CN112646776A - 一种用于疤痕修复的自体脂肪源干细胞的提取方法 - Google Patents

一种用于疤痕修复的自体脂肪源干细胞的提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于疤痕修复的自体脂肪源干细胞的提取方法，该用于疤痕修复的自体脂肪源干细胞的提取方法包括采集脂肪组织液、分离脂肪颗粒、破碎脂肪颗粒、原代培养以及传代培养等步骤，提取到的自体脂肪源干细胞具有良好的分化增殖能力，可促进机体自我脂肪细胞的分裂更新，加快面部疤痕的修复，使细胞保持良好的生长状态，以及旺盛的增殖活力，满足疤痕治疗的需要，且是机体自生细胞增殖修复的过程不具有副作用，有效解决了现阶段对于疤痕修复常采用修复膏、修复液、修复贴等方式，存在大多数的修复产品不同程度地存在着化学成分过多、见效慢、产品价格昂贵，且取得的成效并不一定很好的问题。

Description

一种用于疤痕修复的自体脂肪源干细胞的提取方法
技术领域
本发明涉及疤痕修复技术领域，具体为一种用于疤痕修复的自体脂肪源干细胞的提取方法。
背景技术
自体干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种APSC多能细胞，是一类具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞。自体干细胞是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，改变了人类疾病的应对方法，医学界称为“万用细胞”。自体干细胞是一种“种子细胞”，动物体就是通过自体干细胞的分裂来实现细胞的更新，从而保证动物体持续生长发育的。当遭遇疾病，某一器官罢工或受伤时，自体干细胞会第一时间作出反应，促进分化成身体所需的专属细胞，从而提供足够数量的专属细胞帮助修复和愈合。在神经系统疾病、免疫系统疾病等诸多疾病的治疗有着广泛的应用。
现阶段对于疤痕修复常采用修复膏、修复液、修复贴等方式，存在大多数的修复产品不同程度地存在着化学成分过多、见效慢、产品价格昂贵，且取得的成效并不一定很好的缺点。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种用于疤痕修复的自体脂肪源干细胞的提取方法，用于解决现阶段对于疤痕修复常采用修复膏、修复液、修复贴等方式，存在大多数的修复产品不同程度地存在着化学成分过多、见效慢、产品价格昂贵，且取得的成效并不一定很好的问题。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种用于疤痕修复的自体脂肪源干细胞的提取方法，具体包括如下步骤：
步骤S1：选择患者机体一处部位作为抽取脂肪的部位并进行标记，使用局麻肿胀液处理该部位，局麻肿胀处理完毕后，使用50mL注射器与4mm吸脂针沿着皮肤切口的方向插入皮下脂肪组织，吸取50mL脂肪组织液；
步骤S2：将带有脂肪组织液的注射器置于4-6℃条件下，置于500mL生理盐水中，静置10-15min，排出最下层，然后将剩余液体转移至50mL离心管，置于冷冻高速离心机，在温度4℃，转速1000-1200r/min条件下，离心5min，离心结束后取上层，得到脂肪颗粒；
步骤S3：将步骤S2得到的脂肪颗粒置于50mL注射器，使用双通道乳糜器，分别经过3孔、5孔、9孔经过8次反复推送，乳糜破碎后，将破碎后的脂肪颗粒加入烧杯，然后加入生理盐水和正泰霉素，转速50r/min混合搅拌3-5min，然后转移至50mL离心管中，置于高速离心机中，在温度4℃，转速2000-2500r/min条件下，离心8-10min，离心结束后，取最下层，得到初提液；
步骤S4：将步骤S3得到的初提液加入PBS缓冲液与含有人自体血清的DMEM培养基中，置于二氧化碳培养箱，在30-37℃条件下培养5-7天，得到原代细胞；
步骤S5:5-7天后，融合度到达70％-80％时，使用500mLPBS缓冲液冲洗2次，然后加入胰酶和EDTA消化液，加入含有人自体血清的DMEM培养基，将细胞密度稀释3-4倍，置于二氧化碳培养箱在35-37℃条件下，培养5-7天，培养结束后加入生理盐水，转移至50mL离心管中，再置于高速冷冻离心机，在4℃，1500-2000r/min条件下离心5-8min，离心结束后，取上清液，即为自体脂肪源干细胞。
进一步地，步骤S1所述局麻肿胀液由如下步骤制成，在烧杯中加入500mL生理盐水，然后加入30mL质量分数为2％的利多卡因、1mg肾上腺素以及10mL碳酸氢钠，搅拌混合，即得到局麻肿胀液。
进一步地，步骤S1所述局麻肿胀处理具体为使用11号手术刀片，在标记位置切出3-4mm的皮肤切口，选用2.8mm直径的注水针，对标记位置进行均匀注射，直至标记位置肿胀发白，皮肤具有橘皮外观。
进一步地，步骤S3所述脂肪颗粒、生理盐水和正泰霉素的用量比为20mL：17-19mL：1-3mL，其中脂肪颗粒的体积与生理盐水、正泰霉素总体积的体积比为1:1。
进一步地，步骤S4所述初提液、PBS缓冲液与含有人自体血清的DMEM培养基的体积比为1:1:5。
进一步地，步骤S4所述胰酶的浓度为0.2g/mL，所述EDTA消化液的质量分数为0.04％，所述胰酶、EDTA消化液、含有人自体血清的DMEM培养基以及生理盐水的用量比为1mL：1mL：20mL：40mL。
进一步地，步骤S4和步骤S5所述的二氧化碳培养箱中的CO2的体积分数为5％。
进一步地，所述步骤S1、步骤S2、步骤S3、步骤S4、步骤S5均在无菌条件下进行，步骤S1所述患者机体一处部位包括上臂、腹部以及大腿内侧任意一处。
(三)有益效果
本发明提供了一种用于疤痕修复的自体脂肪源干细胞的提取方法。与现有技术相比具备以下有益效果：该用于疤痕修复的自体脂肪源干细胞的提取方法，通过针对性的从患者自体取得细胞本体，避免免疫排斥反应的发生，经过采集脂肪组织液、分离脂肪颗粒、破碎脂肪颗粒、原代培养以及传代培养得到自体脂肪源干细胞，具有良好的分化增殖能力，可促进机体自我脂肪细胞的分裂更新，加快面部疤痕的修复，提高细胞活性，用于疤痕部位可以使得细胞进行大量增殖，使细胞保持良好的生长状态，以及旺盛的增殖活力，满足疤痕治疗的需要，且是机体自生细胞增殖修复的过程不具有副作用，有效解决了现阶段对于疤痕修复常采用修复膏、修复液、修复贴等方式，存在大多数的修复产品不同程度地存在着化学成分过多、见效慢、产品价格昂贵，且取得的成效并不一定很好的缺点的问题。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种用于疤痕修复的自体脂肪源干细胞的提取方法，具体包括如下步骤：
步骤S1：选择患者机体一处部位作为抽取脂肪的部位并进行标记，使用局麻肿胀液处理该部位，局麻肿胀处理完毕后，使用50mL注射器与4mm吸脂针沿着皮肤切口的方向插入皮下脂肪组织，吸取50mL脂肪组织液；
步骤S2：将带有脂肪组织液的注射器置于4℃条件下，置于500mL生理盐水中，静置10min，排出最下层，然后将剩余液体转移至50mL离心管，置于冷冻高速离心机，在温度4℃，转速1000r/min条件下，离心5min，离心结束后取上层，得到脂肪颗粒；
步骤S3：将步骤S2得到的脂肪颗粒置于50mL注射器，使用双通道乳糜器，分别经过3孔、5孔、9孔经过8次反复推送，乳糜破碎后，将破碎后的脂肪颗粒加入烧杯，然后加入生理盐水和正泰霉素，转速50r/min混合搅拌3min，然后转移至50mL离心管中，置于高速离心机中，在温度4℃，转速2000r/min条件下，离心8min，离心结束后，取最下层，得到初提液；
步骤S4：将步骤S3得到的初提液加入PBS缓冲液与含有人自体血清的DMEM培养基中，置于二氧化碳培养箱，在30℃条件下培养5天，得到原代细胞；
步骤S5:5天后，融合度到达70％时，使用500mLPBS缓冲液冲洗2次，然后加入胰酶和EDTA消化液，加入含有人自体血清的DMEM培养基，将细胞密度稀释3倍，置于二氧化碳培养箱在35℃条件下，培养5天，培养结束后加入生理盐水，转移至50mL离心管中，再置于高速冷冻离心机，在4℃，1500r/min条件下，离心5min，离心结束后，取上清液，即为自体脂肪源干细胞。
实施例2
一种用于疤痕修复的自体脂肪源干细胞的提取方法，具体包括如下步骤：
步骤S1：选择患者机体一处部位作为抽取脂肪的部位并进行标记，使用局麻肿胀液处理该部位，局麻肿胀处理完毕后，使用50mL注射器与4mm吸脂针沿着皮肤切口的方向插入皮下脂肪组织，吸取50mL脂肪组织液；
步骤S2：将带有脂肪组织液的注射器置于5℃条件下，置于500mL生理盐水中，静置12.5min，排出最下层，然后将剩余液体转移至50mL离心管，置于冷冻高速离心机，在温度4℃，转速1100r/min条件下，离心5min，离心结束后取上层，得到脂肪颗粒；
步骤S3：将步骤S2得到的脂肪颗粒置于50mL注射器，使用双通道乳糜器，分别经过3孔、5孔、9孔经过8次反复推送，乳糜破碎后，将破碎后的脂肪颗粒加入烧杯，然后加入生理盐水和正泰霉素，转速50r/min混合搅拌4min，然后转移至50mL离心管中，置于高速离心机中，在温度4℃，转速2250r/min条件下，离心9min，离心结束后，取最下层，得到初提液；
步骤S4：将步骤S3得到的初提液加入PBS缓冲液与含有人自体血清的DMEM培养基中，置于二氧化碳培养箱，在33.5℃条件下培养6天，得到原代细胞；
步骤S5:6天后，融合度到达75％时，使用500mLPBS缓冲液冲洗2次，然后加入胰酶和EDTA消化液，加入含有人自体血清的DMEM培养基，将细胞密度稀释3.5倍，置于二氧化碳培养箱在36℃条件下，培养6天，培养结束后加入生理盐水，转移至50mL离心管中，再置于高速冷冻离心机，在4℃，1750r/min条件下离心7.5min，离心结束后，取上清液，即为自体脂肪源干细胞。
实施例3
一种用于疤痕修复的自体脂肪源干细胞的提取方法，具体包括如下步骤：
步骤S1：选择患者机体一处部位作为抽取脂肪的部位并进行标记，使用局麻肿胀液处理该部位，局麻肿胀处理完毕后，使用50mL注射器与4mm吸脂针沿着皮肤切口的方向插入皮下脂肪组织，吸取50mL脂肪组织液；
步骤S2：将带有脂肪组织液的注射器置于6℃条件下，置于500mL生理盐水中，静置15min，排出最下层，然后将剩余液体转移至50mL离心管，置于冷冻高速离心机，在温度4℃，转速1200r/min条件下，离心5min，离心结束后取上层，得到脂肪颗粒；
步骤S3：将步骤S2得到的脂肪颗粒置于50mL注射器，使用双通道乳糜器，分别经过3孔、5孔、9孔经过8次反复推送，乳糜破碎后，将破碎后的脂肪颗粒加入烧杯，然后加入生理盐水和正泰霉素，转速50r/min混合搅拌5min，然后转移至50mL离心管中，置于高速离心机中，在温度4℃，转速2500r/min条件下，离心10min，离心结束后，取最下层，得到初提液；
步骤S4：将步骤S3得到的初提液加入PBS缓冲液与含有人自体血清的DMEM培养基中，置于二氧化碳培养箱，在37℃条件下培养7天，得到原代细胞；
步骤S5:7天后，融合度到达80％时，使用500mLPBS缓冲液冲洗2次，然后加入胰酶和EDTA消化液，加入含有人自体血清的DMEM培养基，将细胞密度稀释4倍，置于二氧化碳培养箱在37℃条件下，培养7天，培养结束后加入生理盐水，转移至50mL离心管中，再置于高速冷冻离心机，在4℃，2000r/min条件下离心8min，离心结束后，取上清液，即为自体脂肪源干细胞。
实施例4
一种用于疤痕修复的自体脂肪源干细胞的提取方法，其特征在于：具体包括如下步骤：
步骤S1：选择患者机体一处部位作为抽取脂肪的部位并进行标记，使用局麻肿胀液处理该部位，局麻肿胀处理完毕后，使用50mL注射器与4mm吸脂针沿着皮肤切口的方向插入皮下脂肪组织，吸取50mL脂肪组织液；
步骤S2：将带有脂肪组织液的注射器置于4℃条件下，置于500mL生理盐水中，静置15min，排出最下层，然后将剩余液体转移至50mL离心管，置于冷冻高速离心机，在温度4℃，转速1200r/min条件下，离心5min，离心结束后取上层，得到脂肪颗粒；
步骤S3：将步骤S2得到的脂肪颗粒置于50mL注射器，使用双通道乳糜器，分别经过3孔、5孔、9孔经过8次反复推送，乳糜破碎后，将破碎后的脂肪颗粒加入烧杯，然后加入生理盐水和正泰霉素，转速50r/min混合搅拌4min，然后转移至50mL离心管中，置于高速离心机中，在温度4℃，转速2500r/min条件下，离心8min，离心结束后，取最下层，得到初提液；
步骤S4：将步骤S3得到的初提液加入PBS缓冲液与含有人自体血清的DMEM培养基中，置于二氧化碳培养箱，在37℃条件下培养5天，得到原代细胞；
步骤S5:6天后，融合度到达75％时，使用500mLPBS缓冲液冲洗2次，然后加入胰酶和EDTA消化液，加入含有人自体血清的DMEM培养基，将细胞密度稀释4倍，置于二氧化碳培养箱在37℃条件下，培养7天，培养结束后加入生理盐水，转移至50mL离心管中，再置于高速冷冻离心机，在4℃，2000r/min条件下离心6min，离心结束后，取上清液，即为自体脂肪源干细胞。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (8)

1.一种用于疤痕修复的自体脂肪源干细胞的提取方法，其特征在于：具体包括如下步骤：
步骤S1：选择患者机体一处部位作为抽取脂肪的部位并进行标记，使用局麻肿胀液处理该部位，局麻肿胀处理完毕后，使用50mL注射器与4mm吸脂针沿着皮肤切口的方向插入皮下脂肪组织，吸取50mL脂肪组织液；
步骤S2：将带有脂肪组织液的注射器置于4-6℃条件下，置于500mL生理盐水中，静置10-15min，排出最下层，然后将剩余液体转移至50mL离心管，置于冷冻高速离心机，在温度4℃，转速1000-1200r/min条件下，离心5min，离心结束后取上层，得到脂肪颗粒；
步骤S3：将步骤S2得到的脂肪颗粒置于50mL注射器，使用双通道乳糜器，分别经过3孔、5孔、9孔经过8次反复推送，乳糜破碎后，将破碎后的脂肪颗粒加入烧杯，然后加入生理盐水和正泰霉素，转速50r/min混合搅拌3-5min，然后转移至50mL离心管中，置于高速离心机中，在温度4℃，转速2000-2500r/min条件下，离心8-10min，离心结束后，取最下层，得到初提液；
步骤S4：将步骤S3得到的初提液加入PBS缓冲液与含有人自体血清的DMEM培养基中，置于二氧化碳培养箱，在30-37℃条件下培养5-7天，得到原代细胞；
步骤S5:5-7天后，融合度到达70％-80％时，使用500mLPBS缓冲液冲洗2次，然后加入胰酶和EDTA消化液，加入含有人自体血清的DMEM培养基，将细胞密度稀释3-4倍，置于二氧化碳培养箱在35-37℃条件下，培养5-7天，培养结束后加入生理盐水，转移至50mL离心管中，再置于高速冷冻离心机，在4℃，1500-2000r/min条件下离心5-8min，离心结束后，取上清液，即为自体脂肪源干细胞。
2.根据权利要求1所述的一种用于疤痕修复的自体脂肪源干细胞的提取方法，其特征在于：步骤S1所述局麻肿胀液由如下步骤制成，在烧杯中加入500mL生理盐水，然后加入30mL质量分数为2％的利多卡因、1mg肾上腺素以及10mL碳酸氢钠，搅拌混合，即得到局麻肿胀液。
3.根据权利要求1所述的一种用于疤痕修复的自体脂肪源干细胞的提取方法，其特征在于：步骤S1所述局麻肿胀处理具体为使用11号手术刀片，在标记位置切出3-4mm的皮肤切口，选用2.8mm直径的注水针，对标记位置进行均匀注射，直至标记位置肿胀发白，皮肤具有橘皮外观。
4.根据权利要求1所述的一种用于疤痕修复的自体脂肪源干细胞的提取方法，其特征在于：步骤S3所述脂肪颗粒、生理盐水和正泰霉素的用量比为20mL：17-19mL：1-3mL，其中脂肪颗粒的体积与生理盐水、正泰霉素总体积的体积比为1:1。
5.根据权利要求1所述的一种用于疤痕修复的自体脂肪源干细胞的提取方法，其特征在于：步骤S4所述初提液、PBS缓冲液与含有人自体血清的DMEM培养基的体积比为1:1:5。
6.根据权利要求1所述的一种用于疤痕修复的自体脂肪源干细胞的提取方法，其特征在于：步骤S4所述胰酶的浓度为0.2g/mL，所述EDTA消化液的质量分数为0.04％，所述胰酶、EDTA消化液、含有人自体血清的DMEM培养基以及生理盐水的用量比为1mL：1mL：20mL：40mL。
7.根据权利要求1所述的一种用于疤痕修复的自体脂肪源干细胞的提取方法，其特征在于：步骤S4和步骤S5所述的二氧化碳培养箱中的CO2的体积分数为5％。
8.根据权利要求1所述的一种用于疤痕修复的自体脂肪源干细胞的提取方法，其特征在于：所述步骤S1、步骤S2、步骤S3、步骤S4、步骤S5均在无菌条件下进行，步骤S1所述患者机体一处部位包括上臂、腹部以及大腿内侧任意一处。
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