CN112662615B - 一种人间充质干细胞诱导分化成脂的染色鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，更具体的涉及一种人间充质干细胞诱导分化成脂的染色鉴定方法。本发明提供了一种人间充质干细胞诱导分化成脂的染色鉴定方法，包括以下步骤：(1)将染色用Adipo‑Staining A和Adipo‑Staining B混合，得到染色工作液，记为Staining Solution，备用；(2)将分化成脂后的间充质干细胞使用氯化钠注射液清洗，然后加入Adipo‑Fixation，静置；(3)然后向步骤(2)中加入Adipo‑Wash I清洗；(4)然后向步骤(3)中加入Staining Solution，静置染色；(5)染色后再向步骤(4)中加入Adipo‑Wash II清洗；(6)重复步骤(5)一次或多次；(7)最后向步骤(6)中加入Adipo‑Inspection，置于显微镜下观察，拍照，完成。此方法避免了染色后在显微镜中出现的块状漂浮物对细胞形态的判断。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体的涉及一种人间充质干细胞诱导分化成脂的染色鉴定方法。
背景技术
脂肪间充质干细胞Adipose-derived stem cells(ADSC)，是从脂肪组织中分离出来的一种多向分化干细胞，因其与BMSC形态形似而称为脂肪间充质干细胞。2001年，ZuK首次从人抽脂术抽取获得。人脂肪间充质干细胞具有许多特性，包括间充质干细胞潜在的增殖能力和适当条件下的多向分化能力。人脂肪充质干细胞不仅可以应用于组织的修复，而且在细胞免疫调节和基因治疗中均发挥重要作用。
因此，出现了较多有关研究人脂肪间充质干细胞分化的研究，也带动着研究者们对人间充质干细胞诱导分化成脂后的鉴定方法的开发。现阶段关于间充质干细胞诱导分化成脂后的染色过程可能存在因为染色剂的存在导致在观察细胞西南柜台的时候出现漂浮的块状物，影响对细胞形态的判断，影响研究者后续研发的进行。因此，开发一种快速、方便、准确的染色鉴定方法成为一项重要的研究。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的第一方面提供了一种人间充质干细胞诱导分化成脂的染色鉴定方法，包括以下步骤：
(1)将染色用Adipo-Staining A和Adipo-Staining B混合，得到染色工作液，记为Staining Solution，备用；
(2)将分化成脂后的间充质干细胞使用氯化钠注射液清洗，然后加入Adipo-Fixation，静置；
(3)然后向步骤(2)中加入Adipo-Wash I清洗；
(4)然后向步骤(3)中加入Staining Solution，静置染色；
(5)染色后再向步骤(4)中加入Adipo-Wash II清洗；
(6)重复步骤(5)一次或多次；
(7)最后向步骤(6)中加入Adipo-Inspection，置于显微镜下观察，拍照，完成。
作为一种优选的技术方案，步骤(1)所述的Adipo-Staining A和Adipo-StainingB的体积比为(1-4)：2。
作为一种优选的技术方案，所述的Adipo-Staining A和Adipo-Staining B要求混合后3小时内有效。
作为一种优选的技术方案，步骤(2)中氯化钠注射液的质量浓度为0.7～1.0％；步骤(2)中吸掉清洗后的氯化钠注射液后再加入Adipo-Fixation。
作为一种优选的技术方案，步骤(2)中静置时间为20分钟以上。
作为一种优选的技术方案，步骤(2)中静置时间为20～30分钟。
作为一种优选的技术方案，步骤(4)中静置时间为25～30分钟。
作为一种优选的技术方案，步骤(5)中加入Adipo-Wash II清洗，清洗时间为3～5分钟。
作为一种优选的技术方案，步骤(6)中重复步骤(5)一次到三次。
本发明的第二方面，提供了一种人间充质干细胞诱导分化成脂的染色鉴定方法的应用，用于脐带、脂肪、胎盘、羊膜的间充质干细胞诱导分化成脂后染色鉴定。
有益效果：经本发明开发的人间充质干细胞诱导分化成脂染色鉴定方法，可以有效鉴定通过血清替代物和间充质干细胞基础培养基培养的间充质干细胞的成脂分化鉴定，避免了染色后在显微镜中出现的块状漂浮物对细胞形态的判断，并且，此方法简单、快速，有效性和针对性强，在脐带、脂肪、胎盘、羊膜的人间充质干细胞的诱导分化成脂鉴定方面提供了有效的方法。
附图说明
图1为本发明实施例1间充质干细胞诱导分化成脂染色前细胞形态图；
图2为本发明实施例1间充质干细胞诱导分化成脂染色后细胞形态图。
具体实施方式
结合以下本发明的优选实施方法的详述以及包括的实施例可进一步地理解本发明的内容。除非另有说明，本文中使用的所有技术及科学术语均具有与本申请所属领域普通技术人员的通常理解相同的含义。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本申请中提供的任何定义不一致，则以本申请中提供的术语定义为准。
在本文中使用的，除非上下文中明确地另有指示，否则没有限定单复数形式的特征也意在包括复数形式的特征。还应理解的是，如本文所用术语“由…制备”与“包含”同义，“包括”、“包括有”、“具有”、“包含”和/或“包含有”，当在本说明书中使用时表示所陈述的组合物、步骤、方法、制品或装置，但不排除存在或添加一个或多个其它组合物、步骤、方法、制品或装置。此外，当描述本申请的实施方式时，使用“优选的”、“优选地”、“更优选的”等是指，在某些情况下可提供某些有益效果的本发明实施方案。然而，在相同的情况下或其他情况下，其他实施方案也可能是优选的。除此之外，对一个或多个优选实施方案的表述并不暗示其他实施方案不可用，也并非旨在将其他实施方案排除在本发明的范围之外。
为了解决上述技术问题，本发明第一方面提供了一种人间充质干细胞诱导分化成脂的染色鉴定方法，包括以下步骤：
(1)将染色用Adipo-Staining A和Adipo-Staining B混合，得到染色工作液，记为Staining Solution，备用；
(2)将分化成脂后的间充质干细胞使用氯化钠注射液清洗，然后加入Adipo-Fixation，静置；
(3)然后向步骤(2)中加入Adipo-Wash I清洗；
(4)然后向步骤(3)中加入Staining Solution，静置染色；
(5)染色后再向步骤(4)中加入Adipo-Wash II清洗；
(6)重复步骤(5)一次或多次；
(7)最后向步骤(6)中加入Adipo-Inspection，置于显微镜下观察，拍照，完成。
在一些优选的实施方式中，步骤(2)中所说的分化成脂后的间充质干细胞选择由血清代替物和间充质干细胞基础培养基培养得到的细胞。
在一些优选的实施方式中，步骤(1)所述的Adipo-Staining A和Adipo-StainingB的体积比为(1-4)：2。
在一些优选的实施方式中，步骤(1)所述的Adipo-Staining A和Adipo-StainingB的体积比为3.5：2。
在本发明中，发明人发现Adipo-Staining A和Adipo-Staining B的配置比例对由血清代替物和间充质干细胞基础培养基培养的间充质干细胞的成脂分化鉴定存在一定的影响。Adipo-Staining A和Adipo-Staining B的体积比为3.5：2时，可以更清楚的观察到细胞形态，发明人推测：Adipo-Staining A和Adipo-Staining B的体积比不在本申请的范围内，可能会造成血清代替物和间充质干细胞基础培养基中前成脂细胞被染色，造成对成脂分化后的脂肪细胞产生影响，进而影响对细胞形态的判断。
在一些优选的实施方式中，所述的Adipo-Staining A和Adipo-Staining B要求混合后3小时内有效。
在一些优选的实施方式中，步骤(2)中氯化钠注射液的质量浓度为0.7～1.0％.
在一些优选的实施方式中，步骤(2)中吸掉清洗后的氯化钠注射液后再加入Adipo-Fixation。
在一些优选的实施方式中，步骤(2)中氯化钠注射液的质量浓度为0.9％。
在一些优选的实施方式中，步骤(2)中静置时间为20分钟以上。
在一些优选的实施方式中，步骤(2)中静置时间为20～30分钟。
优选的，步骤(2)中静置时间为30分钟。
在一些优选的实施方式中，步骤(4)中静置时间为25～30分钟。
优选的，步骤(4)中静置时间为27分钟。
在一些优选的实施方式中，步骤(5)中加入Adipo-Wash II清洗，清洗时间为3～5分钟。
优选的，步骤(5)中加入Adipo-Wash II清洗，清洗时间为3分钟。
在一些优选的实施方式中，步骤(6)中重复步骤(5)一次到三次。
在一些优选的实施方式中，步骤(6)中重复步骤(5)三次。
在本申请中，步骤(2)、(3)、(4)、(5)中加入一种新物质之前先使用吸管吸掉上一步加入的物质；举例说明：比如步骤(3)中向步骤(2)中加入Adipo-Wash I清洗之前先用吸管吸掉步骤(2)中加入的Adipo-Fixation。
在本申请中，Adipo-Fixation，货号C37A10020；Adipo-Wash I，货号C37A20050；Adipo-Staining A，货号C37A30020；Adipo-Staining B，货号C37A40010；Adipo-Wash II，货号C37A50050；Adipo-Inspection，货号C37A60010；以上试剂购于BI中国市场部上海逍鹏生物科技有限公司。
本发明的第二方面，提供了一种人间充质干细胞诱导分化成脂的染色鉴定方法的应用，用于脐带、脂肪、胎盘、羊膜的间充质干细胞诱导分化成脂后染色鉴定。
下面通过实施例对本发明进行具体描述。有必要在此指出的是，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的专业技术人员根据上述本发明的内容做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
另外，如果没有其它说明，所用原料都是市售得到的。
实施例
实施例1
一种人间充质干细胞诱导分化成脂的染色鉴定方法，包括以下步骤：
(1)将染色用Adipo-Staining A和Adipo-Staining B混合，得到染色工作液，记为Staining Solution，备用；
(2)将分化成脂后的间充质干细胞使用质量浓度为0.9％的氯化钠注射液清洗，然后加入Adipo-Fixation，静置30分钟；
(3)然后向步骤(2)中加入Adipo-Wash I清洗；
(4)然后向步骤(3)中加入Staining Solution，静置27分钟染色；
(5)染色后再向步骤(4)中加入Adipo-Wash II清洗；
(6)重复步骤(5)三次；
(7)最后向步骤(6)中加入Adipo-Inspection，置于显微镜下观察，拍照，完成。
所述的Adipo-Staining A和Adipo-Staining B的体积比为3.5：2。
所述的分化成脂后的间充质干细胞选择由血清代替物和间充质干细胞基础培养基培养得到的细胞。
间充质干细胞分化成脂的方法包括以下步骤：
S1：细胞培养：将人间充质干细胞加入MM3培养基中进行培养2天。
S2：细胞诱导分化：向培养基中加入诱导分化成脂试剂对间充质干细胞进行诱导分化，诱导分化成脂试剂每隔48小时更换一次；诱导分化7天；
S3：将步骤S2得到的分化后的细胞进行染色鉴定。
Adipo-Fixation，货号C37A10020；Adipo-Wash I，货号C37A20050；Adipo-Staining A，货号C37A30020；Adipo-Staining B，货号C37A40010；Adipo-Wash II，货号C37A50050；Adipo-Inspection，货号C37A60010；以上试剂购于BI中国市场部上海逍鹏生物科技有限公司。
实施例2
一种人间充质干细胞诱导分化成脂的染色鉴定方法其具体实施方式同实施例1，与实施例1的不同点在于Adipo-Staining A和Adipo-Staining B的体积比为3：2。
实施例3
一种人间充质干细胞诱导分化成脂的染色鉴定方法其具体实施方式同实施例1，与实施例1的不同点在于Adipo-Staining A和Adipo-Staining B的体积比为5：1。
实施例4
一种人间充质干细胞诱导分化成脂的染色鉴定方法其具体实施方式同实施例1，与实施例1的不同点在于步骤(2)中静置时间为40分钟。
实施例5
一种人间充质干细胞诱导分化成脂的染色鉴定方法其具体实施方式同实施例1，与实施例1的不同点在于步骤(4)中静置时间为40分钟。
实施例6
一种人间充质干细胞诱导分化成脂的染色鉴定方法其具体实施方式同实施例1，与实施例1的不同点在于本实施例中使用的分化成脂后的间充质干细胞的培养方法参照中国专利申请号为201910037685.X的发明专利：
1.配制脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养基(自制DMEM/F12基础培养基，10％胎牛血清，10μg/ml胰岛素，1‰青霉素，1‰链霉素，1μmol/L地塞米松，300μmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)。
2.细胞复苏后，待检测细胞长到80％左右，进行传代。一般做六孔板中3个孔，一个未诱导对照，一个实验组，一个复孔。
3.将消化下来的间充质干细胞按照1×104cells/cm2的细胞密度接种在六孔板中，每孔加入3ml DMEM完全培养基，将细胞置于37℃，5％CO2的培养箱中进行培养。
4.约2天，细胞融合度达到80％左右，小心地将间充质干细胞完全培养基吸走，向六孔板两个实验组孔中加入3ml间充质干细胞成脂诱导分化培养基。
5.每隔3或4天换新鲜的间充质干细胞成脂诱导分化培养基。
6.持续诱导3周后，将分化后的细胞用于染色鉴定。
性能测试：
1.染色情况判断：将实施例1-6进行人间充质干细胞诱导分化成脂的染色鉴定，规定：细胞状态良好，无块状漂浮物出现的记为优；染色后的细胞中存在可见的块状漂浮物记为良；染色后的细胞中较多块状漂浮物，影响染色后细胞形态观察的记为差；并将结果统计于下表。
2.细胞形态判断：通过倒置显微镜观察细胞的形态，规定，细胞形态完好，无卷缩现象的记为优；细胞出现卷缩的记为良；细胞大部分卷缩的记为差；并将结果统计于下表。
| 实验 | 染色情况 | 细胞形态 |
| 实施例1 | 优 | 优 |
| 实施例2 | 良 | 良 |
| 实施例3 | 差 | 差 |
| 实施例4 | 良 | 差 |
| 实施例5 | 良 | 差 |
| 实施例6 | 差 | 差 |
最后指出，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种人间充质干细胞诱导分化成脂的染色鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将染色用Adipo-Staining A和Adipo-StainingB混合，得到染色工作液，记为Staining Solution，备用；
(2)将分化成脂后的间充质干细胞使用氯化钠注射液清洗，然后加入Adipo-Fixation，静置；
(3)然后向步骤(2)中加入Adipo-Wash I清洗；
(4)然后向步骤(3)中加入Staining Solution，静置染色；
(5)染色后再向步骤(4)中加入Adipo-Wash II清洗；
(6)重复步骤(5)一次或多次；
(7)最后向步骤(6)中加入Adipo-Inspection，置于显微镜下观察，拍照，完成；
步骤(1)所述的Adipo-Staining A和Adipo-StainingB的体积比为3.5：2；
所述的Adipo-StainingA和Adipo-Staining B要求混合后3小时内有效；
步骤(2)中氯化钠注射液的质量浓度为0.7～1.0％；步骤(2)中吸掉清洗后的氯化钠注射液后再加入Adipo-Fixation；
步骤(2)中静置时间为20～30分钟；
步骤(4)中静置时间为25～30分钟；
步骤(5)中加入Adipo-Wash II清洗，清洗时间为3～5分钟；
步骤(6)中重复步骤(5)一次到三次；
所述的分化成脂后的间充质干细胞选择由血清代替物和间充质干细胞基础培养基培养得到的细胞；
所述Adipo-Fixation，货号C37A10020；Adipo-WashI，货号C37A20050；
Adipo-StainingA，货号C37A30020；Adipo-Staining B，货号C37A40010；
Adipo-WashII，货号C37A50050；Adipo-Inspection，货号C37A60010，以上试剂购于BI中国市场部上海逍鹏生物科技有限公司。
2.一种根据权利要求1所述的人间充质干细胞诱导分化成脂的染色鉴定方法的应用，其特征在于，用于脐带、脂肪、胎盘、羊膜的间充质干细胞诱导分化成脂后染色鉴定。
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