CN101892286B - 黑素细胞生物活性检测及个体化培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种黑素细胞生物活性检测方法及个体化培养方法。本发明采用HU16选择性培养基在体外成功培养了白癜风患者的移植所需足量的黑素细胞，建立了黑素细胞细胞分裂时间(DOT)、黑素含量(M)和黑素制造量(MP)的检测方法；同时建立了黑素细胞个体化培养实验方案，效果明显。本发明为自体黑素细胞移植治疗白癜风筛选生物学活性好的黑素细胞提供了实用可靠的实验依据，并对生长不好黑素细胞进行个体化矫正后再进行细胞移植提供了较好的实验方案。

Description

黑素细胞生物活性检测及个体化培养方法

(一)技术领域

本发明提供了一种黑素细胞生物活性检测方法及个体化培养方法。

(二)背景技术

随着黑素细胞培养技术的日益成熟，使用培养的自体黑素细胞移植成为目前白癜风治疗的研究和发展方向之一。移植的纯黑素细胞能为白癜风区域提供新的黑素细胞来源，通过增殖扩散，使白斑区复色。用培养的黑素细胞作移植最大技术难点在于黑素细胞生长较差，无法在短期内大量扩增。

移植的黑素细胞生物学活性对疗效有着极其重要的作用，挑选选生物学活性好的黑素细胞进行移植可明显提高疗效，目前还没有对移植的自体黑素细胞生物学活性进行检测的研究报道。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种黑素细胞生物活性检测方法及利用该检测方法对黑素细胞个体化培养的方法。

本发明采用的技术方案是：

黑素细胞生物活性检测方法，所述方法包括：取分离自白癜风患者表皮细胞的黑素细胞，进行传代培养，传代培养过程中进行下述参数评测：

(1)黑素细胞分裂时间DOT计算：每次接种和传代时计数黑素细胞数量，计算获得传代时细胞生长倍数P，根据细胞生长倍数P和生长时间T，按公式计算细胞黑素分裂时间DOT＝0.3T/logP，单位为日；

(2)黑素含量M计算：用二甲基亚砜溶解已知浓度的黑色素，在分光度计475nm处测吸光度A₀，以黑色素含量为横坐标、以对应吸光度值为纵坐标制作标准曲线；在黑素细胞接种和传代时，收集定量黑素细胞离心，加入1mol/l NaOH在37℃水浴溶解细胞30分钟后，在分光度计475nm处测细胞吸光度A，根据标准曲线计算获得每个细胞的黑素含量M，单位ng/cell；

(3)黑素制造量MP计算：MP＝(M₂×P-M₁)/1.3D(P-1)，其中：MP为黑素细胞制造量，单位ng/cell/24hr；M₁为接种时细胞黑素含量，单位ng/cell；M₂为传代时细胞黑素含量，单位ng/cell；P为细胞增长倍数；D为细胞分裂时间DOT，单位日；

(4)结果判断：若传代细胞的DOT值＜4.5，且M、MP数值稳定(M：0.15～0.30ng/cell，MP＜0.10ng/cell/24hour)，则判定该传代细胞处于开始或生长阶段，适宜进行自体黑素细胞移植。

自体黑素细胞悬液移植治疗稳定期白癜风是一种有效的手术方法，接种的细胞浓度为60000～100000/cm²，根据移植面积计算需要细胞量，所以一般要求第三代以后的黑素细胞才能满足移植要求。黑素细胞的生长过程包括开始、生长和衰老三个阶段，移植的黑素细胞要求处在开始或生长阶段。衰老的细胞活性差，在患者移植区不易生长和分化，所以判断移植的黑素细胞的生长阶段很重要。黑素细胞在生长的开始阶段过程中细胞生长快速，黑素含量降低；生长阶段细胞生长快速，黑素含量及黑素制造量维持恒定；衰老阶段细胞生长缓慢，黑素含量和黑素制造量升高。本发明对白癜风患者黑素细胞分裂时间、黑素含量和黑素制造量进行检测分析，从而判断细胞的生长阶段，为移植选择黑素细胞提供了实验依据。

细胞的分裂时间(DOT)是指连续分裂的细胞从第一次完成分裂开始到下一次完成分裂为止所经过的时间，黑素细胞DOT小，表明黑素细胞的分裂和增殖能力强，细胞的生物学活性好，此类细胞移植到患者皮损处的成活率就相对较高，疗效就好。

本发明还涉及一种黑素细胞个体化培养方法，所述方法包括：

(一)取分离自白癜风患者表皮细胞的黑素细胞，于Hu16培养基中进行传代培养，传代培养过程中进行下述参数评测：

1)黑素细胞分裂时间DOT计算：每次接种和传代时计数黑素细胞数量，计算获得传代时细胞生长倍数P，根据细胞生长倍数P和生长时间T，按公式计算细胞黑素分裂时间DOT＝0.3T/logP，单位为日；

2)黑素含量M计算：用二甲基亚砜溶解已知浓度的黑色素，在分光度计475nm处测吸光度A₀，以黑色素含量为横坐标、以对应吸光度值为纵坐标制作标准曲线；在黑素细胞接种和传代时，收集定量黑素细胞离心，加入1mol/l NaOH在37℃水浴溶解细胞30分钟后，在分光度计475nm处测细胞吸光度A，根据标准曲线计算获得每个细胞的黑素含量M，单位ng/cell；

3)黑素制造量MP计算：MP＝(M₂×P-M₁)/1.3D(P-1)，其中：MP为黑素细胞制造量，单位ng/cell/24hr；M₁为接种时细胞黑素含量，单位ng/cell；M₂为传代时细胞黑素含量，单位ng/cell；P为细胞增长倍数；D为细胞分裂时间DOT，单位日；

所述Hu16培养基终浓度组成如下：bFGF 25ng/ml，CT 10ng/ml，IBMX 20ug/ml，10％(v/v)胎牛血清，溶剂为F12培养基；

(二)根据传代细胞参数评测结果，对培养基组分进行调整：

1)、若某一代传代细胞的DOT值＞3.5，M值降低(M＜0.15)，细胞的树突无变化，则从其下一代起将Hu16培养基中胎牛血清浓度增加到15％～20％进行传代培养；

2)、若某一代传代细胞的DOT值＞3.5，M值升高(M＞0.30)，细胞的树突无变化，则从其下一代起将Hu16培养基中bFGF浓度增加到40～80ng/ml进行传代培养；

3)、若某一代传代细胞的DOT值＞3.5，且伴有细胞树突减少(＜3)，则将其下一代传代培养的Hu16培养基中的IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)浓度增加到30～60ug/ml、CT(霍乱毒素)浓度增加到20～40ng/ml进行传代培养。

HU16是用系统研究设计的选择性培养基，以bFGF取代TPA，用复式cAMP增高剂能较长时间维持胞内较高cAMP水平，使培养效果得到改善。黑素细胞仅占表皮细胞的2％～3％，为了使黑素细胞能在体外连续传代培养，采用黑素细胞选择性Hu16培养基在体外成功培养了移植所需的足量黑素细胞，该培养基不含TPA，大大提高了移植的安全性。

黑素细胞生长需三种主要因素，即血清、生长因子与cAMP，本发明应用的HU16培养基包括bFGF、CT、IBMX和胎牛血清。bFGF是黑素细胞的天然分裂剂，同时又可以刺激黑素细胞的生长。CT可提高环磷酸腺苷(cAMP)水平，刺激黑素细胞增殖；IBMX是磷酸二酯酶抑制剂，使细胞内cAMP分解减少，两者联合作用可使细胞内cAMP水平升高，促进黑素细胞增殖。胎牛血清为细胞生长提供必要的营养成分，促进黑素细胞的生长。根据系统化研究，根据报道生长因子不足时黑素生长较慢，但细胞突及黑素含量正常；cAMP不足时细胞生长较慢，细胞突及黑素含量较少；血清不足时细胞生长较慢，黑素含量减小但细胞突正常。因此根据细胞生长快慢(DOT值)、细胞突及黑素量可以判断缺乏的因素，可在此基础上对黑素细胞制定不同的补充方案，进行个体化矫正。

本发明的有益效果主要体现在：本发明采用HU16选择性培养基在体外成功培养了白癜风患者的移植所需足量的黑素细胞，建立了黑素细胞细胞分裂时间(DOT)、黑素含量(M)和黑素制造量(MP)的检测方法；同时建立了黑素细胞个体化培养实验方案，效果明显。本发明为自体黑素细胞移植治疗白癜风筛选生物学活性好的黑素细胞提供了实用可靠的实验依据，并对生长不好黑素细胞进行个体化矫正后再进行细胞移植提供了较好的实验方案。

(四)附图说明

图1为第三代细胞个体化培养细胞数量及形态观察结果(×100)；A：常规培养接种时；B：个体化培养接种时；C：常规培养2天；D：个体化培养2天后，细胞的数量较常规培养增多，细胞树突也有所增加；；E：常规培养5天；F：个体化培养5天后，细胞的数量较常规培养明显增多，细胞树突也明显增加。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

一、材料与方法

(1)病例

10例白癜风患者为2009年6月至2009年9月杭州市第三人民医院皮肤科白癜风专病门诊患者，均符合中国中西医结合学会皮肤性病专业委员会色素病学组制定的诊断标准(中国中西医结合学会皮肤性病专业委员会色素病学组.白癜风临床分型及疗效标准(2003年修订稿)[J].中华皮肤科杂志，2004，37(7)：440.)；病期参照VIDA评分标准(Njoo MD，Das PK，Bos JD，et al.Association of theKobner phenomenon with disease activity and therapeuticresponsiveness in vitiligo vulgaris.Arch Dermatol，1999，135(4)：407-413.)，均为稳定期节段型白癜风患者，病情稳定时间均在6个月以上。所有患者均经知情同意，试验方案经医院伦理委员会讨论通过。

(2)试剂和仪器

F12基础培养基、胎牛血清、谷胺酰氨、庆大霉素、0.25％胰酶、0.02％EDTA、0.05％胰酶-EDTA、D-Hank′s液、基因素均购自GIBCO公司，霍乱毒素(CT)、IBMX购自SIGMA公司，人重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)购自Pepro-Tech公司。倒置显微镜和立体显微镜为OLYMPAS产品。

(3)方法

1.表皮细胞悬液制备：使用表皮分离吸疱仪在白癜风患者腹部正常皮肤处吸疱4个(负压40kPa，时间60～90分钟)，表皮面积共为2.0cm²，用虹膜剪沿水疱壁边缘剪下疱壁，置于无菌D-Hank′s液中。用0.25％胰蛋白酶及0.02％EDTA先后在37℃消化10分钟。在立体显微镜下剥下角质层，刮下角质层下及真皮上的细胞。用D-Hank′s液冲洗后1000r/min离心5分钟，收集沉淀细胞重悬浮于培养基中。

2.黑素细胞培养：用黑素细胞Hu16选择性培养基(以F12基础培养基为基质，含bFGF 25ng/ml、CT10ng/ml、IBMX 20ug/ml和10％胎牛血清)将细胞团吹打成细胞悬液，调整细胞浓度5×10⁵/mL接种于培养瓶中，置37℃，5％CO₂培养箱内培养。在第三天加入基因素以去除角质形成细胞和成纤维细胞的污染，隔天换液1次。当黑素细胞融合后，用0.05％胰酶-EDTA将黑素细胞从培养瓶上消化下来进行传代培养。

3.黑素细胞分裂时间(DOT)计算：每次接种和传代时均计数黑素细胞数量，计算获得传代时细胞生长倍数P，根据细胞生长倍数(P)和生长时间(T)，按照公式计算黑素细胞分裂时间(DOT)，DOT＝0.3T/logP。

4.黑素含量(M)计算：用DMSO溶解已知浓度的黑色素，在分光光度计475nm处测吸光度(A)，以黑色素含量为横坐标、以对应吸光度值为纵坐标制作标准曲线。在黑素细胞接种和传代时，收集一定数量的黑素细胞离心，加入1mol/LNaOH在37℃水浴箱溶解细胞30分钟，在分光光度计475nm处测吸光度(A)，在标准曲线上查找和计算每个细胞的黑素含量(M)。

5.黑素制造量的计算：MP＝(M₂×P-M₁)/1.3D(P-1)。

MP：黑素细胞制造量(ng/cell/24hr)

M₁：接种时细胞黑素含量(ng/cell)

M₂：传代时细胞黑素含量(ng/cell)

P：细胞增长倍数

D：细胞分裂时间(DOT，日)

6.个体化培养：

①培养过程中发现黑素细胞生长速度缓慢(DOT＞3.5)，每个细胞黑素含量降低(M＜0.15)，细胞的树突无变化，增加胎牛血清浓度到15％～20％。

②细胞DOT值大(DOT＞3.5)，每个细胞黑素含量升高(M＞0.30)，细胞的树突无变化，则提高bFGF浓度至40～80ng/ml。

③细胞DOT值大(DOT＞3.5)且伴有细胞树突减少(＜3)，则增加IBMX浓度至30～60ug/ml、增加CT浓度至20～40ng/ml，以促进细胞的生长及分化。

二、结果

(1)细胞培养

从患者表皮中分离到的黑素细胞数量平均为0.41±0.16×10⁴个/cm²。表皮细胞悬液接种至培养瓶2小时后细胞开始贴壁。在第3天加入基因素，可选择性的杀伤角质形成细胞和成纤维细胞，而对黑素细胞无影响，3～4天后即可去除角质形成细胞而获得纯黑素细胞。在经过16.4±7.2天的培养后进行传代，黑素细胞的数量增加53～109倍(平均为84倍)。经过传代后培养黑素细胞数量明显增加，第二代平均为1.6±0.3×10⁶个，第三代平均为3.0±0.7×10⁶个，第四代平均为5.4±1.0×10⁶个，第五代平均为9.4±2.5×10⁶个，第六代平均为16.7±3.8×10⁶个，第七代平均为26.3±8.1×10⁶个。

(2)细胞生物学活性

10例白癜风患者黑素细胞第一代至第七代的生物学活性(见表1)。10例患者黑素细胞第一代DOT均在2.10以下；病例1、2、3、8第二代黑素细胞DOT大于3.50，第三代到第六代细胞的DOT明显增大；病例4、5、6、7、9、10第二代黑素细胞DOT均在3.50以下，第三代到第六代细胞的DOT均在4.50以下；10例患者第七代细胞DOT均在5.50以上。病例1、2、3、8第二代到第六代黑素细胞M均较大，数值不稳定；病例4、5、6、7、9、10第二代到第六代黑素细胞M数值均在0.35以下，且每例患者的第二代到第六代的M数值稳定；10例患者第七代细胞的M均明显增大。10例患者黑素细胞第一代到第七代的MP均在0.15以下。

(3)个体化培养细胞生物学活性

4例白癜风患者第二代生物学活性不好的黑素细胞常规培养和个体化培养后的细胞生物学活性(见表2)。常规培养和个体化培养第三代到第七代的DOT分别平均为4.55和3.40、4.28和3.39、7.16和4.14、6.12和4.73、12.33和7.19；M分别平均为0.330和0.224、0.289和0.213、0.328和0.277、0.309和0.257、0.430和0.326；MP分别平均为0.062和0.041、0.061和0.030、0.053和0.042、0.062和0.055、0.067和0.057。4例患者第二代黑素细胞进行个体化培养后细胞的DOT明显减小，M和MP数值稳定，提示细胞的生物学活性明显变好，生长处于开始或生长阶段。

4例患者第二代黑素细胞个体化培养的培养基组成分别如下：

病例1：

细胞DOT值＞3.5，且伴有细胞树突减少(＜3)，从第三代起将CT与IBMX分别增加至30ng/ml与50ug/ml。

病例2：

生长速度缓慢(DOT值＞3.5)，细胞黑素含量降低(M＜0.15)，细胞的树突无变化，从第三代起增加胎牛血清浓度到20％。

病例3：

细胞DOT值＞3.5，细胞黑素含量升高(M＞0.3)，从第三代起提高bFGF浓度到60ng/ml。

病例8：

细胞DOT值＞3.5，细胞黑素含量升高(M＞0.3)，从第三代起提高bFGF浓度到60ng/ml。

(4)个体化培养细胞数量及形态观察

接种时细胞的数量和形态相似；培养2天后个体化培养细胞的数量较常规培养增多，细胞树突也有所增加；培养5天后个体化培养细胞的数量较常规培养明显增多，细胞树突也明显增加(见图1)。

三、结论

研究发现10例患者黑素细胞第一代DOT均在2.10以下；病例1、2、3、8第二代黑素细胞DOT大于3.50，第三代到第六代细胞的DOT明显增大；病例4、5、6、7、9、10第二代黑素细胞DOT均在3.50以下，第三代到第六代细胞的DOT均在4.50以下；10例患者第七代细胞DOT均在5.50以上。病例1、2、3、8第二代到第六代黑素细胞M均较大，数值不稳定；病例4、5、6、7、9、10第二代到第六代黑素细胞M数值均在0.35以下，且每例患者的第二代到第六代的M数值稳定；10例患者第七代细胞的M均明显增大。10例患者黑素细胞第一代到第七代的MP均在0.15以下。以上结果表明病例4、5、6、7、9、10第一代至第六代的黑素细胞和病例1、2、3、8第一代的黑素细胞生长均处于开始或生长阶段，可进行自体黑素细胞移植；病例1、2、3、8第二代至第七代的黑素细胞和病例4、5、6、7、9、10第七代的黑素细胞生长均有明显衰老现象，此类细胞不易进行自体黑素细胞移植。

根据细胞生长快慢(DOT值)、细胞突及黑素量可以判断缺乏的因素，在此基础上对病例1、2、3、8第二代黑素细胞制定了不同补充方案，进行个体化矫正。个体化培养后细胞的数量明显增多，细胞的树突也明显增加。个体化矫正后病例1、2、3、8第三代到第六代细胞的DOT均明显减小(5.00以下)，且M和MP数值稳定，细胞的生长为开始和生长阶段，这类细胞可以进行自体黑素细胞移植。但进行个体化矫正后第七代的黑素细胞DOT均较大(7.0以上)，细胞明显衰老，不易进行细胞移植。研究发现稳定期白癜风患者生物学活性好的六代以内的黑素细胞和生物学活性不好的六代以内的黑素细胞在经过个体化矫正后，均可用于临床移植治疗；但第七代的白癜风患者黑素细胞，不管是否经过个体化矫正，都不易进行细胞移植。

表1：10例白癜风患者黑素细胞的生物学活性

注：DOT：细胞分裂时间(天)；M：每个细胞黑素含量(ng/cell)；MP：每个细胞24小时黑素制造量(ng/cell/24hr)。

表2：常规培养和个体化培养黑素细胞生物学活性的比较

注：DOT：细胞分裂时间(天)；M：每个细胞黑素含量(ng/cell)；MP：每个细胞24小时黑素制造量(ng/cell/24hr)。

*：常规培养  △：个体化培养。

Claims (2)

1.黑素细胞生物活性检测方法，所述方法包括：取分离自白癜风患者表皮细胞的黑素细胞，进行传代培养，传代培养过程中进行下述参数评测：

(1)黑素细胞分裂时间DOT计算：每次接种和传代时计数黑素细胞数量，计算获得传代时细胞生长倍数P，根据细胞生长倍数P和生长时间T，按公式计算细胞黑素分裂时间DOT＝0.3T/logP，单位为日；

(2)黑素含量M计算：用二甲基亚砜溶解已知浓度的黑色素，在分光度计475nm处测吸光度A₀，以黑色素含量为横坐标、以对应吸光度值为纵坐标制作标准曲线；在黑素细胞接种和传代时，收集定量黑素细胞离心，加入1mol/1NaOH在37℃水浴溶解细胞30分钟后，在分光度计475nm处测细胞吸光度A，根据标准曲线计算获得每个细胞的黑素含量M，单位ng/cell；

(3)黑素制造量MP计算：MP＝(M₂×P-M₁)/1.3D(P-1)，其中：MP为黑素细胞制造量，单位ng/cell/24hr；M₁为接种时细胞黑素含量，单位ng/cell；M₂为传代时细胞黑素含量，单位ng/cell；P为细胞增长倍数；D为细胞分裂时间DOT，单位日；

(4)结果判断：若传代细胞的DOT值＜4.5，且M、MP满足：0.15＜M＜0.30，MP＜0.10，则判定该传代细胞处于开始或生长阶段，适宜进行自体黑素细胞移植。

2.一种黑素细胞个体化培养方法，所述方法包括：

(一)取分离自白癜风患者表皮细胞的黑素细胞，于Hu16培养基中进行传代培养，第二代黑素细胞传代培养过程中进行下述参数评测：

(1)黑素细胞分裂时间DOT计算：每次接种和传代时计数黑素细胞数量，计算获得传代时细胞生长倍数P，根据细胞生长倍数P和生长时间T，按公式计算细胞黑素分裂时间DOT＝0.3T/logP，单位为日；

(2)黑素含量M计算：用二甲基亚砜溶解已知浓度的黑色素，在分光度计475nm处测吸光度A₀，以黑色素含量为横坐标、以对应吸光度值为纵坐标制作标准曲线；在黑素细胞接种和传代时，收集定量黑素细胞离心，加入1mol/l NaOH在37℃水浴溶解细胞30分钟后，在分光度计475nm处测细胞吸光度A，根据标准曲线计算获得每个细胞的黑素含量M，单位ng/cell；

(3)黑素制造量MP计算：MP＝(M₂×P-M₁)/1.3D(P-1)，其中：MP为黑素细胞制造量，单位ng/cell/24hr；M₁为接种时细胞黑素含量，单位ng/cell；M₂为传代时细胞黑素含量，单位ng/cell；P为细胞增长倍数；D为细胞分裂时间DOT，单位日；

所述Hu16培养基终浓度组成如下：

bFGF 25ng/ml，CT 10ng/ml，IBMX 20ug/ml，胎牛血清10％，溶剂为F12基础培养基；

(二)根据传代细胞各参数评测结果，对培养基组分进行调整：

1)、若传代细胞的DOT值＞3.5，M值降低至M＜0.15，细胞的树突无变化，则将Hu16培养基中胎牛血清浓度增加到15％～20％；

2)、若传代细胞的DOT值＞3.5，M值升高至M＞0.3，细胞的树突无变化，则将Hu16培养基中bFGF浓度增加到40～80ng/ml；

3)、若传代细胞的DOT值＞3.5，且细胞的树突减少至＜3，则将Hu16培养基中的IBMX浓度增加到30～60ug/ml、CT浓度增加到20～40ng/ml。