CN106978390A - 适用于贴壁型cho细胞的无血清培养基及培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种适用于贴壁型CHO细胞的无血清培养基及培养方法。该无血清培养基包括基础培养基及添加在所述基础培养基中的脂类物质、激素类物质、生长因子及贴壁因子。上述适用于贴壁型CHO细胞的无血清培养基通过在基础培养基中添加特定浓度范围的脂类物质、激素类物质、生长因子及贴壁因子,可以取代传统的含血清培养基直接用于CHO细胞的贴壁生长,并可连续传代,培养时CHO细胞状态稳定。进一步通过对基础培养基中的各组分的含量进行调整,并添加了一些微量元素组分等,使得该无血清培养基更加适用于CHO细胞的贴壁生长,进一步保证CHO细胞贴壁生长的稳定性和生长速率。
Description
技术领域
本发明涉及细胞工程领域,尤其是涉及一种适用于贴壁型CHO细胞的无血清培养基及培养方法。
背景技术
细胞培养基既是培养细胞中供给细胞营养和促使细胞生殖增殖的基础物质,也是培养细胞生长和繁殖的生存环境,是生物医药工程中最重要的组成部分。细胞培养基从使用方式分为基础培养基和无血清培养基。基础培养基主要成分有:无机盐、氨基酸、碳源、维生素、缓冲体系以及其他类微量营养物质,成分明确清晰。基础培养基不能促进细胞的生长、增殖,需要配合血清使用。血清的主要作用在于给细胞提供生长增殖所需物质,但由于血清中所含的成分复杂,不同产地、批次之间存在质量差异,给动物细胞大规模培养工艺造成了诸多不利影响。同时,通过细胞培养获得产物的过程,血清的存在是纯化的主要障碍,甚至使产物难以成为医药产品。
工业大规模化生产中,常用的细胞系包括CHO细胞(Chinese hamster ovary,中国仓鼠卵巢细胞)、Vero细胞、SP2/0细胞、NS0细胞、小鼠杂交瘤细胞等,其中最常见的是CHO细胞。截止目前,美国FDA批准的63个已上市的抗体药物表达体系中,使用CHO细胞的有33个,占据52%。目前针对CHO细胞的无血清培养基开发主要集中在悬浮培养上,鲜有适用于贴壁的无血清培养基。因此,本领域迫切需要开发新的能支持CHO细胞贴壁生长的无血清培养基。
发明内容
基于此,有必要提供一种适用于贴壁型CHO细胞的无血清培养基及培养方法。
一种适用于贴壁型CHO细胞的无血清培养基,包括基础培养基及添加在所述基础培养基中的脂类物质、激素类物质、生长因子及贴壁因子;其中,所述脂类物质包含浓度之和大于零的如下各组分:
所述激素类物质包括浓度之和大于零的如下各组分:
所述生长因子包括浓度之和大于零的如下各组分:
所述贴壁因子包括浓度之和大于零的如下各组分:
玻连蛋白 0-10mg/L
层粘连蛋白 0-10mg/L
纤维连接蛋白 0-10mg/L。
在其中一个实施例中,所述脂类物质包括浓度之和大于零的如下各组分:
所述激素类物质包括浓度之和大于零的如下各组分:
所述生长因子包括浓度之和大于零的如下各组分:
所述贴壁因子包括浓度之和大于零的如下各组分:
玻连蛋白 0-2mg/L
层粘连蛋白 0-2mg/L
纤维连接蛋白 0-2mg/L。
本文所述的浓度之和大于零指可以选自多个相应组分中的至少一种,当某种组分被选择使用时,其浓度不为零,如贴壁因子可以是玻连蛋白、层粘连蛋白与纤维连接蛋白中一种或多种的混合物,当为混合物时,其中相应组分的浓度比如不为零。
在其中一个实施例中,所述基础培养基中具有如下浓度的各微量元素组分:
在其中一个实施例中,所述基础培养基中还具有如下浓度的各维生素组分:
在其中一个实施例中,所述基础培养基中还具有如下浓度的各氨基酸组分:
在其中一个实施例中,所述基础培养基中还具有如下浓度的各基础组分:
在其中一个实施例中,所述无血清培养基用NaCl调节渗透压至270-310mOsm/kgH2O,用HCl或NaOH调节酸碱度至pH为7.2-7.5。
一种适用于贴壁型CHO细胞的培养方法,使用上述任一实施例所述的适用于贴壁型CHO细胞的无血清培养基对CHO细胞进行培养。
在其中一个实施例中,是将CHO细胞直接使用所述适用于贴壁型CHO细胞的无血清培养基进行培养。
在其中一个实施例中,是使用连续适应方法对所述CHO细胞进行培养,具体是:先使用含胎牛血清的培养基与所述适用于贴壁型CHO细胞的无血清培养基的混合培养基对所述CHO细胞进行传代培养,且每次传代后的混合培养基中所述适用于贴壁型CHO细胞的无血清培养基的比例均较前一次增加,直至最后只使用所述适用于贴壁型CHO细胞的无血清培养基进行培养。
上述适用于贴壁型CHO细胞的无血清培养基通过在基础培养基中添加特定浓度范围的脂类物质、激素类物质、生长因子及贴壁因子,可以取代传统的含血清培养基直接用于CHO细胞的贴壁生长,并可连续传代,培养时CHO细胞状态稳定。
另外,进一步通过对基础培养基中的各组分的含量进行调整,并添加了一些微量元素组分等,使得该适用于贴壁型CHO细胞的无血清培养基更加适用于CHO细胞的贴壁生长,进一步保证CHO细胞贴壁生长的稳定性和生长速率。
附图说明
图1为贴壁因子实验中培养24小时各实验组细胞生长形态照片,其中A为单独添加纤维连接蛋白组,B为单独添加玻连蛋白组培养,C为玻连蛋白和纤维连接蛋白联用,D为不添加贴壁因子。
图2为贴壁因子实验中培养培养60小时各实验组细胞生长形态照片,其中A为单独添加纤维连接蛋白,B为单独添加玻连蛋白组组,C为玻连蛋白和纤维连接蛋白联用。
图3为贴壁因子实验中各实验组不同培养时期细胞活力变化。
图4为生长因子实验各实验组细胞活力。
图5为使用本发明无血清培养基传代至第4代的CHO细胞形态图,此图中细胞培养60h,其中A为无血清培养基培养细胞,B为5%FBS DMEM/F12培养细胞。
图6为使用无血清培养基进行连续传代的CHO细胞密度,每一代的细胞数目为培养至60h测量的数据。
具体实施方式
为了便于理解本发明,下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是,本发明可以以许多不同的形式来实现,并不限于本文所描述的实施例。相反地,提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
实施例1适用于贴壁型CHO细胞的无血清培养基配制
适用于CHO细胞贴壁生长的基础培养基更改了DMEM/F12培养基的微量元素、维生素和氨基酸等,其余组分基本与DMEM/F12培养基一致,配制所得培养基称为“基础培养基”。
基础培养基在配制时首先将各微量元素组分配制成1000倍浓缩液,组成及含量如下:
将各维生素组分配制成1000倍浓缩液,其中肌醇在使用时为单独添加,浓度为13.8mg/L,其他具体组成及含量如下:
将各氨基酸组分配成100倍浓缩液,具体组成及含量如下:
将各基础组分的无机盐溶液配制成50倍母液,具体组成及含量如下:
葡萄糖和GSH配制培养基时直接添加,含量如下:
葡萄糖 3151mg/L
GSH 1mg/L。
将上述浓缩液、母液等加入到1L烧杯中,配制成1倍的液体培养基,使用1mol/LNaCl调节渗透压至270-310mOsm/kg H2O(若调节之前渗透压在此范围内,则无需调节),并使用1mol/L HCl或者NaOH调节pH至7.2-7.5(若调节之前pH在此范围内,则无需调节),然后用0.22μM滤膜过滤除菌,即得基础培养基。
脂类物质配制成浓缩液,称取10mg硬脂酸、10mg十四酸、10mg亚麻酸、10mg亚油酸、5mg花生四烯酸、1g胆固醇溶解于1mL DMSO中,待完全溶解后加入至1L 0.2%吐温溶液,并加入0.2%BSA,37℃水浴加热30分钟。使用时每升基础培养基加入5mL该浓缩液。
激素类物质组成成分及含量为:每升基础培养基中添加10μg地塞米松,3mg乙醇胺,0.5mg腐胺,10mg胰岛素。
生长因子组成及含量具体为每升基础培养基添加0.5mg EGF、0.5mg IGF。
为保证细胞贴壁,加入贴壁因子,具体是每升基础培养基添加1mg玻连蛋白、0.33mg纤维连接蛋白。
实施例2
适用于CHO细胞贴壁生长的基础培养基,其“基础培养基”如实施例1所述。
脂类物质配制成浓缩液,10mg硬脂酸、10mg十四酸、10mg棕榈酸、10mg亚麻酸、10mg亚油酸、10mg油酸、10mg软脂酸、5mg花生四烯酸,待完全溶解后加入至1L 0.2%吐温溶液,并加入0.2%BSA,37℃水浴加热30分钟。使用时每升基础培养基加入0.5mL该浓缩液。
激素类物质组成成分及含量为:每升基础培养基中添加5μg地塞米松,15μg氢化可的松,3mg乙醇胺,0.5mg腐胺,10mg胰岛素,0.5mg孕酮,1mg甲状腺素。
生长因子组成及含量具体为:每升基础培养基添加0.5mg EGF、1mg/L FGF、1mg/LCSF。
贴壁因子组成及含量具体为:每升基础培养基添加1mg玻连蛋白、0.5mg层粘连蛋白,0.5mg/L纤维连接蛋白。
实施例3
适用于CHO细胞贴壁生长的基础培养基,其“基础培养基”配制如实施例1所述。
脂类物质配制成浓缩液,10mg硬脂酸、10mg十四酸、10mg棕榈酸、10mg亚麻酸、10mg亚油酸、10mg油酸、10mg软脂酸、5mg花生四烯酸,待完全溶解后加入至1L 0.2%吐温溶液,并加入0.2%BSA,37℃水浴加热30分钟。使用时每升基础培养基加入1mL该浓缩液。
激素类物质组成成分及含量为:每升基础培养基中添加20μg氢化可的松,6mg乙醇胺,1.5mg腐胺,10mg胰岛素,1mg孕酮,0.2mg甲状腺素,0.2mg肾上腺素。
生长因子组成及含量具体为每升基础培养基添加1mg EGF、1mg IGF,0.2mg/LFGF、0.2mg/L CSF。
实施例4
细胞适应无血清培养基的方法可分为直接适应和连续适应两种。直接适应法将细胞直接从含血清培养基中转入无血清培养基中培养。连续适应法指的是逐步将细胞从有血清培养转换到无血清培养状态。与直接适应法相比,连续适应法相对温和,转入无血清培养基后细胞生长要优于直接适应法。本实施例采用连续适应法进行细胞培养,操作过程如下:
1.以2倍正常接种密度接种生长活跃的CHO细胞培养物到含10%FBS的DMEM/F12培养基:无血清培养基体积比为75:25的混合培养基中,传代培养。
2.当细胞生长稳定后,细胞密度达到2×105-3×105个细胞/mL时,在含10%FBS的DMEM/F12培养基:无血清培养基体积比为50:50的混合培养基中传代培养。
3.以2×105-3×105cell/mL个细胞密度,在含10%FBS的DMEM/F12培养基:无血清培养基体积比为25:75的混合培养基中传代培养。
4.当细胞密度达到1×105-3×105个细胞/mL时,在100%无血清培养基中传代培养。
5.每隔3到5天,当细胞密度达到1×105-3×105个细胞/mL时,细胞活率在90%时,贮备的适应了无血清培养基的CHO细胞培养物应该次传代培养。
实施例5
为了使细胞更好的贴壁生长,需加入贴壁因子。常用的贴壁因子有玻连蛋白、层粘连蛋白、纤维连接蛋白。本实施例通过玻连蛋白、纤维连接蛋白对其作用及添加量做一阐述。
实验设为四组,分别为在基础培养基中单独添加1mg/L玻连蛋白,单独添加1mg/L纤维连接蛋白,同时添加1mg/L玻连蛋白和1mg/L纤维连接蛋白,不添加贴壁因子作为对照。由图1A、1B、1C和1D可看出,在培养至24小时观察,细胞在单独添加1mg/L玻连蛋白或者纤维连接蛋白的无血清培养基中均能很好的贴壁生长,而不添加贴壁因子的对照组细胞则开始漂浮凋亡(图1D)。
培养至48小时观察,单独添加纤维连接蛋白细胞开始飘起,培养至60小时,单独添加粘连蛋白细胞则不能维持贴壁(图2A)。而单独添加玻连蛋白及玻连蛋白和粘连蛋白联用的细胞则继续保持良好的贴壁状态(图2B,2C)。
使用MTT法检测检测细胞活力,结果见图3。在初期(48小时数据)单独添加粘连蛋白的细胞维持较高的细胞活力,生长速率明显高于单独添加玻连蛋白,到后期由于大量细胞失去贴壁能力而凋亡造成细胞活力下降。单独添加玻连蛋白及两种蛋白联用则一直保持较快的生长速率,其中两种蛋白联合使用培养至60h时细胞活力最高。
该实验表明,纤维连接蛋白可维持细胞较好的增殖,玻连蛋白则能维持细胞保持持久的贴壁能力。在使用时应同时玻连蛋白和纤维连接蛋白则可保持较高的细胞增殖和持久的贴壁能力。
实施例6
生长因子添加试验:在基础培养基中添加0.5mg/L IGF、0.5mg/L EGF,培养至60h,从显微镜中观察不到差异。MTT实验检测细胞活力结果见图4,单独添加IGF、EGF或者同时加入IGF、EGF均可提高细胞活力。
实施例7
传代稳定性测试:将驯化至1%血清培养的CHO-K1细胞经过胰蛋白酶消化制成细胞悬液。取5ml实施例1配制的无血清培养基置于培养瓶中,将细胞按照1.5×105个细胞/ml的细胞密度进行接种,5%CO2,37℃培养。细胞长满培养瓶,使用无血清培养基进行传代。以检测其传代稳定性,共进行5次传代。同步使用添加5%FBS DMEM/F12培养基进行传代的CHO-K1细胞进行对照。
通过显微镜观察,连续传代过程中,细胞贴壁良好,培养至60小时可以铺满细胞瓶(图5A、5B),因此每次均在60小时进行传代。从图5可看出无血清培养的细胞形态和5%血清培养的细胞略有差别,培养至60小时,从显微镜中观察细胞量稍低于5%血清培养的细胞。使用MTT检测细胞活力,结果见图6,连续传代过程中,细胞状态稳定,未发现细胞生长速率下降或者上升。
该实验结果表明,本发明所提供的无血清培养基可支持CHO细胞贴壁生长以及连续传代。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种适用于贴壁型CHO细胞的无血清培养基,其特征在于,包括基础培养基及添加在所述基础培养基中的脂类物质、激素类物质、生长因子及贴壁因子;其中,所述脂类物质包含浓度之和大于零的如下各组分:
所述激素类物质包括浓度之和大于零的如下各组分:
所述生长因子包括浓度之和大于零的如下各组分:
所述贴壁因子包括浓度之和大于零的如下各组分:
玻连蛋白 0-10mg/L
层粘连蛋白 0-10mg/L
纤维连接蛋白 0-10mg/L。
2.如权利要求1所述的适用于贴壁型CHO细胞的无血清培养基,其特征在于,所述脂类物质包括浓度之和大于零的如下各组分:
所述激素类物质包括浓度之和大于零的如下各组分:
所述生长因子包括浓度之和大于零的如下各组分:
所述贴壁因子包括浓度之和大于零的如下各组分:
玻连蛋白 0-2mg/L
层粘连蛋白 0-2mg/L
纤维连接蛋白 0-2mg/L。
3.如权利要求1或2所述的适用于贴壁型CHO细胞的无血清培养基,其特征在于,所述基础培养基中具有如下浓度的各微量元素组分:
4.如权利要求3所述的适用于贴壁型CHO细胞的无血清培养基,其特征在于,所述基础培养基中还具有如下浓度的各维生素组分:
5.如权利要求4所述的适用于贴壁型CHO细胞的无血清培养基,其特征在于,所述基础培养基中还具有如下浓度的各氨基酸组分:
6.如权利要求5所述的适用于贴壁型CHO细胞的无血清培养基,其特征在于,所述基础培养基中还具有如下浓度的各基础组分:
7.如权利要求6所述的适用于贴壁型CHO细胞的无血清培养基,其特征在于,所述无血清培养基用NaCl调节渗透压至270-310mOsm/kg H2O,用HCl或NaOH调节酸碱度至pH为7.2-7.5。
8.一种适用于贴壁型CHO细胞的培养方法,其特征在于,使用如权利要求1~7中任一项所述的适用于贴壁型CHO细胞的无血清培养基对CHO细胞进行培养。
9.如权利要求8所述的适用于贴壁型CHO细胞的培养方法,其特征在于,是将CHO细胞直接使用所述适用于贴壁型CHO细胞的无血清培养基进行培养。
10.如权利要求8所述的适用于贴壁型CHO细胞的培养方法,其特征在于,是使用连续适应方法对所述CHO细胞进行培养,具体是:先使用含胎牛血清的培养基与所述适用于贴壁型CHO细胞的无血清培养基的混合培养基对所述CHO细胞进行传代培养,且每次传代后的混合培养基中所述适用于贴壁型CHO细胞的无血清培养基的比例均较前一次增加,直至最后只使用所述适用于贴壁型CHO细胞的无血清培养基进行培养。
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