WO2022196444A1 - 細胞培養用滅菌容器 - Google Patents

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WO2022196444A1
WO2022196444A1 PCT/JP2022/010012 JP2022010012W WO2022196444A1 WO 2022196444 A1 WO2022196444 A1 WO 2022196444A1 JP 2022010012 W JP2022010012 W JP 2022010012W WO 2022196444 A1 WO2022196444 A1 WO 2022196444A1
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WO
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cell
water
cell culture
container
soluble resin
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Application number
PCT/JP2022/010012
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English (en)
French (fr)
Inventor
幸太 五十嵐
Original Assignee
住友ベークライト株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/12—Well or multiwell plates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/20—Material Coatings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M37/00—Means for sterilizing, maintaining sterile conditions or avoiding chemical or biological contamination

Definitions

  • the present invention relates to a sterile container for cell culture.
  • Patent Literature 1 discloses a method in which a polystyrene member is placed in a reaction vessel, ozone gas is circulated, oxygen is introduced to the surface to make it hydrophilic, and adsorption of proteins and the like to the surface of the polystyrene member is reduced. disclosed. In addition to this, a method of coating the inner surface of the container with a hydrophilic polymer is also known.
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned problems, and aims to provide a sterilized container for cell culture that is sufficiently sterilized yet maintains its low cell adsorption property and facilitates the formation of cell aggregates during cell culture. aim.
  • a sterilized container for cell culture according to the present invention is a sterilized container for cell culture with low cell adsorption, which is made of a resin material and is capable of containing cells and a liquid medium for cell culture.
  • a coating layer composed of a water-soluble resin having a hydrophilic functional group on a side chain is formed on the inner surface of the cell-receiving part; It is characterized in that it is bridged with the inner surface of the housing part, and is subjected to radiation sterilization with an absorption dose of radiation of 20 kGy or more and 45 kGy or less.
  • FIG. 1 is a schematic perspective view of a sterilized container for cell culture (multiwell plate) according to this embodiment.
  • FIG. FIG. 3 is a schematic enlarged cross-sectional view of a cell-holding portion of the sterilized container for cell culture (multiwell plate) according to the present embodiment.
  • Fig. 2 is a schematic enlarged cross-sectional view showing an enlarged vicinity of the inner surface of the cell storage portion of the sterilized container for cell culture according to the present embodiment.
  • Fig. 3 is a schematic enlarged cross-sectional view showing a state in which cell aggregates are formed in the cell storage portion of the sterilized container for cell culture (multiwell plate) according to the present embodiment.
  • FIG. 1 is a perspective view schematically showing the cell culture sterilization container 100 according to the present embodiment.
  • the cell culture sterilization container 100 is a cell culture sterilization container 100 having a low cell adsorption property, and is made of a resin material and is capable of containing cells and a liquid medium for cell culture.
  • a coating layer 21 made of a water-soluble resin having a hydrophilic functional group in a side chain is formed on the inner surface 11a of the cell-holding part 11, and between the water-soluble resins.
  • the water-soluble resin and the inner surface 11a of the cell-receiving portion 11 are crosslinked, and the radiation sterilization treatment is performed with an absorption dose of radiation of 20 kGy or more and 45 kGy or less.
  • low cell adsorption means that, under the same culture conditions, the ratio of cell adsorption is lower than that of a sterilized container for cell culture that is made of a resin material and is not surface-treated (including formation of a coating layer).
  • the “inner surface 11a of the cell containing portion 11” is the surface of the internal space capable of containing a liquid medium or the like in the cell containing portion 11 (for example, a well) of the sterilized container for cell culture 100 according to the present embodiment. .
  • the cell containing portion 11 should be made of a resin material.
  • "made of a resin material” means that the resin material is included as a main material (the resin material is 70% by mass or more, more preferably 80% by mass or more, and further preferably 90% by mass or more of the total mass.
  • materials other than the resin material, such as additives may be included within a range that does not affect the effects of the present invention.
  • the cell culture sterilization container 100 according to the present embodiment may be entirely made of a resin material (all members provided), or at least a part of the members other than the cell-holding portion 11 may be made of a resin material.
  • the sterilization container 100 for cell culture according to the present embodiment may be made of other materials (for example, glass), it is more preferable that the entire cell culture sterilization container 100 is made of a resin material (especially the same resin material). This is because the sterilized container 100 for cell culture according to the present embodiment can be easily manufactured (injection molding, etc.).
  • the resin material examples include polyolefin resins such as polypropylene resin, polyethylene resin, polymethylpentene resin, ethylene-propylene copolymer, cyclic polyolefin resins, polystyrene resins such as polystyrene, acrylonitrile-butadiene-styrene resin, Polyacrylic resins such as polyethylene terephthalate resin and polybutylene terephthalate resin; methacrylic resins such as polymethyl methacrylate resin; fluorine resins such as polytetrafluoroethylene; acrylic resins such as polyacrylonitrile; Resins such as polycarbonate resins, vinyl chloride resins, polyarylate resins, polysulfone resins, polyethersulfone resins, polyetheretherketone resins, and polyetherimide resins can be used.
  • polyolefin resins such as polypropylene resin, polyethylene resin, polymethylpentene resin, ethylene-propylene copoly
  • polystyrene-based resin from the viewpoint of moldability, transparency, radiation resistance (sterilization property), etc. required for containers for cell culture.
  • the weight average molecular weight of the resin material is not particularly limited, it is preferably 10,000 or more and 500,000 or less, more preferably 20,000 or more and 100,000 or less. This is because when the weight-average molecular weight of the resin material used is within this range, moldability is more excellent.
  • This weight average molecular weight is a value measured by a size exclusion chromatography method (Gel Permeation Chromatography system, Shodex KF-800 column, both manufactured by Showa Denko, elution solvent: tetrahydrofuran).
  • the cell containing portion 11 of the sterilized container for cell culture 100 according to the present embodiment can be formed by, for example, injection molding, blow molding, injection blow molding, or vacuum molding using such a resin material as a main material. can also form the entire sterile container for cell culture 100 according to this embodiment.
  • the form of the sterilized container for cell culture 100 is not particularly limited as long as it includes the cell containing portion 11 having an internal space capable of containing cells and a liquid medium for cell culture.
  • a multiwell plate as shown in FIG. 1 a petri dish (dish), a resin-made flask, and the like can be used.
  • other forms may be used as long as they are provided with the cell storage section 11 and can be installed and used in an environment in which cells can be cultured.
  • multi-well plates and petri dishes used in bioreactor generation, drug efficacy and toxic substance evaluation, artificial organ development research, etc. from the viewpoint of being able to improve the accuracy of evaluation and research using cell aggregates is preferred.
  • a multi-well plate is a sterile container 100 for cell culture that includes a plurality of wells that are cell storage units 11.
  • a plate that includes, for example, 6, 12, 24, 48, 96, or 384 wells preferred. This is because cell culture can be performed simultaneously in a plurality of wells under the same conditions.
  • the capacity of the cell-holding part 11 (capacity of the internal space capable of accommodating a liquid medium or the like) is not limited, but for example, the capacity of one cell-holding part 11 may be 0.05 mL or more, or 0.1 mL or more. can be Although the upper limit is not limited, it may be 20 mL or less, or 16 mL or less.
  • the cell culture sterilization container 100 may further include other members (for example, a lid member, etc.) in addition to the member including the cell-holding portion 11 .
  • the member including the cell-holding portion 11 may be provided with a gripping portion that can be gripped by hand.
  • the sterilized container for cell culture 100 is hermetically packaged in two or more layers, more preferably three or more layers, with gas-permeable film materials (all film materials in the multiple packaging are gas-permeable). ), preferably as a hermetically packaged sterile container for cell culture.
  • a sealed package with a configuration suitable for carrying in and using at a cell processing facility (CPF) or a cell processing center (CPC), etc., and a radiation odor that can be generated by the radiation sterilization treatment described later. This is because a product with little residue can be obtained.
  • a film material having gas permeability and heat-sealing properties is preferable because it is easier to seal and package.
  • a film material examples include, but are not limited to, a film material made of polyethylene (eg, HDPE, LDPE, LLDPE, etc.) or polypropylene.
  • this film material has a gas permeability of 0.1 L/m 2 ⁇ day ⁇ atm or more measured at a temperature of 25°C and a relative humidity (RH) of 0%. It is more preferably 0.5 L/m 2 ⁇ day ⁇ atm or more, even more preferably 1.0 L/m 2 ⁇ day ⁇ atm or more.
  • FIG. 2 is an enlarged cross-sectional view schematically showing the cell containing portion 11 of the sterile container for cell culture 100 according to the present embodiment.
  • FIG. 3 is a schematic enlarged cross-sectional view showing the vicinity of the inner surface 11a of the cell containing portion 11 of the cell culture sterilization container 100 according to the present embodiment in a more enlarged manner.
  • FIG. 4 is a schematic enlarged cross-sectional view showing a state in which cell aggregates 31 are formed in the cell containing portion 11 of the sterilized container for cell culture 100 according to this embodiment.
  • the sterilized container 100 for cell culture according to the present embodiment for example, like the embodiment shown in FIG. A layer 21 is formed. Then, as shown in FIG. 3, between the water-soluble resins, that is, between the molecules of the water-soluble resin in the coating layer 21, and between the water-soluble resin (water-soluble resin molecules in the coating layer 21) and the cells All are bridged with the inner surface 11a of the portion 11 .
  • the surface layer of the inner surface 11a of the cell-holding portion 11 contains a hydrophilic functional group, making it difficult for the cells housed in the cell-holding portion 11 to adhere to the container. As a result, the cells can easily gather near the bottom of the cell-holding part 11 during culture, and the container can easily form a cell aggregate 31 as shown in FIG. 4 .
  • the “water-soluble resin” in the present embodiment is a resin that can be hydrated by ionic bonding or hydrogen bonding with water molecules and dissolved in water, and is 1.0 g or more per 100 g of water at 25 ° C. It is soluble.
  • the “coating layer 21 composed of a water-soluble resin” means the coating layer 21 containing the water-soluble resin as a main component (for example, containing 80% by mass or more, further 90% by mass or more). It means that the water-soluble resin contained in the coating layer 21 is cross-linked and hardened so that the coating layer 21 is denatured to be water-insoluble. In other words, as long as the coating layer 21 is formed using a material containing a water-soluble resin as a main component, it may be crosslinked and cured to become water-insoluble.
  • water-soluble resins having hydrophilic functional groups in side chains include saponified polyvinyl acetate, polyvinylpyrrolidone, polyethylene glycol, polyacrylamide, polymethacrylamide, polyhydroxyethyl methacrylate, polypentaerythritol triacrylate, poly Examples include pentaerythritol tetraacrylate, polydiethylene glycol diacrylate, copolymers of monomers constituting them, and copolymers of 2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine and other monomers (eg, butyl methacrylate). Some of these water-soluble resins include those to which another hydrophilic functional group or the like is added as a side chain.
  • one or more selected from saponified polyvinyl acetate, polyvinylpyrrolidone, and polyethylene glycol are more preferable. This is because stimulation to the cells can be suppressed thereby.
  • the average degree of polymerization of the water-soluble resin is not particularly limited, but is preferably 100 to 10,000, and 200, because it facilitates formation of a uniform coating on the inner surface 11a of the cell-holding portion 11 and improves workability. ⁇ 5000 is more preferred.
  • saponified polyvinyl acetate examples include polyvinyl alcohol or copolymers of vinyl alcohol and other compounds, hydrophilic group-modified, hydrophobic group-modified, anion-modified, cation-modified, amide group-modified or acetoacetyl group-modified. and a saponified product of vinyl alcohol and modified vinyl acetate modified with a reactive group such as
  • the saponification degree of the saponified product of polyvinyl acetate is not particularly limited, but is preferably 20 to 100 mol%, more preferably 50 to 95 mol% of the entire polyvinyl acetate.
  • the water-soluble resin constituting the coating layer 21 has a hydrophilic functional group in its side chain, and may further have a functional group for cross-linking and curing.
  • the functional group for may be a hydrophilic functional group or part thereof.
  • These functional groups include, for example, hydroxyl groups, functional groups containing carbonyl groups (carboxy groups, aldehyde groups, ketone groups, ester groups, amide groups, etc.), radiation-reactive, photosensitive, and heat-reactive functional groups. is mentioned.
  • a functional group containing a diazo group, an azide group, a diazide group, etc. which is a photosensitive hydrophilic functional group, is more preferable.
  • a water-soluble resin having a functional group containing a carbonyl group more preferably a water-soluble resin having a functional group containing an aromatic azide group and / or a carbonyl group in the side chain, the following formula (Ia) or the following formula ( Water-soluble resins represented by Ib) are more preferred.
  • R1 is a hydrocarbon group having a carbonyl and an amine and may contain an amide bond
  • R2, R3, R4, and R5 are all hydrogen or alkyl groups
  • r1 is 1 to 1000
  • r2 is 40 to 4995
  • r3 is 0 to 4000
  • n is 1, 2 or 3.
  • R2, R3, R4, and R5 are hydrogen. Since it can impart properties, it can be expected to have the effect of further improving the adhesion of the water-soluble resin to the container.
  • R is a hydrocarbon group having carbonyl and amine
  • r1 is 1-1000
  • r2 is 40-4995
  • r3 is 0-4000.
  • the water-soluble resin represented by the above formula (Ia) is more preferably a water-soluble resin represented by the following formula (IIa).
  • R is an alkyl group having a carbonyl and an amine and may contain an amide bond
  • r1 is 1 to 1000
  • r2 is 40 to 4995
  • r3 is 0 to 4000
  • n is 1, Shows 2 or 3.
  • the coating layer 21 is formed by coating the inner surface 11a of the cell-holding part 11 with the water-soluble resin described above, and by light irradiation or the like, the molecules of the water-soluble resin contained in the coating layer 21 are crosslinked and cured. It is formed. That is, the structure is such that the water-soluble resins of the coating layer 21 are crosslinked (for example, the crosslinked structure 41 in FIG. 3). This cross-linking is preferably formed by the functional groups of the side chains of the water-soluble resin. Note that the coating layer 21 may contain some molecules of the water-soluble resin that are not cross-linked, as long as they are cross-linked and cured to such an extent that the structure of the coating layer 21 can be maintained. good.
  • the crosslinked structure 41 in FIG. 3 simply shows the crosslinked structure between the molecules of the water-soluble resin, and does not represent the actual size or number of the crosslinked structure.
  • the cross-linking structure 43 in FIG. 3 also shows the cross-linking structure between the water-soluble resin molecules and the inner surface 11a of the cell housing part 11 in an easy-to-understand manner. It does not represent
  • the inner surface 11a of the cell-holding part 11 on which the coating layer 21 is formed is subjected to surface treatment such as hydrophilization and formation of surface treatment functional groups before the coating layer 21 is formed.
  • surface treatment such as hydrophilization and formation of surface treatment functional groups before the coating layer 21 is formed.
  • surface treatment include treatment for forming oxygen-containing functional groups.
  • oxygen-containing functional groups include polar functional groups such as carbonyl groups (carboxy groups, aldehyde groups, ketone groups, ester groups, etc.), hydroxyl groups, ether groups, peroxide groups, and epoxy groups.
  • a treatment for forming a carbonyl group as an oxygen-containing functional group is performed.
  • the surface treatment for example, plasma treatment, corona discharge treatment, excimer laser treatment, flame treatment, etc. can be employed, and plasma treatment is particularly preferred.
  • the amount of oxygen-containing functional groups formed by the above treatment is not particularly limited, but is preferably 0.01 to 100 nmol/cm 2 , particularly preferably 0.05 to 10 nmol/cm 2 . If the amount of oxygen-containing functional groups is less than the lower limit, the desired effect may not be sufficiently exhibited, and if the amount exceeds the upper limit, the properties of the inner surface 11a itself of the cell-holding portion 11 will change, making it suitable for cell culture. There is a possibility that the required performance as a container cannot be met.
  • the water-soluble resin constituting the coating layer 21 has a side chain containing an aromatic azide group and a side chain containing a carbonyl group. and the carbonyl group of the water-soluble resin, and between the aromatic azide group of the water-soluble resin and the carbonyl group of the inner surface 11a of the cell housing portion 11. be. This is because these crosslinks are very easily formed, and the coating layer 21 is likely to be more stable against the radiation sterilization treatment to be described later.
  • the thickness of the coating layer 21 is not particularly limited, it is preferably 0.1 to 50 ⁇ m, more preferably 0.5 to 20 ⁇ m.
  • the thickness of the coating layer 21 is preferably uniform on the inner surface 11 a of the cell-holding portion 11 .
  • the “thickness of the coating layer 21” is the length of the shortest distance from the surface of the coating layer 21 (the surface on the inner space side of the cell-holding portion 11) to the surface in contact with the inner surface 11a of the cell-holding portion 11. It is.
  • the “uniform” thickness means that the thickness of the coating layer 21 formed on the inner surface 11a of the cell-holding portion 11 is measured at 10 arbitrary points, and the variation in the measured values (difference between maximum and minimum) is It means within 0.1 ⁇ m, more preferably within 0.05 ⁇ m.
  • the thickness of this coating layer 51 is measured by an ellipsometer.
  • the sterilized container for cell culture 100 according to the present embodiment in which the coating layer 21 as described above is formed on the inner surface 11a of the cell-holding portion 11, is sufficiently sterilized, but the coating layer 21 prevents the cell-holding portion from being sufficiently sterilized. Cells are difficult to adhere to the inner surface 11a of 11, and cell culture easily forms cell aggregates 31 as shown in FIG.
  • the sterilization process (radiation sterilization process) of the cell culture sterilization container 100 according to the present embodiment will be described in detail below.
  • the sterilized container for cell culture 100 is a container including the cell containing portion 11 having the coating layer 21 as described above. It is.
  • the radiation is preferably ⁇ -rays or electron beams, and ⁇ -ray sterilization is particularly preferred in the case of mass production or multi-packaging as described above, from the viewpoint of radiation transparency.
  • the absorption dose of radiation is more preferably 22.5 kGy or more and 40 kGy or less. With such a configuration, high sterility is provided, and since the predetermined coating layer 21 described above is maintained in a stable state, low cell adsorption is maintained, and cell aggregates are easily formed by cell culture. It has become.
  • the coating layer 21 is characterized in that it is difficult to decompose even when subjected to radiation sterilization as described above, and that little substances are eluted from the coating layer 21 into the liquid medium or the like.
  • the cell culture sterilization container 100 according to the present embodiment is sufficiently sterilized, but pure water is contained in the cell containing portion 11 so as to be 0.12 mL/cm 2 and heated at 37° C. for 72 hours. Then, the obtained test solution was placed in a cell with a layer length of 1 cm, and the absorbance measured when irradiated with UV light having a wavelength of 220 nm and the absorbance measured when irradiated with UV light having a wavelength of 241 nm were both 0.0.
  • the decomposition of the coating layer 21 can be reduced even if the strong radiation sterilization treatment as described above is performed.
  • the absorbance measured when irradiated with UV light having a wavelength of 220 nm may be more than 0.06, and may be 0.07 or more.
  • the absorbance measured when irradiated with UV light having a wavelength of 241 nm may be greater than 0.03 and may be 0.04 or more.
  • the amount of pure water described above is the amount relative to the surface area of the region in which the coating layer 21 is formed on the inner surface 11a of the cell-holding portion 11 that holds pure water.
  • the above-described absorbance measurement is performed with a UV spectrophotometer.
  • the cell culture sterilization container 100 has high sterility and facilitates formation of cell aggregates 31 as shown in FIG. 4 by cell culture.
  • human hepatoma-derived cells HepG2
  • 96 cell-holding portions 11 such as a multiwell plate
  • FBS fetal bovine serum
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • the container can have 88 or more, further 90 or more, further 92 or more, furthermore 95 or more cell storage portions 11 formed as described above.
  • the cell culture sterilization container 100 has high sterility and low cell adsorption, even if it is subjected to the above radiation sterilization treatment.
  • it may be one that has undergone sterilization other than radiation sterilization.
  • the cell containing portion 11 and the like may be made of a highly heat-resistant resin material and subjected to dry heat sterilization or steam sterilization. In order to maintain the stability of the coating layer 21 and maintain its low cell adsorptivity at a high level, and to facilitate the formation of cell aggregates by cell culture, the above conditions are satisfied.
  • it has a cell containing portion 11 which is made of a resin material and is capable of containing cells and a liquid medium for cell culture.
  • a coating layer 21 composed of a water-soluble resin is formed, and the water-soluble resins are cross-linked and the water-soluble resin and the inner surface 11a of the cell-holding part 11 are bridged.
  • FBS fetal bovine serum
  • each cell-holding portion 11 When the number of human hepatoma-derived cells (HepG2) in each cell-holding portion 11 was set to 1 ⁇ 10 3 cells and the cells were cultured at 37° C. for 3 days, the cells were housed together with Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM).
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • a sterilized container 100 for cell culture, wherein the number of cell-holding portions 11 in which one or more cell aggregates 31 having a diameter of 200 ⁇ m or more of human liver cancer-derived cells (HepG2) are formed is 88 or more, further 92 or more, further 95 or more. is preferable.
  • the lower limit of the absorbance described above may be the same as described above.
  • a container having a desired shape including the cell containing portion 11 is molded by injection molding or the like using a material made of a resin material as described above. do. Then, the coating layer 21 is formed on the inner surface 11a of the cell-holding portion 11 of the obtained container using the material containing the water-soluble resin as a main component as described above. It is preferable to form the coating layer 21 after subjecting the inner surface 11a of the cell-holding part 11 to surface treatment such as plasma treatment in an oxygen atmosphere.
  • the coating layer 21 made of a water-soluble resin on the inner surface 11a of the cell-holding portion 11 for example, dipping or dispensing a water-soluble resin solution into the cell-holding portion 11 and then tilting the container.
  • a method of discharging the solution or the like can be used.
  • the coating layer 21 can be formed by bringing the water-soluble resin solution into contact with the inner surface 11a of the cell-holding part 11 and then drying the remaining solvent or the like.
  • the water-soluble resin in this case is a solution prepared using a solvent so that the viscosity at 20° C. is preferably 1 mPa ⁇ s or more and 10 mPa ⁇ s or less, more preferably 2 mPa ⁇ s or more and 7 mPa ⁇ s or less. It is preferred to use
  • the solvent in that case is water, or a mixture of water and an organic solvent can be used to increase the solubility. When the viscosity of the water-soluble resin solution used is within the above range, the coating layer 21 having excellent low cell adsorption capacity can be easily obtained.
  • a step of cross-linking and curing between the water-soluble resins of the formed coating layer 21 and between the water-soluble resin and the inner surface 11a of the cell housing portion 11 to denature into a water-insoluble cured film is performed.
  • This step can be performed by light irradiation treatment, heat treatment, radiation irradiation treatment, etc. as described above, and the workability, the properties of the water-soluble resin constituting the coating layer 21, and the inner surface 11a of the cell-holding part 11 may be appropriately selected according to the type of functional group formed in the .
  • the light irradiation treatment (UV irradiation treatment, etc.) is a method that enables the cross-linking and curing treatment to be performed rapidly and can be performed with simple equipment.
  • the light source for cross-linking and curing the coating layer 21 by light irradiation is not particularly limited, but an ultra-high pressure mercury lamp with an illuminance of about 5.0 mW/cm 2 or a UV lamp with an illuminance of about 0.1 mW/cm 2 can be used. can.
  • Cross-linking and curing by light irradiation can be controlled by illuminance and irradiation time, so if a light source with low illuminance is used, the irradiation time can be lengthened. Crosslinking and curing are also possible.
  • a stable coating layer 21 having hydrophilic functional groups on the surface layer can be constructed. At least part of the unreacted water-soluble resin may be removed by washing the surface of the coating layer 21 with water or an aqueous solvent after curing by crosslinking. By inserting such a cleaning step for the coating layer 21 after curing, the amount of eluted matter can be further reduced.
  • the sterilized container for cell culture 100 according to the present embodiment in which the coating layer 21 as described above is formed, is sealed and packaged in two or more layers with a gas-permeable film material, if necessary.
  • a gas-permeable film material for example, after boxing, etc., radiation sterilization as described above is performed.
  • sterilization other than radiation sterilization may be performed.
  • a sterilized container for cell culture with low cell adsorption comprising a cell containing portion made of a resin material capable of containing cells and a liquid medium for cell culture, wherein the cell containing portion A coating layer composed of a water-soluble resin having a hydrophilic functional group in a side chain is formed on the inner surface of the cell-holding part, and between the water-soluble resins and between the water-soluble resin and the inner surface of the cell-holding part
  • a sterilized container for cell culture which is cross-linked between the cells, and is subjected to radiation sterilization treatment with an absorption dose of radiation of 20 kGy or more and 45 kGy or less.
  • one or more cell aggregates with a diameter of 200 ⁇ m or more of the human liver cancer-derived cells are formed.
  • the water-soluble resin constituting the coating layer has a side chain containing an aromatic azide group and a side chain containing a carbonyl group, and the carbonyl group is formed on the inner surface of the cell housing portion; Crosslinking between the aromatic azide group of the water-soluble resin and the carbonyl group of the water-soluble resin, and between the aromatic azide group of the water-soluble resin and the carbonyl group of the inner surface of the cell-housing part.
  • the sterilized container for cell culture according to any one of (1) to (3).
  • Any one of (1) to (4), wherein the water-soluble resin constituting the coating layer is a water-soluble resin represented by the above formula (Ia) or the above formula (Ib). sterilized container for cell culture.
  • a sterilized container for cell culture with low cell adsorption comprising a cell containing part made of a resin material, capable of containing cells and a liquid medium for cell culture, wherein the cell containing part A coating layer composed of a water-soluble resin having a hydrophilic functional group in a side chain is formed on the inner surface of the cell-holding part, and between the water-soluble resins and between the water-soluble resin and the inner surface of the cell-holding part Pure water is stored in the cell storage part so as to have a volume of 0.12 mL/cm 2 and heated at 37° C. for 72 hours.
  • the absorbance measured when UV light with a wavelength of 220 nm is irradiated and the absorbance measured when UV light with a wavelength of 241 nm is irradiated are both 0.10 or less, and human cells are placed in each of the 96 cell storage units.
  • Liver cancer-derived cells (HepG2) were housed together with fetal bovine serum (FBS)-containing Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), and the number of said human liver cancer-derived cells (HepG2) in each said cell-holding portion was 1 ⁇ 10 3 .
  • the number of the cell-receiving portions where one or more cell aggregates having a diameter of 200 ⁇ m or more of the human hepatoma-derived cells (HepG2) are formed when the cells are cultured at 37° C. for 3 days is 88 or more.
  • Example 1 A 96-well multiwell plate (width: 127.6 mm, length: 85.8 mm, height: 14 mm) as shown in FIG. 0 mm) was molded. The shape of the wells, which are the cell-retaining portions, was as shown in FIG. 8 mm and the volume per well was about 0.25 mL.
  • the obtained multi-well plate was subjected to plasma treatment (oxygen plasma for 10 minutes) in an oxygen atmosphere using a plasma treatment apparatus (BRANSON/IPC SERIES7000). This imparted wettability to the plate surface.
  • R is a group represented by the following formula (III)): a compound represented by the following formula (IIa) (water-soluble Resin with an average degree of polymerization of 1600 and a photosensitive group introduction rate of 0.65 mol%)) is dissolved in a 25% by volume ethanol aqueous solution in a light-shielding polypropylene container colored with a brown pigment, and a 0.5% by weight water-soluble resin solution is added.
  • IIa water-soluble Resin with an average degree of polymerization of 1600 and a photosensitive group introduction rate of 0.65 mol%
  • a cell suspension was prepared by dispersing HepG2 in a liquid medium (Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) containing fetal bovine serum (FBS)), and the number of cells was added to the wells of the two types of sterile containers for cell culture obtained above. was 1 ⁇ 10 3 cells/well, and the cells were cultured at 37° C. for 3 days. As a result, it was confirmed under a microscope that one cell aggregate (spheroid) with a diameter of about 700 ⁇ m was formed in all the wells of all sterilized cell culture vessels.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • FBS fetal bovine serum
  • Example 2 A petri dish-shaped container (capacity: 6.6 mL) with a diameter of 90 mm and a height of 1.16 mm was subjected to plasma treatment and water-soluble resin treatment in the same manner as in Example 1, and further UV irradiation and radiation sterilization ( ⁇ -ray irradiation) was performed.
  • Three kinds of sterilized containers for cell culture were obtained by adjusting the absorption dose of ⁇ rays to 15.0 kGy, 25.0 kGy, or 40.0 kGy.
  • the absorbance was 0.10 or less in all cases, indicating that there was little elution into the test solution. That is, the sterilized cell culture containers with absorbed doses of ⁇ -rays of 25.0 kGy and 40.0 kGy had almost the same amount of effluent as the sterilized containers for cell culture with absorbed doses of ⁇ -rays of 15.0 kGy. Therefore, even if strong radiation sterilization was applied, the coating layer was less decomposed, and the coating layer was stably maintained.

Abstract

本願発明は、十分な滅菌がされていながらその低細胞吸着性が十分保たれ、細胞培養により細胞凝集塊を形成し易い細胞培養用滅菌容器を提供する。 本願発明の低細胞吸着性の細胞培養用滅菌容器は、樹脂素材により構成された、細胞および液体培地を収容して細胞培養を行うことが可能な細胞収容部を備え、この細胞収容部の内面には側鎖に親水性官能基を有する水溶性樹脂により構成された被覆層が形成され、且つ、この水溶性樹脂どうしの間ならびにこの水溶性樹脂と細胞収容部の内面との間が架橋されており、さらに、放射線の吸収線量として２０ｋＧｙ以上４５ｋＧｙ以下の放射線滅菌処理が施されている。

Description

細胞培養用滅菌容器
　本発明は、細胞培養用滅菌容器に関する。
　細胞培養に用いられる容器である細胞培養用滅菌容器は、樹脂素材により構成されたものが多く用いられている。しかし、この樹脂素材により構成された容器は、その内面に細胞が吸着し易い場合がある。そして、細胞培養時において容器の内面に細胞が吸着してしまうと、細胞を容器内から回収し難くなり、その回収率が低下してしまう可能性がある。また、再生医療分野などにおいて必要とされる細胞凝集塊（細胞同士が３次元的に凝集して塊状になったもの）の形成もし難くなる傾向にある。
　このような課題を解決するために、生化学用の容器の内面に細胞などを吸着し難くする処理（低吸着処理）を行う方法が知られている。例えば、特許文献１には、ポリスチレン製部材を反応容器に入れてオゾンガスを流通させ、表面に酸素を導入して親水性とし、このポリスチレン製部材の表面へのタンパク質などの吸着を低減させる方法が開示されている。これ以外にも、容器の内表面に親水性のポリマーをコートする方法なども知られている。
特開平１０－１０１８２０号公報
　ところで、近年、再生医療分野（例えばＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ：ＭＳＣ）等の培養）などにおいて、細胞培養用滅菌容器に高い無菌性が求められることが増加してきている。その場合、より強い滅菌処理が施された容器が必要となるが、樹脂素材により構成された細胞培養用の容器は、乾熱滅菌や湿熱滅菌では樹脂素材の耐熱性が問題となり、ＥＯＧ（エチレンオキサイドガス）等の化学物質による滅菌では残留物の細胞毒性が問題となるため、放射線滅菌によりこの強い滅菌処理を行う必要があった。しかしながら、上記した低吸着処理を行った細胞培養用の容器は、親水基やポリマーが破壊されて低細胞吸着性が低下してしまう恐れがあることなどから、強い放射線滅菌（高線量での放射線滅菌）がし難いという課題があった。
　本発明は上記課題に鑑みてなされたものであり、十分な滅菌がされていながらその低細胞吸着性が保たれ、細胞培養により細胞凝集塊を形成し易い細胞培養用滅菌容器を提供することを目的とする。
　本発明に係る細胞培養用滅菌容器は、低細胞吸着性の細胞培養用滅菌容器であって、樹脂素材により構成された、細胞および液体培地を収容して細胞培養を行うことが可能な細胞収容部を備え、この細胞収容部の内面には側鎖に親水性官能基を有する水溶性樹脂により構成された被覆層が形成され、且つ、この水溶性樹脂どうしの間ならびにこの水溶性樹脂と細胞収容部の内面との間が架橋されており、さらに、放射線の吸収線量として２０ｋＧｙ以上４５ｋＧｙ以下の放射線滅菌処理が施されたものであることを特徴とする。
　本発明によれば、十分な滅菌がされていながらその低細胞吸着性が十分保たれ、細胞培養により細胞凝集塊を形成し易い細胞培養用滅菌容器を得ることができる。
本実施形態に係る細胞培養用滅菌容器（マルチウェルプレート）の模式的な斜視図である。 本実施形態に係る細胞培養用滅菌容器（マルチウェルプレート）の細胞収容部の模式的な拡大断面図である。 本実施形態に係る細胞培養用滅菌容器の細胞収容部の内面付近を拡大して示した模式的な拡大断面図である。 本実施形態に係る細胞培養用滅菌容器（マルチウェルプレート）の細胞収容部において細胞凝集塊を形成させた状態の模式的な拡大断面図である。
　以下、本発明に係る細胞培養用滅菌容器の実施形態を図面に基づいて説明する。
　なお、以下に説明する実施形態は、本発明の理解を容易にするための一例に過ぎず、本発明を限定するものではない。すなわち、以下に説明する部材の形状、寸法、配置等については、本発明の趣旨を逸脱することなく、変更、改良され得るとともに、本発明にはその等価物が含まれることは勿論である。
　また、すべての図面において、同様な構成要素には同様の符号を付し、重複する説明は適宜省略する。なお、いずれの図面についても、便宜上、符号を付していない（省略している）箇所がある。さらに、図面に示された各部材の寸法比率は、発明の理解を容易にするために、実際の寸法比率とは異なる場合がある。
＜概要＞
　まず、本実施形態に係る細胞培養用滅菌容器の概要について、図１を参照して詳細に説明する。なお、図１は、本実施形態に係る細胞培養用滅菌容器１００を模式的に示した斜視図である。
　本実施形態に係る細胞培養用滅菌容器１００は、低細胞吸着性の細胞培養用滅菌容器１００であって、樹脂素材により構成された、細胞および液体培地を収容して細胞培養を行うことが可能な細胞収容部１１を備え、この細胞収容部１１の内面１１ａには側鎖に親水性官能基を有する水溶性樹脂により構成された被覆層２１が形成され、且つ、この水溶性樹脂どうしの間ならびにこの水溶性樹脂と細胞収容部１１の内面１１ａとの間が架橋されており、さらに、放射線の吸収線量として２０ｋＧｙ以上４５ｋＧｙ以下の放射線滅菌処理が施されたものである。なお、「低細胞吸着性」とは、同じ培養条件において、樹脂素材により構成され且つ表面処理（被覆層形成も含む）がされていない細胞培養用滅菌容器よりも細胞が吸着する割合が低いことを意味する。また、「細胞収容部１１の内面１１ａ」とは、本実施形態に係る細胞培養用滅菌容器１００の細胞収容部１１（例えばウェルなど）における液体培地等を収容可能な内部空間側の表面である。
　まず、本実施形態に係る細胞培養用滅菌容器１００は、少なくとも細胞収容部１１が樹脂素材により構成されていれば良い。ここで、「樹脂素材により構成された」とは、樹脂素材が主材として含まれること（樹脂素材が総質量の７０質量％以上、より好ましくは８０質量％以上、さらに好ましくは９０質量％以上含まれること）を意味し、本発明の効果に影響を与えない範囲内において添加剤などの樹脂素材以外の材料が含まれていても良い。なお、本実施形態に係る細胞培養用滅菌容器１００は、その全体（備わる全ての部材）が樹脂素材により構成されていても良く、あるいは、細胞収容部１１以外の部材の少なくとも一部が樹脂素材以外の材料（例えばガラスなど）により構成されても良いが、本実施形態に係る細胞培養用滅菌容器１００の全体が樹脂素材（特に同じ樹脂素材）により構成されているのがより好ましい。本実施形態に係る細胞培養用滅菌容器１００の製造（射出成形など）がし易いからである。
　この樹脂素材としては、例えば、ポリプロピレン樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリメチルペンテン樹脂、エチレン－プロピレン共重合体等のポリオレフィン系樹脂または環状ポリオレフィン系樹脂、ポリスチレン、アクリロニトリル－ブタジエン－スチレン樹脂等のポリスチレン系樹脂、ポリエチレンテレフタレート樹脂、ポリブチレンテレフタレート樹脂等のポリアクリル系樹脂、ポリメチルメタクリレート樹脂等のメタクリル系樹脂、ポリテトラフルオロエチレン等のフッ素系樹脂、ポリアクリロニトリル等のアクリル系樹脂、プロピオネート樹脂等の繊維素系樹脂、ポリカーボネート樹脂、塩化ビニル樹脂、ポリアリレート樹脂、ポリサルホン樹脂、ポリエーテルサルホン樹脂、ポリエーテルエーテルケトン樹脂、ポリエーテルイミド樹脂などを用いることができる。これらは、１種単独で用いられていても良く、２種以上が併用されていても良い。これらの中でも、細胞培養用の容器に求められる成形性、透明性、放射線耐性（滅菌性）などの観点から、ポリスチレン系樹脂を用いるのが特に好ましい。
　また、この樹脂素材の重量平均分子量は、特に限定されるものではないが、１００００以上５０００００以下が好ましく、２００００以上１０００００以下がより好ましい。用いる樹脂素材の重量平均分子量がこの範囲内であると、成形性がより優れるからである。
　なお、この重量平均分子量は、サイズ排除クロマトグラフィー法（Ｇｅｌ　Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙシステム、Ｓｈｏｄｅｘ　ＫＦ－８００カラム、いずれも昭和電工社製、溶出溶媒：テトラヒドロフラン）により測定される値である。
　このような樹脂素材を主材として、例えば射出成形、ブロー成形、インジェクションブロー成形、真空成形などにより、本実施形態に係る細胞培養用滅菌容器１００の細胞収容部１１を形成することができ、さらには、本実施形態に係る細胞培養用滅菌容器１００の全体を形成することもできる。
　本実施形態に係る細胞培養用滅菌容器１００の形態は、細胞および液体培地を収容して細胞培養を行うことが可能な内部空間を有する細胞収容部１１を備えるものであれば良く、特段限定されないが、例えば、図１に示すようなマルチウェルプレートや、シャーレ（ディッシュ）、樹脂製のフラスコ等が挙げられる。しかしながら、細胞収容部１１を備え、細胞が培養できる環境下に設置して使用できるものであれば、他の形態であっても良い。これらの中でも、細胞凝集塊を用いた評価、研究の精度を向上させることができるという観点から、バイオリアクターの生成、薬効や毒物の評価、人工臓器の開発研究等で用いられるマルチウェルプレートやシャーレが好ましい。マルチウェルプレートは、細胞収容部１１であるウェルを複数備える細胞培養用滅菌容器１００であるが、このウェルを、例えば、６、１２、２４、４８、９６、または３８４個備えるものであるのが好適である。複数のウェルにおいて同条件で同時に細胞培養を行うことができるからである。
　また、細胞収容部１１の容量（液体培地等を収容可能な内部空間の容量）も限定されないが、例えば、１つの細胞収容部１１の容量が０．０５ｍＬ以上であって良く、０．１ｍＬ以上であって良い。上限も限定されないが、２０ｍＬ以下であって良く、１６ｍＬ以下であって良い。
　なお、本実施形態に係る細胞培養用滅菌容器１００は、細胞収容部１１を含む部材に加えて、さらに他の部材（例えば蓋材など）を含んでいても良い。また、細胞収容部１１を含む部材などに、手で把持することができるような把持部が備わっていても良い。
　そして、本実施形態に係る細胞培養用滅菌容器１００は、ガス透過性を有するフィルム材により２重以上、より好ましくは３重以上に密封包装された（多重包装の全てのフィルム材がガス透過性を有する）、密封包装済み細胞培養用滅菌容器とすると好適である。細胞加工施設（ｃｅｌｌ　ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　ｆａｃｉｌｉｔｙ；ＣＰＦ）や細胞加工センター（ｃｅｌｌ　ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　ｃｅｎｔｅｒ；ＣＰＣ）などでの搬入、使用により適した構成となり、且つ後述する放射線滅菌処理により発生し得る放射線照射臭の密封包装内残留が少ないものが得られるからである。特に、ガス透過性およびヒートシール性を有するフィルム材であると、密封包装がよりし易いため好適である。このようなフィルム材としては、限定されるものではないが、ポリエチレン（例えばＨＤＰＥ、ＬＤＰＥ、ＬＬＤＰＥ等）またはポリプロピレンにより構成されたフィルム材などが例示される。そして、このフィルム材は、ＪＩＳ　Ｋ７１２６－１に準じて、温度が２５℃および相対湿度（ＲＨ）が０％の条件で測定されるガス透過度が０．１Ｌ／ｍ2・ｄａｙ・ａｔｍ以上であるとより好ましく、０．５Ｌ／ｍ2・ｄａｙ・ａｔｍ以上であるとさらに好ましく、１．０Ｌ／ｍ2・ｄａｙ・ａｔｍ以上であるとさらに好ましい。
＜細胞収容部の構成＞
　次に、本実施形態に係る細胞培養用滅菌容器１００の細胞収容部１１の構成について図２から図４を参照して詳細に説明する。なお、図２は、本実施形態に係る細胞培養用滅菌容器１００の細胞収容部１１を模式的に示した拡大断面図である。また、図３は、本実施形態に係る細胞培養用滅菌容器１００の細胞収容部１１の内面１１ａ付近をより拡大して示した模式的な拡大断面図である。さらに、図４は、本実施形態に係る細胞培養用滅菌容器１００の細胞収容部１１において細胞凝集塊３１を形成させた状態を示した模式的な拡大断面図である。
　本実施形態に係る細胞培養用滅菌容器１００は、例えば図２に示す実施形態のように、細胞収容部１１の内面１１ａに、側鎖に親水性官能基を有する水溶性樹脂により構成された被覆層２１が形成されている。そして、図３に示すように、この水溶性樹脂どうしの間、つまり被覆層２１中の水溶性樹脂の分子間、ならびに、この水溶性樹脂（被覆層２１中の水溶性樹脂分子）と細胞収容部１１の内面１１ａとの間がいずれも架橋されている。このような被覆層２１の形成により、細胞収容部１１の内面１１ａの表層に親水性官能基が含まれることとなり、細胞収容部１１に収容された細胞が容器に吸着し難くなる。これにより、培養時に細胞が細胞収容部１１の底部付近に集まり易く、図４に示すような細胞凝集塊３１を形成し易い容器となっている。
　なお、本実施形態における「水溶性樹脂」とは、水分子とのイオン結合または水素結合により水和して水に溶解可能な樹脂であって、２５℃の水１００ｇに対して１．０ｇ以上溶解可能なものである。また、「水溶性樹脂により構成された被覆層２１」とは、上記のような水溶性樹脂を主成分（例えば８０質量％以上、さらには９０質量％以上含まれるもの）として含む被覆層２１を意味し、この被覆層２１に含まれる水溶性樹脂が架橋、硬化することにより被覆層２１が非水溶性に変性しているものも包含される。つまり、水溶性樹脂を主成分とする材料を用いて形成された被覆層２１でれば、架橋、硬化されて非水溶性となっているものであっても良い。
　側鎖に親水性官能基を有する水溶性樹脂としては、例えば、ポリ酢酸ビニルのケン化物、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド、ポリメタアクリルアミド、ポリヒドロキシエチルメタアクリレート、ポリペンタエリスリトールトリアクリレート、ポリペンタエリスリトールテトラアクリレート、ポリジエチレングリコールジアクリレート、およびそれらを構成するモノマー同士の共重合体、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンと他のモノマー（例えばブチルメタクリレート等）との共重合体等が挙げられる。これらの水溶性樹脂には、その一部に、さらに別の親水性官能基などが側鎖として付加されたものも包含される。そして、これらの中でも、ポリ酢酸ビニルのケン化物、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコールから選ばれる１種以上がより好ましい。これにより、細胞に対する刺激を抑制することができるからである。そして、この水溶性樹脂の平均重合度は、特に限定されないが、細胞収容部１１の内面１１ａに均一な被膜が形成しやすく、かつ作業性が良好となることから、１００～１００００が好ましく、２００～５０００がより好ましい。
　なお、ポリ酢酸ビニルのケン化物としては、例えば、ポリビニルアルコールまたはビニルアルコールと他の化合物との共重合体や、親水基変性、疎水基変性、アニオン変性、カチオン変性、アミド基変性またはアセトアセチル基のような反応基変性をさせた変性酢酸ビニルとビニルアルコールとのケン化物等が挙げられる。ポリ酢酸ビニルのケン化物のケン化度は、特に限定されないが、ポリ酢酸ビニル全体の２０～１００ｍｏｌ％が好ましく、５０～９５ｍｏｌ％がより好ましい。
　そして、この被覆層２１を構成する水溶性樹脂は、側鎖に親水性官能基を有するものであるが、さらに架橋、硬化のための官能基を有していても良く、あるいは、架橋、硬化のための官能基が親水性官能基またはその一部であっても良い。これらの官能基としては、例えば、水酸基、カルボニル基（カルボキシ基、アルデヒド基、ケトン基、エステル基、アミド基など）を含む官能基や、放射線反応性、感光性、熱反応性の官能基などが挙げられる。さらに、感光性の親水性官能基である、ジアゾ基、アジド基、ジアジド基等を含む官能基がより好ましいものとして挙げられる。
　特に、３００～５００ｎｍの波長の光照射により容易に架橋および硬化させることができ、後述する放射線滅菌処理に対する安定性も高く、さらに細胞の吸着量をより低減できることから、側鎖にアジド基および／またはカルボニル基を含む官能基を有する水溶性樹脂がより好ましく、側鎖に芳香族アジド基および／またはカルボニル基を含む官能基を有する水溶性樹脂がさらに好ましく、下記式（Ｉａ）または下記式（Ｉｂ）で表される水溶性樹脂がさらに好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　なお、上記式（Ｉａ）中において、Ｒ１はカルボニルとアミンとを有する炭化水素基でアミド結合を含んでも良く、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５はいずれも水素またはアルキル基、ｒ１は１～１０００、ｒ２は４０～４９９５、ｒ３は０～４０００、ｎは１、２または３を示す。特に、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５はいずれも水素であるのがより好ましいが、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５のうち少なくとも１つをアルキル基とする事で水溶性樹脂の一部に疎水性を付与できることから水溶性樹脂の容器への密着性をより向上させる効果が期待できる。
　また、上記式（Ｉｂ）中において、Ｒはカルボニルとアミンとを有する炭化水素基、ｒ１は１～１０００、ｒ２は４０～４９９５、ｒ３は０～４０００を示す。
　さらに、上記式（Ｉａ）で表される水溶性樹脂は、下記式（ＩＩａ）で表される水溶性樹脂であるのがさらに好ましい。
　なお、下記式（ＩＩａ）中において、Ｒはカルボニルとアミンとを有するアルキル基でアミド結合を含んでも良く、ｒ１は１～１０００、ｒ２は４０～４９９５、ｒ３は０～４０００、ｎは１、２または３を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　そして、この被覆層２１は、上記した水溶性樹脂が細胞収容部１１の内面１１ａに被覆され、光照射などによって被覆層２１に含まれる水溶性樹脂の分子間どうしが架橋されて硬化することにより形成される。つまり、被覆層２１の水溶性樹脂どうしの間が架橋されている構成である（例えば図３の架橋構造４１）。この架橋は、水溶性樹脂の側鎖の官能基どうしにより形成されたものであるのが好ましい。なお、被覆層２１中には、架橋されていない水溶性樹脂の分子が一部含まれていても良く、被覆層２１としての構造を保つことができる程度に架橋、硬化された状態であれば良い。これにより、強い放射線滅菌がされても、細胞収容部１１に細胞および液体培地等を収容した際の被覆層２１からの溶出物の量が少ないものを得ることができ、被覆層２１の低細胞吸着性が長期にわたって維持される。ここで、図３の架橋構造４１は、水溶性樹脂の分子どうしの間の架橋構造をわかり易く示したものであって、実際の架橋構造の大きさや数を表すものではない。
　さらに、本実施形態に係る細胞培養用滅菌容器１００では、被覆層２１を構成する水溶性樹脂どうしの間だけでなく、被覆層２１を構成する水溶性樹脂と細胞収容部１１の内面１１ａとの間も架橋されている（例えば図３の架橋構造４３）。この架橋は、水溶性樹脂の側鎖の官能基と、細胞収容部１１の内面１１ａの官能基（後述する表面処理により形成された官能基など）により形成されたものであるのが好ましい。これにより、細胞収容部１１の内面１１ａとの接着性が高い被覆層２１となる。つまり、被覆層２１の安定性がより高まっている。ここで、図３の架橋構造４３も、水溶性樹脂の分子と細胞収容部１１の内面１１ａとの間の架橋構造をわかり易く示したものであって、これも実際の架橋構造の大きさや数を表すものではない。
　そして、この被覆層２１が形成される細胞収容部１１の内面１１ａは、その表面が、被覆層２１の形成前において、親水化処理や表面処置官能基の形成処理などの表面処理が施されていても良い。このような表面処理としては、例えば含酸素官能基を形成する処理などが示される。この含酸素官能基を表面に形成することにより、上記した架橋（被覆層２１の水溶性樹脂との間の架橋、図３の架橋構造４３）がより形成し易くなる。含酸素官能基としては、カルボニル基（カルボキシ基、アルデヒド基、ケトン基、エステル基など）、水酸基、エーテル基、パーオキサイト基、エポキシ基などの極性を有した官能基が例示される。特に、含酸素官能基としてカルボニル基が形成される処理が施されているのがより好ましい。また、この表面処理としては、例えば、プラズマ処理、コロナ放電処理、エキシマレーザー処理、フレーム処理などを採用することができ、特にプラズマ処理を行うのがより好適である。
　上記処理により形成される含酸素官能基の量としては、特に限定されないが、０．０１～１００ｎｍｏｌ／ｃｍ2が好ましく、特に０．０５～１０ｎｍｏｌ／ｃｍ2が好ましい。含酸素官能基の量がこの下限値未満であると所望の効果が十分に発揮されない可能性があり、上限値を超えると細胞収容部１１の内面１１ａ自体の特性が変化して細胞培養用の容器としての要求性能を満たせなくなる可能性がある。
　なお、被覆層２１を構成する水溶性樹脂が芳香族アジド基を含む側鎖およびカルボニル基を含む側鎖を有し、細胞収容部１１の内面１１ａにカルボニル基が形成されており、水溶性樹脂の芳香族アジド基と水溶性樹脂のカルボニル基との間、ならびに水溶性樹脂の芳香族アジド基と細胞収容部１１の内面１１ａのカルボニル基との間が架橋されている構成であると好適である。これらの架橋は非常に形成し易く、後述する放射線滅菌処理に対してより安定な被覆層２１となり易いからである。
　また、この被覆層２１の厚さとしては、特に限定されるものではないが、例えば、０．１～５０μｍであるのが好ましく、０．５～２０μｍであるのがより好ましい。そして、この被覆層２１の厚さは、細胞収容部１１の内面１１ａにおいて均一であるのが好ましい。ここで、「被覆層２１の厚さ」とは、被覆層２１の表面（細胞収容部１１の内部空間側の表面）から細胞収容部１１の内面１１ａと接している面までの最短距離の長さである。また、厚さが「均一」とは、細胞収容部１１の内面１１ａに形成された被覆層２１の厚さを任意に１０か所測定したときの測定値のバラツキ（最大と最小の差）が０．１μｍ以内、より好ましくは０．０５μｍ以内であることを意味する。
　なお、この被覆層５１の厚さは、エリプソメーターにより測定される。
　そして、細胞収容部１１の内面１１ａに上記のような被覆層２１が形成されている本実施形態に係る細胞培養用滅菌容器１００は、十分な滅菌がされていながら上記被覆層２１により細胞収容部１１の内面１１ａに細胞が吸着し難く、細胞培養により図４に示すような細胞凝集塊３１を形成し易いものとなっているため、再生医療分野などに使用するものとして非常に適している。以下に、本実施形態に係る細胞培養用滅菌容器１００の滅菌処理（放射線滅菌処理）について詳細に説明する。
＜放射線滅菌処理＞
　本実施形態に係る細胞培養用滅菌容器１００は、前述したような被覆層２１が形成された細胞収容部１１を備える容器が、放射線の吸収線量として２０ｋＧｙ以上４５ｋＧｙ以下の放射線滅菌処理が施されたものである。なお、この放射線は、γ線あるいは電子線であるのが好ましく、大量生産を行う場合や前述した多重包装などを行う場合は放射線透過性の点からγ線滅菌であるのが特に好ましい。また、放射線の吸収線量は、２２．５ｋＧｙ以上４０ｋＧｙ以下であるのがより好ましい。このような構成により、高い無菌性を備えるとともに、前述した所定の被覆層２１が安定した状態で維持されているため、低細胞吸着性が保たれ、細胞培養により細胞凝集塊を形成し易いものとなっている。
　つまり、この被覆層２１は、上記のような放射線滅菌処理が施されても分解が起こり難く、液体培地などへの被覆層２１からの溶出物が少ないことが特徴である。例えば、本実施形態に係る細胞培養用滅菌容器１００は、十分な滅菌がされていながら、細胞収容部１１に０．１２ｍＬ／ｃｍ2となるように純水を収容して３７℃で７２時間加熱し、得られた試験液を層長１ｃｍのセルに入れ、波長２２０ｎｍのＵＶ光を照射したときに測定される吸光度および波長２４１ｎｍのＵＶ光を照射したときに測定される吸光度がいずれも０．１０以下のものとすることができる。言い換えれば、上記のような強い放射線滅菌処理が施されていても被覆層２１の分解が少ないものとすることができる。なお、本実施形態に係る細胞培養用滅菌容器１００においては、上記した波長２２０ｎｍのＵＶ光を照射したときに測定される吸光度が０．０６超であって良く、０．０７以上であって良い。また、上記した波長２４１ｎｍのＵＶ光を照射したときに測定される吸光度が０．０３超であって良く、０．０４以上であって良い。
　ここで、上記した純水の量は、純水を収容する細胞収容部１１の内面１１ａにおける被覆層２１が形成された領域の表面積に対する量である。また、上記した吸光度の測定は、ＵＶ分光光度計により行う。
　そして、このような本実施形態に係る細胞培養用滅菌容器１００は、高い無菌性を備え、さらに細胞培養により図４に示すような細胞凝集塊３１の形成が非常にし易い。例えば、９６の細胞収容部１１（マルチウェルプレートなど）にそれぞれヒト肝癌由来細胞（ＨｅｐＧ２）をウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）とともに収容して細胞収容部１１の１つ当たりにおけるヒト肝癌由来細胞（ＨｅｐＧ２）の細胞数を１×１０3ｃｅｌｌとし、３７℃で３日間細胞培養を行った場合に、ヒト肝癌由来細胞（ＨｅｐＧ２）の直径２００μｍ以上の細胞凝集塊３１が１以上形成される細胞収容部１１の数が８８以上、さらには９０以上、さらには９２以上、さらには９５以上である容器とすることができる。
　なお、本実施形態に係る細胞培養用滅菌容器１００は、高い無菌性を備え且つ低細胞吸着性を有するものとなっていれば、上記のような放射線滅菌処理が施されたものであっても良く、あるいは、放射線滅菌処理以外の滅菌処理が施されたものであっても良い。例えば、細胞収容部１１などが耐熱性の高い樹脂素材により構成されて、乾熱滅菌や蒸気滅菌が施されたものであっても良い。そして、被覆層２１の安定性およびその低細胞吸着性が高く維持され、細胞培養により細胞凝集塊を形成し易いものであるものとするために、上記のような条件を満たす構成であるのが好ましい。つまり、樹脂素材により構成された、細胞および液体培地を収容して細胞培養を行うことが可能な細胞収容部１１を備え、この細胞収容部１１の内面には側鎖に親水性官能基を有する水溶性樹脂により構成された被覆層２１が形成され、且つ、水溶性樹脂どうしの間ならびに水溶性樹脂と細胞収容部１１の内面１１ａとの間が架橋されており、細胞収容部１１に０．１２ｍＬ／ｃｍ2となるように純水を収容して３７℃で７２時間加熱し、得られた試験液を層長１ｃｍのセルに入れ、波長２２０ｎｍのＵＶ光を照射したときに測定される吸光度および波長２４１ｎｍのＵＶ光を照射したときに測定される吸光度がいずれも０．１０以下であり、さらに、９６の細胞収容部１１にそれぞれヒト肝癌由来細胞（ＨｅｐＧ２）をウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）とともに収容して細胞収容部１１の１つ当たりにおけるヒト肝癌由来細胞（ＨｅｐＧ２）の細胞数を１×１０3ｃｅｌｌとし、３７℃で３日間細胞培養を行った場合に、ヒト肝癌由来細胞（ＨｅｐＧ２）の直径２００μｍ以上の細胞凝集塊３１が１以上形成される細胞収容部１１の数が８８以上、さらには９２以上、さらには９５以上である細胞培養用滅菌容器１００とするのが好ましい。なお、上記した吸光度の下限は、前述と同様であって良い。
＜細胞培養用滅菌容器の製造方法＞
　次に、本実施形態に係る細胞培養用滅菌容器１００の製造方法について説明する。
　本実施形態に係る細胞培養用滅菌容器１００の製造方法は、まず、前述したような樹脂素材により構成された材料を用いて、射出成形などによって細胞収容部１１を備える所望の形状の容器を成形する。そして、得られた容器の細胞収容部１１の内面１１ａに前述したような水溶性樹脂を主成分とする材料を用いて被覆層２１を形成する。なお、この細胞収容部１１の内面１１ａに酸素雰囲気下でのプラズマ処理などの表面処理を施してから被覆層２１を形成するのが好適である。
　細胞収容部１１の内面１１ａに水溶性樹脂により構成された被覆層２１を形成する方法としては、例えば、ディッピングや、水溶性樹脂溶液を細胞収容部１１内に分注した後、容器を傾けて溶液を排出する方法などを用いることができる。このような方法により、細胞収容部１１の内面１１ａに水溶性樹脂溶液を接触させた後、残留した溶媒等を乾燥させることによって被覆層２１を形成することができる。
　そして、この場合の水溶性樹脂は、２０℃における粘度が好ましくは１ｍＰａ・ｓ以上１０ｍＰａ・ｓ以下、より好ましくは２ｍＰａ・ｓ以上７ｍＰａ・ｓ以下となるように溶媒を用いて調製された溶液として使用するのが好適である。その際の溶媒は、水であるか、もしくは溶解度を高めるために水と有機溶媒との混合物を使用することができる。使用する水溶性樹脂溶液の粘度が上記範囲内であると、細胞の低吸着能が優れた被覆層２１を容易に得ることができる。
　そして、形成された被覆層２１の水溶性樹脂どうしの間および水溶性樹脂と細胞収容部１１の内面１１ａとの間を架橋および硬化させて、非水溶性の硬化被膜に変性させる工程を行う。この工程は、前述したような光照射処理や、熱処理、放射線照射処理などによって行うことができ、作業性や、被覆層２１を構成している水溶性樹脂の特性、細胞収容部１１の内面１１ａに形成されている官能基の種類などに応じて適宜選択すれば良い。なお、光照射処理（ＵＶ照射処理など）は、これらの中でも架橋、硬化処理を迅速に行うことができ、且つ簡易な設備で行うことができる方法である。
　光照射により被覆層２１を架橋、硬化させる場合の光源は、特に限定されないが、照度が５．０ｍＷ／ｃｍ2程度の超高圧水銀灯または０．１ｍＷ／ｃｍ2程度のＵＶランプを使用することができる。光照射による架橋、硬化は照度と照射時間で制御することができるため、照度の低い光源を用いる場合は照射時間を長くすればよく、反応性の高い感光基を選択した場合は蛍光灯下で架橋、硬化させることも可能である。例えば、５．０ｍＷ／ｃｍ2の超高圧水銀灯を使用した場合は１～１０秒の照射で、０．１ｍＷ／ｃｍ2のＵＶランプを使用した場合は３～１０分の照射で充分に架橋、硬化させることができる。
　このようにして、被覆層２１を非水溶性の硬化被膜に変性させることで、親水性官能基を表層に有する安定な被覆層２１を構築することができる。なお、架橋による硬化後に被覆層２１の表面を水または水性溶媒によって洗浄することにより、未反応の水溶性樹脂の少なくとも一部を除去しても良い。硬化後にこのような被覆層２１の洗浄工程を入れることにより、溶出物の量をより低減することができる。
　そして、上記のような被覆層２１が形成された本実施形態に係る細胞培養用滅菌容器１００について、必要であればガス透過性を有するフィルム材により２重以上に密封包装し、さらに必要であれば箱詰めなどを行ってから、前述したような放射線滅菌処理を行う。また、前述したような構成となる限りにおいて、放射線滅菌処理以外の滅菌処理を行っても良い。以上のような製造方法により、被覆層２１が安定に保たれ、且つ高い無菌性を有する、本実施形態に係る細胞培養用滅菌容器１００を製造することができる。
　そして、上記実施形態は、以下の技術思想を包含するものである。
（１）低細胞吸着性の細胞培養用滅菌容器であって、樹脂素材により構成された、細胞および液体培地を収容して細胞培養を行うことが可能な細胞収容部を備え、前記細胞収容部の内面には側鎖に親水性官能基を有する水溶性樹脂により構成された被覆層が形成され、且つ、前記水溶性樹脂どうしの間ならびに前記水溶性樹脂と前記細胞収容部の前記内面との間が架橋されており、さらに、放射線の吸収線量として２０ｋＧｙ以上４５ｋＧｙ以下の放射線滅菌処理が施された、細胞培養用滅菌容器。
（２）前記細胞収容部に０．１２ｍＬ／ｃｍ2となるように純水を収容して３７℃で７２時間加熱し、得られた試験液を層長１ｃｍのセルに入れ、波長２２０ｎｍのＵＶ光を照射したときに測定される吸光度および波長２４１ｎｍのＵＶ光を照射したときに測定される吸光度がいずれも０．１０以下である、（１）に記載の細胞培養用滅菌容器。
（３）９６の前記細胞収容部にそれぞれヒト肝癌由来細胞（ＨｅｐＧ２）をウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）とともに収容して前記細胞収容部の１つ当たりにおける前記ヒト肝癌由来細胞（ＨｅｐＧ２）の細胞数を１×１０3ｃｅｌｌとし、３７℃で３日間細胞培養を行った場合に、前記ヒト肝癌由来細胞（ＨｅｐＧ２）の直径２００μｍ以上の細胞凝集塊が１以上形成される前記細胞収容部の数が８８以上である、（１）または（２）に記載の細胞培養用滅菌容器。
（４）前記被覆層を構成する前記水溶性樹脂が芳香族アジド基を含む側鎖およびカルボニル基を含む側鎖を有し、前記細胞収容部の前記内面にカルボニル基が形成されており、前記水溶性樹脂の前記芳香族アジド基と前記水溶性樹脂の前記カルボニル基との間、ならびに前記水溶性樹脂の前記芳香族アジド基と前記細胞収容部の前記内面の前記カルボニル基との間が架橋されている、（１）～（３）のいずれか１つに記載の細胞培養用滅菌容器。
（５）前記被覆層を構成する前記水溶性樹脂が、上記式（Ｉａ）または上記式（Ｉｂ）で表される水溶性樹脂である、（１）～（４）のいずれか１つに記載の細胞培養用滅菌容器。
（６）前記細胞収容部がウェルであり、前記細胞培養用滅菌容器が前記ウェルを複数備えるマルチウェルプレートである、（１）～（５）のいずれか１つに記載の細胞培養用滅菌容器。
（７）（１）～（６）のいずれか１つに記載の細胞培養用滅菌容器がガス透過性を有するフィルム材により２重以上に密封包装された、密封包装済み細胞培養用滅菌容器。
（８）低細胞吸着性の細胞培養用滅菌容器であって、樹脂素材により構成された、細胞および液体培地を収容して細胞培養を行うことが可能な細胞収容部を備え、前記細胞収容部の内面には側鎖に親水性官能基を有する水溶性樹脂により構成された被覆層が形成され、且つ、前記水溶性樹脂どうしの間ならびに前記水溶性樹脂と前記細胞収容部の前記内面との間が架橋されており、前記細胞収容部に０．１２ｍＬ／ｃｍ2となるように純水を収容して３７℃で７２時間加熱し、得られた試験液を層長１ｃｍのセルに入れ、波長２２０ｎｍのＵＶ光を照射したときに測定される吸光度および波長２４１ｎｍのＵＶ光を照射したときに測定される吸光度がいずれも０．１０以下であり、さらに、９６の前記細胞収容部にそれぞれヒト肝癌由来細胞（ＨｅｐＧ２）をウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）とともに収容して前記細胞収容部の１つ当たりにおける前記ヒト肝癌由来細胞（ＨｅｐＧ２）の細胞数を１×１０3ｃｅｌｌとし、３７℃で３日間細胞培養を行った場合に、前記ヒト肝癌由来細胞（ＨｅｐＧ２）の直径２００μｍ以上の細胞凝集塊が１以上形成される前記細胞収容部の数が８８以上である、細胞培養用滅菌容器。
　以下、本発明の実施例について説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、本発明の技術的思想内において様々な変形が可能である。
（実施例１）
　ポリスチレン樹脂（ＰＳジャパン社製、商品名：ＨＦ７７）を用いて、射出成形により図１に示すような９６ウェルのマルチウェルプレート（横：１２７．６ｍｍ、縦：８５．８ｍｍ、高さ：１４．０ｍｍ）を成形した。細胞収容部であるウェルの形状は図２に示すような形状とし、各ウェルの開口直径は６．２ｍｍ、深さは５．０ｍｍ、側壁の厚みは０　．８ｍｍとし、ウェル１つ当たりの容量は約０．２５ｍＬとした。
　得られたマルチウェルプレートにプラズマ処理装置（ＢＲＡＮＳＯＮ／ＩＰＣ社製　ＳＥＲＩＥＳ７０００）を用いて、酸素雰囲気下でプラズマ処理（酸素プラズマ１０分）を行った。これにより、プレート表面に濡れ性を付与した。
　次に、ウェルの表面処理（被覆層形成）を行うために、水溶性樹脂として側鎖にアジド基を有するポリビニルアルコール（東洋合成工業社製　ＡＷＰ（Ａｚｉｄｅ－ｕｎｉｔ　ｐｅｎｄａｎｔ　Ｗａｔｅｒ　ｓｏｌｕｂｌｅ　Ｐｈｏｔｏｐｏｌｙｍｅｒ、ｒ１＝１～１０００、ｒ２＝４～４９９５、ｒ３＝０～４０００、ｎ＝１、２、または３、Ｒは下記式（ＩＩＩ）で表される基）：下記式（ＩＩａ）で表される化合物（水溶性樹脂の平均重合度１６００、感光基の導入率０．６５ｍｏｌ％））を、茶色顔料で着色した遮光ポリプロピレン容器中で２５体積％エタノール水溶液に溶解し、０．５重量％の水溶性樹脂溶液を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　上記０．５重量％の水溶性樹脂溶液を、プラズマ処理したマルチウェルプレートに、１ウェルにつき５０μＬ加えて１分間静置した後、プレートを裏返して余分な溶液を廃棄した。ついで、４０℃で６０分一次乾燥した後、ＵＶランプで２５０ｎｍのＵＶ光を１．０ｍＷ／ｃｍ2×３０秒間照射して水溶性樹脂を硬化および架橋させた。次いで、マルチウェルプレートを超純水で３回繰り返し洗浄し、乾燥させた後、γ線を吸収線量が２２．５ｋＧｙあるいは４５．０ｋＧｙとなるように照射して滅菌し、２種類の細胞培養用滅菌容器を得た。
　ＨｅｐＧ２を液体培地（ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ））に分散させた細胞懸濁液を調製し、上記で得られた２種類の細胞培養用滅菌容器のウェルに細胞数が１×１０3ｃｅｌｌ／ウェルとなるように分注し、３７℃で３日間細胞培養を行った。
　この結果、いずれの細胞培養用滅菌容器も、全てのウェルに直径が約７００μｍのサイズの１個の細胞凝集塊（スフェロイド）が形成されていることを顕微鏡下で確認した。
（実施例２）
　９０ｍｍ径、高さ１．１６ｍｍのシャーレ形状容器（容量：６．６ｍＬ）に、実施例１と同様の方法によりプラズマ処理、および水溶性樹脂処理を行い、さらに、同様のＵＶ照射および放射線滅菌（γ線照射）を行った。なお、γ線の吸収線量は１５．０ｋＧｙ、２５．０ｋＧｙ、または４０．０ｋＧｙとなるようにして、３種類の細胞培養用滅菌容器を得た。
　そして、これらの３種類の細胞培養用滅菌容器の細胞収容部に、被覆層が形成された領域の表面積に対する量として０．１２ｍＬ／ｃｍ2となるように純水を収容して３７℃で７２時間加熱し、得られた試験液を層長１ｃｍのセルに入れ、ＵＶ分光光度計により、波長２２０ｎｍのＵＶ光を照射したときに測定される吸光度および波長２４１ｎｍのＵＶ光を照射したときに測定される吸光度を測定した。この結果を下記表１に示す。
　この結果、いずれも吸光度が０．１０以下であり、試験液中への溶出物が少ないことが示された。つまり、γ線の吸収線量が２５．０ｋＧｙ、および４０．０ｋＧｙの細胞培養用滅菌容器は、γ線の吸収線量が１５．０ｋＧｙの細胞培養用滅菌容器と溶出物の量がほぼ同じレベルであり、よって強い放射線滅菌が施されていても被覆層の分解が少なく、被覆層が安定して維持されていることが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
１００　細胞培養用滅菌容器（マルチウェルプレート）
１１　　細胞収容部（ウェル）
１１ａ　細胞収容部（ウェル）の内面
２１　　被覆層
３１　　細胞凝集塊
４１　　架橋構造（水溶性樹脂間）
４３　　架橋構造（水溶性樹脂－内面間）

Claims (8)

  1. 　低細胞吸着性の細胞培養用滅菌容器であって、
    　樹脂素材により構成された、細胞および液体培地を収容して細胞培養を行うことが可能な細胞収容部を備え、
    　前記細胞収容部の内面には側鎖に親水性官能基を有する水溶性樹脂により構成された被覆層が形成され、且つ、前記水溶性樹脂どうしの間ならびに前記水溶性樹脂と前記細胞収容部の前記内面との間が架橋されており、
    　さらに、放射線の吸収線量として２０ｋＧｙ以上４５ｋＧｙ以下の放射線滅菌処理が施された、
    細胞培養用滅菌容器。
  2. 　前記細胞収容部に０．１２ｍＬ／ｃｍ2となるように純水を収容して３７℃で７２時間加熱し、得られた試験液を層長１ｃｍのセルに入れ、波長２２０ｎｍのＵＶ光を照射したときに測定される吸光度および波長２４１ｎｍのＵＶ光を照射したときに測定される吸光度がいずれも０．１０以下である、請求項１に記載の細胞培養用滅菌容器。
  3. 　９６の前記細胞収容部にそれぞれヒト肝癌由来細胞（ＨｅｐＧ２）をウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）とともに収容して前記細胞収容部の１つ当たりにおける前記ヒト肝癌由来細胞（ＨｅｐＧ２）の細胞数を１×１０3ｃｅｌｌとし、３７℃で３日間細胞培養を行った場合に、前記ヒト肝癌由来細胞（ＨｅｐＧ２）の直径２００μｍ以上の細胞凝集塊が１以上形成される前記細胞収容部の数が８８以上である、請求項１または２に記載の細胞培養用滅菌容器。
  4. 　前記被覆層を構成する前記水溶性樹脂が芳香族アジド基を含む側鎖およびカルボニル基を含む側鎖を有し、
    　前記細胞収容部の前記内面にカルボニル基が形成されており、
    　前記水溶性樹脂の前記芳香族アジド基と前記水溶性樹脂の前記カルボニル基との間、ならびに前記水溶性樹脂の前記芳香族アジド基と前記細胞収容部の前記内面の前記カルボニル基との間が架橋されている、請求項１～３のいずれか１項に記載の細胞培養用滅菌容器。
  5. 　前記被覆層を構成する前記水溶性樹脂が、下記式（Ｉａ）または下記式（Ｉｂ）で表される水溶性樹脂である、請求項１～４のいずれか１項に記載の細胞培養用滅菌容器。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式（Ｉａ）中、Ｒ１はカルボニルとアミンとを有する炭化水素基、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５はいずれも水素またはアルキル基、ｒ１は１～１０００、ｒ２は４０～４９９５、ｒ３は０～４０００、ｎは１、２または３を示す。）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式（Ｉｂ）中、Ｒはカルボニルとアミンとを有する炭化水素基、ｒ１は１～１０００、ｒ２は４０～４９９５、ｒ３は０～４０００を示す。）
  6. 　前記細胞収容部がウェルであり、前記細胞培養用滅菌容器が前記ウェルを複数備えるマルチウェルプレートである、請求項１～５のいずれか１項に記載の細胞培養用滅菌容器。
  7. 　請求項１～６のいずれか１項に記載の細胞培養用滅菌容器がガス透過性を有するフィルム材により２重以上に密封包装された、密封包装済み細胞培養用滅菌容器。
  8. 　低細胞吸着性の細胞培養用滅菌容器であって、
    　樹脂素材により構成された、細胞および液体培地を収容して細胞培養を行うことが可能な細胞収容部を備え、
    　前記細胞収容部の内面には側鎖に親水性官能基を有する水溶性樹脂により構成された被覆層が形成され、且つ、前記水溶性樹脂どうしの間ならびに前記水溶性樹脂と前記細胞収容部の前記内面との間が架橋されており、
    　前記細胞収容部に０．１２ｍＬ／ｃｍ2となるように純水を収容して３７℃で７２時間加熱し、得られた試験液を層長１ｃｍのセルに入れ、波長２２０ｎｍのＵＶ光を照射したときに測定される吸光度および波長２４１ｎｍのＵＶ光を照射したときに測定される吸光度がいずれも０．１０以下であり、
    　さらに、９６の前記細胞収容部にそれぞれヒト肝癌由来細胞（ＨｅｐＧ２）をウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）とともに収容して前記細胞収容部の１つ当たりにおける前記ヒト肝癌由来細胞（ＨｅｐＧ２）の細胞数を１×１０3ｃｅｌｌとし、３７℃で３日間細胞培養を行った場合に、前記ヒト肝癌由来細胞（ＨｅｐＧ２）の直径２００μｍ以上の細胞凝集塊が１以上形成される前記細胞収容部の数が８８以上である、
    細胞培養用滅菌容器。
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