CN113403298B - 一种游离酶的固定化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种游离酶的固定化方法，该方法首次采用微乳液悬浮技术，将游离酶原位吸附于共价改性的无机载体上，有效解决了游离酶在催化过程中不易分离，传统固定化酶结构稳定性差和酶的单位利用效率较低等缺点。所得固定酶的装载量高达200mg/g，酶的尺寸为纳米级，平均直径为3.5～6.5nm且分散均一，无团聚现象。此外，该工艺无需苛刻的制备环境，酶活性保持率可达100％，机械损失率小于0.05％。该方法适用于合成用于催化大分子、小分子的酶，具有普适性。
Description
技术领域
本发明属于化学合成技术领域，具体涉及一种游离酶的固定化方法。
背景技术
固定化酶技术指经物理或化学方法处理后，使酶变成不易溶于水，且具有活性的酶制剂。与游离酶相比，固定化酶的优点有：第一，有效地提高酶的催化性能和操作稳定性，并降低其成本。第二，固定化酶比游离酶更利于产品的分离纯化，在pH耐受性，底物选择性，热稳定性和回收使用性等方面表现出优越的性能。
传统的酶固定化方法主要包括以下几类：吸附法、化学交联法、包埋法和共价结合法。吸附法主要利用载体对酶的吸附作用进行固定化，这种固定化方式不会影响酶的活性结构，但因吸附作用力较弱，固定化酶不具有较好的机械强度，且所得酶容易团聚；共价结合法是利用酶结构中的一些基团与载体上的有机基团通过共价结合将游离酶固定在载体上，该法操作复杂，条件苛刻，且制备所得酶尺寸较大，通常为微米以上；专利CN102286452A公开了一种利益载体上的叠氮基易与酶上的氨基发生置换反应从而达到固定作用的方法，虽不会影响酶的活性及选择性，但其装载量过小，单位生产成本较高；化学交联法则通过多功能试剂实现酶蛋白分子内或分子间的交联，该方法价格昂贵，固定化过程通常会使得酶活性下降；包埋法是将游离酶包埋于高分子聚合物的细微凝胶网格内，通常只适用于一些作用于小分子底物的酶，不具普适性，且制备所得酶尺寸随高分子材料尺寸的变化而变化，颗粒不均一。
随着纳米科技的发展，微乳液悬浮技术成为调节物质大小、形貌，制备高分散、1-10nm级别的颗粒重要手段。微乳体系是指由油、水、表面活性剂和助剂按照一定比例自发形成的热力学稳定的高度分散体系，具有超低的界面张力，稳定的热力学特性。如何利用微乳液悬浮技术制备出一种稳定性好、分散性好、不易团聚的颗粒酶的固定化方法，具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种游离酶的固定化方法，该方法采用微乳液悬浮技术，将游离酶原位吸附于改性的无机非金属载体上，有效解决了游离酶在催化过程中不易分离，传统固定化酶结构稳定性差的问题，所得固定化酶具有均一的纳米尺寸，粒径分布窄，无任何团聚效应。操作简单且工艺温和，不会产生高温环境，对酶活性无影响，固定化酶的装载量较高，制作成本低廉，该方法适用于合成用于催化大分子、小分子的酶，具有普适性。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
本发明提供一种游离酶的固定化方法，包括以下步骤：
(1)将油相、水相和表面活性剂混合配制两份微乳液；
(2)将游离酶、金属盐一加入到缓冲液中，然后将缓冲液加入到其中一份微乳液中形成溶液一；
(3)将金属盐二溶液、改性剂加入到另一份微乳液中，混合均匀，形成溶液二；
(4)将溶液二加入到溶液一中，搅拌破乳，分离得到固定化酶。
所述油相为不溶于水相的有机溶剂，优选环己烷、正己烷、石油醚、甲苯、苯、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷等有机溶剂中的一种或多种，优选非极性溶剂与极性溶剂的混合物，非极性溶剂优选正己烷，极性溶剂优选乙酸乙酯；所述非极性溶剂与极性溶剂的质量比为0.1:1～10:1，优选0.5:1～5:1。极性溶剂和非极性溶剂的混合物有利于形成O/W的微乳液，从而增加油相的亲水性，减小水油界面的表面张力，提高传质，增加纳米酶的单位形成速率和无机盐的溶解度。
所述水相为去离子水，所述水相溶液中还可含有甲醇、乙醇、硫酸、无机盐等。
所述表面活性剂为离子型表面活性剂，如十六烷基三甲基溴化铵、乙二醇辛基苯基醚、十二烷基氨基丙酸、烷基二甲基甜菜碱、十二烷基苯磺酸钠、聚乙烯基吡咯烷酮等，优选十二烷基氨基丙酸。
所述油相、表面活性剂与水相的质量比为0.5～50：1：0.5～50，优选1～10：1：1～10。
所述缓冲液为分散和保护颗粒酶的无机溶剂，可选用磷酸盐溶液，所述的磷酸盐优选磷酸氢钠、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、磷酸钠、磷酸钾等中的一种或多种，优选磷酸氢钠；所述缓冲液中磷酸盐的浓度为0.01mol/L～5.0mol/L，优选0.2mol/L～1.8mol/L。所述缓冲液的加入量为：每克游离酶中加入的缓冲液的体积为1～50mL，优选5～10mL。
所述游离酶为常见具有催化活性的酶，包括但不限于脂肪酶、氧化酶和水解酶，如Chirazymel-2脂肪酶、皱褶假丝酵母脂肪酶、Novo435脂肪酶、CALB脂肪酶、RMIM脂肪酶、核甘磷酯化酶，古洛糖酸内酯氧化酶、黑曲霉β-葡萄糖苷酶、过氧化氢酶中的一种或多种，优选CALB脂肪酶。所述步骤(2)中，游离酶与金属盐一的质量比为1:0.1～1:10，优选1:1～1:5。步骤(2)中，游离酶与其加入的微乳液质量比为1：10～50，优选1：20～30。
所述步骤(2)中的金属盐一和步骤(3)中的金属盐二混合后可以形成沉淀物，所述的沉淀物为金属的氢氧化物或不溶性盐，包括碱土金属的氢氧化物或不溶性盐，如氢氧化钙、氢氧化镁、碳酸钙、硫酸钡、碳酸钡等，过渡金属的不溶性盐，如氯化银等，优选碱金属的不溶性盐。
本发明步骤(2)中所述金属盐一为常见的无机金属盐类化合物，如硫酸钠、氯化钡、碳酸钾、氯化钠、氯化钙、碳酸钠、硝酸银、磷酸锌等。
本发明步骤(3)中所述另一金属盐二为能与上述(2)中金属盐形成沉淀物的金属盐，如硫酸钠、碳酸钠、硫酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾等，其金属盐水溶液的质量百分数为1～70wt％，优选10～50wt％。所述步骤(2)中金属盐一与步骤(3)中金属盐二的摩尔比为1:50～50:1，优选1:10～10:1，进一步优选1：4-4：1。通常情况下，两种金属盐的加入量按二者完全反应的理论摩尔量加入，其中一般优选可形成沉淀的阳离子完全反应，形成沉淀的阴离子可过量。所述步骤(3)中金属盐二的加入量与微乳液质量比为1：20～50，优选1：25～30。
优选的，步骤(2)的微乳液的质量及组成与步骤(3)的微乳液的质量和组成相同。
优选的，所述步骤(3)中所述改性剂为含胺基的化合物，如伯胺：甲胺、乙胺、苯甲胺和苯胺；仲胺：乙二胺、甲乙胺、N-甲基苯胺；叔胺：三丙胺、N，N-二甲基苯胺、三苯胺，三乙胺等；优选三乙胺。所述改性剂加入可使载体上含有胺基，能强化酶中的羧基与载体上胺基的反应吸附作用，从而增加有机酶与无机载体间的结合强度。优选的，所述游离酶的加入量与改性剂的质量比为1：1～50，优选1：1～10，更优选1：1～5。
进一步的，所述步骤(4)中两种溶液的混合温度为0～100℃，优选10～30℃，相对较低的温度有利于酶的稳定存储，并降低无机盐沉淀物的形成速率，使游离酶在水油相界面随着沉淀物的析出而吸附其表面，从而控制成核尺寸。优选的，所述溶液二采用滴加的方式加入到溶液一中，滴加时间为1～10h，优选2～6h。所述搅拌破乳的转速为500～5000rpm，优选1000～2000rpm。
本发明由于采用了以上技术方案，具有显著的技术效果：
第一，本申请采用微乳液悬浮技术合成的固定化酶可制备出纳米级固定化酶，分散性好，解决了酶在反应液体系容易团聚的问题，酶的单位利用率显著提高，从而降低了生产成本；所得固定酶的装载量可高达200mg/g，酶的尺寸为纳米级，平均直径可小于10nm，且分散均一，无团聚现象。
第二，该工艺无需苛刻的制备环境，可以有效地克服某些高温制备过程中的不可避免的晶形转变、分解、挥发等问题，所得颗粒纯度高，酶活性保持率高达100％，采用本发明方法制备的酶稳定性高，机械损失率低。
第三，本发明方法合成的固定化酶可以用于催化大分子底物、小分子底物，具有普适性。
附图说明
图1为实施例1制备的脂肪酶的电镜图。
具体实施方式
实施例1：
(1)25℃下配制两份相同的微乳液，每份微乳液的组成为：100g正己烷/乙酸乙酯(正己烷33.3g，乙酸乙酯66.7g)，100g十二烷基氨基丙酸和100g去离子水。
(2)称取10g CALB脂肪酶干粉，向其中加入50mL，0.2mol/L磷酸氢钠缓冲液，再向其中加入10g氯化钡粉末，搅拌均匀后得到白色乳液。将所得白色乳液加入至步骤(1)中制备的其中一份微乳液中，搅拌状态下待用，记为微乳液混合液一。
(3)配制100g质量分数为10wt％的硫酸钠水溶液，加入至上述微乳液二中，再向其中加入10g三乙胺，搅拌混合后待用，记为微乳液混合液二。
(4)10℃下将步骤(3)的微乳液混合液二滴加入至步骤(2)的微乳液混合液一中，控制滴加时间为2h，滴加结束后以高转速1000rpm进行破乳化，离心分离后将所得纳米颗粒酶记为M-CALB@BaSO4。
(5)测定所得固定化酶的尺寸大小和装载量。以高分辨透射电子显微镜统计酶的平均直径为3.52nm，并取一定质量的所得固定化酶在40HZ的超声仪中超声24h后，称取固体前后质量变化，测定机械损失率，并测定超声前后酶活性的变化。固定酶的装载量高达200mg/g，超声前酶活性为50.1U/g，超声后酶活性为50.1U/g，酶的活性保持率高达100％，机械损失率仅为0.01％。
实施例2
(1)25℃下配制两份相同的微乳液，每份微乳液的组成为：100g正己烷/乙酸乙酯(正己烷50.0g，乙酸乙酯50.0g)，50g十二烷基氨基丙酸和100g去离子水。
(2)称取10g CALB脂肪酶干粉，向其中加入60mL，0.4mol/L磷酸氢钠缓冲液，再向其中加入20g氯化钡粉末，搅拌均匀后得到白色乳液。将所得白色乳液加入至步骤(1)中制备的其中一份微乳液中，搅拌状态下待用，记为微乳液混合液一。
(3)配制100g质量分数为12wt％的硫酸钠水溶液，加入至上述微乳液二中，再向其中加入20g三乙胺，搅拌混合后待用，记为微乳液混合液二。
(4)15℃下将步骤(3)的微乳液混合液二滴加入至步骤(2)的微乳液混合液一中，控制滴加时间为2.5h，滴加结束后以高转速1200rpm进行破乳化，离心分离后将所得纳米颗粒酶记为M-CALB@BaSO4。
(5)测定所得固定化酶的尺寸大小和装载量。以高分辨透射电子显微镜统计酶的平均直径为4.59nm，并取一定质量的所得固定化酶在40HZ的超声仪中超声24h后，称取固体前后质量变化，测定机械损失率，并测定超声前后酶活性的变化。固定酶的装载量高达190mg/g，超声前酶活性为50.1U/g，超声后酶活性为48.0U/g，酶的活性保持率高达95.8％，机械损失率仅为0.03％。
实施例3：
(1)25℃下配制两份相同的微乳液，每份微乳液的组成为：100g正己烷，100g十二烷基氨基丙酸和100g去离子水。
(2)称取10g CALB脂肪酶干粉，向其中加入50mL，0.2mol/L磷酸氢钠缓冲液，再向其中加入10g氯化钡粉末，搅拌均匀后得到白色乳液。将所得白色乳液加入至步骤(1)中制备的其中一份微乳液中，搅拌状态下待用，记为微乳液混合液一。
(3)配制100g质量分数为10wt％的硫酸钠水溶液，加入至上述微乳液二中，再向其中加入10乙二胺，搅拌混合后待用，记为微乳液混合液二。
(4)10℃下将步骤(3)的微乳液混合液二滴加入至步骤(2)的微乳液混合液一中，控制滴加时间为2h，滴加结束后以高转速1000rpm进行破乳化，离心分离后将所得纳米颗粒酶记为M-CALB@BaSO4。
(5)测定所得固定化酶的尺寸大小和装载量。以高分辨透射电子显微镜统计酶的平均直径为5.98nm，并取一定质量的所得固定化酶在40HZ的超声仪中超声24h后，称取固体前后质量变化，测定机械损失率，并测定超声前后酶活性的变化。固定酶的装载量高达198mg/g，超声前酶活性为48.6U/g，超声后酶活性为46.2U/g，酶的活性保持率高达95.1％，机械损失率为0.04％。
实施例4：
(1)25℃下配制两份相同的微乳液，每份微乳液的组成为：100g环己烷/丙酮(环己烷33.3g，丙酮66.7g)，100g十二烷基氨基丙酸和100g去离子水。
(2)称取10g古洛糖酸内酯氧化酶干粉，向其中加入50mL，0.2mol/L磷酸氢钠缓冲液，再向其中加入10g氯化钡粉末，搅拌均匀后得到白色乳液。将所得白色乳液加入至步骤(1)中制备的其中一份微乳液中，搅拌状态下待用，记为微乳液混合液一。
(3)配制100g质量分数为10wt％的硫酸钠水溶液，加入至上述微乳液二中，再向其中加入10g苯胺，搅拌混合后待用，记为微乳液混合液二。
(4)10℃下将步骤(3)的微乳液混合液二滴加入至步骤(2)的微乳液混合液一中，控制滴加时间为2h，滴加结束后以高转速1000rpm进行破乳化，离心分离后得到纳米颗粒酶。
(5)测定所得固定化酶的尺寸大小和装载量。以高分辨透射电子显微镜统计酶的平均直径为4.33nm，并取一定质量的所得固定化酶在40HZ的超声仪中超声24h后，称取固体前后质量变化，测定机械损失率，并测定超声前后酶活性的变化。固定酶的装载量高达200mg/g，超声前酶活性为47.9U/g，超声后酶活性为44.5U/g，酶的活性保持率高达92.9％，机械损失率为0.03％。
实施例5：
(1)25℃下配制两份相同的微乳液，每份微乳液的组成为：100g正己烷/乙酸乙酯(正己烷33.3g，乙酸乙酯66.7g)，100g十二烷基氨基丙酸和100g去离子水。
(2)称取10g黑曲霉β-葡萄糖苷酶干粉，向其中加入50mL，0.2mol/L磷酸氢钠缓冲液，再向其中加入10g氯化钡粉末，搅拌均匀后得到白色乳液。将所得白色乳液加入至步骤(1)中制备的其中一份微乳液中，搅拌状态下待用，记为微乳液混合液一。
(3)配制100g质量分数为10wt％的硫酸钠水溶液，加入至上述微乳液二中，再向其中加入10g甲胺，搅拌混合后待用，记为微乳液混合液二。
(4)10℃下将步骤(3)的微乳液混合液二滴加入至步骤(2)的微乳液混合液一中，控制滴加时间为2h，滴加结束后以高转速1000rpm进行破乳化，离心分离后将所得纳米颗粒酶记为黑曲霉β-葡萄糖苷酶@BaSO4。
(5)测定所得固定化酶的尺寸大小和装载量。以高分辨透射电子显微镜统计酶的平均直径为5.74nm，并取一定质量的所得固定化酶在40HZ的超声仪中超声24h后，称取固体前后质量变化，测定机械损失率，并测定超声前后酶活性的变化。固定酶的装载量高达192mg/g，超声前酶活性为44.4U/g，超声后酶活性为42.3U/g，酶的活性保持率为95.3％，机械损失率为0.02％。
实施例6
(1)25℃下配制两份相同的微乳液，每份微乳液的组成为：100g正己烷/乙酸乙酯(正己烷83.3g，乙酸乙酯16.7g)，10g十二烷基氨基丙酸和100g去离子水。
(2)称取10g CALB脂肪酶干粉，向其中加入100mL，1.8mol/L磷酸氢钠缓冲液，再向其中加入50g氯化钡粉末，搅拌均匀后得到白色乳液。将所得白色乳液加入至步骤(1)中制备的其中一份微乳液中，搅拌状态下待用，记为微乳液混合液一。
(3)配制100g质量分数为50wt％的硫酸钠水溶液，加入至上述微乳液二中，再向其中加入100g三乙胺，搅拌混合后待用，记为微乳液混合液二。
(4)15℃下将步骤(3)的微乳液混合液二滴加入至步骤(2)的微乳液混合液一中，控制滴加时间为6.0h，滴加结束后以高转速2000rpm进行破乳化，离心分离后将所得纳米颗粒酶记为M-CALB@BaSO4。
(5)测定所得固定化酶的尺寸大小和装载量。以高分辨透射电子显微镜统计酶的平均直径为6.35nm，并取一定质量的所得固定化酶在40HZ的超声仪中超声24h后，称取固体前后质量变化，测定机械损失率，并测定超声前后酶活性的变化。固定酶的装载量高达180mg/g，超声前酶活性为47.6U/g，超声后酶活性为45.4U/g，酶的活性保持率高达95.74％，机械损失率仅为0.047％。
实施例7：
(1)25℃下配制两份相同的微乳液，每份微乳液的组成为：100g正己烷/乙酸乙酯(正己烷33.3g，乙酸乙酯66.7g)，100g十二烷基氨基丙酸和100g去离子水。
(2)称取10g CALB脂肪酶干粉，向其中加入50mL，0.2mol/L磷酸氢钠缓冲液，再向其中加入10g氯化镁粉末，搅拌均匀后得到白色乳液。将所得白色乳液加入至步骤(1)中制备的其中一份微乳液中，搅拌状态下待用，记为微乳液混合液一。
(3)配制100g质量分数为10wt％的氢氧化钠水溶液，加入至上述微乳液二中，再向其中加入10g三乙胺，搅拌混合后待用，记为微乳液混合液二。
(4)10℃下将步骤(3)的微乳液混合液二滴加入至步骤(2)的微乳液混合液一中，控制滴加时间为2h，滴加结束后以高转速1000rpm进行破乳化，离心分离后将所得纳米颗粒酶记为M-CALB@Mg(OH)2。
(5)测定所得固定化酶的尺寸大小和装载量。以高分辨透射电子显微镜统计酶的平均直径为3.98nm，并取一定质量的所得固定化酶在40HZ的超声仪中超声24h后，称取固体前后质量变化，测定机械损失率，并测定超声前后酶活性的变化。固定酶的装载量高达200mg/g，超声前酶活性为49.3U/g，超声后酶活性为47.1U/g，酶的活性保持率为95.5％，机械损失率仅为0.04％。
实施例8：
(1)25℃下配制两份相同的微乳液，每份微乳液的组成为：100g正己烷/乙酸乙酯(正己烷33.3g，乙酸乙酯66.7g)，100g十二烷基氨基丙酸和100g去离子水。
(2)称取10gChirazymel-2脂肪酶干粉，向其中加入50mL，0.2mol/L磷酸氢钠缓冲液，再向其中加入10g硝酸银，搅拌均匀后得到白色乳液。将所得白色乳液加入至步骤(1)中制备的其中一份微乳液中，搅拌状态下待用，记为微乳液混合液一。
(3)配制100g质量分数为10wt％的氯化钠水溶液，加入至上述微乳液二中，再向其中加入10g三乙胺，搅拌混合后待用，记为微乳液混合液二。
(4)10℃下将步骤(3)的微乳液混合液二滴加入至步骤(2)的微乳液混合液一中，控制滴加时间为2h，滴加结束后以高转速1000rpm进行破乳化，离心分离后将所得纳米颗粒酶记为M-Chirazymel@AgCl。
(5)测定所得固定化酶的尺寸大小和装载量。以高分辨透射电子显微镜统计酶的平均直径为4.42nm，并取一定质量的所得固定化酶在40HZ的超声仪中超声24h后，称取固体前后质量变化，测定机械损失率，并测定超声前后酶活性的变化。固定酶的装载量高达201mg/g，超声前酶活性为50.0U/g，超声后酶活性为49.3U/g，酶的活性保持率为98.6％，机械损失率为0.03％。
实施例9
(1)25℃下配制两份相同的微乳液，每份微乳液的组成为：100g正己烷/乙酸乙酯(正己烷80.0g，甲苯20.0g)，100g十二烷基氨基丙酸和100g去离子水。
(2)称取10g CALB脂肪酶干粉，向其中加入50mL，0.2mol/L磷酸氢钠缓冲液，再向其中加入10g氯化钙粉末，搅拌均匀后得到白色乳液。将所得白色乳液加入至步骤(1)中制备的其中一份微乳液中，搅拌状态下待用，记为微乳液混合液一。
(3)配制100g质量分数为10wt％的碳酸钠水溶液，加入至上述微乳液二中，再向其中加入10g三乙胺，搅拌混合后待用，记为微乳液混合液二。
(4)10℃下将步骤(3)的微乳液混合液二滴加入至步骤(2)的微乳液混合液一中，控制滴加时间为2h，滴加结束后以高转速1000rpm进行破乳化，离心分离后将所得纳米颗粒酶记为M-CALB@CaCO3。
(5)测定所得固定化酶的尺寸大小和装载量。以高分辨透射电子显微镜统计酶的平均直径为5.54nm，并取一定质量的所得固定化酶在40HZ的超声仪中超声24h后，称取固体前后质量变化，测定机械损失率，并测定超声前后酶活性的变化。固定酶的装载量高达178mg/g，超声前酶活性为49.5U/g，超声后酶活性为46.5U/g，酶的活性保持率高达93.9％，机械损失率仅为0.025％。
对比例1：
(1)25℃下配制两份相同的微乳液，每份微乳液的组成为：100g正己烷/乙酸乙酯(正己烷33.3g，乙酸乙酯66.7g)，100g十二烷基氨基丙酸和100g去离子水。
(2)称取10g CALB脂肪酶干粉，向其中加入50mL，0.2mol/L磷酸氢钠缓冲液，再向其中加入10g氯化钡粉末，搅拌均匀后得到白色乳液。将所得白色乳液加入至步骤(1)中制备的其中一份微乳液中，搅拌状态下待用，记为微乳液混合液一。
(3)配制100g质量分数为10wt％的硫酸钠水溶液，加入至上述微乳液二中，搅拌混合后待用，记为微乳液混合液二。
(4)10℃下将步骤(3)的微乳液混合液二滴加入至步骤(2)的微乳液混合液一中，控制滴加时间为2h，滴加结束后以高转速1000rpm进行破乳化，离心分离后将所得纳米颗粒酶记为M-CALB@BaSO4。
(5)测定所得固定化酶的尺寸大小和装载量。以高分辨透射电子显微镜统计酶的平均直径为10.70nm，并取一定质量的所得固定化酶在40HZ的超声仪中超声24h后，称取固体前后质量变化，测定机械损失率，并测定超声前后酶活性的变化。固定酶的装载量为126mg/g，超声前酶活性为40.1U/g，超声后酶活性为33.5U/g，酶的活性保持率高达83.54％，机械损失率为0.12％。
由对比例1可知，在微乳液体系中未加入胺基改性剂，所得固定化酶的平均粒径增大，有机酶与无机载体的吸附结合能力减弱，导致酶的活性保持率下降，机械损失率增加。
对比例2：
(1)25℃下配制两份相同的均相有机液，每份溶液组成为：100g正己烷/乙酸乙酯(正己烷33.3g，乙酸乙酯66.7g)，100g十二烷基氨基丙酸和100g正己烷。
(2)称取10g CALB脂肪酶干粉，向其中加入50mL，0.2mol/L磷酸氢钠缓冲液，再向其中加入10g氯化钡粉末，搅拌均匀后得到白色乳液。将所得白色乳液加入至步骤(1)中制备的其中一份溶液中，搅拌状态下备用，记为混合液一。
(3)配制100g质量分数为10wt％的硫酸钠水溶液，加入至上述溶液二中，搅拌混合后待用，记为混合液二。
(4)10℃下将步骤(3)的混合液二滴加入至步骤(2)的混合液一中，控制滴加时间为2h，滴加结束后以高转速1000rpm进行破乳化，离心分离后将所得纳米颗粒酶记为M-CALB@BaSO4。
(5)测定所得固定化酶的尺寸大小和装载量。以高分辨透射电子显微镜统计酶的平均直径为10.85μm，颗粒有团聚，并取一定质量的所得固定化酶在40HZ的超声仪中超声24h后，称取固体前后质量变化，测定机械损失率，并测定超声前后酶活性的变化。固定酶的装载量高达84.6mg/g，超声前酶活性为35.6U/g，超声后酶活性为29.5U/g，酶的活性保持率高达82.8％，机械损失率为1.23％。
对比例2可知，在无微乳液体系下所得固定化酶的平均粒径增大，尺寸由纳米级变化为微米级，因颗粒团聚严重，导致固定化后酶于无机载体上的负载量大幅度减小，导致酶的机械损失率增加。
Claims (33)
1.一种游离酶的固定化方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将油相、水相和表面活性剂混合配制两份微乳液；
（2）将游离酶、金属盐一加入到缓冲液中，然后将缓冲液加入到其中一份微乳液中形成溶液一；
（3）将金属盐二溶液、改性剂加入到另一份微乳液中，混合均匀，形成溶液二；
（4）将溶液二加入到溶液一中，搅拌破乳，分离得到固定化酶；
所述步骤（2）中的金属盐一和步骤（3）中的金属盐二混合后可以形成沉淀物；
所述的沉淀物为碱土金属的氢氧化物或不溶性盐、过渡金属的不溶性盐；
所述步骤（3）中所述改性剂为甲胺、苯胺、乙二胺或三乙胺；
所述油相为环己烷、正己烷、丙酮、乙酸乙酯中的一种或多种；
所述游离酶为脂肪酶、氧化酶和水解酶。
2.根据权利要求1所述的游离酶的固定化方法，其特征在于，所述油相为非极性溶剂与极性溶剂的混合物，非极性溶剂为正己烷，极性溶剂为乙酸乙酯。
3.根据权利要求2所述的游离酶的固定化方法，其特征在于，所述非极性溶剂与极性溶剂的质量比为0.1:1~10:1。
4.根据权利要求3所述的游离酶的固定化方法，其特征在于，所述非极性溶剂与极性溶剂的质量比为0.5:1~5:1。
5.根据权利要求1所述的游离酶的固定化方法，其特征在于，所述表面活性剂为离子型表面活性剂，选自十六烷基三甲基溴化铵、乙二醇辛基苯基醚、十二烷基氨基丙酸、烷基二甲基甜菜碱、十二烷基苯磺酸钠、聚乙烯基吡咯烷酮。
6.根据权利要求1所述的游离酶的固定化方法，其特征在于，所述油相、表面活性剂与水相的质量比为0.5~50：1：0.5~50。
7.根据权利要求6所述的游离酶的固定化方法，其特征在于，所述油相、表面活性剂与水相的质量比为1~10：1：1~10。
8.根据权利要求1所述的游离酶的固定化方法，其特征在于，所述缓冲液为磷酸盐溶液，所述的磷酸盐选自磷酸氢钠、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、磷酸钠、磷酸钾中的一种或多种。
9.根据权利要求1所述的游离酶的固定化方法，其特征在于，所述缓冲液的加入量为：每克游离酶中加入的缓冲液的体积为1～50mL。
10.根据权利要求9所述的游离酶的固定化方法，其特征在于，所述缓冲液的加入量为：每克游离酶中加入的缓冲液的体积为5～10mL。
11.根据权利要求1所述的游离酶的固定化方法，其特征在于，所述游离酶为Chirazymel-2脂肪酶、皱褶假丝酵母脂肪酶、Novo435脂肪酶、CALB脂肪酶、RMIM脂肪酶、核甘磷酯化酶、古洛糖酸内酯氧化酶、黑曲霉β-葡萄糖苷酶、过氧化氢酶中的一种或多种。
12.根据权利要求11所述的游离酶的固定化方法，其特征在于，所述游离酶为CALB脂肪酶。
13.根据权利要求1所述的游离酶的固定化方法，其特征在于，所述步骤（2）中，游离酶与金属盐一的质量比为1:0.1~1:10。
14.根据权利要求13所述的游离酶的固定化方法，其特征在于，所述步骤（2）中，游离酶与金属盐一的质量比为1:1~1:5。
15.根据权利要求1所述的游离酶的固定化方法，其特征在于，步骤（2）中，游离酶与其加入的微乳液质量比为1：10~50。
16.根据权利要求15所述的游离酶的固定化方法，其特征在于，步骤（2）中，游离酶与其加入的微乳液质量比为1：20~30。
17.根据权利要求1所述的游离酶的固定化方法，其特征在于，所述的沉淀物为氢氧化钙、氢氧化镁、碳酸钙、碳酸钡、硫酸钡、氯化银。
18.根据权利要求1所述的游离酶的固定化方法，其特征在于，所述步骤（2）中金属盐一与步骤（3）中金属盐二的摩尔比为1:50~50:1。
19.根据权利要求18所述的游离酶的固定化方法，其特征在于，所述步骤（2）中金属盐一与步骤（3）中金属盐二的摩尔比为1:10~10:1。
20.根据权利要求19所述的游离酶的固定化方法，其特征在于，所述步骤（2）中金属盐一与步骤（3）中金属盐二的摩尔比为1：4~4：1。
21.根据权利要求1所述的游离酶的固定化方法，其特征在于，所述步骤（3）中金属盐二的加入量与微乳液质量比为1：20~50。
22.根据权利要求21所述的游离酶的固定化方法，其特征在于，所述步骤（3）中金属盐二的加入量与微乳液质量比为1：25~30。
23.根据权利要求1所述的游离酶的固定化方法，其特征在于，步骤（2）的微乳液的质量及组成与步骤（3）的微乳液的质量和组成相同。
24.根据权利要求1所述的游离酶的固定化方法，其特征在于，所述改性剂为三乙胺。
25.根据权利要求1所述的游离酶的固定化方法，其特征在于，所述游离酶的加入量与改性剂的质量比为1：1~50。
26.根据权利要求25所述的游离酶的固定化方法，其特征在于，所述游离酶的加入量与改性剂的质量比为1：1~10。
27.根据权利要求26所述的游离酶的固定化方法，其特征在于，所述游离酶的加入量与改性剂的质量比为1：1~5。
28.根据权利要求1所述的游离酶的固定化方法，其特征在于，所述步骤（4）中两种溶液的混合温度为0~100℃。
29.根据权利要求28所述的游离酶的固定化方法，其特征在于，所述步骤（4）中两种溶液的混合温度为10~30℃。
30.根据权利要求1所述的游离酶的固定化方法，其特征在于，所述溶液二采用滴加的方式加入到溶液一中，滴加时间为1~10h。
31.根据权利要求30所述的游离酶的固定化方法，其特征在于，所述溶液二采用滴加的方式加入到溶液一中，滴加时间为2~6h。
32.根据权利要求1所述的游离酶的固定化方法，其特征在于，所述搅拌破乳的转速为500~5000rpm。
33.根据权利要求32所述的游离酶的固定化方法，其特征在于，所述搅拌破乳的转速为1000~2000rpm。
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