CN113041397A - 一种含有交联葡聚糖的面部填充剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医疗脂肪移植技术领域，尤其涉及一种含有脂肪干细胞的面部填充剂及其制备方法，本发明的面部填充剂包括的组分及各组分的重量份数为：交联葡聚糖20‑180份，脂肪干细胞5‑120份，聚甲基丙烯酸甲酯1‑50份，注射用生理盐水10‑150份。本发明的有益效果是：该面部填充剂使用交联葡聚糖作为主填充材料，可保证脂肪干细胞的成活率，诱导脂肪干细胞成脂分化，组织相容性更好，维持时间更长，效果更自然，术后反应轻微，可达到持久的填充效果。

Description

一种含有交联葡聚糖的面部填充剂及其制备方法
技术领域
本发明属于医疗脂肪移植技术领域，尤其涉及一种含有交联葡聚糖的面部填充剂及其制备方法。
背景技术
随着人民物质生活水平的提高，越来越多的人选择使用面部注射填充的方法进行面部特征重塑。目前一般使用自体脂肪填充和脂肪干细胞填充两种方式。自体脂肪填充的自体脂肪是从人体自身某些部位吸取多余的皮下脂肪细胞，然后经过吸出的混合物经净化处理、注入药物得到的复合脂肪颗粒，选择完整的颗粒脂肪细胞通过注射的方式再移植到自己需要进行脂肪填充的部位。自体脂肪填充因其供区损伤小、易于获得、组织相容性好、移植后无排斥反应且感染几率小、移植成活后修复区域形态自然无异物感被广泛应用于面部填充手术，但脂肪填充容易出现脂肪结节、脂肪液化、矫正过度或矫正不足、脂肪栓塞、脂肪生存率低等缺点，脂肪多少能留下来多少能吸收对手术效果起到关键性作用，因此脂肪干细胞填充技术随之被更多消费者喜爱。移植后的脂肪干细胞填充能力强、具有局部血液重建能力、乏氧耐受能力强、可生成VEGF等细胞因子诱导血管分化，并加速受区的创面愈合。但移植后脂肪干细胞的分化方向并不受控制，且成活率较低，无法成活的脂肪有一部分会随着代谢排出体外，剩余的有可能发生液化，患者的皮肤会凹陷，还有可能有流液、流脓并会感到疼痛、局部红肿。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提供一种含有交联葡聚糖的面部填充剂及其制备方法，该面部填充剂使用交联葡聚糖作为主填充材料，可保证脂肪干细胞的成活率，诱导脂肪干细胞成脂分化，组织相容性更好，维持时间更长，效果更自然，术后反应轻微，可达到持久的填充效果。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种含有交联葡聚糖的面部填充剂，包括交联葡聚糖、脂肪干细胞、聚甲基丙烯酸甲酯、注射用生理盐水。
优选地，本发明的面部填充剂包括的组分及各组分的重量份数为：交联葡聚糖20-180份，脂肪干细胞5-120份，聚甲基丙烯酸甲酯1-50份，注射用生理盐水10-150份。
优选地，交联葡聚糖的分子量为1万-500万。
优选地，注射用生理盐水的浓度为0.8wt％～1.0wt％。
优选地，脂肪干细胞为自体脂肪干细胞。
本发明还提供了一种含有交联葡聚糖的面部填充剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)、将交联葡聚糖加入其体积100-1000倍的超纯水中，搅拌1～3h，灭菌得到交联葡聚糖与超纯水的混合物，将混合物中的超纯水滤净得到处理后的交联葡聚糖；
(2)、使用与步骤(1)中超纯水等体积的注射用生理盐水反复浸润处理后的交联葡聚糖，调节渗透压与人体相近，然后将注射用生理盐水滤净得到处理后的交联葡聚糖；
(3)、将通过注射器吸出来的脂肪液连同注射器放入注射用生理盐水中直立静置，此时，混合液分为三层，上层为橘红色的脂肪液体，中间层为淡黄色脂肪颗粒，下层为粉红色的肿胀液和血液混合物；
(4)、将混合物取出并排去底层液体，把中、上两层的脂肪液及脂肪颗粒转移至离心管内，放入离心机离心，离心后呈现上下两层，上层为淡黄色脂肪颗粒，下层为淡红色肿胀液，移除下层液体，得到纯脂肪颗粒；
(5)、将获得的纯脂肪颗粒通过物理方法完全乳糜粉碎，然后加入10-100倍脂肪体积、浓度0.1-10wt％的胶原酶溶液，并加入10倍脂肪体积的注射用生理盐水搅拌，充分振荡离心管使胶原酶与脂肪混匀后，放入培养箱中消化，期间每10min取出摇匀一次；
(6)、在消化后的脂肪细胞中加入脂肪细胞100倍体积的注射用生理盐水后用滤网过滤，并放入离心机中离心，留沉淀细胞，此步骤重复三次，得到脂肪干细胞；
(7)、将20-180份得到的处理后的交联葡聚糖、5-120份脂肪干细胞、1-50份聚甲基丙烯酸甲酯和10-150份注射用生理盐水混合均匀后即得到面部填充剂。
优选地，所述步骤(4)的离心条件为4℃，1200r/min，5min。
优选地，所述步骤(6)的离心条件为4℃，1200r/min，5min。
优选地，所述步骤(1)的灭菌条件为：120℃，20min。
优选地，整个制备过程全程应保证无菌环境。
优选地，所述步骤(5)中培养箱的温度为36-39℃，消化时间3h。
本发明的有益效果为：
相较于现有技术，本发明的面部填充剂可提高脂肪干细胞的成活率，诱导脂肪干细胞成脂分化，组织相容性更好，维持时间更长，效果更自然，术后反应轻微，可达到持久的填充效果。
首先，交联葡聚糖作为主要填充材料，组织相容性好，无细胞毒性，可被完全降解，材料性质柔软，触感与人体类似，微球状结构保证手术风险低；
其次，脂肪干细胞具有更新及增殖能力及成脂分化潜能，可产生多种细胞因子，组织相容性好，分离简单，患者易于接受，保证填充的持久性；
另外，由于交联葡聚糖带有富孔状三维结构，使富有微孔的交联葡聚糖可与组织液充分结合，使脂肪干细胞的生存环境与之前保持一致；交联葡聚糖的化学结构决定了相较于其他种类的材料，其组织相容性更好，因此交联葡聚糖作为脂肪干细胞的三维立体支架，可显著提高脂肪干细胞成活率，诱导脂肪干细胞增殖，经实验验证，可诱导脂肪干细胞的成脂分化，进而保证填充效果的自然。
附图说明
图1为MTS检测细胞活力图；
图2为qPCR检测LPL表达量图；
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图和实施例对本发明作进一步地详细描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
本实施例的面部填充剂包括50份的交联葡聚糖，30份的自体脂肪干细胞，5份的聚甲基丙烯酸甲酯，15份浓度为0.9wt％的注射用生理盐水。
本实施例的面部填充剂的制备方法包括如下步骤：
(1)、将分子量为80-100万的交联葡聚糖加入100倍交联葡聚糖体积的超纯水中，搅拌1h，120℃，20min灭菌得到交联葡聚糖与超纯水的混合物，将混合物中的超纯水滤净得到处理后的交联葡聚糖；
(2)、使用与步骤(1)中超纯水等体积的注射用生理盐水反复浸润处理后的交联葡聚糖3次，然后将注射用生理盐水滤净得到处理后的交联葡聚糖；
(3)、将通过注射器吸出来的脂肪液连同注射器放入注射用生理盐水中直立静置，此时，混合液分为三层，上层为橘红色的脂肪液体，中间层为淡黄色脂肪颗粒，下层为粉红色的肿胀液和血液混合物；
(4)、将混合物取出并排去底层液体，把中、上两层的脂肪液及脂肪颗粒转移至离心管内，放入离心机离心，离心条件为4℃，1200r/min，5min，离心后呈现上下两层，上层为淡黄色脂肪颗粒，下层为淡红色肿胀液，移除下层液体；
(5)、将获得的纯脂肪颗粒通过注射器抽吸完全乳糜粉碎，然后加入10倍脂肪体积的0.1wt％胶原酶溶液并加入10倍脂肪体积的注射用生理盐水搅拌，充分振荡离心管使胶原酶与脂肪混匀后，放入37℃培养箱中消化3h，期间每10min取出摇匀一次；
(6)、在脂肪细胞中加入脂肪干细胞100倍体积的注射用生理盐水后用滤网过滤，并放入离心机中离心，离心条件为4℃，1200r/min，5min。留沉淀细胞，此步骤重复三次，得到脂肪干细胞；
(7)、将上述处理得到的50份交联葡聚糖、30份脂肪干细胞以及5份聚甲基丙烯酸甲酯和15份注射用生理盐水混合均匀后即得到面部填充剂。
本实施例使用的人脂肪组织来自北京海医悦美医院抽脂手术废弃脂肪组织，材料的获取已经得患者口头同意。
实施例2：
本实施例的面部填充剂包括40份的交联葡聚糖，50份的自体脂肪干细胞，3份的聚甲基丙烯酸甲酯，7份浓度为0.8wt％的注射用生理盐水。
本实施例的面部填充剂的制备方法包括如下步骤：
(1)、将分子量为150-200万的交联葡聚糖加入1000倍交联葡聚糖体积的超纯水中，搅拌3h，120℃，20min灭菌得到交联葡聚糖与超纯水的混合物，将混合物中的超纯水滤净得到处理后的交联葡聚糖；
(2)、使用与步骤(1)中超纯水等体积的注射用生理盐水反复浸润处理后的交联葡聚糖3次，然后将注射用生理盐水滤净得到处理后的交联葡聚糖；
(3)、将通过注射器吸出来的脂肪液连同注射器放入注射用生理盐水中直立静置，此时，混合液分为三层，上层为橘红色的脂肪液体，中间层为淡黄色脂肪颗粒，下层为粉红色的肿胀液和血液混合物；
(4)、将混合物取出并排去底层液体，把中、上两层的脂肪液及脂肪颗粒转移至离心管内，放入离心机离心，离心条件为4℃，1200r/min，5min。离心后呈现上下两层，上层为淡黄色脂肪颗粒，下层为淡红色肿胀液，移除下层液体；
(5)、将获得的纯脂肪颗粒通过注射器抽吸或其他物理方法完全乳糜粉碎，然后加入50倍脂肪体积的0.5wt％胶原酶溶液并加入10倍脂肪体积的注射用生理盐水搅拌，充分振荡离心管使胶原酶与脂肪混匀后，放入38℃培养箱中消化3h，期间每10min取出摇匀一次；
(6)、在消化后的脂肪细胞中加入相对其100倍体积的注射用生理盐水后用滤网过滤，并放入离心机中离心，在4℃，1200r/min离心5min。留沉淀细胞，此步骤重复三次，得到脂肪干细胞；
(7)、将上述处理后得到的40份交联葡聚糖、50份脂肪干细胞以及3份聚甲基丙烯酸甲酯和7份注射用生理盐水混合均匀后即得到面部填充剂。
实施例3：
本实施例的面部填充剂包括20份分子量为50-80万的交联葡聚糖，50份的自体脂肪干细胞，10份的聚甲基丙烯酸甲酯，20份浓度为0.9wt％的注射用生理盐水。其制备方法与实施例2完全相同。
实施例4：
本实施例的面部填充剂包括160份分子量为100-120万的交联葡聚糖，30份的自体脂肪干细胞，20份的聚甲基丙烯酸甲酯，30份浓度为1.0wt％的注射用生理盐水。制备时，除步骤1中，交联葡聚糖加入600倍交联葡聚糖体积的超纯水中，其他步骤与实施例2完全相同。
实施例5：
为了证明交联葡聚糖能增强脂肪干细胞的细胞活力，促使脂肪干细胞成脂分化，设置实验组、对照组1、对照组2进行细胞实验。将50份分子量为300-350万的交联葡聚糖、50份脂肪干细胞混合均匀，在1640+10％FBS中培养72h，作为实验组；将50份粒径为40μm的聚乳酸微球与50份脂肪干细胞混合均匀，在1640+10％FBS中培养72h，作为对照组1；将50份PBS与50份脂肪干细胞混合均匀，以使对照组2中液体量与对照组1和实验组相等，在1640+10％FBS中培养72h，作为对照组2。实验组、对照组1、对照组2培养条件均为37℃，5％二氧化碳。其中交联葡聚糖和脂肪干细胞使用实施例1的方法得到。
将实验组、对照组1、对照组2得到的细胞进行细胞活力检测，直接使用碧云天的MTS试剂盒检测细胞活力，在细胞与实验组或对照组材料共孵育72h后，加入MTS于37℃恒温箱中孵育3h，用酶标仪检测在570nm波长处各孔与活细胞相关的吸光度值(OD值)，计算得到的MTS检测细胞活力图如图1所示，其中纵坐标表示细胞总体活力，从图1可以看出，实验组的细胞活力显著高于对照组1、对照组2。所以，交联葡聚糖共培养的脂肪干细胞具有更强的细胞活力。
将实验组、对照组1、对照组2得到的细胞进行分化基因检测，使用RT-PCR检测成脂特征性基因LPL的表达，实验组对照组细胞培养条件与MTS检测中培养条件一致，培养结束后，收集细胞，使用trizol法提取细胞内总RNA，并将胞内总RNA反转录，使用特定引物测定胞内LPL的总体表达量(其中引物序列为：5'-3'TCATTCCCGGAGTAGCAGAGT，3'-5'GGCCACAAGTTTTGGCACC)，通过待测基因与内参基因(GAPDH)Ct值的差值来计算基因表达差异，得到图2所示的qPCR检测LPL表达量图，纵坐标为标准化后脂肪干细胞内LPL的总体表达量，交联葡聚糖共培养的脂肪干细胞LPL的表达量显著高于对照组1和对照组2，说明交联葡聚糖共培养的脂肪干细胞成脂分化更明显。
实施例6：
将本实施例的填充剂用于人体试验，本实施例的填充剂制备方法与实施例2的条件相同。然后将40份得到的分子量为200-300万的交联葡聚糖、50份脂肪干细胞、5份聚甲基丙烯酸甲酯和5份注射用生理盐水混合均匀后即得到本实施例的面部填充剂。
使用时，在面部需要进行填充部位的真皮下，直接注射本发明制备的面部填充剂。
于本市某医院选取待试志愿者男女各20人，共计40人，且年龄均在20-45岁之间，将40名志愿者随机分为实验组、对照组1、对照组2、对照组3，每组10人，分别注射面部填充剂。实验组、对照组1、对照组2、对照组3，所采用的面部填充剂分别对应本实施例、直接获得的自体脂肪组织、通过本发明的方法获得的自体脂肪干细胞与某面部填充剂(包含交联葡聚糖与聚乳酸微球)。该实验为双盲实验，待试志愿者均已签订知情同意书，该实验已通过伦理审查。
实验一个月后对填充效果进行评定，分为有效和无效，有效指填充效果完美、达到被试预期效果，预期效果包括填充形状、填充硬度和术后满意程度、一个月后效果稳定且不反弹；无效指填充效果完美、未达到被试预期效果，预期效果包括填充形状、填充硬度和术后满意程度、或一个月后效果不稳定、或一个月后出现反弹，需要重新进行填充；实验后一周对被试不良反应情况进行检测。
得到的实验结果如下表所示：
Figure BDA0003011768160000061
Figure BDA0003011768160000071
从上表可得，实验组效果均优于对照组，且过敏反应出现人数少，患者满意度高。实验组1的效果最好，稳定性高且不反弹。由此可说明，本发明的面部填充剂填充效果自然丰满，效果维持时间持久，患者满意度高，不良反应率低。
以上对本发明的实例进行了详细说明，但内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (9)

1.一种含有交联葡聚糖的面部填充剂，其特征在于包括交联葡聚糖、脂肪干细胞、聚甲基丙烯酸甲酯、注射用生理盐水。
2.根据权利要求1所述的面部填充剂，其特征在于所述面部填充剂包括的组分及各组分的重量份数为：交联葡聚糖20-180份，脂肪干细胞5-120份，聚甲基丙烯酸甲酯1-50份，注射用生理盐水10-150份。
3.根据权利要求1所述的面部填充剂，其特征在于交联葡聚糖的分子量为1万-500万。
4.根据权利要求1所述的面部填充剂，其特征在于注射用生理盐水的浓度为0.8wt%～1.0wt%。
5.一种含有交联葡聚糖的面部填充剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）、将交联葡聚糖加入其体积100-1000倍的超纯水中，搅拌1～3h，灭菌得到交联葡聚糖与超纯水的混合物，将混合物中的超纯水滤净得到处理后的交联葡聚糖；
（2）、使用与步骤（1）中超纯水等体积的注射用生理盐水反复浸润处理后的交联葡聚糖，至渗透压与人体相近，然后将注射用生理盐水滤净得到处理后的交联葡聚糖；
（3）、将通过注射器吸出来的脂肪液连同注射器放入注射用生理盐水中直立静置；
（4）、将混合物取出并排去底层液体，把中、上两层的脂肪液及脂肪颗粒转移至离心管内，放入离心机离心，离心后呈现上下两层，上层为淡黄色脂肪颗粒，下层为淡红色肿胀液，移除下层液体，得到纯脂肪颗粒；
（5）、将获得的纯脂肪颗粒完全乳糜粉碎，然后加入10-100倍脂肪体积的0.1-10wt%的胶原酶溶液，并加入10倍脂肪体积的注射用生理盐水搅拌，充分振荡离心管使胶原酶与脂肪混匀后，放入培养箱中消化，期间每10 min取出摇匀一次；
（6）、在消化后的脂肪细胞中加入其100倍体积的注射用生理盐水后用滤网过滤，并放入离心机中离心，留沉淀细胞，此步骤重复三次，得到脂肪干细胞；
（7）、将处理后的得到的交联葡聚糖20-180份、脂肪干细胞5-120份、以及聚甲基丙烯酸甲酯1-50份和注射用生理盐水10-150份混合均匀后即得到面部填充剂。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述步骤（4）的离心条件为4℃，1200r/min，5min。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述步骤（6）的离心条件为4℃，1200r/min，5min。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述步骤（1）的灭菌条件为：120℃，20min。
9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于整个制备过程在无菌环境操作。
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