CN110396524A - 一种用于蚊虫的RNAi纳米颗粒和制备方法及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种用于蚊虫的RNAi纳米颗粒和制备方法及其用途，所述的用于蚊虫的RNAi纳米颗粒，包括壳聚糖和dsRNA；所述壳聚糖具有40‑100kDa的分子量，去乙酰化程度为70‑78％；通过选择上述壳聚糖包裹dsRNA得到的RNAi纳米颗粒，稳定性高，可以有效的将dsRNA送入蚊虫体内，干扰效果优良，能满足对蚊虫体内特异基因进行功能研究的要求。

Description

一种用于蚊虫的RNAi纳米颗粒和制备方法及用途
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种用于蚊虫的RNAi纳米颗 粒和制备方法及用途。
背景技术
目前，蚊虫中常用的RNAi方法包括注射、浸泡以及饲喂等。注射法成 本高，死亡率较高，对操作技术要求较高，重复性差，而注射法一般在成 蚊中应用较多，且雄蚊腹部不具有张力不利于注射，因此，用注射法对蚊 虫进行干扰具有很大的局限性。直接采用dsRNA进行浸泡或饲喂干扰蚊虫 特异性基因，然而在浸泡或饲喂的过程中，dsRNA暴露于外界环境中， dsRNA不稳定，容易降解，影响干扰效果。
壳聚糖(chitosan，CS)又称脱乙酰甲壳素，是由广泛存在于自然界的 几丁质(chitin)经化学处理脱乙酰作用得到。由于壳聚糖属于天然高分子具 有良好的安全性、生物相容性和微生物降解性等优良性能，从而被广泛研 究和应用于植物保护、生物治疗、基因工程、食品和医药等领域。壳聚糖 分子中存在带正电荷葡糖胺基，可与负电荷的DNA、dsRNA等产生静电作 用，二者经混合凝聚成多聚复合物，使得DNA与CS结合形成结构较为致密的纳米级粒。目前，已经有研究，将CS与dsRNA进行结合获得的纳米 微粒可以稳定的和有效的送入人体内或植物体内，然而由于蚊虫体积小， 通过饲喂的方式，将包裹dsRNA纳米颗粒送入蚊虫体内，干扰效果较差， 不能满足对蚊虫体内特异基因进行功能研究的要求，因此，还没有人成功 的提供一种CS与dsRNA结合的纳米颗粒更为稳定且可以有效传送至蚊虫体内。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于提供一种用于蚊虫的RNAi纳米颗 粒和制备方法及其用途，所述RNAi纳米颗粒可以更为稳定且可以有效传送 至蚊虫体内，满足对蚊虫体内特异基因进行功能研究的要求。
为此，本发明提供了如下技术方案：
一种用于蚊虫的RNAi纳米颗粒，包括壳聚糖和dsRNA；所述壳聚糖 具有40-100kDa的分子量，去乙酰化程度为70-78％。
所述的用于蚊虫的RNAi纳米颗粒，所述壳聚糖具有60-80kDa的分子 量，去乙酰化程度为75％。
所述的用于蚊虫的RNAi纳米颗粒，所述dsRNA为针对蚊虫的特异基 因进行设计的。
所述的用于蚊虫的RNAi纳米颗粒，所述壳聚糖和dsRNA的质量比为 1:4-10；优选的，质量比为1:8。
本发明提供了一种制备所述的用于蚊虫的RNAi纳米颗粒的方法，包括 如下步骤：
S1、将选定的壳聚糖溶解在醋酸钠溶液中制备壳聚糖工作液；
S2、向吸取的dsRNA中加入硫酸钠溶液配制得到dsRNA悬浮液；
S3、将壳聚糖工作液和dsRNA悬浮液混合，水浴静置，然后振荡混匀。
所述的方法，在S1步骤中，所述聚糖工作液中的壳聚糖的浓度为 0.05-0.06w/v％。
所述的方法，所述水浴静置步骤中，水浴温度为50-60℃，静置时间为 0.5-2min；优选的，水浴温度为55℃，静置时间为1min。
本发明提供了一种用于蚊虫的RNAi组合物，包括所述的用于蚊虫的 RNAi纳米颗粒。
所述的用于蚊虫的RNAi组合物，还包括蚊虫饲料和介孔二氧化硅；
优选的，所述的用于蚊虫的RNAi组合物中用于蚊虫的RNAi纳米颗粒、 蚊虫饲料和介孔二氧化硅的质量比1:1：(0.02-0.1)。
优选的，所述的用于蚊虫的RNAi组合物的制备方法如下：用于蚊虫的 RNAi纳米颗粒、蚊虫饲料和介孔二氧化硅按比例混合，加水混匀，随后以 等体积琼脂重悬，即得。
所述的用于蚊虫的RNAi组合物，所述介孔二氧化硅粒径为20-50nm， 孔径为3-8nm。
本发明提供了所述的用于蚊虫的RNAi纳米颗粒或所述的用于蚊虫的 RNAi组合物在蚊虫研究中的用途。
所述的用途，将所述的用于蚊虫的RNAi纳米颗粒或所述的用于蚊虫的 RNAi组合物饲喂所述的蚊虫。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的一种用于蚊虫的RNAi纳米颗粒，包括壳聚糖和 dsRNA；所述壳聚糖具有40-100kDa的分子量，去乙酰化程度为70-78％； 通过选择上述壳聚糖包裹dsRNA得到的RNAi纳米颗粒，稳定性高，可以 有效的将dsRNA送入蚊虫体内，干扰效果优良，能满足对蚊虫体内特异基 因进行功能研究的要求。
2.本发明提供的一种用于蚊虫的RNAi纳米颗粒，所述壳聚糖具有 60-80kDa的分子量，去乙酰化程度为75％；选择上述的壳聚糖，更加适合 于蚊虫，蚊虫可以更容易摄取，大大提高送入蚊虫体内的dsRNA的量，提 高干扰效果。
3.本发明提供的一种制备所述的用于蚊虫的RNAi纳米颗粒的方法，制 备方法简单易操作。
4.本发明提供的一种用于蚊虫的RNAi组合物，包括所述的用于蚊虫 的RNAi纳米颗粒；优选的，还包括蚊虫饲料和介孔二氧化硅；更优选的， 所述介孔二氧化硅粒径为20-50nm，孔径为3-8nm；由于在蚊虫干扰过程中 申请人观察发现当采用蚊虫饲料与RNAi纳米颗粒的组合物在饲喂蚊虫幼 虫时，在第一天时蚊虫幼虫较有活力，然而随着饲喂天数的增加蚊虫幼虫 活力逐渐下降，在饲喂至第6天-9天时，蚊虫幼虫活力较差，对于饲料的 摄取下降，甚至存在个别死亡的情况，经RT-PCR方法检测和分析，RNAi 纳米颗粒和蚊虫饲料的组合物饲喂蚊虫幼虫的干扰效果不理想，在实验过 程中偶然发现通过选择特定粒径和孔径的介孔二氧化硅掺入到蚊虫饲料与 所述壳聚糖包裹dsRNA的纳米颗粒混合物中制备成的用于蚊虫的RNAi组 合物饲喂蚊虫，发现饲喂多天时，蚊虫幼虫依然保持活力，经RT-PCR方法 检测和分析，蚊虫中的目的基因的表达量大大降低，远低于饲喂普通饲料 和壳聚糖包裹dsRNA的纳米颗粒混合制备的RNAi组合物的基因表达量， 干扰效果更优，所述的用于蚊虫的RNAi组合物导致干扰效果大大提高的原 因，可能在于介孔二氧化硅凝聚了饲料混合物中RNAi纳米颗粒，提高了蚊 虫幼虫对RNAi纳米颗粒的摄取，同时吸附了蚊虫饲料中部分油脂如营养成 分维生素E、植物油等，避免油脂漂浮在饲料混合物表面影响蚊虫幼虫的对 氧的需求，同时还保证了蚊虫幼虫对于部分油脂成分的摄取，进一步保证 蚊虫幼虫的活力，促进其对RNAi纳米颗粒的摄取，因此达到显著提高RNAi 纳米颗粒干扰效果的作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下 面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍， 显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普 通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获 得其他的附图。
图1是本发明实施例5中提取的DOPAL合成酶基因的dsRNA的凝胶 电泳图；
图2是本发明实施例5中提取的gus基因的dsRNA的凝胶电泳图；
图3是本发明效果例中qRT-PCR测定DOPAL合成酶基因相对表达量 的柱形图。
具体实施方式
下述实施例中涉及到的材料、试剂均为市售产品，包括不限于Trizol Reagent(Sangon)，PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Takara)， 5High-Fidelity2×master mix(BioLabsInc)，PMD18-T(Takara)，SanPrep柱 式质粒DNA小量抽提试剂盒(Sangon)，琼脂糖(Biowest)，SanPrep柱 式质粒DNA胶回收试剂盒(Sangon)，DNA ligation(Takara)，Oligo dT Primer，dNTP Mixture，RNase free H2O，5×Primer ScriptⅡBuffer，RNA inhibitor，Primer ScriptⅡRNase，质粒pBI121，Buffer B2，Soultion I，PMD-18T 质粒，质粒PL4440，LB固体培养基，LB液体培养基，感受态DH5α，感 受态HT115，Buffer P1，Buffer P2，Buffer P3，Buffer DW1，Wash Solution, 介孔二氧化硅、琼脂，蚊虫饲料(为常用的小鼠普通饲料，在下述实施例、 对比例和效果例中涉及的蚊虫饲料为购自江苏美迪森生物医药有限公司的 大小鼠维持饲料)，以上采用不同厂家和型号的产品并不会对本发明技术方 案所产生的技术效果产生显著的差异。
下述实施例仅以埃及伊蚊幼虫、蛹和成蚊作为对象，本发明的技术方 案并不仅限于埃及伊蚊，还可以应用于其他种类的蚊虫。对于蚊虫的总RNA 的提取也可以采用其他的常规方法进行提取。
实施例1埃及伊蚊总RNA的提取
用无酶管收取埃及伊蚊幼虫、蛹和成蚊，然后用Trizol法提取已收集样 品的总RNA，包括如下步骤：
(1)用未灭菌的DEPC水浸泡小钢珠过夜，高温高压灭菌；
(2)向收集的样品的无酶管中加入200ul trizol和5-7颗小钢珠(小钢珠数 量覆盖样品即可)；
(3)放入研磨器中打碎；
(4)将Trizol补足至1mL，室温裂解5min；
(5)加入200μL三氯甲烷，剧烈振荡15s，室温放置3min；
(6)4℃离心10min，小心吸取上清到新的无酶离心管中，加入等体积提前 预冷的异丙醇，充分混匀，室温20min；
(7)4℃离心10min，弃上清；
(8)加1mL提前预冷的DEPC水配制的75％酒精，充分洗涤；
(9)4℃离心3min，弃上清，干燥酒精，加30-50μLDEPC水溶解，跑胶检 测提取质量；
跑胶检测所提取的总RNA的质量，-80℃冰箱保存以备后用。
实施例2埃及伊蚊的cDNA的制备
cDNA第一条链的合成
1)取实施例1制备的总RNA，下表1配制模板RNA变性反应体系， 然后65℃保温5min，冰上迅速冷却；
表1模板RNA变性反应体系
2)取步骤1)获得的变性液按照下表2的反应体系进行配制，然后于 42℃下反应60min，获得短片段，然后于95℃下反应5min后，即得，冰上 冷却，-20℃保存。
表2反应体系
实施例3目的基因的扩增及TA克隆
一、目的基因的扩增
采用PCR方法扩增DOPAL合成酶基因及gus基因(gus基因为大肠杆 菌的β-葡萄糖醛酸酶的基因，用于作为阴性对照)，两基因的PCR反应体 系及PCR反应条件相同，区别仅在于反应模板不同，DOPAL合成酶基因所 用的模板为实施例2中制备的埃及伊蚊cDNA，产物大小497bp，Gus所用 模板为质粒pBI121，产物大小401bp。其中DOPAL合成酶基因的PCR扩 增引物F如SEQ ID NO.1所示，引物R如SEQ ID NO.2所示，Gus基因的 PCR扩增引物F如SEQ IDNO.3所示，引物R如SEQ ID NO.4所示，所述 PCR反应体系如下表3所示：
表3 PCR反应体系
PCR反应条件：98℃预变性2min，98℃保持10s，52℃保持30s，72℃ 保持45s，30个循环后，72℃延伸10min，跑胶检测。
胶回收：采用生工胶回收试剂盒进行回收上述目的基因，包括如下步 骤：
(1)1％琼脂糖核酸电泳检测，割取目的片段(保证所用工具的清洁)，放 入离心管中，称重；
(2)每100mg琼脂糖加入300μL Buffer B2；
(3)50℃水浴5-10min，期间不断混匀，直至胶块儿完全融化即可；
(4)当目的片段<500bp时，加入所使用的Buffer B2三分之一体积的异丙 醇，颠倒混匀，当目的片段≥500bp时，可忽略此步骤；
(5)将融化后的溶液全部移入吸附柱，8000×g离心30s，倒掉收集管中的 液体，将吸附柱放入同一收集管中；
(6)向收集管中加入300uL Buffer B2，9000×g离心30s，倒掉收集管中的 液体，将吸附柱放入同一收集管中；
(7)向吸附柱中加入500uL wash Solution,9000×g离心30s，倒掉收集管中 的液体，将吸附柱放入同一收集管中；
(8)重复步骤7；
(9)将空吸附柱和离心管放入离心机，9000×g离心1min；
(10)提前60℃预热ddH2O，在吸附膜中央加入30uL ddH2O，室温静置 1-2min，9000×g离心1min，将所得目的基因片段，于-20℃冰箱保存。
二、TA克隆
(1)加A反应，将上述胶回收的目的基因片段进行加A反应，按照 下表4中的加A反应体系进行配制并混匀，然后于72℃反应30min，跑胶 检测并回收，分别对DOPAL合成酶基因及gus基因进行加A。
表4加A反应体系
(2)TA克隆，将上述加A反应后的DOPAL合成酶基因及gus基因为 样品，按照下表5TA克隆反应体系进行配制并混匀，然后将上述溶液于16℃ 水浴连接1h，得到质粒DOPAL合成酶-PMD18-T和gus-PMD18-T。
表5 TA克隆反应体系
实施例4重组干扰载体PL4440的制备
一、DH5α的制备及转化
(1)配制LB固体培养基，将原始感受态DH5α划线于无抗生素的LB固 体培养基，37℃培养16-24h。
(2)挑取单个菌落于5mL无抗生素的LB液体培养基中，37℃振荡培养 12-16h。
(3)取2mL菌液加入100mL无抗生素的LB液体培养基中，37℃振荡培 养至菌体OD600为0.5。
(4)将菌液于冰上放置10min，使其冷却至0℃。
(5)4000rpm，4℃离心10min，倒掉上清。
(6)加入10mL预冷的0.1M氯化钙，重悬菌体，于冰上静置30min。
(7)4000rpm，4℃离心10min，倒掉上清。
(8)用2ml氯化钙重悬菌体，加入860uL预冷的50％甘油，混匀，分装到 1.5mL离心管中，每管100μL，于-80℃保存。
(9)取新制备的感受态DH5α，置于冰上，每50uL感受态DH5α中加入 10uL连接体系，所述连接体系如表8所示，按照表8的连接体系进行配制， 冰上静置30min。
(10)42℃金属浴45s，冰上静置3-5min。
(11)加入500μL无抗生素的LB液体培养基，摇床37℃振荡培养1h。
(12)涂板，涂到含有氨苄(AMP)抗生素的LB固体培养基中，于37℃ 倒置培养过夜。
二、质粒提取
(1)挑单个菌落于5mL含有AMP的LB液体培养基中，37℃振荡培养 12-16h。
(2)使用生工SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒进行质粒DNA的提 取，取1.5-5mL菌液，8000×g室温离心2min，收集菌体，倒尽培养基。
(3)在菌体沉淀中加入250μL的Buffer P1，吸打至彻底悬浮菌体。
(4)加入250uL Buffer P2，立即温和颠倒混匀5-10次，室温静置2-4min。
(5)加入350ul Buffer P3，立即温和颠倒混匀5-10次。
(6)1200×g离心10min，将上清小心全部移入吸附柱中，9000×g离心30s， 倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一收集管中。
(7)(可选步骤)在吸附柱中加入500μL去蛋白液Buffer DW1，9000×g离 心30s，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一收集管中。
(8)向吸附柱中加入500μL Wash Solution，9000×g离心30s，倒掉收集管 中的液体，将吸附柱放入同一收集管中。
(9)重复步骤(8)一次
(10)将空吸附柱和收集管放入离心机，9000×g离心1min。
(11)在吸附膜中央加入60μL提前60℃预热的ddH2O，室温静置1-2min， 9000×g离心1min，获得质粒PL4440，将所得质粒于-20℃冰箱保存。
三、双酶切检测及测序检验
将实施例3制备的质粒DOPAL合成酶-PMD18-T、Gus-PMD18-T和质 粒PL4440(空载体)分别进行双酶切，酶切体系分别见下表6和表7：
表6质粒DOPAL合成酶-PMD18-T和质粒PL4440的酶切体系
按照上表6进行配制，将DOPAL合成酶-PMD18-T或质粒PL4440与 10×Fast DigestGreen Buffer混合后，先单加Sma I混匀后，于30℃酶切 30min，再加XbaI于37℃酶切30min，跑胶检测并回收。
表7质粒gus-PMD18-T和质粒PL4440的酶切体系
按照上表7进行配制，将上述溶液混匀，于37℃酶切1h，跑胶检测并 回收。
四、重组干扰载体PL4440的制备
将上述双酶切的目的基因(DOPAL合成酶-PMD18-T和gus-PMD18-T) 以及双酶切的PL4440载体(干扰所用载体，具有双向T7启动子)分别进 行胶回收(步骤同实施例3中的胶回收步骤)，回收后分别将酶切的目的基 因与酶切的PL4440载体进行连接，连接体系如下表8：
表8连接体系
将上述溶液混匀，于16℃水浴过夜，将连接体系于感受态DH5α中进 行转化(步骤如本实施例中所述的“一、DH5α的制备及转化”步骤)，挑 取单菌落，提质粒后进行双酶切检测，分别得到DOPAL合成酶基因和gus 基因的重组干扰载体PL4440。
实施例5dsRNA的提取
一、感受态HT115的制备及转化
(1)配制LB固体培养基，将原始感受态HT115划线于无抗生素的LB固 体培养基，37℃培养16-24h。
(2)挑取单个菌落于5mL加入四环素(四环素是抗生素，以终浓度10μg/mlL 加入培养基)的LB液体培养基中，37℃振荡培养12-16h。
(3)取2mL菌液加入100mL加入四环素(四环素是抗生素，以终浓度 10μg/mlL加入培养基)的LB液体培养基中，37℃振荡培养至菌体OD600为0.5。
(4)将菌液于冰上放置10min，使其冷却至0℃。
(5)4000rpm，4℃离心10min，倒掉上清。
(6)加入10mL预冷的0.1M氯化钙，重悬菌体，于冰上静置30min。
(7)4000rpm，4℃离心10min，倒掉上清。
(8)用2ml氯化钙重悬菌体，加入860μL预冷的50％甘油，混匀，分装到 1.5mL离心管中，每管100μL，于-80℃保存。
(9)取新制备的感受态HT115，置于冰上，每50uL感受态HT115中加入 2μL实施例4中制备的DOPAL合成酶基因或Gus基因的重组干扰载体 PL4440，冰上静置30min。
(10)42℃金属浴45s，冰上静置3-5min。
(11)加入500μL无抗生素的LB液体培养基，摇床37℃振荡培养1h。
(12)涂板，涂到含有氨苄(AMP)抗生素和四环素的LB固体培养基中， 于37℃倒置培养12-16小时。
(13)挑单个菌落于5mL含有AMP和四环素的LB液体培养基中，37℃振 荡培养12-16h，然后于-80℃保存菌种。
二、质粒提取
(1)挑单个菌落于5mL含有AMP和四环素的LB液体培养基中，37℃振 荡培养12-16h。
(2)使用生工SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒进行质粒DNA的提 取，取1.5-5mL菌液，8000×g室温离心2min，收集菌体，倒尽培养基。
(3)在菌体沉淀中加入250μL的Buffer P1，吸打至彻底悬浮菌体。
(4)加入250μL Buffer P2，立即温和颠倒混匀5-10次，室温静置2-4min。
(5)加入350μl Buffer P3，立即温和颠倒混匀5-10次。
(6)1200×g离心10min，将上清小心全部移入吸附柱中，9000×g离心30s， 倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一收集管中。
(7)(可选步骤)在吸附柱中加入500μL去蛋白液Buffer DW1，9000×g离 心30s，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一收集管中。
(8)向吸附柱中加入500μL Wash Solution，9000×g离心30s，倒掉收集管 中的液体，将吸附柱放入同一收集管中。
(9)重复步骤(8)一次
(10)将空吸附柱和收集管放入离心机，9000×g离心1min。
(11)在吸附膜中央加入60μL提前60℃预热的ddH2O，室温静置1-2min， 9000×g离心1min，获得质粒，将所得质粒于-20℃冰箱保存。
三、双酶切检测及测序检验
将上述制备DOPAL合成酶基因或Gus基因的重组干扰载体PL4440分 别进行双酶切，酶切体系分别见下表9和表10：
表9 DOPAL合成酶基因的重组干扰载体PL4440的酶切体系
按照上表9进行配制，将DOPAL合成酶-PMD18-T或质粒PL4440与 10×Fast DigestGreen Buffer混合后，先单加Sma I混匀后，于30℃酶切 30min，再加XbaI于37℃酶切30min，跑胶并测序。
表10 Gus基因的重组干扰载体PL4440的酶切体系
按照上表10进行配制，将上述溶液混匀，于37℃酶切1h，跑胶并测 序。
三、dsRNA的提取
将上述步骤二中所保存的菌种在冰上进行解冻，于150mL含有氨苄和 四环素的LB液体培养基中37℃振荡培养其至OD600的值为0.4-0.6，加入 0.6mmoL IPTG继续在37℃振荡培养4-6h，进行dsRNA的诱导表达，4℃ 离心得菌体，采用Trizol法提取菌液的dsRNA(具体方法同实施例1中的 Trizol法提取总RNA)，跑胶检测，凝胶图见图1和图2，图1为DOPAL合成酶基因靶dsRNA的凝胶图，其中泳道1中500-700bp之间的条带为 dsRNA的特异性条带，该条带下方的条带为诱导后的菌液，图2为gus基 因靶dsRNA的凝胶图，其中泳道1中500-700bp之间的条带为dsRNA的特 异性条带，该条带下方的条带为诱导后的菌液，将所提取的DOPAL合成酶 基因靶dsRNA或gus基因靶dsRNA于-80℃保存以备后续。所述DOPAL 合成酶基因的dsRNA序列如SEQ ID NO.5所示，所述gus基因的dsRNA 序列如SEQ ID NO.6所示。
实施例6 RNAi纳米颗粒的制备
本实施例的用于蚊虫的RNAi纳米颗粒，包括壳聚糖和dsRNA；所述 壳聚糖具有100kDa的分子量，去乙酰化程度为78％，所述壳聚糖和dsRNA 的质量比为1:4。所述dsRNA为实施例5中提取的DOPAL合成酶基因靶 dsRNA。
本实施例还提供了上述的用于蚊虫的RNAi纳米颗粒的制备方法，按 照上述的用于蚊虫的RNAi纳米颗粒选择相应分子量和去乙酰化程度的壳 聚糖，然后按照下述步骤制备：
(1)将选定的壳聚糖8μg溶解在PH4.5，0.1mol的醋酸钠溶液中，配 成0.05％(每100ml溶液中含有0.05g壳聚糖)
(2)吸取实施例5中提取的DOPAL合成酶基因靶dsRNA 32μg，加 入1μl 2.5moL/L的硫酸钠溶液，已灭菌的DEPC水补足至100μL，混匀后 加入100μl壳聚糖溶液。
(3)将离心管于50℃水浴静置2min，迅速转至旋涡振荡仪振荡30s， 4℃，1300×g离心10min，所得沉淀即为RNAi纳米颗粒。
实施例7 RNAi纳米颗粒的制备
本实施例的用于蚊虫的RNAi纳米颗粒，包括壳聚糖和dsRNA；所述 壳聚糖具有40kDa的分子量，去乙酰化程度为70％，所述壳聚糖和dsRNA 的质量比为1:10。所述dsRNA为实施例5中提取的DOPAL合成酶基因靶 dsRNA。
本实施例还提供了上述的用于蚊虫的RNAi纳米颗粒的制备方法，按 照上述的用于蚊虫的RNAi纳米颗粒选择相应分子量和去乙酰化程度的壳 聚糖，然后按照下述步骤制备：
(1)将选定的壳聚糖4μg溶解在PH4.5，0.1mol的醋酸钠溶液中，配 成0.06％(每100ml溶液中含有0.05g壳聚糖)
(2)吸取实施例5中提取的DOPAL合成酶基因靶dsRNA 40μg，加 入1ul 2.5moL/L的硫酸钠溶液，已灭菌的DEPC水补足至100μL，混匀后 加入100μl壳聚糖溶液。
(3)将离心管于60℃水浴静置0.5min，迅速转至旋涡振荡仪振荡30s， 4℃，1300×g离心10min，所得沉淀即为RNAi纳米颗粒。
实施例8 RNAi纳米颗粒的制备
本实施例的用于蚊虫的RNAi纳米颗粒，包括壳聚糖和dsRNA；所述 壳聚糖具有70kDa的分子量，去乙酰化程度为75％，所述壳聚糖和dsRNA 的质量比为1:8。所述dsRNA分别选择实施例5中提取的DOPAL合成酶基 因靶dsRNA和gus基因靶dsRNA。
本实施例还提供了上述的用于蚊虫的RNAi纳米颗粒的制备方法，按 照上述的用于蚊虫的RNAi纳米颗粒选择相应分子量和去乙酰化程度的壳 聚糖，然后按照下述步骤制备：
(1)将选定的壳聚糖4μg溶解在PH4.5，0.1mol的醋酸钠溶液中，配 成0.05％(每100ml溶液中含有0.05g壳聚糖)
(2)吸取实施例5中提取的DOPAL合成酶基因靶dsRNA或Gus基因 靶dsRNA 32μg，加入1ul 2.5moL/L的硫酸钠溶液，已灭菌的DEPC水补 足至100μL，混匀后加入100μl壳聚糖溶液。
(3)将离心管于55℃水浴静置1min，迅速转至旋涡振荡仪振荡30s， 4℃，1300×g离心10min，所得沉淀即为RNAi纳米颗粒，包裹DOPAL合 成酶基因靶dsRNA的RNAi纳米颗粒命名为DOPAL合成酶-RNAi纳米颗 粒，包裹gus基因靶dsRNA的RNAi纳米颗粒命名为gus-RNAi纳米颗粒。
(4)将上清移至新的离心管中，琼脂糖凝胶电泳检测dsRNA的包埋 情况，凝胶结果见图1-2，图1为DOPAL合成酶基因的dsRNA的凝胶电泳 图，其中泳道2为包裹DOPAL合成酶基因的dsRNA的RNAi纳米颗粒的 上清，图2为gus基因的dsRNA的凝胶电泳图，其中泳道2为包裹gus基 因靶dsRNA的RNAi纳米颗粒的上清，图1-2中的泳道2均未出现条带， 上清中没有游离的dsRNA，说明DOPAL合成酶基因靶dsRNA和gus基因 靶dsRNA包埋情况优良。
实施例9用于蚊虫的RNAi组合物
本实施例的用于蚊虫的RNAi组合物，分别向实施例8获得的DOPAL 合成酶-RNAi纳米颗粒或gus-RNAi纳米颗粒(沉淀)中加入等量蚊虫饲料， 得到混合物，然后按照混合物和水的质量比为1:3向混合物中加水混匀，同 时以等体积琼脂重悬，所述琼脂的质量浓度为0.2％，分别得到DOPAL合 成酶-RNAi组合物和gus-RNAi组合物。
实施例10用于蚊虫的RNAi组合物
本实施例的用于蚊虫的RNAi组合物，将实施例8获得的用于蚊虫的 DOPAL合成酶-RNAi纳米颗粒或gus-RNAi纳米颗粒(沉淀)、蚊虫饲料和 介孔二氧化硅的按照质量比1:1：0.02混合，得到混合物，然后按照混合物 和水的质量比为1:1向混合物中加水混匀，随后以等体积琼脂重悬，所述琼 脂的质量浓度为0.3％，即分别得到DOPAL合成酶-RNAi组合物和gus-RNAi 组合物。
所述介孔二氧化硅粒径为20nm，孔径为3nm。
实施例11用于蚊虫的RNAi组合物
本实施例的用于蚊虫的RNAi组合物，将实施例8获得的用于蚊虫的 DOPAL合成酶-RNAi纳米颗粒或gus-RNAi纳米颗粒(沉淀)、蚊虫饲料和 介孔二氧化硅的按照质量比1:1：0.1混合得到混合物，然后按照混合物和 水的质量比为1:2向混合物中加水混匀，随后以等体积琼脂重悬，所述琼脂 的质量浓度为0.15％，即分别得到DOPAL合成酶-RNAi组合物和gus-RNAi 组合物。
所述介孔二氧化硅粒径为50nm，孔径为8nm。
实施例12用于蚊虫的RNAi组合物
本实施例的用于蚊虫的RNAi组合物，将实施例8获得的用于蚊虫的 DOPAL合成酶-RNAi纳米颗粒或gus-RNAi纳米颗粒(沉淀)、蚊虫饲料和 介孔二氧化硅的按照质量比1:1：0.06混合，得到混合物，然后按照混合物 和水的质量比为1:3向混合物中加水混匀，随后以等体积琼脂重悬，所述琼 脂的质量浓度为0.2％，即分别得到DOPAL合成酶-RNAi组合物和gus-RNAi 组合物。
所述介孔二氧化硅粒径为35nm，孔径为5nm。
对比例1 RNAi纳米颗粒的制备
本实施例的用于蚊虫的RNAi纳米颗粒，包括壳聚糖和dsRNA；所述 壳聚糖具有150kDa的分子量，去乙酰化程度为85％，所述壳聚糖和dsRNA 的质量比为1:16。所述dsRNA选择实施例5中提取的DOPAL合成酶基因 靶dsRNA。
本实施例还提供了上述的用于蚊虫的RNAi纳米颗粒的制备方法，按 照上述的用于蚊虫的RNAi纳米颗粒选择相应分子量和去乙酰化程度的壳 聚糖，然后按照下述步骤制备：
(1)将选定的壳聚糖4μg溶解在PH4.5，0.1mol的醋酸钠溶液中，配 成0.05％(每100ml溶液中含有0.05g壳聚糖)
(2)吸取实施例5中的DOPAL合成酶基因靶dsRNA64μg，加入1μl 2.5moL/L的硫酸钠溶液，已灭菌的DEPC水补足至100μL，混匀后加入100μl 壳聚糖溶液。
(3)将离心管于55℃水浴静置1min，迅速转至旋涡振荡仪振荡30s， 4℃，1300×g离心10min，所得沉淀即为RNAi纳米颗粒。
将上述获得的沉淀中加入蚊虫饲料和介孔二氧化硅，按照质量比1:1： 0.06混合，得到混合物，然后按照混合物和水的质量比为1:3向混合物中加 水混匀，随后以等体积琼脂重悬，所述琼脂的质量浓度为0.2％，即得到 DOPAL合成酶-RNAi组合物。
所述介孔二氧化硅粒径为35nm，孔径为5nm。
对比例2 RNAi纳米颗粒的制备
本实施例的用于蚊虫的RNAi纳米颗粒，包括壳聚糖、dsRNA和介孔 二氧化硅；所述壳聚糖具有70kDa的分子量，去乙酰化程度为75％，所述 介孔二氧化硅粒径为35nm，孔径为5nm，所述dsRNA选择实施例5中提 取的DOPAL合成酶基因靶dsRNA，所述壳聚糖、dsRNA和介孔二氧化硅 的质量比为1:8:0.45。
本实施例还提供了上述的用于蚊虫的RNAi纳米颗粒的制备方法，按 照上述的用于蚊虫的RNAi纳米颗粒选择相应分子量和去乙酰化程度的壳 聚糖，然后按照下述步骤制备：
(1)将选定的壳聚糖4μg溶解在PH4.5，0.1mol的醋酸钠溶液中，配 成0.05％(每100ml溶液中含有0.05g壳聚糖)
(2)吸取实施例5中提取的DOPAL合成酶基因靶dsRNA 32μg，加 入1μl 2.5moL/L的硫酸钠溶液，然后向其中加入1.8μg所选择的介孔二氧 化硅，随后加入已灭菌的DEPC水补足至100μL，混匀后加入100μl壳聚糖 溶液。
(3)将离心管于55℃水浴静置1min，迅速转至旋涡振荡仪振荡30s， 4℃，1300×g离心10min，所得沉淀即为RNAi纳米颗粒。
向上述获得的沉淀中加入等量蚊虫饲料，得到混合物，然后按照混合 物和水的质量比为1:3向混合物中加水混匀，同时以等体积琼脂重悬，所述 琼脂的质量浓度为0.2％，获得用于蚊虫的RNAi组合物。
效果例
本效果例通过RT-PCR方法检测和分析，考察本发明的用于蚊虫的 RNAi纳米颗粒对于蚊虫中特异基因的干扰效果。
1.实验材料与仪器
实验动物：埃及伊蚊幼虫120只，一龄，由军事医学研究院微生物流 行病研究所提供。
实验试剂：PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara)，FastStart Essential DNAGreen Master(Roche)。
实验材料：实施例9、实施例12、对比例1和对比例2中制备得到的 DOPAL-RNAi组合物以及实施例12制备的Gus-RNAi组合物。
普通蚊虫饲料的制备：取蚊虫饲料，以等体积琼脂重悬，所述琼脂的 质量浓度为0.15-0.3％，即得。
仪器：RT-PCR仪器的生产厂家和型号(LightCycler96，Roche)
2.实验方法
2.1实验分组
空白对照组：饲喂普通蚊虫饲料。
阴性对照组：饲喂实施例12的gus-RNAi组合物。
实施例9实验组：饲喂实施例9的DOPAL合成酶-RNAi组合物。
实施例12实验组：饲喂实施例12的DOPAL合成酶-RNAi组合物。
对比例1实验组：饲喂对比例1的DOPAL合成酶-RNAi组合物。
对比例2实验组：饲喂对比例2的DOPAL合成酶-RNAi组合物。
2.2实验方法
对埃及伊蚊幼虫进行干扰，包括如下步骤：
取96孔细胞培养板，每孔喂养10只一龄埃及伊蚊幼虫，加4mL灭菌 去离子水，将实施例9、实施例12、对比例1或对比例2中制备得到的DOPAL 合成酶-RNAi组合物放入不同的培养孔中，每天饲喂两小时后，喂普通蚊 虫饲料，实施例12的gus-RNAi组合物作为阴性对照，普通蚊虫饲料作为 空白对照，连续饲喂8-10天。
3实验检测和结果
3.1检测方法
(1)取样：实验组用无酶离心管收取有表型缺陷的幼虫，对照组用无 酶离心管收取与实验组同一时期的幼虫。
(2)总RNA提取：提取幼虫的总RNA，方法与实施例1相同。
(3)cDNA的获取：首先检测所提RNA浓度，使所加体系RNA终浓 度不超过1000ng，然后去除提取的总RNA中的基因组DNA，随后按照下 表11所示的反应体系配制，于42℃反应2min，4℃冷却。
表11反应体系
(4)反转录：将上述步骤(3)获得的反应液按照下表12进行配制， 随后混匀，37℃保持15min，85℃保持15s，然后降温至4℃，于-20℃保存。
表12反转体系
(5)qRT-PCR：取步骤(4)获得的含cDNA的反应液按照下表13进 行配制，混匀，然后进行qRT-PCR反应，DOPAL合成酶基因的qRT-PCR-F 引物如SEQ ID NO.7所示，qRT-PCR-R引物如SEQ ID NO.8所示，选用 GAPDH作为内参，GAPDH的qRT-PCR-F引物如SEQ ID NO.9所示，qRT-PCR-R引物如SEQ ID NO.10所示。qRT-PCR反应条件为：95℃预变 性600s，采用三步法进行扩增，95℃保持10s，55℃保持10s，72℃保持10s， 45个循环，熔解曲线温度，95℃保持10s，72℃保持30s，97℃保持1s，37℃ 冷却30s。
表13 qRT-PCR反应体系
3.2实验结果
测定结果如图3所示，Ds代表实验组，Gus代表阴性对照，横坐标代 表不同组的RNAi组合物，纵坐标代表DOPAL合成酶基因的相对表达量。 图中字母代表差异显著性，b代表与阴性对照组相比差异显著(P<0.05)， a代表与阴性对照组相比差异不显著(P＞0.05)，由图中可知，本发明的 用于蚊虫的RNAi纳米颗粒及其组合物对于蚊虫中DOPAL合成酶基因表达 的干扰效果显著，大大降低了DOPAL合成酶基因的相对表达量，能满足对 蚊虫体内特异基因进行功能研究的要求。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方 式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可 以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予 以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保 护范围之中。
SEQUENCE LISTING
<110> 海南大学
<120> 一种用于蚊虫的RNAi纳米颗粒和制备方法及用途
<130> HA2018
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
cctggaggaa attggtc 17
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
agtaggtgtc ctctcctttc a 21
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
gcggccgccc cttacgctga agagatgc 28
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
ctcgagggca cagcacatca aagaga 26
<210> 5
<211> 497
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
cctggaggaa attggtcctt actgtaatga caacaagctt tggcttcatg tggatgcagc 60
ctatgcagga gcctcatttt gtctaccaga gtatgcatgg attaagaaag gacttgaaat 120
ggctgattcg ctgaacttca atctacacaa atggcttttc gtgaacttcg attgctgtgc 180
catgtggttc aaggatgctg ctatgatcac ggaagctttc agtgtggatc gtatatatct 240
ccaacataaa ttccaaggca tgagtaaagc accagactat cgccattggc aaattcagct 300
cggaagacga ttccgttcac tgaaggtttg gatcacactg aaaaccatgg gagcggagaa 360
gattcgtgag ctgattcggt ttcacataag tcttgcgcag aagtttgaac aatacgtgcg 420
agcggatcca cgttttgagg taacatcgtc cacattggca ttagtatgct tccgtttgaa 480
aggagaggac acctact 497
<210> 6
<211> 401
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
cccttacgct gaagagatgc tcgactgggc agatgaacat ggaatcgtgg tgattgatga 60
aactgcagct gtcggcttta acctctcttt aggcattggt ttcgaagcgg gcaacaagcc 120
gaaagaactg tacagcgaag aggcagtcaa cggggaaacc cagcaggcgc acttacaggc 180
gattaaagag ctgattgcgc gtgacaaaaa ccacccaagc gtggtgatgt ggagtattgc 240
caacgaaccg gatacccgtc cgcaaggtgc acgggaatat tttgcgccac tggcggaagc 300
aacgcgtaaa ctcgacccga cgcgtccgat cacctgtgtc aatgtaatgt tctgcgaggc 360
tcacaccgat accatcagcg atctctttga tgtgctgtgc c 401
<210> 7
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<212> DNA
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<400> 7
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<210> 9
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
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<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
tgtcgtacca ggagatgagc 20

Claims (10)

1.一种用于蚊虫的RNAi纳米颗粒，其特征在于，包括壳聚糖和dsRNA；所述壳聚糖具有40-100kDa的分子量，去乙酰化程度为70-78％。
2.根据权利要求1所述的用于蚊虫的RNAi纳米颗粒，其特征在于，所述壳聚糖具有60-80kDa的分子量，去乙酰化程度为75％。
3.根据权利要求1或2所述的用于蚊虫的RNAi纳米颗粒，其特征在于，所述壳聚糖和dsRNA的质量比为1:4-10。
4.一种制备权利要求1-3任一项所述的用于蚊虫的RNAi纳米颗粒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将选定的壳聚糖溶解在醋酸钠溶液中制备壳聚糖工作液；
S2、向吸取的dsRNA中加入硫酸钠溶液配制得到dsRNA悬浮液；
S3、将壳聚糖工作液和dsRNA悬浮液混合，水浴静置，然后振荡混匀。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在S1步骤中，所述聚糖工作液中的壳聚糖的浓度为0.05-0.06w/v％。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述水浴静置步骤中，水浴温度为50-60℃，静置时间为0.5-2min；优选的，水浴温度为55℃，静置时间为1min。
7.一种用于蚊虫的RNAi组合物，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的用于蚊虫的RNAi纳米颗粒。
8.根据权利要求7所述的用于蚊虫的RNAi组合物，其特征在于，还包括蚊虫饲料和介孔二氧化硅；优选的，所述的用于蚊虫的RNAi组合物中用于蚊虫的RNAi纳米颗粒、蚊虫饲料和介孔二氧化硅的质量比1:1：(0.02-0.1)；优选的，所述的用于蚊虫的RNAi组合物的制备方法如下：用于蚊虫的RNAi纳米颗粒、蚊虫饲料和介孔二氧化硅按比例混合，加水混匀，随后以等体积琼脂重悬，即得。
9.根据权利要求8所述的用于蚊虫的RNAi组合物，其特征在于，所述介孔二氧化硅孔径为3-8nm，粒径为20-50nm。
10.权利要求1-5任一项所述的用于蚊虫的RNAi纳米颗粒或权利要求7-9任一项所述的用于蚊虫的RNAi组合物在蚊虫研究中的用途；优选的，将所述的用于蚊虫的RNAi纳米颗粒或所述的用于蚊虫的RNAi组合物饲喂所述的蚊虫。
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