CN111068120A - 一种利用自体脂肪干细胞提高面部及其他部位脂肪填充效果的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及自体脂肪干细胞应用领域，尤其是涉及一种利用自体脂肪干细胞提高面部及其他部位脂肪填充效果的方法，其主要包括脂肪的提取及ADSCs与脂肪细胞的提取与浓缩，所述脂肪的提取可根据实验者主观要求及自身条件，选择上臂、腹部及大腿内侧、外侧作为供区并进行标记，本发明通过控制ADSCs在体外处理的时间结合ADSCs辅助脂肪移植技术，提高了面部移植脂肪细胞的存活率，有效提高了面部填充后使用者的满意度，减少了脂肪移植的并发症及后遗症的发病率。
Description
技术领域
本发明涉及自体脂肪干细胞应用领域，尤其是涉及一种利用自体脂肪干细胞提高面部及其他部位脂肪填充效果的方法。
背景技术
面部轮廓是否分明丰满，除了骨骼因素以外，主要由面部皮下脂肪而定，一般来说，青少年至中年人群面部皮下脂肪丰满，然而，随着年龄增长或因某些疾病甚至外伤导致面部皮下脂肪减少，会显得消瘦凹陷，年轻化面部组织随着年龄的增长，也会产生皮肤松弛、皮下胶原蛋白减少、脂肪颗粒减少、筋膜松弛、肌肉体积减少及弹性降低等现象，软组织容积的减少会造成骨骼显形，脸型由年轻时的“类鹅蛋形”变成“类菱形”，因软组织减少及松弛的缘故，面部轮廓呈现上小下大的椭圆形，从美学角度来说显得老态或给人以沧桑感，这给爱美人士带来了烦恼，2001年研究人员首次从人脂肪组织抽吸物中获取了大量成纤维样的细胞群，体外培养发现其具有多向分化潜能及自我复制更新能力，符合干细胞特性，将其命名为脂肪干细胞(adipose—derived stem cells，ADSCs)，上述干细胞具有骨髓间充质干细胞相同的特性，能够自我更新、多向分化潜能以及低免疫原性，随后又有研究指出，ADSCs不仅是脂肪细胞的前体，而且是多种细胞的祖细胞，包括骨细胞、软骨细胞、肌细胞、表皮细胞和神经细胞等，这使它作为一种单一、易于获取的自体干细胞又拥有解决多种组织缺陷性的潜能。脂肪组织中的ASCs 储量丰富、获取方便，不涉及医学伦理学问题，单位体积产出ASCs 远高于骨髓、脐带血等，1 g脂肪组织可以产出大约5 000 个ASCs，是从骨髓中提取比例的500 倍，是理想的成体干细胞来源，在疾病治疗、组织再生工程、整形美容等临床应用中具有重要意义。
由于自体脂肪移植后存在一定程度的吸收率，临床观察发现，根据就医者的年龄、移植部位、移植体积及个体差异，自体脂肪吸收率约30％～90％，平均超过60％，成熟脂肪细胞因其高耗氧的特性，对移植后的缺氧特别敏感，因此脂肪移植后大多数成熟脂肪细胞会坏死，释放出油滴导致炎症反应，这样就会导致脂肪移植后较为明显的肿胀。如何减少移植后的吸收及预后效果成为脂肪细胞移植的技术关键。
发明内容
针对现有利用自体脂肪进行面部填充移植后存在一定程度的吸收率，脂肪细胞的存活率低的问题，本发明提供一种利用自体脂肪干细胞提高面部及其他部位脂肪填充效果的方法，其主要包括脂肪的提取及ADSCs与脂肪细胞的提取与浓缩，所述脂肪的提取可根据实验者主观要求及自身条件，选择上臂、腹部及大腿内侧、外侧作为供区并进行标记，所述ADSCs与脂肪细胞的提取与浓缩主要分为以下步骤：
步骤一、将吸出来的脂肪液连同注射器放入生理盐水中直立静置，此时，混合液分为三层，上层为橘红色的脂肪液体，中间层为淡黄色脂肪颗粒，下层为粉红色的肿胀液和血液混合物；
步骤二、将上述分层后的注射器取出并排去底层液体，把中、上两层脂肪液及脂肪颗粒转移至50ml离心管内，放入冷冻离心机中进行离心作业，离心后在离心管内呈现上下两层，上层为淡黄色脂肪，底层为淡红色肿胀液，移除下层液体；
步骤三、将上一步骤中获得的纯脂肪颗粒通过物理方法完全乳糜粉碎，然后按加入生理盐水并转移至离心管内混匀，再置于冷冻离心机进行离心作业；
步骤四、上一步骤中经离心后的离心管内液体共呈现四层，最顶层为油脂性液体，第二层为破碎脂肪碎片及部分脂肪细胞及淋巴细胞，第三层为生理盐水，最下一层即为ADSCs，吸去顶层以及第三层液体；
步骤五、将上一步骤中留下的乳糜脂肪及底层干细胞转移至20ml注射器内，把获得的乳糜脂肪加入庆大霉素、利多卡因，用两个注射器连接后反复推送混匀即可；
进一步的，在上述步骤中应注意脂肪干细胞与脂肪细胞的整个提取过程应该尽快缩短时间，避免脂肪干细胞和脂肪细胞因体外错做过程的缺氧而死亡；
进一步的，在上述步骤中脂肪干细胞与脂肪细胞的整个提取过程的最佳处理时间为40分钟；
进一步的，上述在进行脂肪的提取时的具体操作如下：常规供区肿胀麻醉，用0.9％生理盐水500 ml，2％盐酸利多卡因40 mL，肾上腺素1mL配成局麻肿胀液，在标记供区抽吸部位做3～5 mm皮肤切口，将一只手放在抽吸部位皮肤表面，可感觉到针的定位及肿胀程度，在标记供区范围内均匀注射至肿胀发白，皮肤有“橘皮样”外观为止，结束注射后，应轻按摩供区至肿胀液扩散均匀，上述麻醉成功后，用吸脂针沿切口插入皮下脂肪组织，吸脂针呈扇形均匀抽取深层脂肪5 mL；
进一步的，在上述步骤一中需要将吸出来的脂肪液连同注射器放入4℃生理盐水中直立静置5min；
进一步的，在上述步骤二中，冷冻离心机以400 r／min离心2min；
进一步的，在上述步骤三中，将获得的纯脂肪颗粒通过物理方法完全乳糜粉碎，然后按1:1加入生理盐水（25mL的乳糜状脂肪中加入23 mL生理盐水和2ml庆大霉素（标准浓度））转移至离心管内混匀，再置于冷冻离心机，以2 500r／min，离心5min；
进一步的，在上述步骤四中，在吸去顶层以及第三层液体的过程中动作要轻缓，避免扰乱分层，如扰乱分层出现，需要重新离心再重复此步骤；
进一步的，在上述步骤五中，将步骤四中留下乳糜脂肪及底层干细胞转移至20ml注射器内，把获得乳糜脂肪按每15ml加入庆大霉素4U国际单位，2％利多卡因3ml，用两个注射器连接后反复推送混匀。
本发明的有益效果为，本发明通过控制ADSCs在体外处理的时间结合ADSCs辅助脂肪移植技术，提高了面部移植脂肪细胞的存活率，有效提高了面部填充后使用者的满意度，减少了脂肪移植的并发症及后遗症的发病率，本发明提供采用抽取自身脂肪，通过细胞成分结合释放（在体外提取ADSCs以及乳糜脂肪细胞，），在总计40分钟时间内进行面部填充，达到了很好的填充效果，通过本发明所提供的方法，脂肪存活效果好，减少了脂肪颗粒物，有效减低了脂肪增生，而且，本发明工艺简单，满足了人们的使用需求，具有巨大的市场应用价值。
附图说明
图1是裸鼠移植后的脂肪获取与称重图；
图2是裸鼠移植后的脂肪获取与称重分析图；
图3是实施例2中实验者的满意度调查表；
图4是实施例2中实验者的临床资料对比表。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。需要说明的是：本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方法可以相互组合形成新的技术方案。本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案。本发明中，如果没有特别的说明，所涉及的各组分或其优选组分可以相互组合形成新的技术方案。本发明中，除非有其他说明，数值范围“a～b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围“1.5～2.5”表示本文中已经全部列出了“1.5～2.5”之间的全部实数，“1.5～2.5”只是这些数值组合的缩略表示。本发明所公开的“范围”以下限和上限的形式，可以分别为一个或多个下限，和一个或多个上限。本发明中，除非另有说明，各个反应或操作步骤可以顺序进行，也可以按照顺序进行。优选地，本文中的反应方法是顺序进行的。除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
具体实施例1 ：为了说明控制ADSCs在体外处理的时间结合ADSCs辅助脂肪移植技术是否真实有效，在前期应用此方法进行了BALB/c裸鼠动物模型试验，观察实验结果，发现采用控制时间的脂肪干细胞辅助脂肪颗粒移植，能够有效提升脂肪移植后脂肪细胞的存活率，具体实施步骤如下：
一、首先是ADSCs与脂肪细胞的获取，具体如下：
1.1脂肪的提取：根据实验者的主观要求及自身条件，选择上臂、腹部及大腿内侧、外侧作为供区并标记抽取脂肪的范围。具体操作如下：在常规供区肿胀麻醉，用0.9％生理盐水500 ml，2％盐酸利多卡因40 mL，肾上腺素1mL配成局麻肿胀液，在标记抽吸部位做3～5 mm的皮肤切口，将一只手放在抽吸部位皮肤表面，可感觉到针的定位及肿胀程度，在标记供区范围内均匀注射至肿胀发白，皮肤有“橘皮样”外观为止。结束注射后，应轻按摩术区至肿胀液扩散均匀，麻醉成功后，用吸脂针沿切口插入皮下脂肪组织，吸脂针呈扇形均匀抽取深层脂肪5 mL；
ADSCs与脂肪细胞的提取与浓缩：此过程共分为5步，具体操作如下：
①首先将吸出来的脂肪液连同注射器放入4℃生理盐水中直立静置5min，此时，混合液分为3层，上层为橘红色的脂肪液体，中间层为淡黄色脂肪颗粒，下层为粉红色的肿胀液和血液混合物；
②然后将上步骤中的含有脂肪液分层的注射器取出并排去底层液体，把中、上两层脂肪液及脂肪颗粒转移至50ml的离心管内，放入冷冻离心机，400 r／min离心2min，离心后在离心管内呈现上下两层，上层为淡黄色脂肪，底层为淡红色肿胀液，移除下层液体；
③将上步骤获得的纯脂肪颗粒通过物理方法完全乳糜粉碎，然后按1:1比例加入生理盐水（25mL的乳糜状脂肪中加入23 mL生理盐水和2ml庆大霉素（标准浓度））转移至离心管内混匀，再置于冷冻离心机中，以2 500r／min，离心5min；
④离心后的离心管内共呈现4层，最顶层为油脂性液体，第二层为破碎脂肪碎片及部分脂肪细胞及淋巴细胞，第三层为生理盐水，最下一层即为ADSCs，吸去顶层以及第三层液体，在吸去过程中动作要轻缓(避免扰乱分层，如扰乱分层出现，需要重新离心再重复此步骤)；
⑤将留下乳糜脂肪及底层干细胞转移至20ml注射器内，把获得乳糜脂肪按每15ml加入庆大霉素4U国际单位，2％利多卡因3ml，用两个注射器连接后反复推送混匀。在进行以上步骤时需要注意的是，脂肪干细胞与脂肪细胞的整个提取过程应该尽快缩短时间，避免脂肪干细胞和脂肪细胞因体外错做过程的缺氧而死亡，最好的处理时间为40分钟。
二．BALB/c裸鼠动物模型试验
2.1移植物的制备
将按照上述步骤提取的脂肪干细胞和脂肪细胞命名为研究组，按照传统的脂肪干细胞辅助脂肪细胞移植方法进行的命名为对照组，将提取的脂肪细胞直接移植，命名为空白组；
2.2 BALB/c裸鼠动物模型试验
首先取6周龄的BALB/c裸鼠15只，分成（甲、乙、丙）3组，每组5只，将所有裸鼠尾静脉注射1%戊巴比妥钠100ul，待裸鼠完全麻醉后，在裸鼠双侧背部皮下进行脂肪移植物注射。每只裸鼠背部两侧各注射1ml，共2ml，注射方式采用扇形多点位注射方式，以中心点起始，分8个方向，进针距离为1cm，采用退针法注射，每个方向各注射0.125ml。甲组的裸鼠注射步骤1中的研究组组脂肪移植物，乙组注射对照组脂肪移植物，丙组注射空白组脂肪移植物；
2.3 裸鼠移植后的脂肪获取与称重与分析
脂肪移植后12周，所有的裸鼠各腹腔注射400ul 1%戊巴比妥钠处死，而后每只裸鼠解剖获取两个移植部位的全部脂肪组织，进行称重并记录，记录结果如说明书附图1所示：
三组的脂肪重量均值进行比较分析，结果如说明书附图2所示：
甲组的脂肪重量均值为1.504g，乙组，丙组分别为1.012g与0.556g，经过12周后，甲组留存的脂肪组织重量明显高于乙组与丙组，表明采用控制时间的脂肪干细胞辅助脂肪颗粒移植，能够有效提升脂肪移植后脂肪细胞的存活率，该实验结果也从另一方面表明，移植脂肪细胞长期存活的关键因素是控制脂肪干细胞的体外处理时间，即控制脂肪干细胞的体外处理时间是提升脂肪移植成功率的关键因素。
具体实施例2 ：为了解决由于自体脂肪移植后存在一定程度的吸收率，通过临床观察，根据实验者的年龄、移植部位、移植体积及个体差异，自体脂肪吸收率约30％～90％，平均超过60％这一问题。在报批临床委员会和与实验者签署知情及免责协议后本发明将此方法应用于实验者，结果发现通过缩短自源ADSCs的体外处理时间（目前体外处理时间最短为40分钟），能够有效提高脂肪移植后的成活率，提高实验者的满意度。其具体实施步骤如下：
一．自源ADSCs与脂肪细胞的获取
1.1.自体脂肪的提取：根据实验者主观要求及自身条件，选择上臂、腹部及大腿内侧、外侧作为供区并标记抽取脂肪的范围。具体操作如下：常规供区肿胀麻醉，用0.9％生理盐水500ml，2％盐酸利多卡因40ml，肾上腺素1mL配成局麻肿胀液，在标记抽吸部位做3～5mm皮肤切口，将一只手放在抽吸部位皮肤表面，可感觉到针的定位及肿胀程度，在标记供区范围内均匀注射至肿胀发白，皮肤有“橘皮样”外观为止。结束注射后，应轻按摩术区至肿胀液扩散均匀。麻醉成功后，用吸脂针沿切口插入皮下脂肪组织，吸脂针呈扇形均匀抽取深层脂肪5 mL；
.ADSCs的提取与浓缩：此过程共分为5个步骤，具体操作如下：
①首先将吸出来的脂肪液连同注射器放入4℃生理盐水中直立静置5min，混合液分为3层，上层为橘红色的脂肪液体，中间层为淡黄色脂肪颗粒，下层为粉红色的肿胀液和血液混合物；
②然后取出注射器并排去底层液体，把中、上两层脂肪液及脂肪颗粒转移至50ml离心管内，放入冷冻离心机，400 r／min离心2min，离心后呈现上下两层，上层为淡黄色脂肪，底层为淡红色肿胀液，移除下层液体；
③将上步骤中获得的纯脂肪颗粒通过物理方法完全乳糜粉碎，然后按1:1加入生理盐水（23 mL生理盐水，2ml庆大霉素（标准浓度））转移至离心管内混匀，再置于冷冻离心机，以2 500r／min，离心5min；
④离心后离心管内共呈现4层，最顶层为油脂性液体，第二层为破碎脂肪碎片及部分脂肪细胞及淋巴细胞，第三层为生理盐水，最下一层为ADSCs及少量红细胞，吸去顶层以及第三层液体，在吸去过程中动作要轻缓(避免扰乱分层，如扰乱分层出现，需要重新离心再重复此步骤)；
⑤将上步骤中留下的乳糜脂肪及底层干细胞转移至20ml注射器内，把获得乳糜脂肪按每15ml加入庆大霉素4U国际单位，2％利多卡因3ml，用两个注射器连接后反复推送混匀。
二．脂肪细胞的移植回输（自体脂肪源性干细胞的移植）
移植前进行常规面部消毒，在标记好的受区边缘外2cm处以发际线、眉部、口角和耳垂后等隐蔽处选择合适的进针点，并给予利多卡因局部浸润麻醉，吸取自体脂肪源性干细胞液进行注射，针头与皮肤之间的角度为30°，针头刺入皮肤后还可以调节注射角度，自体脂肪源性干细胞液（即通过本发明的工艺过程所提取的自体脂肪干细胞ADSCs）应该注入面部褶皱真皮层，呈扇形均匀小剂量，每点注射量为0.05-0.1 ml，注射时用最小压力缓慢匀速注射，以免损伤脂肪细胞以及造成脂肪颗粒分布不均匀，调整注入的量，脂肪颗粒的注射量以矫枉过正30%左右为宜。在注射过程中应该保持力度均匀一致，可轻轻推动局部以促进脂肪的分布均匀，且与周围衔接自然，从而达到面部更为理想的效果，注射完成以后，用冰块进行冷敷10分钟左右，一个星期内不得对移植部位进行挤压或者揉搓，更加不能使用化妆品。将上述步骤中分为两个组，研究组为按照上述步骤处理得到的ADSCs与脂肪细胞混合物后，在40分钟内将其回输到就医者的面部，对照组为按照常规ADSCs辅助脂肪颗粒移植混合物的方法进行即：将纯化后的脂肪颗粒组织与获取的ADSCs充分混合，并静置30 min，使ADSCs和脂肪颗粒细胞充分附着，形成ADSCs辅助脂肪颗粒移植混合物，并将这一混合物回输到就医者面部。
三．效果评估
效果评估包括，二次注射率，并发症情况，实验者满意度等指标。
四．效果验证
两组实验者临床资料对比如说明书附图4所示，其中，年龄，BMI，随访时间，供区等数据无明显差异不具备统计学意义，对照组的面部注射量高于研究组的面部注射量（P<0.001），其中传统ADSCs辅助脂肪移植组在注射后5-6个月内出现脂肪细胞吸收现象，而研究组在注射后6～13个月仍维持一个较满意的效果，部分实验者在注射后6-9个月要求行二次注射，研究组8例(18.6％)行二次注射，对照组6例(25.0％)进行二次注射，其差异具有统计学意义(P=0．011)。所有实验者注射均顺利，未发生感染、坏死、肉芽肿或其他严重并发症。实验组28例实验者注射后均出现明显的面部肿胀，约4周恢复，6例实验者出现面部皮下出血，于注射后l～2周自行吸收恢复。研究组43例实验者面部出现轻微肿胀，注射后1-2周恢复，未出现皮下出血。注射后6个月实验者复诊时，使用Likert量表评估实验者的满意度，其评分包括非常不满意、不满意、一般、满意和非常满意。具体调查结果如说明书附图3所示，研究组的满意度高于对照组（P<0.001）。
因此，通过上述对比，结果发现通过缩短自源ADSCs的体外处理时间（目前体外处理时间最短为40分钟），能够有效提高脂肪移植后的成活率，提高使用者的满意度。
Claims (9)
1.一种利用自体脂肪干细胞提高面部及其他部位脂肪填充效果的方法，其特征在于，主要包括脂肪的提取及ADSCs与脂肪细胞的提取与浓缩，所述脂肪的提取可根据实验者主观要求及自身条件，选择上臂、腹部及大腿内侧、外侧作为供区并进行标记，所述ADSCs与脂肪细胞的提取与浓缩主要分为以下步骤：
步骤一、将吸出来的脂肪液连同注射器放入生理盐水中直立静置，此时，混合液分为三层，上层为橘红色的脂肪液体，中间层为淡黄色脂肪颗粒，下层为粉红色的肿胀液和血液混合物；
步骤二、将上述分层后的注射器取出并排去底层液体，把中、上两层脂肪液及脂肪颗粒转移至50ml离心管内，放入冷冻离心机中进行离心作业，离心后在离心管内呈现上下两层，上层为淡黄色脂肪，底层为淡红色肿胀液，移除下层液体；
步骤三、将上一步骤中获得的纯脂肪颗粒通过物理方法完全乳糜粉碎，然后按加入生理盐水并转移至离心管内混匀，再置于冷冻离心机进行离心作业；
步骤四、上一步骤中经离心后的离心管内液体共呈现四层，最顶层为油脂性液体，第二层为破碎脂肪碎片及部分脂肪细胞及淋巴细胞，第三层为生理盐水，最下一层即为ADSCs，吸去顶层以及第三层液体；
步骤五、将上一步骤中留下的乳糜脂肪及底层干细胞转移至20ml注射器内，把获得的乳糜脂肪加入庆大霉素、利多卡因，用两个注射器连接后反复推送混匀即可。
2.根据权利要求1所述的一种利用自体脂肪干细胞提高面部及其他部位脂肪填充效果的方法，其特征在于，在上述步骤中应注意脂肪干细胞与脂肪细胞的整个提取过程应该尽快缩短时间，避免脂肪干细胞和脂肪细胞因体外错做过程的缺氧而死亡。
3.根据权利要求2所述的一种利用自体脂肪干细胞提高面部及其他部位脂肪填充效果的方法，其特征在于，在上述步骤中脂肪干细胞与脂肪细胞的整个提取过程的最佳处理时间为 40分钟。
4.根据权利要求1所述的一种利用自体脂肪干细胞提高面部及其他部位脂肪填充效果的方法，其特征在于，上述在进行脂肪的提取时的具体操作如下：常规供区肿胀麻醉，用0.9％生理盐水500 ml，2％盐酸利多卡因40 mL，肾上腺素1mL配成局麻肿胀液，在标记供区抽吸部位做3～5 mm皮肤切口，将一只手放在抽吸部位皮肤表面，可感觉到针的定位及肿胀程度，在标记供区范围内均匀注射至肿胀发白，皮肤有“橘皮样”外观为止，结束注射后，应轻按摩供区至肿胀液扩散均匀，上述麻醉成功后，用吸脂针沿切口插入皮下脂肪组织，吸脂针呈扇形均匀抽取深层脂肪5 mL。
5.根据权利要求1所述的一种利用自体脂肪干细胞提高面部及其他部位脂肪填充效果的方法，其特征在于，在上述步骤一中需要将吸出来的脂肪液连同注射器放入4℃生理盐水中直立静置5min。
6.根据权利要求1所述的一种利用自体脂肪干细胞提高面部及其他部位脂肪填充效果的方法，其特征在于，在上述步骤二中，冷冻离心机以400 r／min离心2min。
7.根据权利要求1所述的一种利用自体脂肪干细胞提高面部及其他部位脂肪填充效果的方法，其特征在于，在上述步骤三中，将获得的纯脂肪颗粒通过物理方法完全乳糜粉碎，然后按1:1加入生理盐水（25mL的乳糜状脂肪中加入23 mL生理盐水和2ml庆大霉素（标准浓度））转移至离心管内混匀，再置于冷冻离心机，以2 500r／min，离心5min。
8.根据权利要求1所述的一种利用自体脂肪干细胞提高面部及其他部位脂肪填充效果的方法，其特征在于，在上述步骤四中，在吸去顶层以及第三层液体的过程中动作要轻缓，避免扰乱分层，如扰乱分层出现，需要重新离心再重复此步骤。
9.根据权利要求1所述的一种利用自体脂肪干细胞提高面部及其他部位脂肪填充效果的方法，其特征在于，在上述步骤五中，将步骤四中留下乳糜脂肪及底层干细胞转移至20ml注射器内，把获得乳糜脂肪按每15ml加入庆大霉素4U国际单位，2％利多卡因3ml，用两个注射器连接后反复推送混匀。
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