WO2019021748A1 - 培養容器、培養容器の製造方法、積層構造体、及び積層構造体の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】　スフェア培養のための軟包材からなる培養容器の製造において、培養容器の内面が接触することにより、一方の内面に塗布した細胞接着抑制剤が剥がれて、他方の内面に裏移りしてしまうことを防止することを可能とする。 【解決手段】　軟包材からなる培養容器であって、対面する第一の側面部と第二の側面部とを備え、接触角ヒステリシスを水滑落時の前進接触角－後退接触角と定義した場合に、第一の側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスが、第二の側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスより大きくなるように、少なくとも第一の側面部の内面側に表面処理が施されており、かつ、第一の側面部の内面側に、細胞接着抑制剤からなる膜が形成された培養容器とする。

Description

培養容器、培養容器の製造方法、積層構造体、及び積層構造体の製造方法

　本発明は、細胞培養技術に関し、特にスフェア培養に用いられる培養容器に関する。
　また、本発明は、細胞培養容器などを製造するために好適に使用可能な積層構造体、及びその製造方法に関する。

　近年、医薬品の生産や、遺伝子治療、再生医療、免疫療法等の分野において、細胞や組織、微生物などを人工的な環境下で効率良く大量に培養することが求められている。
　このような状況において、培養容器に細胞と培養液を充填して、閉鎖系で自動的に細胞を大量培養することが行われている。

　また、最近では、ｉＰＳ細胞などの接着細胞を培養容器に接着させることなく、培養容器内で細胞を浮遊させて培養し、スフェア（凝集塊）を形成させることによって、細胞の培養効率を向上させる方法が用いられている。この場合、通常、培養容器内の底面には、細胞が接着しないように、細胞接着抑制剤を塗布（コーティング）しておく必要がある。

　ここで、スフェアを形成する培養方法に関して、特許文献１には、細胞接着抑制剤が内面に塗布された、凹部を有する培養基材が提案されている。この培養基材は、リジッドなものであり、細胞接着抑制剤を内面に塗布することによって、スフェアは適切に形成し得ると考えられる。

　また、細胞培養容器の製造に使用するフィルムやシート（以下、単にフィルムと称する場合がある）は、その表面に細胞接着抑制剤を塗布した後に、細胞培養容器の製造時まで保管する必要があった。

国際公開第２０１２／０３６０１１号パンフレット 特開２０１３－７０６３６号公報

　細胞を効率的に大量に培養する場合には、容積の大きい培養容器を比較的容易に製造可能な、軟包材からなる培養容器を用いて、閉鎖系で細胞を自動的に培養することが好ましい。
　しかしながら、このような軟包材からなる培養容器は、一般にバッグ形状となるため、培養容器内の底面に細胞接着抑制剤を塗布すると、培養容器内の底面と上面が接触することによって、図８に示すように、底面に塗布された細胞接着抑制剤の膜が上面に裏移りして、底面から剥がれてしまうという問題があった。

　すなわち、このように細胞接着抑制剤の膜が底面から剥がれると、細胞がその細胞接着抑制剤の剥がれた底面部分に接着してしまうため、細胞はスフェアを適切に形成することができなくなり、スフェア培養が阻害されてしまうという問題があった。

　そこで、本発明者らは鋭意研究し、培養容器内の底面と上面の基材を特定の条件で加工することによって、細胞接着抑制剤の膜が底面から上面に裏移りしない培養容器を製造することに成功し、本発明を完成させた。
　すなわち、培養容器における細胞接着抑制剤を塗布する表面の接触角ヒステリシスが、これに対面する表面の接触角ヒステリシスよりも大きくなるように、少なくとも細胞接着抑制剤を塗布する表面側に表面処理を施し、かつ、当該表面に細胞接着抑制剤の膜を形成することによって、細胞接着抑制剤の膜が剥がれて対面側に裏移りすることを防止することが可能となった。

　ところで、細胞接着抑制剤を塗布したフィルムは、ロール状に巻き取って保管される場合があるが、使用に際してフィルムを平面状に展開すると、細胞接着抑制剤がフィルムから剥がれてしまうという問題があった。
　具体的には、図１３及び図１４に示すように、フィルムをロール状に巻き取る際に、細胞接着抑制剤を培養基材１００に塗布して形成されたコーティング層２００が、培養基材１００におけるコーティング層２００と反対側の表面に密着する。
　そして、フィルムを平面状に戻す際に、コーティング層２００が培養基材１００の表面から剥がれて、培養基材１００の反対側の表面に裏移りするという問題があった。

　そこで、本発明者らは鋭意研究し、可撓性を有する、フィルム又はシート状の培養基材の第一の面の親水性を、その反対側の第二の面の親水性よりも高くなるように処理し、第一の面にコーティング層を形成して培養基材をロール状に巻き取って積層構造体を形成することにより、コーティング層の裏移りが生じない積層構造体を製造することに成功し、本発明を完成させた。

　ここで、特許文献２の実施例１には、培養基材の表面にプラズマ処理を行い、細胞低接着化処理を行うことが記載されている。
　しかしながら、この培養基材は可撓性を有するものでなく、また培養基材の両面の親水性を考慮して、コーティング層の裏移りが生じない積層構造体を形成可能にするものではなかった。

　本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、スフェア培養のための軟包材からなる培養容器の製造において、培養容器の内面が接触することにより、一方の内面に塗布した細胞接着抑制剤が剥がれて、他方の内面に裏移りしてしまうことを防止可能な培養容器、及び培養容器の製造方法の提供を目的とする。

　また、本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、培養基材をロール状に巻き取って形成された積層構造体において、培養基材の表面上に形成されたコーティング層が裏移りしない積層構造体、及びその製造方法の提供を目的とする。

　上記目的を達成するため、本発明の培養容器は、軟包材からなる培養容器であって、対面する第一の側面部と第二の側面部とを備え、接触角ヒステリシスを水滑落時の前進接触角－後退接触角と定義した場合に、前記第一の側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスが、前記第二の側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスより大きくなるように、少なくとも前記第一の側面部の内面側に表面処理が施されており、かつ、前記第一の側面部の内面側に、細胞接着抑制剤からなる膜が形成された構成としてある。

　また、本発明の培養容器の製造方法は、スフェア培養のための培養容器の製造方法であって、ポリオレフィンからなるフィルム又はシートの一部に親水化処理を施し、前記フィルム又はシートの親水化処理が施された面を内面側に備えた第一の側面部と、前記第一の側面部に対面する第二の側面部とを備え、かつ、接触角ヒステリシスを水滑落時の前進接触角－後退接触角と定義した場合に、前記第一の側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスが、前記第二の側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスより大きい前記培養容器を形成し、前記第一の側面部の内面側に、細胞接着抑制剤を塗布する方法としてある。

　また、本発明の培養容器の製造方法は、スフェア培養のための培養容器の製造方法であって、ポリオレフィンからなるフィルム又はシートの一部に第一の親水化処理を施すと共に、前記フィルム又はシートの他の一部に前記第一の親水化処理よりも親水化力の小さい第二の親水化処理を施し、前記フィルム又はシートの前記第一の親水化処理が施された面を内面側に備えた第一の側面部と、前記第一の側面部に対面する前記第二の親水化処理が施された面を内面側に備えた第二の側面部とを備え、かつ、接触角ヒステリシスを水滑落時の前進接触角－後退接触角と定義した場合に、前記第一の側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスが、前記第二の側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスより大きい前記培養容器を形成し、前記第一の側面部の内面側に、細胞接着抑制剤を塗布する方法としてある。

　また、上記目的を達成するため、本発明の積層構造体は、可撓性を有する培養基材を重ね合わせた積層構造体であって、前記培養基材はフィルム又はシート状であり、ロール状に巻き取られて前記積層構造体を形成し、前記培養基材は、コーティング層が形成された第一の表面と、その反対側の第二の表面とを有し、前記第一の表面の親水性が前記第二の表面の親水性よりも高い構成としてある。

　また、本発明の積層構造体の製造方法は、可撓性を有する培養基材を重ね合わせた積層構造体の製造方法であって、フィルム又はシートからなる前記培養基材の第一の表面の親水性が、前記第一の表面の反対側の第二の表面の親水性よりも大きくなるように、少なくとも前記第一の表面に親水化処理を施し、前記第一の表面上にコーティング剤を塗布してコーティング層を形成し、前記培養基材をロール状に巻き取る方法としてある。

　本発明によれば、スフェア培養のための軟包材からなる培養容器の製造において、培養容器の内面が接触することにより、一方の内面に塗布した細胞接着抑制剤が剥がれて、他方の内面に裏移りしてしまうことを防止することが可能となる。
　また、本発明によれば、培養基材をロール状に巻き取って形成された積層構造体において、培養基材の表面上に形成されたコーティング層が裏移りしない積層構造体、及びその製造方法の提供が可能となる。

静的水接触角についての説明図である。 接触角ヒステリシスについての説明図である。 実施例１（実施例１１）（培養容器の基材（培養基材）：ＰＥ，下面（第一の表面）：コロナ処理１回、上面（第二の表面）：無処理，細胞接着抑制剤：リン脂質ポリマー）、実施例２（実施例１２）（培養容器の基材：ＰＥ，下面：コロナ処理３回、上面：無処理，細胞接着抑制剤：リン脂質ポリマー）、比較例１（比較例１１）（培養容器の基材：ＰＥ，下面：無処理、上面：無処理，細胞接着抑制剤：リン脂質ポリマー）における細胞接着抑制剤の裏移り状況を撮影した写真を示す図である。 比較例２（比較例１２）（培養容器の基材（培養基材）：ＰＥ，下面（第一の表面）：無処理、上面（第二の表面）：コロナ処理１回，細胞接着抑制剤：リン脂質ポリマー）、比較例３（比較例１３）（培養容器の基材：ＰＥ，下面：コロナ処理１回、上面：コロナ処理３回，細胞接着抑制剤：リン脂質ポリマー）、比較例４（比較例１４）（培養容器の基材：ＰＥ，下面：コロナ処理３回、上面：コロナ処理３回，細胞接着抑制剤：リン脂質ポリマー）における細胞接着抑制剤の裏移り状況を撮影した写真を示す図である。 実施例３（実施例１３）（培養容器の基材（培養基材）：ＣＯＣ，下面（第一の表面）：コロナ処理３回、上面（第二の表面）：無処理，細胞接着抑制剤：リン脂質ポリマー）、比較例５（比較例１５）（培養容器の基材：ＣＯＣ，下面：無処理、上面：無処理，細胞接着抑制剤：リン脂質ポリマー）における細胞接着抑制剤の裏移り状況を撮影した写真を示す図である。 実施例４（実施例１４）（培養容器の基材（培養基材）：ＰＥ，下面（第一の表面）：コロナ処理３回、上面（第二の表面）：無処理，細胞接着抑制剤：ポリビニルアルコール）、比較例６（比較例１６）（培養容器の基材：ＰＥ，下面：無処理、上面：無処理，細胞接着抑制剤：ポリビニルアルコール）における細胞接着抑制剤の裏移り状況を撮影した写真を示す図である。 実施例５（実施例１５）（培養容器の基材（培養基材）：ＰＥ，下面（第一の表面）：コロナ処理１回、上面（第二の表面）：無処理，細胞接着抑制剤：リン脂質ポリマー，５０℃７日間経過後）、実施例６（実施例１６）（培養容器の基材：ＰＥ，下面：コロナ処理３回、上面：無処理，細胞接着抑制剤：リン脂質ポリマー，５０℃７日間経過後）、比較例７（比較例１７）（培養容器の基材：ＰＥ，下面：無処理、上面：無処理，細胞接着抑制剤：リン脂質ポリマー，５０℃７日間経過後）における細胞接着抑制剤の裏移り状況を撮影した写真を示す図である。 実施例７（実施例１７）（培養容器の基材（培養基材）：ＰＥ，下面（第一の表面）：エキシマ処理１回、上面（第二の表面）：無処理，細胞接着抑制剤：リン脂質ポリマー）における細胞接着抑制剤の裏移り状況を撮影した写真を示す図である。 従来の培養容器の製造工程における細胞接着抑制剤の裏移りを示す模式図である。 本発明の実施形態に係る積層構造体の構成を示す模式図である。 本発明の実施形態に係るその他の積層構造体の構成を示す模式図である。 本発明の実施形態に係る積層構造体の製造方法（第一の製造方法）を示す模式図である。 本発明の実施形態に係る積層構造体の製造方法（第二の製造方法）を示す模式図である。 積層構造体を形成する様子を示す模式図である。 従来の積層構造体におけるコーティング層の裏移りを示す模式図である。

　以下、本発明の培養容器、及び培養容器の製造方法の実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の実施形態の具体的な内容に限定されるものではない。
　本実施形態の培養容器は、軟包材からなる培養容器であって、対面する第一の側面部と第二の側面部とを備え、接触角ヒステリシスを水滑落時の前進接触角－後退接触角と定義した場合に、第一の側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスが、第二の側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスより大きくなるように、少なくとも第一の側面部の内面側に表面処理が施されており、かつ、第一の側面部の内面側に、細胞接着抑制剤からなる膜が形成されたことを特徴とする。

　まず、静的水接触角と接触角ヒステリシスについて、図１Ａ及び図１Ｂを参照して説明する。
　静的水接触角とは、静止した液体の表面が固体壁の表面に接するところで液面と固体面がなす角（図１Ａのθｓ）を意味する。静的水接触角が大きいと、固体壁の表面の疎水性が相対的に強く、静的水接触角が小さいと、固体壁の表面の親水性が相対的に強いという関係がある。

　接触角ヒステリシスとは、水滴が固体壁の表面を滑落するときの前進接触角（θa）と、後退接触角（θr）との差（滑落時ヒステリシス（θa－θr））を意味する。
　すなわち、水平に支持した固体壁の表面に水滴を摘下し、固体壁を徐々に傾けて、液滴が転落を開始したときの前進接触角と後退接触角にもとづき算出される。この接触角ヒステリシスは、固体壁の表面の動的な親水性（濡れ性）を示す指標として用いられる。接触角ヒステリシスが大きいと、固体壁の表面の親水性が相対的に強く、接触角ヒステリシスが小さいと、固体壁の表面の疎水性が相対的に強いという関係がある。

　本実施形態の培養容器を構成する軟包材としては、ポリオレフィンを用いることが好ましく、ポリエチレン（ＰＥ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）等を用いることがより好ましい。特に、少なくとも培養容器の第一の側面部の内面側と第二の側面部の内面側を、ポリオレフィンを用いて構成することが好ましい。

　第一の側面部の内面側、及び第二の側面部の内面側は、培養容器内の表面を構成し、細胞培養時において、通常、第一の側面部の内面側が底面となるように培養容器を配置して用いられることを想定している。
　すなわち、一般的に細胞培養に使用される培養液の比重は細胞の比重よりも小さいため、培養容器を静置させたときに細胞は、下方に沈降する。このため、通常は、第一の側面部の内面側が底面となるように、培養容器が配置される。
　一方、仮に、培養液の比重が細胞の比重よりも大きい場合には、培養容器を静置させたときに細胞は上方に集まると考えられるため、第一の側面部の内面側が上面となるように、培養容器を配置することとなる。

　本実施形態の培養容器は、一般的にバッグ形状であり、対面する二つの側面部を備えている。そして、これら側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスが、異なる値を示すように、少なくとも一方の側面部の内面側に、表面処理が施されている。
　このとき、培養容器における、細胞接着抑制剤の膜が形成される表面側（一般的には底面側）の接触角ヒステリシスが、これに対面する、細胞接着抑制剤の膜が形成されない表面側（一般的には上面側）の接触角ヒステリシスよりも、大きくなるように、培養容器の内面に対して表面処理が施される。
　表面処理としては、親水化処理を行うことが好ましい。親水化処理の方法としてコロナ処理やエキシマ処理などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

　具体的には、例えば以下の（Ａ）～（Ｆ）ようにすることができるが、これらに限定されない。なお、以下において、細胞接着抑制剤の膜を形成する表面を第一の側面、細胞接着抑制剤の膜を形成しない表面を第二の側面と称する。

（Ａ）第一の側面にコロナ処理を１回行い、第二の側面には表面処理を行わない。
（Ｂ）第一の側面にコロナ処理を３回行い、第二の側面には表面処理を行わない。
（Ｃ）第一の側面にコロナ処理を３回行い、第二の側面にコロナ処理を１回行う。
（Ｄ）第一の側面にエキシマ処理を１回行い、第二の側面には表面処理を行わない。
（Ｅ）第一の側面にエキシマ処理を３回行い、第二の側面には表面処理を行わない。
（Ｆ）第一の側面にエキシマ処理を３回行い、第二の側面にエキシマ処理を１回行う。

　また、本実施形態の培養容器では、以下の（ａ）～（ｋ）ような表面処理方法は行われない。その理由は、これらの表面処理方法によれば、細胞接着抑制剤の膜を形成する表面側の接触角ヒステリシスが、これに対面する、細胞接着抑制剤の膜を形成しない表面側の接触角ヒステリシスよりも小さくなるか、又は同じになるためである。

（ａ）第一の側面に表面処理を行わず、第二の側面にも表面処理を行わない。
（ｂ）第一の側面に表面処理を行わず、第二の側面にコロナ処理を１回行う。
（ｃ）第一の側面に表面処理を行わず、第二の側面にコロナ処理を３回行う。
（ｄ）第一の側面にコロナ処理を１回行い、第二の側面にもコロナ処理を１回行う。
（ｅ）第一の側面にコロナ処理を１回行い、第二の側面にコロナ処理を３回行う。
（ｆ）第一の側面にコロナ処理を３回行い、第二の側面にもコロナ処理を３回行う。
（ｇ）第一の側面に表面処理を行わず、第二の側面にエキシマ処理を１回行う。
（ｈ）第一の側面に表面処理を行わず、第二の側面にエキシマ処理を３回行う。
（ｉ）第一の側面にエキシマ処理を１回行い、第二の側面にもエキシマ処理を１回行う。
（ｊ）第一の側面にエキシマ処理を１回行い、第二の側面にエキシマ処理を３回行う。
（ｋ）第一の側面にエキシマ処理を３回行い、第二の側面にもエキシマ処理を３回行う。

　本実施形態において、細胞接着抑制剤としては、リン脂質ポリマー、ポリビニルアルコール誘導体、リン脂質・高分子複合体、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリビニルアルコール、アガロース、キトサン、ポリエチレングリコール、アルブミン等を用いることができる。また、これらを組み合わせて用いても良い。

　本実施形態の培養容器は、細胞接着抑制剤の膜が形成される側面部の内面側に、複数のウェルが形成されたものとすることも好ましい。本実施形態の培養容器において、このようなウェルを形成することで、細胞を各ウェル内に集めることができるため、例えば、スフェア培養の初期段階における細胞密度を高めることができ、スフェアの形成効率を向上させることが可能となる。

　また、本実施形態の培養容器の製造方法は、スフェア培養のための培養容器の製造方法であって、ポリオレフィンからなるフィルム又はシートの一部に親水化処理を施し、フィルム又はシートの親水化処理が施された面を内面側に備えた第一の側面部と、第一の側面部に対面する第二の側面部とを備え、かつ、接触角ヒステリシスを水滑落時の前進接触角－後退接触角と定義した場合に、第一の側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスが、第二の側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスより大きい培養容器を形成し、第一の側面部の内面側に、細胞接着抑制剤を塗布することを特徴とする。

　また、本実施形態の培養容器の製造方法を、スフェア培養のための培養容器の製造方法であって、ポリオレフィンからなるフィルム又はシートの一部に第一の親水化処理を施すと共に、フィルム又はシートの他の一部に第一の親水化処理よりも親水化力の小さい第二の親水化処理を施し、フィルム又はシートの第一の親水化処理が施された面を内面側に備えた第一の側面部と、第一の側面部に対面する第二の親水化処理が施された面を内面側に備えた第二の側面部とを備え、かつ、接触角ヒステリシスを水滑落時の前進接触角－後退接触角と定義した場合に、第一の側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスが、第二の側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスより大きい培養容器を形成し、第一の側面部の内面側に、細胞接着抑制剤を塗布する方法とすることも好ましい。

　すなわち、本実施形態の培養容器の製造方法では、ポリオレフィンからなるフィルム又はシートの一部に親水化処理を施すと共に、このフィルム又はシートを用いて培養容器を製袋することで、接触角ヒステリシスの値が異なる側面部を備えた培養容器を形成する。
　具体的には、細胞接着抑制剤の膜を形成する表面側（第一の側面部の内面側、一般的には底面側）の接触角ヒステリシスが、これに対面する、細胞接着抑制剤の膜を形成しない表面側（第二の側面部の内面側、一般的には上面側）の接触角ヒステリシスよりも、大きい培養容器を形成する。

　そして、このような培養容器の第一の側面部の内面側に、細胞接着抑制剤を塗布することで、細胞接着抑制剤の膜が容易に剥がれることのない培養容器を製造することが可能となっている。
　したがって、本実施形態の培養容器の製造方法によれば、スフェアを好適に形成可能な培養容器を製造することが可能である。

　以上説明したように、本実施形態の培養容器、及び培養容器の製造方法によれば、培養容器内における、細胞接着抑制剤の膜が形成される表面の接触角ヒステリシスが、これに対面する、細胞接着抑制剤の膜が形成されない表面の接触角ヒステリシスよりも大きい培養容器を得ることができる。
　このような培養容器に塗布された細胞接着抑制剤は、塗布された表面から剥がれて対面側に裏移りすることがないため、スフェア培養を適切に行うことが可能である。

　次に、本発明の積層構造体、及び積層構造体の製造方法の実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の実施形態の具体的な内容に限定されるものではない。
　本実施形態の積層構造体は、可撓性を有する培養基材を重ね合わせた積層構造体であって、培養基材はフィルム又はシート状であり、ロール状に巻き取られて積層構造体を形成し、培養基材は、コーティング層が形成された第一の表面と、その反対側の第二の表面とを有し、第一の表面の親水性が第二の表面の親水性よりも高いことを特徴とする。
　すなわち、接触角ヒステリシスを前進接触角－後退接触角と定義した場合、第一の表面のヒステリシスが第二の表面のヒステリシスより大きくなっている。
　また、第二の表面とコーティング層は、接着することなく密着した状態となっている。
　本実施形態の積層構造体は、多層フィルムからなるものであってよく、培養容器などを形成するための包材として好適に使用することができる。

　本実施形態の積層構造体は、図９に示すように、表面にコーティング層２が形成された培養基材１が積層して形成されている。なお、図９には、本実施形態の積層構造体の一部のみが示されている。また、同図の積層構造体は、培養基材１を４層有しているが、これに限定されず、２層や３層有していても５層以上有するものであってもよい。
　このような積層構造体は、表面にコーティング層２が形成された培養基材１をロール状に巻き取ることによって形成することができる。同図において最上層以外のコーティング層２は、その下の培養基材１の表面１２に接着しているが、その上の培養基材１の下面には接着することなく密着している。

　培養基材１の表面１１（第一の表面）には、親水化処理が施されており、これによって、親水化処理を施さない場合に比較して、静的水接触角が相対的に減少し、接触角ヒステリシスが相対的に増加した状態となっている。親水化処理は、例えばコロナ処理やエキシマ処理などにより行うことができるが、これらに限定されるものではない。
　そして、このように親水化処理を施された培養基材１の表面１１上にコーティング剤が塗布されて、コーティング層２が形成されている。

　本実施形態の積層構造体は、上記のように、培養基材１の表面１１に親水化処理を施すことによって、培養基材１の表面１１の接触角ヒステリシスが、培養基材１の表面１２（培養基材１における、コーティング層２が形成された表面と反対側の表面）（第二の表面）の接触角ヒステリシスよりも相対的に大きい状態となっている。

　このように、本実施形態の積層構造体は、培養基材１の表面１１の接触角ヒステリシスが、培養基材１の表面１２の接触角ヒステリシスよりも大きいため、使用に際して培養基材１を平面状に展開するにあたり、培養基材１の表面１１上に形成されたコーティング層２が、培養基材１の表面１２に裏移りすることを防止できる。
　したがって、本実施形態の積層構造体によれば、培養基材１の表面１１上に形成されたコーティング層２が、培養基材１の表面１２に接着して表面１１から剥がれることを防止することが可能となっている。

　培養基材１を構成する材料としては、ポリオレフィンを用いることが好ましく、ポリエチレン（ＰＥ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）等を用いることがより好ましい。特に、少なくとも培養基材１の表面１１側を、ポリオレフィンを用いて構成することが好ましい。

　コーティング層２を形成するコーティング剤としては、特に限定されないが、例えば、細胞接着抑制剤とすることができる。この細胞接着抑制剤としては、リン脂質ポリマー、ポリビニルアルコール誘導体、リン脂質・高分子複合体、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリビニルアルコール、アガロース、キトサン、ポリエチレングリコール、アルブミン等を用いることができる。また、これらを組み合わせて用いても良い。

　また、培養基材を同一又は異なる複数の基材の層からなるものとすることもできる。具体的には、図１０に示すように、培養基材として、培養基材１と培養基材１ａとを接着して形成したものとすることができる。また、より多く数の培養基材を接着して形成することもできる。このとき、培養基材１の表面１１の接触角ヒステリシスは、培養基材１ａの表面１２ａ（又は最も下側の培養基材の底面）（第二の表面）の接触角ヒステリシスよりも大きい。
　培養基材１ａ及びその他の培養基材を構成する材料としても、ポリオレフィンを用いることが好ましく、ポリエチレン（ＰＥ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）等を用いることがより好ましい。
　培養基材をこのように複数の基材の層からなるものとした場合でも、コーティング層２が培養基材の第二の表面に接着して剥がれることを防止することができる。

　本実施形態の積層構造体の製造方法は、可撓性を有する培養基材を重ね合わせた積層構造体の製造方法であって、フィルム又はシートからなる培養基材の第一の表面の親水性が、第一の表面の反対側の第二の表面の親水性よりも大きくなるように、少なくとも第一の表面に親水化処理を施し、第一の表面上にコーティング剤を塗布してコーティング層を形成し、培養基材をロール状に巻き取ることを特徴とする。

　具体的には、図１１に示すように、培養基材１の表面１１に親水化処理を施して、培養基材１の表面１１の接触角ヒステリシスが、培養基材１の表面１２の接触角ヒステリシスよりも大きい状態とする。同図の例では、培養基材１の表面１２には、親水化処理を施していない。次に、培養基材１の表面１１上にコーティング層２を形成する。なお、培養基材を複数の基材の層からなるものとしてもよい。以下においても同様である。
　そして、このようにして得られた培養基材１をロール状に巻き取ることによって、本実施形態の積層構造体を得ることができる。

　また、図１２に示すように、培養基材１の表面１２に親水化処理を施すこともできる。この場合、培養基材１の表面１２には、培養基材１の表面１１に対する親水化処理Ａよりも親水化力の小さい親水化処理Ｂが施される。すなわち、培養基材１の表面１１の親水性よりも、培養基材１の表面１２の親水性が小さくなるように、培養基材１の表面１２に親水化処理が施される。
　その結果、培養基材１の表面１１の親水性の方が、培養基材１の表面１２の親水性よりも高い状態の積層構造体が得られる。
　これによって、培養基材１の表面１１の方が、培養基材１の表面１２よりもコーティング層２との密着性が強くなり、コーティング層２が表面１２に接着して、表面１１から剥がれることを防止することが可能となっている。

　すなわち、図１１及び図１２に示す方法のいずれの場合でも、本実施形態の積層構造体の製造方法において、培養基材１の表面１１の接触角ヒステリシスが、培養基材１の表面１２の接触角ヒステリシスよりも大きくなるように、培養基材１の表面１１に対して親水化処理が施される。具体的には、例えば以下の（Ｉ）～（ＶＩ）ようにすることができるが、これらに限定されない。

（Ｉ）　　表面１１にコロナ処理を１回行い、表面１２には親水化処理を行わない。
（ＩＩ）　表面１１にコロナ処理を３回行い、表面１２には親水化処理を行わない。
（ＩＩＩ）表面１１にコロナ処理を３回行い、表面１２にコロナ処理を１回行う。
（ＩＶ）　表面１１にエキシマ処理を１回行い、表面１２には親水化処理を行わない。
（Ｖ）　　表面１１にエキシマ処理を３回行い、表面１２には親水化処理を行わない。
（ＶＩ）　表面１１にエキシマ処理を３回行い、表面１２にエキシマ処理を１回行う。

　また、本実施形態の積層構造体の製造方法では、以下の（ｉ）～（ｉｘ）ような親水化処理は行われない。その理由は、表面１１の接触角ヒステリシスが、表面１２の接触角ヒステリシスよりも小さくなるか、又は同じになるためである。

（ｉ）　　　表面１１に親水化処理を行わず、表面１２にも親水化処理を行わない。
（ｉｉ）　　表面１１に親水化処理を行わず、表面１２にコロナ処理を１回行う。
（ｉｉｉ）　表面１１にコロナ処理を１回行い、表面１２にもコロナ処理を１回行う。
（ｉｖ）　　表面１１にコロナ処理を１回行い、表面１２にコロナ処理を３回行う。
（ｖ）　　　表面１１にコロナ処理を３回行い、表面１２にもコロナ処理を３回行う。
（ｖｉ）　　表面１１に親水化処理を行わず、表面１２にエキシマ処理を１回行う。
（ｖｉｉ）　表面１１にエキシマ処理を１回行い、表面１２にもエキシマ処理を１回行う。
（ｖｉｉｉ）表面１１にエキシマ処理を１回行い、表面１２にエキシマ処理を３回行う。
（ｉｘ）　　表面１１にエキシマ処理を３回行い、表面１２にもエキシマ処理を３回行う。

　ここで、本実施形態においては、親水性を接触角ヒステリシスにより判断している。その理由は、静的水接触角は、空気と触れている時の最表層の親水性官能基の量と相関のあるものであるため、経時により官能基が樹脂に潜り込んでしまうと、その数値が疎水性側にまで変化すると考えられるためである。
　一方、接触角ヒステリシスは、最表層と少し内側の親水性官能基の量と相関のあるものであるため、経時により官能基が樹脂に潜り込んでも、その数値にほとんど変化がないと考えられるためである。

　本実施形態の積層構造体の製造方法において、複数の層からなる培養基材の形成方法としては、多層押出成形やラミネート法を用いることができる。
　多層押出成形では、例えば、複数の種類の樹脂をそれぞれ独立した押出機に注入して、これらの押出機から多層Ｔダイへ複数の種類の樹脂を押出す。そして、多層Ｔダイにより溶融した樹脂を流し、これを巻き取ることによって複数の層からなる培養基材を得ることができる。
　また、ラミネート法では、別途成形したフィルム同士を加熱しながら圧着することにより、複数の層からなる培養基材を得ることができる。なお、この場合、例えばＰＥとナイロンや、ＰＥとＰＥＴのように種類が全く異なる樹脂を積層させる場合には、接着剤を使用するが、ＰＥと親水化処理ＰＥなどは同じ性質の樹脂同士であるため、接着剤は不要である。

　以上説明したように、本実施形態の積層構造体、及び積層構造体の製造方法によれば、
培養基材をロール状に巻き取って形成された積層構造体において、培養基材の表面上に形成されたコーティング層が剥がれて、裏移りすることを防止することが可能となる。
　さらに、上述の積層構造体からフィルムを送り出して、三方或いは四方をヒートシールすることで二枚のフィルムを貼り合わせた袋状容器形態とすることができる。
　また、コーティング層は、表面１１の全面にコーティングしてもよいし、未ヒートシール領域のみに選択的にコーティングしてもよい。積層構造体は包装材として好適に用いられる。

　以下、本発明の実施形態に係る培養容器において、細胞接着抑制剤の膜が形成される表面の接触角ヒステリシスが、これに対面する、細胞接着抑制剤の膜が形成されない表面の接触角ヒステリシスよりも大きければ、細胞接着抑制剤が塗布された表面から剥がれて対面側に裏移りすることがないことを確認するために行った実験について詳細に説明する。

（実施例１）
　ポリオレフィンからなる長方形のフィルムを準備して、図２に示すように、その左半分側の正方形部分を培養容器における底面と想定し、その右半分側の正方形部分を培養容器における上面と想定した。そして、底面に細胞接着抑制剤を塗布した後、上面を底面に重ね合わせて荷重をかけ、その後、上面を底面から剥離して、細胞接着抑制剤が上面に裏移りしたか否かを目視により判定した。具体的には、以下のように行った。

　まず、フィルムとして、ポリエチレン（ＰＥ）フィルムを使用した。そして、表面処理として、底面に対してバッチ式コロナ処理装置（春日電機株式会社製、以下同様）を用いてコロナ処理を１回施した。また、上面に対しては、表面処理を行わなかった。
　このとき、底面の静的水接触角は７１．９°であり、接触角ヒステリシスは４３．６°であった。また、上面の静的水接触角は９６．７°であり、接触角ヒステリシスは１８．０°であった。

　静的水接触角及びヒステリシスの測定には、固液界面解析システムＤｒｏｐＭａｓｔｅｒ　７００（協和界面科学株式会社製）を使用した。
　具体的には、静的水接触角（θｓ）は、フィルム上に純水３μｌを滴下して測定した。また、接触角ヒステリシス（θａ－θｒ）は、フィルム上に純水３０μｌを滴下し、１秒毎に１°ずつ測定台を傾け、滑落時の前進接触角（θａ）と後退接触角（θｒ）を接線法により算出して得た。

　次に、底面に対して、細胞接着抑制剤として０．５％に調製されたリン脂質ポリマー（LIPIDURE（登録商標），日油株式会社）エタノール溶液をバーコーターで塗布して膜を形成した後、この細胞接着抑制剤の膜をクマシーブルーにて染色して乾燥させた。
　そして、この底面に対して上面を貼り付けて、１０ｇ／ｃｍ^２の荷重をかけて1分静置した後、上面を底面から剥離した。

　その結果、底面に形成された細胞接着抑制剤の膜は、上面に裏移りしていなかった。本実験では底面を親水化したことにより、底面の基材と細胞接着抑制剤の密着性が向上し、一方で上面は疎水性のままであるため、底面から上面に細胞接着抑制剤が裏移りせず、剥離しなかったと考えられる。

（実施例２）
　表面処理の条件を実施例１と異なるものとし、その他の条件については、実施例１と同様にして、実験を行った。
　具体的には、フィルムとして、ポリエチレン（ＰＥ）フィルムを使用した。そして、表面処理として、底面に対してバッチ式コロナ処理装置を用いてコロナ処理を３回施した。また、上面に対しては、表面処理を行わなかった。
　このとき、底面の静的水接触角は５４．２°であり、接触角ヒステリシスは５０．３°であった。また、上面の静的水接触角は９６．７°であり、接触角ヒステリシスは１８．０°であった。

　その結果、底面に形成された細胞接着抑制剤の膜は、裏移りしていなかった。本実験では底面をより強く親水化したことによって、底面の基材と細胞接着抑制剤の密着性が一層向上し、一方で上面は疎水性のままであるため、底面から上面に細胞接着抑制剤が裏移りせず、剥離しなかったと考えられる。

（比較例１）
　表面処理の条件を実施例１と異なるものとし、その他の条件については、実施例１と同様にして、実験を行った。
　具体的には、フィルムとして、ポリエチレン（ＰＥ）フィルムを使用した。そして、底面及び上面に対して、表面処理を行わなかった。
　このとき、底面及び上面の静的水接触角は９６．７°であり、接触角ヒステリシスは１８．０°であった。

　その結果、底面に形成された細胞接着抑制剤の膜は、上面に大きく裏移りしていた。本実験では底面も上面も共に疎水性のままであるため、底面の基材と細胞接着抑制剤が十分に接着せず、上面に裏移りして、底面から剥離してしまったと考えられる。

（比較例２）
　表面処理の条件を実施例１と異なるものとし、その他の条件については、実施例１と同様にして、実験を行った。
　具体的には、フィルムとして、ポリエチレン（ＰＥ）フィルムを使用した。そして、底面に対して、表面処理を行わなかった。一方、上面に対して、表面処理としてバッチ式コロナ処理装置を用いてコロナ処理を３回施した。
　このとき、底面の静的水接触角は９６．７°であり、接触角ヒステリシスは１８．０°であった。また、上面の静的水接触角は５４．２°であり、接触角ヒステリシスは５０．３°であった。

　その結果、底面に形成された細胞接着抑制剤の膜は、上面に大きく裏移りしていた。本実験では底面が疎水性のままである一方、上面が強く親水化されたため、底面に形成された細胞接着抑制剤の膜が上面に裏移りし、底面から剥離してしまったと考えられる。

（比較例３）
　表面処理の条件を実施例１と異なるものとし、その他の条件については、実施例１と同様にして、実験を行った。
　具体的には、フィルムとして、ポリエチレン（ＰＥ）フィルムを使用した。そして、底面に対して、表面処理としてバッチ式コロナ処理装置を用いてコロナ処理を１回施し、上面に対して、表面処理としてバッチ式コロナ処理装置を用いてコロナ処理を３回施した。
　このとき、底面の静的水接触角は７１．９°であり、接触角ヒステリシスは４３．６°であった。また、上面の静的水接触角は５４．２°であり、接触角ヒステリシスは５０．３°であった。

　その結果、底面に形成された細胞接着抑制剤の膜は、上面に大きく裏移りしていた。本実験では底面よりも上面がより強く親水化されたため、底面に形成された細胞接着抑制剤の膜が上面に裏移りし、底面から剥離してしまったと考えられる。

（比較例４）
　表面処理の条件を実施例１と異なるものとし、その他の条件については、実施例１と同様にして、実験を行った。
　具体的には、フィルムとして、ポリエチレン（ＰＥ）フィルムを使用した。そして、底面及び上面に対して、表面処理としてバッチ式コロナ処理装置を用いてコロナ処理を３回施した。
　このとき、底面及び上面の静的水接触角は５４．２°であり、接触角ヒステリシスは５０．３°であった。

　その結果、底面に形成された細胞接着抑制剤の膜は、上面に大きく裏移りしていた。本実験では底面も上面も同様に強く親水化されたため、底面に形成された細胞接着抑制剤の膜が上面に裏移りし、底面から剥離してしまったと考えられる。
　このように、比較例２～４の結果から、上面が強く親水化されていると、細胞接着抑制剤は底面から剥離しやすくなることが分かった。

（実施例３）
　フィルムの材料と表面処理の条件を実施例１と異なるものとし、その他の条件については、実施例１と同様にして、実験を行った。
　具体的には、フィルムとして、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）フィルムを使用した。そして、底面に対して、表面処理としてバッチ式コロナ処理装置を用いてコロナ処理を３回施した。また、上面に対しては、表面処理を行わなかった。
　このとき、底面の静的水接触角は５５．２°であり、接触角ヒステリシスは４８．８°であった。また、上面の静的水接触角は９７．０°であり、接触角ヒステリシスは２２．６°であった。

　その結果、底面に形成された細胞接着抑制剤の膜は、上面に裏移りしていなかった。本実験では底面を親水化したことによって、底面の基材と細胞接着抑制剤の密着性が向上し、一方で上面は疎水性のままであるため、底面から上面に細胞接着抑制剤が裏移りせず、剥離しなかったと考えられる。

（比較例５）
　表面処理の条件を実施例３と異なるものとし、その他の条件については、実施例３と同様にして、実験を行った。
　具体的には、フィルムとして、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）フィルムを使用した。そして、底面及び上面に対して、表面処理を行わなかった。
　このとき、底面及び上面の静的水接触角は、９７．０°であり、接触角ヒステリシスは２２．６°であった。

　その結果、底面に形成された細胞接着抑制剤の膜は、上面にわずかに裏移りしていた。本実験では底面も上面も共に疎水性のままであるため、底面の基材と細胞接着抑制剤が十分に接着せず、上面に裏移りして、底面から剥離してしまったと考えられる。

（実施例４）
　細胞接着抑制剤の種類とそのコーティング方法、及び表面処理の条件を実施例１と異なるものとし、その他の条件については、実施例１と同様にして、実験を行った。
　具体的には、フィルムとして、ポリエチレン（ＰＥ）フィルムを使用した。また、底面に対して、表面処理としてバッチ式コロナ処理装置を用いてコロナ処理を３回施した。また、上面に対しては、表面処理を行わなかった。
　このとき、底面の静的水接触角は５４．２°であり、接触角ヒステリシスは５０．３°であった。また、上面の静的水接触角は９６．７°であり、接触角ヒステリシスは１８．０°であった。
　また、細胞接着抑制剤として、側鎖にアジド基を有するポリビニルアルコール（BIOSURFINE(登録商標)-ＡＷＰ，東洋合成工業株式会社）を使用した。この細胞接着抑制剤を１％の水溶液に調製してバーコーターで底面に塗布した後、波長２５４ｎｍのＵＶを積算光量０．７Ｊ／ｃｍ^２で照射して硬化させた。

　その結果、底面に形成された細胞接着抑制剤の膜は、上面に裏移りしていなかった。本実験では底面を親水化したことによって、底面の基材と細胞接着抑制剤の密着性が向上し、一方で上面は疎水性のままであるため、底面から上面に細胞接着抑制剤が裏移りせず、剥離しなかったと考えられる。
　すなわち、細胞接着抑制剤の種類を異なるものとした場合でも、底面に親水化処理を施すことによって、底面から上面に細胞接着抑制剤が裏移りすることを防止することができた。

（比較例６）
　表面処理の条件を実施例４と異なるものとし、その他の条件については、実施例４と同様にして、実験を行った。
　具体的には、フィルムとして、ポリエチレン（ＰＥ）フィルムを使用した。また、底面及び上面に対して、表面処理を行わなかった。
　このとき、底面及び上面の静的水接触角は９６．７°であり、接触角ヒステリシスは１８．０°であった。
　また、細胞接着抑制剤として、側鎖にアジド基を有するポリビニルアルコール（BIOSURFINE(登録商標)-ＡＷＰ，東洋合成工業株式会社）を使用した。この細胞接着抑制剤を１％の水溶液に調製してバーコーターで底面に塗布した後、波長２５４ｎｍのＵＶを積算光量０．７Ｊ／ｃｍ^２で照射して硬化させた。

　その結果、底面に形成された細胞接着抑制剤の膜は、上面にわずかに裏移りしていた。本実験では底面も上面も共に疎水性のままであるため、底面の基材と細胞接着抑制剤が十分に接着せず、上面に裏移りして、底面から剥離してしまったと考えられる。

（実施例５）
　実施例１と同じ条件でフィルムに表面処理を行った後、５０℃で７日間経過後に、底面及び上面の静的水接触角と接触角ヒステリシスを測定した。
　具体的には、フィルムとして、ポリエチレン（ＰＥ）フィルムを使用した。そして、底面に対して、表面処理としてバッチ式コロナ処理装置を用いてコロナ処理を１回施した。また、上面に対しては、表面処理を行わなかった。

　５０℃で７日間経過後、コロナ処理を１回行った底面の静的水接触角は８７．８°であり、接触角ヒステリシスは４３．９°であった。また、表面処理を行わなかった上面の静的水接触角は９６．７°であり、接触角ヒステリシスは１８．０°であった。
　すなわち、底面に表面処理を施したフィルムを５０℃で７日間保管した結果、底面の静的水接触角は、表面処理を行っていない数値に近い、疎水性を示す数値にまで戻っていることが分かる。これに対して、底面の接触角ヒステリシスは、実施例１と比較して大きな変化は見られなかった。

　次に、実施例１と同様に、底面に対して、細胞接着抑制剤を塗布して膜を形成した後、この細胞接着抑制剤の膜をクマシーブルーにて染色して乾燥させた。
　そして、この底面に対して上面を貼り付けて、１０ｇ／ｃｍ^２の荷重をかけて1分静置した後、上面を底面から剥離した。

　その結果、底面に形成された細胞接着抑制剤の膜は、上面に裏移りしていなかった。
　すなわち、底面の静的水接触角が疎水性を示す数値にまで戻っていたが、底面の接触角ヒステリシスは親水化された数値を示しており、底面の基材と細胞接着抑制剤の密着性が向上し、一方で上面は疎水性のままであるため、底面から上面に細胞接着抑制剤が裏移りせず、剥離しなかったと考えられる。

　ここで、静的水接触角は、空気と触れている時の最表層の親水性官能基の量と相関のあるものであるため、経時で官能基が樹脂に潜り込んでしまった結果、その数値が疎水性を示す値にまで変化したと考えられる。
　これに対して、接触角ヒステリシスは、最表層と少し内側の親水性官能基の量と相関のあるものであるため、経時で官能基が樹脂に潜り込んでも、その数値がほとんど変化しなかったと考えられる。
　そして、このように底面の静的水接触角は疎水性の数値を示すものの、底面の接触角ヒステリシスが親水化された数値を示す場合に、底面は親水化されていると言えることが、上記の通り、明らかとなった。

（実施例６）
　表面処理の条件を実施例５と異なるものとし、その他の条件については、実施例５と同様にして、実験を行った。
　具体的には、フィルムとして、ポリエチレン（ＰＥ）フィルムを使用した。そして、底面に対して、表面処理としてバッチ式コロナ処理装置を用いてコロナ処理を３回施した。また、上面に対しては、表面処理を行わなかった。そして、５０℃で７日間経過後に、底面及び上面の静的水接触角と接触角ヒステリシスを測定した。

　このとき、コロナ処理を３回行った底面の静的水接触角は８５．３°であり、接触角ヒステリシスは４４．５°であった。また、表面処理を行わなかった上面の静的水接触角は９６．７°であり、接触角ヒステリシスは１８．０°であった。
　すなわち、底面に表面処理を施したフィルムを５０℃で７日間保管した結果、底面の静的水接触角は、表面処理を行っていない数値に近い、疎水性を示す数値にまで戻っていることが分かる。これに対して、底面の接触角ヒステリシスには、大きな変化は見られなかった。

　次に、実施例１と同様に、底面に対して、細胞接着抑制剤を塗布して膜を形成した後、この細胞接着抑制剤の膜をクマシーブルーにて染色して乾燥させた。
　そして、この底面に対して上面を貼り付けて、１０ｇ／ｃｍ^２の荷重をかけて1分静置した後、上面を底面から剥離した。

　その結果、実施例５と同様に、底面に形成された細胞接着抑制剤の膜は、上面に裏移りしていなかった。
　すなわち、底面の静的水接触角が疎水性を示す数値にまで戻っていたが、底面の接触角ヒステリシスは親水化された数値を示しており、底面の基材と細胞接着抑制剤の密着性が向上し、一方で上面は疎水性のままであるため、底面から上面に細胞接着抑制剤が裏移りせず、剥離しなかったと考えられる。

（比較例７）
　表面処理の条件を実施例５と異なるものとし、その他の条件については、実施例５と同様にして、実験を行った。
　具体的には、フィルムとして、ポリエチレン（ＰＥ）フィルムを使用した。そして、底面及び上面に対して、表面処理を行わなかった。そして、５０℃で７日間経過後に、底面及び上面の静的水接触角と接触角ヒステリシスを測定した。
　このとき、底面及び上面の静的水接触角は９６．７°であり、接触角ヒステリシスは１８．０°であった。

　次に、実施例１と同様に、底面に対して、細胞接着抑制剤を塗布して膜を形成した後、この細胞接着抑制剤の膜をクマシーブルーにて染色して乾燥させた。
　そして、この底面に対して上面を貼り付けて、１０ｇ／ｃｍ^２の荷重をかけて1分静置した後、上面を底面から剥離した。

　その結果、底面に形成された細胞接着抑制剤の膜は、上面に裏移りしていた。本実験では底面も上面も共に疎水性のままであるため、底面の基材と細胞接着抑制剤が十分に接着せず、上面に裏移りして、底面から剥離してしまったと考えられる。

（実施例７）
　表面処理の条件を実施例１と異なるものとし、その他の条件については、実施例１と同様にして、実験を行った。
　具体的には、フィルムとして、ポリエチレン（ＰＥ）フィルムを使用した。そして、表面処理として、底面に対してエキシマ照射装置（株式会社エム・ディ・コム製）を用いてエキシマ処理を１回施した。このとき、エキシマ処理の条件は１２Ｖ、照射距離４ｍｍ、テーブル移動速度５ｍｍ／ｓｅｃとした。また、上面に対しては、表面処理を行わなかった。
　このとき、底面の静的水接触角は７６．２°であり、接触角ヒステリシスは４１．８°であった。また、上面の静的水接触角は９６．７°であり、接触角ヒステリシスは１８．０°であった。

　その結果、底面に形成された細胞接着抑制剤の膜は、上面に裏移りしていなかった。本実験では底面を親水化したことによって、底面の基材と細胞接着抑制剤の密着性が向上し、一方で上面は疎水性のままであるため、底面から上面に細胞接着抑制剤が裏移りせず、剥離しなかったと考えられる。
　すなわち、親水化処理の方法をコロナ処理とは異なるものとした場合でも、底面に親水化処理を施すことによって、底面から上面に細胞接着抑制剤が裏移りすることを防止することができた。

　以上の通り、培養容器内の底面のみを親水化するか、又は底面を上面よりも強く親水化することによって、底面の基材と細胞接着抑制剤の密着性を上面の基材と細胞接着抑制剤の密着性よりも相対的に向上させることができ、底面から上面に細胞接着抑制剤が裏移りせず、剥離を防止できることが明らかとなった。一方、培養容器内の上面を強く親水化すると、細胞接着抑制剤は底面から剥離しやすくなることが明らかとなった。
　また、細胞接着抑制剤の種類を異なるものとした場合でも、培養容器内の底面のみを親水化するか、又は底面を上面よりも強く親水化することにより、底面から上面に細胞接着抑制剤が裏移りすることを防止できることが分かった。

　次に、本発明の本実施形態に係る積層構造体において、培養基材１のコーティング層が形成される表面の接触角ヒステリシスが、その表面の反対側のコーティング層が形成されない表面の接触角ヒステリシスよりも大きければ、コーティング層が形成された表面から剥がれて反対側の表面に裏移りすることがないことを確認するために行った実験について詳細に説明する。
　なお、以下に示す実施例１１～１７、及び比較例１１～１７は、それぞれ上述した実施例１～７、及び比較例１～７と同一の実験であるが、それぞれ対応する実施形態において使用している用語が異なるため、改めて説明する。

（実施例１１）
　ポリオレフィンからなる長方形のフィルムを準備して、図２に示すように、その左半分側の正方形部分を培養基材１の表面１１と想定し、その右半分側の正方形部分を培養基材１の表面１２と想定した。そして、表面１１に細胞接着抑制剤を塗布した後、表面１２を表面１１に重ね合わせて荷重をかけ、その後、表面１２を表面１１から剥離して、細胞接着抑制剤が表面１２に裏移りしたか否かを目視により判定した。具体的には、以下のように行った。

　まず、フィルムとして、ポリエチレン（ＰＥ）フィルムを使用した。そして、表面処理として、表面１１に対してバッチ式コロナ処理装置（春日電機株式会社製、以下同様）を用いてコロナ処理を１回施した。また、表面１２に対しては、表面処理を行わなかった。
　このとき、表面１１の静的水接触角は７１．９°であり、接触角ヒステリシスは４３．６°であった。また、表面１２の静的水接触角は９６．７°であり、接触角ヒステリシスは１８．０°であった。

　静的水接触角及びヒステリシスの測定には、固液界面解析システムＤｒｏｐＭａｓｔｅｒ　７００（協和界面科学株式会社製）を使用した。
　具体的には、静的水接触角（θｓ）は、フィルム上に純水３μｌを滴下して測定した。また、接触角ヒステリシス（θａ－θｒ）は、フィルム上に純水３０μｌを滴下し、１秒毎に１°ずつ測定台を傾け、滑落時の前進接触角（θａ）と後退接触角（θｒ）を接線法により算出して得た。

　次に、表面１１に対して、細胞接着抑制剤として０．５％に調製されたリン脂質ポリマー（LIPIDURE（登録商標），日油株式会社）エタノール溶液をバーコーターで塗布して膜を形成した後、この細胞接着抑制剤の膜をクマシーブルーにて染色して乾燥させた。
　そして、この表面１１に対して表面１２を貼り付けて、１０ｇ／ｃｍ^２の荷重をかけて1分静置した後、表面１２を表面１１から剥離した。

　その結果、表面１１に形成された細胞接着抑制剤の膜（コーティング層）は、表面１２に裏移りしていなかった。本実験では表面１１を親水化したことにより、表面１１の基材と細胞接着抑制剤の密着性が向上し、一方で表面１２は疎水性のままであるため、表面１１から表面１２に細胞接着抑制剤が裏移りせず、剥離しなかったと考えられる。

（実施例１２）
　表面処理の条件を実施例１１と異なるものとし、その他の条件については、実施例１１と同様にして、実験を行った。
　具体的には、フィルムとして、ポリエチレン（ＰＥ）フィルムを使用した。そして、表面処理として、表面１１に対してバッチ式コロナ処理装置を用いてコロナ処理を３回施した。また、表面１２に対しては、表面処理を行わなかった。
　このとき、表面１１の静的水接触角は５４．２°であり、接触角ヒステリシスは５０．３°であった。また、表面１２の静的水接触角は９６．７°であり、接触角ヒステリシスは１８．０°であった。

　その結果、表面１１に形成された細胞接着抑制剤の膜は、裏移りしていなかった。本実験では表面１１をより強く親水化したことによって、表面１１の基材と細胞接着抑制剤の密着性が一層向上し、一方で表面１２は疎水性のままであるため、表面１１から表面１２に細胞接着抑制剤が裏移りせず、剥離しなかったと考えられる。

（比較例１１）
　表面処理の条件を実施例１１と異なるものとし、その他の条件については、実施例１１と同様にして、実験を行った。
　具体的には、フィルムとして、ポリエチレン（ＰＥ）フィルムを使用した。そして、表面１１及び表面１２に対して、表面処理を行わなかった。
　このとき、表面１１及び表面１２の静的水接触角は９６．７°であり、接触角ヒステリシスは１８．０°であった。

　その結果、表面１１に形成された細胞接着抑制剤の膜は、表面１２に大きく裏移りしていた。本実験では表面１１も表面１２も共に疎水性のままであるため、表面１１の基材と細胞接着抑制剤が十分に接着せず、表面１２に裏移りして、表面１１から剥離してしまったと考えられる。

（比較例１２）
　表面処理の条件を実施例１１と異なるものとし、その他の条件については、実施例１１と同様にして、実験を行った。
　具体的には、フィルムとして、ポリエチレン（ＰＥ）フィルムを使用した。そして、表面１１に対して、表面処理を行わなかった。一方、表面１２に対して、表面処理としてバッチ式コロナ処理装置を用いてコロナ処理を３回施した。
　このとき、表面１１の静的水接触角は９６．７°であり、接触角ヒステリシスは１８．０°であった。また、表面１２の静的水接触角は５４．２°であり、接触角ヒステリシスは５０．３°であった。

　その結果、表面１１に形成された細胞接着抑制剤の膜は、表面１２に大きく裏移りしていた。本実験では表面１１が疎水性のままである一方、表面１２が強く親水化されたため、表面１１に形成された細胞接着抑制剤の膜が表面１２に裏移りし、表面１１から剥離してしまったと考えられる。

（比較例１３）
　表面処理の条件を実施例１１と異なるものとし、その他の条件については、実施例１１と同様にして、実験を行った。
　具体的には、フィルムとして、ポリエチレン（ＰＥ）フィルムを使用した。そして、表面１１に対して、表面処理としてバッチ式コロナ処理装置を用いてコロナ処理を１回施し、表面１２に対して、表面処理としてバッチ式コロナ処理装置を用いてコロナ処理を３回施した。
　このとき、表面１１の静的水接触角は７１．９°であり、接触角ヒステリシスは４３．６°であった。また、表面１２の静的水接触角は５４．２°であり、接触角ヒステリシスは５０．３°であった。

　その結果、表面１１に形成された細胞接着抑制剤の膜は、表面１２に大きく裏移りしていた。本実験では表面１１よりも表面１２がより強く親水化されたため、表面１１に形成された細胞接着抑制剤の膜が表面１２に裏移りし、表面１１から剥離してしまったと考えられる。

（比較例１４）
　表面処理の条件を実施例１１と異なるものとし、その他の条件については、実施例１１と同様にして、実験を行った。
　具体的には、フィルムとして、ポリエチレン（ＰＥ）フィルムを使用した。そして、表面１１及び表面１２に対して、表面処理としてバッチ式コロナ処理装置を用いてコロナ処理を３回施した。
　このとき、表面１１及び表面１２の静的水接触角は５４．２°であり、接触角ヒステリシスは５０．３°であった。

　その結果、表面１１に形成された細胞接着抑制剤の膜は、表面１２に大きく裏移りしていた。本実験では表面１１も表面１２も同様に強く親水化されたため、表面１１に形成された細胞接着抑制剤の膜が表面１２に裏移りし、表面１１から剥離してしまったと考えられる。
　このように、比較例１２～１４の結果から、表面１２が強く親水化されていると、細胞接着抑制剤は表面１１から剥離しやすくなることが分かった。

（実施例１３）
　フィルムの材料と表面処理の条件を実施例１１と異なるものとし、その他の条件については、実施例１１と同様にして、実験を行った。
　具体的には、フィルムとして、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）フィルムを使用した。そして、表面１１に対して、表面処理としてバッチ式コロナ処理装置を用いてコロナ処理を３回施した。また、表面１２に対しては、表面処理を行わなかった。
　このとき、表面１１の静的水接触角は５５．２°であり、接触角ヒステリシスは４８．８°であった。また、表面１２の静的水接触角は９７．０°であり、接触角ヒステリシスは２２．６°であった。

　その結果、表面１１に形成された細胞接着抑制剤の膜は、表面１２に裏移りしていなかった。本実験では表面１１を親水化したことによって、表面１１の基材と細胞接着抑制剤の密着性が向上し、一方で表面１２は疎水性のままであるため、表面１１から表面１２に細胞接着抑制剤が裏移りせず、剥離しなかったと考えられる。

（比較例１５）
　表面処理の条件を実施例１３と異なるものとし、その他の条件については、実施例１３と同様にして、実験を行った。
　具体的には、フィルムとして、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）フィルムを使用した。そして、表面１１及び表面１２に対して、表面処理を行わなかった。
　このとき、表面１１及び表面１２の静的水接触角は、９７．０°であり、接触角ヒステリシスは２２．６°であった。

　その結果、表面１１に形成された細胞接着抑制剤の膜は、表面１２にわずかに裏移りしていた。本実験では表面１１も表面１２も共に疎水性のままであるため、表面１１の基材と細胞接着抑制剤が十分に接着せず、表面１２に裏移りして、表面１１から剥離してしまったと考えられる。

（実施例１４）
　細胞接着抑制剤の種類とそのコーティング方法、及び表面処理の条件を実施例１１と異なるものとし、その他の条件については、実施例１１と同様にして、実験を行った。
　具体的には、フィルムとして、ポリエチレン（ＰＥ）フィルムを使用した。また、表面１１に対して、表面処理としてバッチ式コロナ処理装置を用いてコロナ処理を３回施した。また、表面１２に対しては、表面処理を行わなかった。
　このとき、表面１１の静的水接触角は５４．２°であり、接触角ヒステリシスは５０．３°であった。また、表面１２の静的水接触角は９６．７°であり、接触角ヒステリシスは１８．０°であった。
　また、細胞接着抑制剤として、側鎖にアジド基を有するポリビニルアルコール（BIOSURFINE(登録商標)-ＡＷＰ，東洋合成工業株式会社）を使用した。この細胞接着抑制剤を１％の水溶液に調製してバーコーターで表面１１に塗布した後、波長２５４ｎｍのＵＶを積算光量０．７Ｊ／ｃｍ^２で照射して硬化させた。

　その結果、表面１１に形成された細胞接着抑制剤の膜は、表面１２に裏移りしていなかった。本実験では表面１１を親水化したことによって、表面１１の基材と細胞接着抑制剤の密着性が向上し、一方で表面１２は疎水性のままであるため、表面１１から表面１２に細胞接着抑制剤が裏移りせず、剥離しなかったと考えられる。
　すなわち、細胞接着抑制剤の種類を異なるものとした場合でも、表面１１に親水化処理を施すことによって、表面１１から表面１２に細胞接着抑制剤が裏移りすることを防止することができた。

（比較例１６）
　表面処理の条件を実施例１４と異なるものとし、その他の条件については、実施例１４と同様にして、実験を行った。
　具体的には、フィルムとして、ポリエチレン（ＰＥ）フィルムを使用した。また、表面１１及び表面１２に対して、表面処理を行わなかった。
　このとき、表面１１及び表面１２の静的水接触角は９６．７°であり、接触角ヒステリシスは１８．０°であった。
　また、細胞接着抑制剤として、側鎖にアジド基を有するポリビニルアルコール（BIOSURFINE(登録商標)-ＡＷＰ，東洋合成工業株式会社）を使用した。この細胞接着抑制剤を１％の水溶液に調製してバーコーターで表面１１に塗布した後、波長２５４ｎｍのＵＶを積算光量０．７Ｊ／ｃｍ^２で照射して硬化させた。

　その結果、表面１１に形成された細胞接着抑制剤の膜は、表面１２にわずかに裏移りしていた。本実験では表面１１も表面１２も共に疎水性のままであるため、表面１１の基材と細胞接着抑制剤が十分に接着せず、表面１２に裏移りして、表面１１から剥離してしまったと考えられる。

（実施例１５）
　実施例１１と同じ条件でフィルムに表面処理を行った後、５０℃で７日間経過後に、表面１１及び表面１２の静的水接触角と接触角ヒステリシスを測定した。
　具体的には、フィルムとして、ポリエチレン（ＰＥ）フィルムを使用した。そして、表面１１に対して、表面処理としてバッチ式コロナ処理装置を用いてコロナ処理を１回施した。また、表面１２に対しては、表面処理を行わなかった。

　５０℃で７日間経過後、コロナ処理を１回行った表面１１の静的水接触角は８７．８°であり、接触角ヒステリシスは４３．９°であった。また、表面処理を行わなかった表面１２の静的水接触角は９６．７°であり、接触角ヒステリシスは１８．０°であった。
　すなわち、表面１１に表面処理を施したフィルムを５０℃で７日間保管した結果、表面１１の静的水接触角は、表面処理を行っていない数値に近い、疎水性を示す数値にまで戻っていることが分かる。これに対して、表面１１の接触角ヒステリシスは、実施例１と比較して大きな変化は見られなかった。

　次に、実施例１１と同様に、表面１１に対して、細胞接着抑制剤を塗布して膜を形成した後、この細胞接着抑制剤の膜をクマシーブルーにて染色して乾燥させた。
　そして、この表面１１に対して表面１２を貼り付けて、１０ｇ／ｃｍ^２の荷重をかけて1分静置した後、表面１２を表面１１から剥離した。

　その結果、表面１１に形成された細胞接着抑制剤の膜は、表面１２に裏移りしていなかった。
　すなわち、表面１１の静的水接触角が疎水性を示す数値にまで戻っていたが、表面１１の接触角ヒステリシスは親水化された数値を示しており、表面１１の基材と細胞接着抑制剤の密着性が向上し、一方で表面１２は疎水性のままであるため、表面１１から表面１２に細胞接着抑制剤が裏移りせず、剥離しなかったと考えられる。

　このように表面１１の静的水接触角は疎水性の数値を示すものの、表面１１の接触角ヒステリシスが親水化された数値を示す場合に、表面１１は親水化されていると言えることが、上記の通り、明らかとなった。

（実施例１６）
　表面処理の条件を実施例１５と異なるものとし、その他の条件については、実施例１５と同様にして、実験を行った。
　具体的には、フィルムとして、ポリエチレン（ＰＥ）フィルムを使用した。そして、表面１１に対して、表面処理としてバッチ式コロナ処理装置を用いてコロナ処理を３回施した。また、表面１２に対しては、表面処理を行わなかった。そして、５０℃で７日間経過後に、表面１１及び表面１２の静的水接触角と接触角ヒステリシスを測定した。

　このとき、コロナ処理を３回行った表面１１の静的水接触角は８５．３°であり、接触角ヒステリシスは４４．５°であった。また、表面処理を行わなかった表面１２の静的水接触角は９６．７°であり、接触角ヒステリシスは１８．０°であった。
　すなわち、表面１１に表面処理を施したフィルムを５０℃で７日間保管した結果、表面１１の静的水接触角は、表面処理を行っていない数値に近い、疎水性を示す数値にまで戻っていることが分かる。これに対して、表面１１の接触角ヒステリシスには、大きな変化は見られなかった。

　次に、実施例１１と同様に、表面１１に対して、細胞接着抑制剤を塗布して膜を形成した後、この細胞接着抑制剤の膜をクマシーブルーにて染色して乾燥させた。
　そして、この表面１１に対して表面１２を貼り付けて、１０ｇ／ｃｍ^２の荷重をかけて1分静置した後、表面１２を表面１１から剥離した。

　その結果、実施例１５と同様に、表面１１に形成された細胞接着抑制剤の膜は、表面１２に裏移りしていなかった。
　すなわち、表面１１の静的水接触角が疎水性を示す数値にまで戻っていたが、表面１１の接触角ヒステリシスは親水化された数値を示しており、表面１１の基材と細胞接着抑制剤の密着性が向上し、一方で表面１２は疎水性のままであるため、表面１１から表面１２に細胞接着抑制剤が裏移りせず、剥離しなかったと考えられる。

（比較例１７）
　表面処理の条件を実施例５と異なるものとし、その他の条件については、実施例５と同様にして、実験を行った。
　具体的には、フィルムとして、ポリエチレン（ＰＥ）フィルムを使用した。そして、表面１１及び表面１２に対して、表面処理を行わなかった。そして、５０℃で７日間経過後に、表面１１及び表面１２の静的水接触角と接触角ヒステリシスを測定した。
　このとき、表面１１及び表面１２の静的水接触角は９６．７°であり、接触角ヒステリシスは１８．０°であった。

　次に、実施例１１と同様に、表面１１に対して、細胞接着抑制剤を塗布して膜を形成した後、この細胞接着抑制剤の膜をクマシーブルーにて染色して乾燥させた。
　そして、この表面１１に対して表面１２を貼り付けて、１０ｇ／ｃｍ^２の荷重をかけて1分静置した後、表面１２を表面１１から剥離した。

　その結果、表面１１に形成された細胞接着抑制剤の膜は、表面１２に裏移りしていた。本実験では表面１１も表面１２も共に疎水性のままであるため、表面１１の基材と細胞接着抑制剤が十分に接着せず、表面１２に裏移りして、表面１１から剥離してしまったと考えられる。

（実施例１７）
　表面処理の条件を実施例１１と異なるものとし、その他の条件については、実施例１１と同様にして、実験を行った。
　具体的には、フィルムとして、ポリエチレン（ＰＥ）フィルムを使用した。そして、表面処理として、表面１１に対してエキシマ照射装置（株式会社エム・ディ・コム製）を用いてエキシマ処理を１回施した。このとき、エキシマ処理の条件は１２Ｖ、照射距離４ｍｍ、テーブル移動速度５ｍｍ／ｓｅｃとした。また、表面１２に対しては、表面処理を行わなかった。
　このとき、表面１１の静的水接触角は７６．２°であり、接触角ヒステリシスは４１．８°であった。また、表面１２の静的水接触角は９６．７°であり、接触角ヒステリシスは１８．０°であった。

　その結果、表面１１に形成された細胞接着抑制剤の膜は、表面１２に裏移りしていなかった。本実験では表面１１を親水化したことによって、表面１１の基材と細胞接着抑制剤の密着性が向上し、一方で表面１２は疎水性のままであるため、表面１１から表面１２に細胞接着抑制剤が裏移りせず、剥離しなかったと考えられる。
　すなわち、親水化処理の方法をコロナ処理とは異なるものとした場合でも、表面１１に親水化処理を施すことによって、表面１１から表面１２に細胞接着抑制剤が裏移りすることを防止することができた。

　以上の通り、培養容器内の表面１１のみを親水化するか、又は表面１１を表面１２よりも強く親水化することによって、表面１１の基材とコーティング層の密着性を表面１２の基材とコーティング層の密着性よりも相対的に向上させることができ、表面１１から表面１２にコーティング層が裏移りせず、剥離を防止できることが明らかとなった。一方、培養容器内の表面１２を強く親水化すると、コーティング層は表面１１から剥離しやすくなることが明らかとなった。
　また、コーティング層の種類を異なるものとした場合でも、培養容器内の表面１１のみを親水化するか、又は表面１１を表面１２よりも強く親水化することにより、表面１１から表面１２にコーティング層が裏移りすることを防止できることが分かった。

　本発明は、以上の実施形態に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
　例えば、上記実施例では、培養容器の基材としてポリエチレンと環状オレフィンコポリマーを用いたが、ポリオレフィンであればその他の基材を用いても良い。また、表面処理としては、接触角ヒステリシスの値にもとづき親水化が示されるものであれば、コロナ処理やエキシマ処理に限定されず、その他の処理を用いることもできる。さらに、培養容器内の上面及び下面に細胞接着抑制剤の膜を形成するなど適宜変更することが可能である。

　本発明は、ｉＰＳ細胞などをスフェア培養する場合に好適に利用することが可能である。
　また、本発明は、細胞培養容器を製造するための包材などに好適に利用することが可能である。

　この明細書に記載の文献及び本願のパリ優先の基礎となる日本出願明細書の内容を全てここに援用する。

　１、１ａ　培養基材
　１１　第一の表面
　１２、１２ａ　第二の表面
　２　コーティング層
 

Claims (19)

1. 　軟包材からなる培養容器であって、
   　対面する第一の側面部と第二の側面部とを備え、
   　接触角ヒステリシスを水滑落時の前進接触角－後退接触角と定義した場合に、前記第一の側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスが、前記第二の側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスより大きくなるように、少なくとも前記第一の側面部の内面側に表面処理が施されており、かつ、
   　前記第一の側面部の内面側に、細胞接着抑制剤からなる膜が形成された
   　ことを特徴とする培養容器。
2. 　前記第一の側面部の内面側の基材及び前記第二の側面部の内面側の基材がポリオレフィンからなることを特徴とする請求項１記載の培養容器。
3. 　少なくとも前記第一の側面部の内面側に親水化処理が施されていることを特徴とする請求項１又は２記載の培養容器。
4. 　前記細胞接着抑制剤が、少なくともリン脂質ポリマー又はポリビニルアルコール誘導体のいずれかであることを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載の培養容器。
5. 　前記第一の側面部の内面側に複数のウェルが形成されたことを特徴とする請求項１～４のいずれかに記載の培養容器。
6. 　スフェア培養のための培養容器の製造方法であって、
   　ポリオレフィンからなるフィルム又はシートの一部に親水化処理を施し、
   　前記フィルム又はシートの親水化処理が施された面を内面側に備えた第一の側面部と、前記第一の側面部に対面する第二の側面部とを備え、かつ、接触角ヒステリシスを水滑落時の前進接触角－後退接触角と定義した場合に、前記第一の側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスが、前記第二の側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスより大きい前記培養容器を形成し、
   　前記第一の側面部の内面側に、細胞接着抑制剤を塗布する
   　ことを特徴とする培養容器の製造方法。
7. 　スフェア培養のための培養容器の製造方法であって、
   　ポリオレフィンからなるフィルム又はシートの一部に第一の親水化処理を施すと共に、前記フィルム又はシートの他の一部に前記第一の親水化処理よりも親水化力の小さい第二の親水化処理を施し、
   　前記フィルム又はシートの前記第一の親水化処理が施された面を内面側に備えた第一の側面部と、前記第一の側面部に対面する前記第二の親水化処理が施された面を内面側に備えた第二の側面部とを備え、かつ、接触角ヒステリシスを水滑落時の前進接触角－後退接触角と定義した場合に、前記第一の側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスが、前記第二の側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスより大きい前記培養容器を形成し、
   　前記第一の側面部の内面側に、細胞接着抑制剤を塗布する
   　ことを特徴とする培養容器の製造方法。
8. 　可撓性を有する培養基材を重ね合わせた積層構造体であって、
   　前記培養基材はフィルム又はシート状であり、ロール状に巻き取られて前記積層構造体を形成し、
   　前記培養基材は、コーティング層が形成された第一の表面と、その反対側の第二の表面とを有し、前記第一の表面の親水性が前記第二の表面の親水性よりも高い
   　ことを特徴とする積層構造体。
9. 　前記第二の表面と前記コーティング層が接着することなく密着していることを特徴とする請求項８記載の積層構造体。
10. 　接触角ヒステリシスを前進接触角－後退接触角と定義した場合、前記第一の表面のヒステリシスが前記第二の表面のヒステリシスより大きいことを特徴とする請求項８又は９記載の積層構造体。
11. 　前記コーティング層が細胞接着抑制剤を前記第一の表面に塗布して形成されたことを特徴とする請求項８～１０のいずれかに記載の積層構造体。
12. 　前記細胞接着抑制剤がリン脂質ポリマー又はポリビニルアルコール誘導体であることを特徴とする請求項８～１１のいずれかに記載の積層構造体。
13. 　前記培養基材がポリオレフィンからなることを特徴とする請求項８～１２のいずれかに記載の積層構造体。
14. 　前記第一の表面に親水化処理が施されていることを特徴とする請求項８～１３のいずれかに記載の積層構造体。
15. 　前記第二の表面に親水化処理が施されていないことを特徴とする請求項８～１４のいずれかに記載の積層構造体。
16. 　前記第二の表面の親水性が、前記第一の表面の親水性よりも小さくなるように、前記第二の表面に親水化処理が施されていることを特徴とする請求項８～１５のいずれかに記載の積層構造体。
17. 　前記培養基材が同一又は異なる複数の基材の層からなることを特徴とする請求項８～１６のいずれかに記載の積層構造体。
18. 　可撓性を有する培養基材を重ね合わせた積層構造体の製造方法であって、
    　フィルム又はシートからなる前記培養基材の第一の表面の親水性が、前記第一の表面の反対側の第二の表面の親水性よりも大きくなるように、少なくとも前記第一の表面に親水化処理を施し、
    　前記第一の表面上にコーティング剤を塗布してコーティング層を形成し、
    　前記培養基材をロール状に巻き取る
    　ことを特徴とする積層構造体の製造方法。
19. 　前記第一の表面の親水性よりも前記第二の表面の親水性が小さくなるように、前記第二の表面に親水化処理を施す
    　ことを特徴とする請求項１８記載の積層構造体の製造方法。

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