CN102260650B - 鸡马立克氏病毒的大规模生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种大规模生产鸡马立克氏病毒的方法，利用生物反应器，以细胞微载体悬浮培养系统生产鸡马立克氏病病毒，将制备病毒用鸡胚成纤维细胞接种到含有培养液与微载体的载体罐，并将上述细胞与微载体混合均匀，使细胞贴附在微载体上；在适当培养环境下，提供上述细胞足够的养分和适宜的气体环境，使细胞在上述微载体上生长至接种浓度的5～10倍；换用细胞维持液，将鸡马立克氏病毒制成病毒悬液，使其吸附到上述细胞上；在适当培养环境下培养病毒；连续培养3～4天后，收获细胞，制成细胞悬液；分装安瓿瓶，密封后置于程序降温仪，然后转入液氮保存。该方法生产规模大、单批次产量高、生产成本相对较低。

Description

鸡马立克氏病毒的大规模生产方法

技术领域

本发明涉及一种鸡马立克氏病毒的大规模生产方法，特别是指一种潮汐式生物反应器大规模生产鸡马立克氏病毒的方法。 

背景技术

马立克氏病(Marek’s disease，MD)是由疱疹病毒科的马立克氏病毒(Marek’s disease virus，MDV)引起的鸡的一种传染性肿瘤性疾病，以淋巴组织增生和肿瘤形成为特征，在外周神经、性腺、虹膜各种脏器、肌肉和皮肤发生单核细胞浸润。MD在临床上引起肿瘤和死亡的同时，更重要的是损害感染鸡的免疫器官，造成免疫抑制，导致机体抵抗力下降和对接种疫苗的免疫应答降低或不应答，引发其他多种疾病的并发和继发感染，造成巨大的经济损失。 

疫苗接种仍是目前控制马立克氏病的有效途径之一。疫苗生产的关键点就是作为抗原的病毒的生产。目前使用的商品化鸡马立克氏病疫苗大都是用原代鸡胚成纤维细胞作为制苗材料，以获得马立克氏病毒。产业化生产多采用传统转瓶培养，如《鸡马立克氏病二价活疫苗(CVI988/Rispens+HVT)生产工艺的优化》(南京农业大学，顾丙生，2007年硕士论文)一文中使用了转瓶生产鸡马立克氏病病毒。但转瓶方法在生产中细胞所能增殖的区域仅限于培养转瓶的有限面积，培养的环境条件难以检测和控制，因此细胞密度低，劳动强度大，批间差异大，病毒含量不高引起质量不稳定，操作过程易污染，疫苗产量及质量受到极大限制。 

生物反应器技术高密度生产是七十年代新开发的技术，利用此技术连续培养工艺生产具有良好的商业开发前景。利用生物反应器规模化生产可以克服转瓶培养的以上缺陷，它具有操作方便、占地小、 节省人工、可控程度高、病毒含量高和产量高、易于进行标准化控制。 

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种鸡马立克氏病毒的大规模生产方法，以解决鸡马立克氏病疫苗的产量及质量不佳的问题。 

技术方案 

本发明的鸡马立克氏病毒的大规模生产方法，包括如下步骤： 

1)在生物反应器中，接种鸡胚成纤维细胞至生物反应器内的微载体上，进行细胞的吸附培养； 

2)在细胞的吸附培养结束后进行细胞的扩增培养； 

3)将鸡马立克氏病毒接种到扩增培养的鸡胚成纤维细胞上，进行病毒的吸附培养； 

4)在病毒的吸附培养结束后进行病毒的增殖培养； 

5)在接种的鸡胚成纤维细胞CPE达到70％以上时，收获病毒液，保存病毒液； 

其中，本发明的生物反应器为潮汐式生物反应器。 

优选地，本发明的所述微载体由选自聚酯、明胶或多糖的一种或几种制成。 

优选地，本发明的所述微载体以0.1×10⁸～3.0×10⁸cells/g的终密度接种细胞。 

优选地，本发明的所述微载体以2.2×10⁸cells/g的终密度接种细胞。 

优选地，本发明的所述微载体的添加量为5～30g/L。 

优选地，本发明的步骤2)中接种时的细胞浓度为0.5×10⁷～1.0×10⁸cells/g。 

优选地，本发明的所述鸡马立克氏病毒为血清I型、血清II型和血清III型中的一种或一种以上的组合。 

优选地，本发明的步骤3)中所述鸡马立克氏病毒接种的感染复数为0.02。 

优选地，本发明的步骤1)中所述的吸附培养和步骤2)中所述的扩增培养使用含3％～5％(V/V)牛血清的M199细胞培养液；步骤3)中所述的病毒吸附培养和步骤4)中所述的病毒增殖培养使用2％(V/V)牛血清的DMEM细胞培养液，其中所述的牛血清为胎牛血清、新生牛血清或小牛血清。 

优选地，本发明的步骤1)-步骤4)中载体罐中培养液的液面上下行速度为0.5～50L/分钟，液面在载体上下端点停滞时间为0～150s，步骤1)和步骤3)程序运行为60～240分钟。 

优选地，本发明在步骤1)至步骤4)的培养过程中控制温度37℃，pH调节7.0～7.5，二氧化碳浓度为3％～5％的条件下进行。 

本发明的另一目的在于提供一种使用上述大规模培养方法获得的鸡马立克氏病病毒液。 

本发明的又一个方面为由上述方法制备鸡马立克氏病毒在疫苗生产中的应用。 

由上可以看出，本发明创造性地使用潮汐式生物反应器生产鸡马立克氏病毒，而且对潮汐式培养方法进行了工艺的优化和参数的调整，使得大规模生产具有高质量、免疫力强的鸡马立克氏病疫苗成为可能。 

本发明的大规模生产鸡马立克氏病毒的方法，克服了传统的转瓶或摇瓶培养，不能对培养液的养分、pH及溶氧等培养条件进行实时调整，无法保证细胞处于最佳培养状态的缺点；克服了传统的转瓶或摇瓶培养，操作程序繁琐，有污染风险的暴露点多，生产工艺难放大的缺点；克服了转瓶或摇瓶培养，批间差异大，生产质量难以控制，产品质量不稳定的缺点。 

因此，本发明的大规模生产鸡马立克氏病毒的方法具有条件可控、操作简便、污染风险小、无过敏原、生产批间差异小等优点，病毒质量好和产量可以放大，能够提供产品规模大、成本低、品质高的鸡马立克氏病疫苗。 

附图说明

图1为本发明实施例中使用的潮汐式生物反应器示意图。 

具体实施方式

本实施例中采用的生物反应器是美国CESCO公司生产的TideCell-020型，载体罐体积为20L，培养基袋体积为200L。 

生物反应器结构见图1，其主要组成部分包括：进料桶、收料桶、自动馈料仪、pH/DO监控器、恒温振荡箱、培养液袋、电脑控制器、载体罐、载体、恒温培养舱、进/取样管。各组成部分的主要功能如下： 

载体罐放置于恒温培养舱中，恒温培养舱为载体罐提供一个恒温的环境。载体罐是细胞培养与病毒增殖的场所，细胞贴附生长在载体罐内部的载体上，当培养液泵入载体罐时，载体罐内的培养液液面上升并淹没细胞，向细胞供给养分，并将细胞的新陈代谢产物从细胞上去除。当载体罐内的培养液被泵出时，载体罐中的培养液液面随之下降，细胞露出，进行通风供氧。这个重复的运动使载体上的细胞能够得到足够的营养和氧气，同时产生的代谢废物如CO₂能够有效地被排出去。 

载体罐的盖子上装有数根管道，这些管道的作用包括：人工手动方式向载体罐内注入液体(如接种细胞悬液等)或排出载体罐内的液体；由电脑控制器向载体罐注入气体，气体通常是压缩空气、氧气及CO₂三种的混合物，三种气体在混合物中的比例可以自动调节控制，以适应细胞培养需要。电脑控制器可自动控制混合气体向载体罐内的注入与排出，并为潮汐提供动力。 

培养液袋用以盛装培养液，并通过管道与载体罐底部相通，通过与载体罐之间的液体流动，从而完成潮汐过程。培养液在潮汐过程中的灌流速度可通过电脑控制器进行调整。培养液的换液量是指在一次潮汐过程中，泵入或泵出载体罐的液体量，换液量的大小决定了载体罐内液面顶部和底部所处的位置。 

在培养液袋与载体罐之间相连通的管道上设有进/取样管，可使 用无菌注射器通过进/取样管对培养液进行取样，用以检测其中的葡萄糖含量及病毒含量等指标。 

恒温振荡箱通过加热与振荡，来维持培养液袋内培养液温度的恒定及成分的匀质性。 

收料桶及进料桶均通过自动馈料仪与培养液袋相连，培养液袋内的培养液需要进行收获时，可通过自动馈料仪进入收料桶，而进料桶内的培养液则可以通过自动馈料仪对培养液袋进行补充。 

pH/DO监控器可以监测培养液袋内培养液的酸碱度(pH)及溶氧(DO)(溶氧是指氧气在培养液中的溶解饱和度)，并通过向培养液袋内自动注入碱性溶液(如NaOH溶液或NaHCO₃溶液)将培养液的pH值控制在合适范围内。 

电脑控制器可以调节控制多种参数，如潮汐过程中载体罐内培养液的潮汐速率及频率、恒温培养舱的温度、溶氧、CO₂浓度(指载体罐内液面上方的混合气体中CO₂所占的体积百分比)等。 

对培养液中葡萄糖含量的调节是通过人工方式进行，根据对培养液中剩余葡萄糖的含量测定结果及培养液的总体积计算出需补加的葡萄糖量，然后通过注射器将高浓度的葡萄糖溶液从进/取样管处注入培养液。 

采用的载体为该公司生产的BioNocII聚酯纤维，该纤维是网状结构，具有亲水性和生物无害性，1g载体提供2400cm²的贴壁面积，能够提供约1.0×10⁹细胞的生长空间，每升载体罐体积需要数量为11g的BioNocII聚酯纤维。 

本实施例中，鸡马立克氏病毒为血清I型的CVI988/Rispens株，公开于CN1008969B，保藏号为CCTCC0002，为目前常见的马立克氏病毒，具有普遍意义。其他类型的鸡马立克氏病毒也可以使用本发明的实施例方法生产获得。 

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。 

实施例1鸡马立克氏病毒的大规模培养 

使用上述潮汐式反应器，制备步骤如下： 

(1)制备鸡胚成纤维细胞(CEF)种子液，使细胞总数达到2.0×10⁹个。 

(2)在上述潮汐式生物反应器中，向含有载体罐中加入步骤(1)所述的CEF细胞种子液，向培养基袋加入500L含4％(v/v)牛血清的M199细胞生长液，同时连接载体罐与培养基袋。 

(3)在37℃、pH 7.2、3.5％CO₂环境下进行培养细胞，设置培养参数如下，细胞吸附程序： 

液面上升速率(up rate)2600ml/min、液面顶部停留时间(hold time)15s，液面下降速率(down rate)2600ml/min、液面底部停留时间(hold time)10s；吸附程序持续4h；切换细胞培养程序：液面上升速率(up rate)2000ml/min、液面顶部停留时间(hold time)10s，液面下降速率(down rate)2000ml/min、液面底部停留时间(hold time)2min。 

(4)待细胞浓度达到2.2×10⁸cells/g载体，将M199细胞生长液全部抽出，换上2％(v/v)牛血清的DMEM细胞维持液，接种鸡马立克氏病毒。 

(5)在37℃、pH 7.2、3.5％CO₂环境下进行培养病毒；设置培养参数如下，病毒吸附程序病毒吸附程序： 

液面上升速率(up rate)2300ml/min、液面顶部停留时间(hold time)2min，液面下降速率(down rate)2300ml/min、液面底部停留时间(hold time)10s；吸附程序持续4h；切换细胞培养程序：液面上升速率(up rate)1900ml/min、液面顶部停留时间(hold time)20s，液面下降速率(down rate)1900ml/min、液面底部停留时间(hold time)2min。 

(6)细胞病变率(CPE)达70％以上时收获病毒。 

鸡马立克氏病毒种毒的检验：按照《中华人民共和国药典》2005版第三部附录15页、19页、20页进行检验，无细菌和霉菌、支原体、外源病毒污染，另外无鸡传染性贫血病毒污染。安全性和免疫原性均符合《中华人民共和国兽药生物制品规程》。 

测定病毒含量方法如下：将CEF接种于细胞方瓶，待到细胞长成单层，按常规方法制备次代CEF，接种于24孔板，每板细胞含量为1.2×10⁷个，培养8～12h备用；10倍系列稀释病毒液取10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7稀释度各接种上述制备好的24孔细胞培养板，每孔0.1ml，每个稀释度设置4个重复。观察细胞病变率，计算蚀斑数。制苗毒液每1.0ml病毒含量1.0×10⁷PFU。 

实施例2不同培养系统增殖鸡马立克氏病毒的相关比较 

将上述潮汐式生物反应器与3000mL转瓶培养鸡马立克氏病毒进行了比较，其中转瓶培养中使用的条件和方法为：37℃恒温温室，转瓶机8r/h培养。 

1)在3000ml转瓶中生产鸡马立克氏病毒，先制备鸡胚成纤维细胞(CEF)，以终浓度1.5×10⁶cells/ml接种至3000ml转瓶，加细胞生长液至300ml。置37℃温室中于转瓶机上5r/h培养，以此方式培养细胞至24h接种鸡马立克氏病毒，接毒前先把3000ml转瓶中的细胞生长液倒掉，按感染复数0.02进行接毒，补加细胞维持液至300ml，置37℃温室中于转瓶机上8r/h培养，此过程为病毒吸附1h后。自接毒之时起算培养至72h，收获细胞，1500r/min离心10min弃上清并用30ml冻存保护液悬浮，分装安瓿瓶，密封后置程序降温仪再转入液氮中保存，测定蚀斑含量PFU。 

2)在20L的生物反应器中生产鸡马立克氏病毒，方法步骤同实施例1。 

3)实验结果：3000ml转瓶中培养鸡马立克氏病毒平均蚀斑数为2.0×10⁶PFU/ml，而20L反应器中培养鸡马立克氏病毒的平均蚀斑数为1.0×10⁷PFU/ml。各项参数比较具体见下表。 

本发明中使用的TideCell-020悬浮培养系统载体罐体积为20L，载体为BioNocII聚酯纤维，添加载体220g，1g载体能够提供2400cm²的细胞贴壁面积，若要达到和TideCell-020相同的贴壁面积则需要423个3000的转瓶，然而获得的蚀斑数是转瓶系统的3倍多。整个TideCell采用全自动封闭式培养，需要的人力明显低于转瓶系统，并且污染的机率也明显降低。再从耗材成本上比较，TideCell仅需要悬浮培养的整个系统，而转瓶系统则需要大量的转瓶和转瓶机。从清洗成本上，TideCell若采用抛弃式的设备则清洗成本为0，若采用原地灭菌式则只需要对系统做整体灭菌，而转瓶系统则需要对成百甚至上千的转瓶进行清洗灭菌，不仅消耗清洗成本，而且消耗人力。 

因此，采用潮汐式生物反应器大规模培养鸡马立克氏病毒，能够提高细胞的生长密度，节约资源消耗，实现对同批产品的质量控制，生产出产品规模大、成本低、品质高的鸡马立克氏病疫苗 

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。 

Claims (11)

1.一种鸡马立克氏病毒的大规模生产方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）在潮汐式生物反应器中，接种鸡胚成纤维细胞至生物反应器内的微载体上，进行细胞的吸附培养；

2）在细胞的吸附培养结束后进行细胞的扩增培养；

3）将鸡马立克氏病毒接种到扩增培养的鸡胚成纤维细胞上，进行病毒的吸附培养；

4）在病毒的吸附培养结束后进行病毒的增殖培养；

5）在接种的鸡胚成纤维细胞CPE达到70%以上时，收获病毒液，保存病毒液。

其中，步骤1）中接种时的细胞浓度为0.5×10⁷～1.0×10⁸细胞/克，所述接种时的细胞浓度为细胞吸附培养开始时的细胞浓度。

2.根据权利要求1所述的鸡马立克氏病毒的大规模生产方法，其特征在于，所述微载体由选自聚酯、明胶或多糖的一种或几种制成。

3.根据权利要求1所述的鸡马立克氏病毒的大规模生产方法，其特征在于，所述细胞以0.1×10⁸～3.0×10⁸细胞/克微载体的密度接种所述鸡马立克氏病毒。

4.根据权利要求1所述的鸡马立克氏病毒的大规模生产方法，其特征在于，所述细胞以2.2×10⁸细胞/克微载体的密度接种所述鸡马立克氏病毒。

5.根据权利要求1所述的鸡马立克氏病毒的大规模生产方法，其特征在于，所述微载体的添加量为5～30克/升。

6.根据权利要求1所述的鸡马立克氏病毒的大规模生产方法，其特征在于，所述鸡马立克氏病病毒为血清Ⅰ型、血清Ⅱ和血清Ⅲ中的一种或一种以上的组合。

7.根据权利要求1所述的鸡马立克氏病毒的大规模生产方法，其特征在于，步骤3）中所述鸡马立克氏病病毒接种的感染复数为0.0001～1.5。

8.根据权利要求1所述的鸡马立克氏病毒的大规模生产方法，其特征在于，步骤1)中所述的吸附培养和步骤2)中所述的扩增培养使用含3%～5%V/V牛血清的M199细胞培养液；步骤3)中所述的病毒吸附培养和步骤4)中所述的病毒增殖培养使用2%V/V牛血清的DMEM细胞培养液，其中所述的牛血清为胎牛血清、新生牛血清或小牛血清。

9.根据权利要求1中所述的马立克氏病毒的大规模生产方法，其特征在于，所述潮汐式生物反应器为TideCell-020型生物反应器，所述步骤1)-步骤4)中载体罐中培养液的液面上下行速度为0.5～50升/分钟，液面在载体上下端点停滞时间为0～150秒，步骤1)和步骤3）程序运行为60～240分钟。

10.根据权利要求1中所述的鸡马立克氏病毒的大规模生产方法，其特征在于，在步骤1)至步骤4)的培养过程中控制温度37℃，pH调节7.0～7.5，二氧化碳浓度为3%～5%的条件下进行。

11.根据权利要求1-10任一项的方法获得的鸡马立克氏病病毒的培养液。

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