＝6)

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种热敏型大环内酯类抗生素分子印迹固相微萃取纤维的制备方法，其特征在于按如下步骤进行：

(2)截取长度约为1～5cm的玻璃管，烘干；

(3)称取0.1～0.5mmol的模板分子溶于1～5mL DMSO和2～10mL氯仿组成的混合溶剂中(所述的模板分子为螺旋霉素)，加入热敏型和非热敏型功能单体各0.4～2.5mmol(所述的热敏型功能单体为N-异丙基丙烯酰胺，非热敏型功能单体为非共价化合物)，将此混合溶液于室温下超声，使模板分子与功能单体充分混合；然后加入交联剂1～5mmol(所述的交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯)，再加入偶氮二异腈10～50mg，超声混匀、氮气脱氧，获得预聚合物溶液A；

(5)将步骤(4)反应后的毛细管从玻璃管中推出，得到长度为1～5cm、表面光滑的聚合物纤维，再将整个毛细管浸入20％乙酸-甲醇中振荡24h，去除模板分子，放入甲醇中保存待用。

2.根据权利要求1所述的一种热敏型大环内酯类抗生素分子印迹固相微萃取纤维的制备方法，其特征在于所述毛细管是玻璃毛细管或石英毛细管，外径为200～350m。

3.根据权利要求1或2所述的一种热敏型大环内酯类抗生素分子印迹固相微萃取纤维的制备方法，其特征在于所述的硅烷化试剂为10％3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基丙烯酸酯/丙酮溶液。

4.根据权利要求1所述的一种热敏型大环内酯类抗生素分子印迹固相微萃取纤维的制备方法，其特征在于所述玻璃管的内径为0.5～1mm。

5.根据专利要求1-4任一所述的一种热敏型大环内酯类抗生素分子印迹固相微萃取纤维的制备方法，其特征在于所述的非热敏性功能单体为甲基丙烯酸、丙烯酰胺或二乙烯基苯的任一种。

6.根据权利要求1所述的一种热敏型大环内酯类抗生素分子印迹固相微萃取纤维的制备方法，其特征在于步骤(5)中模板分子的洗脱溶剂每5～8h更换一次，反复3次。

7.利用权利要求1所述制备方法获得的大环内酯类抗生素分子印迹固相微萃取纤维在萃取大环内酯类抗生素中应用。