JP2008191067A

JP2008191067A - 生化学用容器

Info

Publication number: JP2008191067A
Application number: JP2007027608A
Authority: JP
Inventors: Hayao Tanaka; 速雄田中
Original assignee: Sumitomo Bakelite Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Bakelite Co Ltd
Priority date: 2007-02-07
Filing date: 2007-02-07
Publication date: 2008-08-21

Abstract

【課題】容器内に蛋白質等の生体由来物質の吸着を低減する表面を有し、かつ低温保存性、耐薬品性、保存安定性に優れた生化学用容器を提供することにある。
【解決手段】一端が開口されている容器部材を有する生化学用容器であって、前記容器部材はポリエステル樹脂又はポリエステル共重合体を含むものであり、更に前記容器部材内表面の少なくとも一部が側鎖に感光性の官能基を有する水溶性樹脂で被覆されており、更に前記水溶性樹脂がポリ酢酸ビニルのけん化物、ポリビニルピロリドン及び、ポリエチレングリコールの中から選ばれるものである。

【選択図】なし

Description

本発明は、生化学用容器に関する。

生化学実験における蛋白質溶液、細胞懸濁液等の秤量、調製、遠心分離操作に使用する容器には、従来ポリプロピレンまたはＴＰＸ製のものが使用されてきた。
近年、測定系の高感度化に伴い扱う試料が微量になり、容器内表面に対する蛋白質や細胞の非特異的な吸着の影響が問題になってきた。
そのため、容器内表面に親水性を付与する事で生体由来物質の吸着を低減させる種々の技術が開示されている。
しかしながら、ポリヒドロキシエチルメタクリレート共重合体またはポリイソプロピルアクリルアミドやプロピオネート、さらにポリビニルアルコールといった親水性化合物を培養容器内面にコーティングする方法（例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３参照）が開示されているが、コーティングした親水性化合物が培地水溶液中に溶出し、細胞の機能・形態に影響を与える可能性があった。
更にポリヒドロキシエチルメタアクリレート共重合体等を使用した場合は、親水性化合物が放射線に対する耐性を有していないため、コーティング後に放射線で滅菌することが出来ないものが多く、無菌性を必要とする生化学容器においては無菌状況下での生産を余儀なくされていた。
更に、容器内表面にポリエチレンオキシドやプロピルイソシアネート等の親水性材料をグラフトする事により、表面に親水性を付与する方法が開示されているが、グラフト鎖長を均一に制御する事が難しく、更にグラフト鎖の導入密度を上げる事が困難である事から、改質のばらつきが大きく、充分な改質効果を得る事が難しいという問題点を有していた。（例えば、特許文献４参照）

特開昭６２−１６９０５２号公報特開平０７−００５１７７号公報特開平１０−１５３５９９号公報特開平２００１−１６４０１３号公報

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、容器内に蛋白質等の生体由来物質の吸着を低減する表面を有し、かつ低温保存性、耐薬品性、保存安定性に優れた生化学用容器を提供することにある。

このような目的は、下記（１）から（３）に記載の本発明により達成される。
（１）一端が開口されている容器部材を有する生化学用容器であって、前記容器部材はポリエステル樹脂又はポリエステル共重合体を含むものであり、更に前記容器部材内表面の少なくとも一部が側鎖に感光性の官能基を有する水溶性樹脂で被覆されていることを特徴とする生化学用容器。
（２）前記水溶性樹脂がポリ酢酸ビニルのけん化物、ポリビニルピロリドン及び、ポリエチレングリコールの中から選ばれるものである請求項１記載の生化学用容器。
（３）遠心分離用に用いられる容器を含むものである請求項１又は２記載の生化学用容器。

本発明によれば、容器内に蛋白質等の生体由来物質の吸着を低減する表面を有し、かつ低温保存性、耐薬品性、保存安定性に優れた生化学用容器を得ることが出来る。

以下、本発明について詳細に説明する。
本発明は、一端が開口されている容器部材を有する生化学用容器であって、上記容器部材はポリエステル樹脂又はポリエステル共重合体を含むものであり、更に上記容器部材内表面の少なくとも一部が側鎖に感光性の官能基を有する水溶性樹脂で被覆されていることを特徴とする生化学用容器である。

本発明の生化学用容器に用いられる上記容器部材はポリエステル樹脂又はポリエステル共重合体を含むものであるが、それによって種々の形状を容易に形成することが出来、更に生化学用容器として求められる透明性、耐低温保存性、耐薬品性に加えて、遠心分離用容器に求められる破壊強度を付与することが出来る。

また、上記容器部材内表面の少なくとも一部が側鎖に官能基を有する水溶性樹脂で被覆されていることを特徴とする。こうすることで、光で硬化させた表面の経時的な劣化を低減することができ、保存安定性を向上させることができる。

上記樹脂材料としては、例えばポリエチレンテレフタレート樹脂、ポリブチレンテレフタレート樹脂、１，４シクロヘキシルジメチレンテレフタレート樹脂、またこれらの少なくとも一種類を含む共重合体等が挙げられる。
上記樹脂材料から本発明の生化学用容器を製造する場合、例えば射出成形、ブロー成形、インジェクションブロー成形により上記生化学用容器を製造することができる。
上記樹脂材料の中でもポリエチレンテレフタレート樹脂共重合体が射出成形性に優れるため好ましく、上記ポリエチレンテレフタレート樹脂共重合体としては例えば、テレフタル酸−エチレングリコール−ビスフェノールＡエチレンオキサイド（１〜４）重縮合物、またはテレフタル酸−イソフタル酸−エチレングリコール重縮合物等が挙げられる。上記樹脂材料には成形性向上、耐候性向上を目的として、本発明の目的を損なわない範囲で炭化水素系、脂肪酸アミド系等の添加剤を添加することができる。

本発明の生化学用容器の形態としては、例えば生化学研究に使用される遠沈管、凍結保存チューブ、チューブ類（試験管）等の容器類が挙げられる。これらの中でも、生体由来物質との接触時間が比較的長く、各種分析における試料調製に使用されるチューブ類（具体的には、採血容器または蛋白質の分析に用いられる試験管やサンプル容器）として用いられることが好ましく、これにより、分析結果の精度及び感度を向上させることができる。更に、遠心分利用に用いられる容器の場合、蛋白質または細胞の回収率が向上するため特に好ましく用いることが出来る。

本発明の生化学用容器においては水溶性樹脂を基材表面に被覆する事で、生体由来物質の基材表面への吸着・損失を低いレベルに抑えることが出来る。
ここで水溶性樹脂とは、水分子とのイオンもしくは水素結合により水和し、その結果として水に溶解する樹脂のことであり、言い換えれば水溶性樹脂とは水に溶解するために分子内の主鎖に対して必要充分な量のイオン性もしくは極性の側鎖を持つ樹脂のことである。

更に本発明の生化学用容器に用いられる水溶性樹脂は、側鎖に感光性の官能基を有していることを特徴とする。水溶性樹脂で被覆した後に水溶性被覆層を光照射により硬化させ、非水溶性硬化皮膜層とすることができる。非水溶性硬化皮膜層とすることで被覆層が溶解、遊離することを防ぎ、培養容器として必要な耐水性を獲得し、生化学実験に好適に使用することが出来る。

光照射により硬化させる場合の光源は特に限定するものではなく、照度が５．０ｍＷ／ｃｍ²程度の超高圧水銀灯または０．１ｍＷ／ｃｍ²程度のＵＶランプを使用することも出来る。光照射による硬化は照度と照射時間で制御することが出来るため、照度の低い光源を用いる場合は照射時間を長くすればよく、反応性の高い感光基を選択した場合は蛍光灯下で硬化させることも可能である。例えば５．０ｍＷ／ｃｍ²の超高圧水銀灯を使用した場合は１ないし１０秒の照射で、０．１ｍＷ／ｃｍ²のＵＶランプを使用した場合は３ないし１０分の照射で充分に硬化させることが出来る。側鎖に感光性の官能基を有する水溶性樹脂を用いることで、上記のような簡易な製造設備で短時間に効率的に水溶性樹脂を架橋反応する事が出来る。

このような感光性の官能基としては、例えば窒素原子を含む官能基、硫黄原子を含む官能基、臭素原子を含む官能基、塩素原子を含む官能基またはそれらいずれの原子も含まない官能基等が挙げられる。これらの中でも窒素原子を含む官能基が好ましい。
具体的には例えばアジド基を含む官能基、ジアゾ基を含む官能基、ジアジド基を含む官能基等が挙げられる。これらの中でもアジド基を含む官能基が好ましい。これにより、実用的な２３０〜５００ｎｍの波長で反応させる事が出来、更に優れた解像性により皮膜の形成性を向上することができる。

本発明の生化学用容器に用いられる水溶性樹脂について更に説明する、
上記水溶性樹脂としては、例えばポリ酢酸ビニルのけん化物、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド、ポリメタアクリルアミド、ポリヒドロキシエチルメタアクリレート、ポリペンタエリスリトールトリアクリレート、ポリペンタエリスリトールテトラアクリレート、ポリジエチレングリコールジアクリレート、およびそれらを構成するモノマー同士の共重合体、また２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンと他のモノマー（例えばブチルメタクリレート等）との共重合体等が挙げられる。これらの中でもポリ酢酸ビニルのけん化物、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコールの中から選ばれるものが好ましい。これにより、生体由来物質の吸着を低減し、実験の精度を向上することができる。

ここで、ポリ酢酸ビニルのけん化物とは、例えばポリビニルアルコールまたはビニルアルコールと他の化合物との共重合体をいう。さらには、ビニルアルコールと、親水基変性、疎水基変性、アニオン変性、カチオン変性、アミド基変性またはアセトアセチル基のような反応基変性等の変性酢酸ビニルのけん化物等も含まれる。

なお、ここで水溶性樹脂とは、２５℃の水１００ｇに対して１．０ｇ以上溶解可能なものをいう。
上記水溶性樹脂の平均重合度は、特に限定されないが、１００以上、１００００以下が好ましく、特に２００以上、５，０００以下が好ましい。平均重合度が１００以上であると、均一な皮膜を成形することができ、また、平均重合度が１００００以下であれば作業性に適した水溶性の粘度とすることができる。

また、上記ポリ酢酸ビニルのけん化物を用いる場合、上記ポリ酢酸ビニルのけん化物のけん化度は特に限定されないが、該ポリ酢酸ビニル全体の２０ｍｏｌ％以上、１００ｍｏｌ％以下が好ましく、特に５０ｍｏｌ％以上、９５ｍｏｌ％以下が好ましい。上記ポリ酢酸ビニルのけん化度が上記範囲内であると、生体由来物質の吸着を特に低減することができる。

上記水溶性樹脂は、２０℃における粘度が１ｍＰａ・ｓ以上、１０ｍＰａ・ｓ以下に、好ましくは２ｍＰａ・ｓ以上、７ｍＰａ・ｓ以下となるよう溶媒を用いて調製されたものを使用する事が好ましい。その際に使用する溶媒は水もしくは溶解度を高めるために水と有機溶媒の混合物を使用することができる。水溶性樹脂の粘度が上記範囲内であると、被覆の際の作業性に優れ、被覆層表面の平滑性に優れることから結果として生体由来物質の吸着をより低減することが出来る。

水溶性樹脂を使用するもう一つの利点としては硬化後に表面を水で洗浄する事で、未反応の樹脂を容易に洗い流す事が出来るという点である。もし、硬化反応性が悪い等の原因で溶出物が確認された場合は、硬化後に洗浄工程を入れることにより生化学実験に好ましくない影響を与える溶出物を特に低減すること出来る。

本発明の生化学用容器は必要に応じて滅菌することが出来、滅菌には熱による変形の心配がなく大量処理に適したγ線あるいは電子線といった放射線滅菌を使用することが好ましい。
本発明の生化学用容器に用いられる樹脂材料は放射線への耐性も優れており、滅菌後の経時劣化の影響を受けにくい点も特徴である。放射線の吸収線量については特に限定するものではないが、吸収線量が低すぎると滅菌性は確保されず、高すぎると細胞培養容器および被覆層が劣化してしまう放射線の吸収線量としては１ｋＧｙ以上、５０ｋＧｙ以下が好ましく、５ｋＧｙ以上、３０ｋＧｙ以下が特に好ましい。これによって本発明の生化学用容器の特性を充分に保持したまま滅菌性を付与する事ができる。

以下、本発明の生化学用容器を実施例および比較例に基づいて詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
（実施例）
樹脂材料としてポリエステル共重合体（ユニチカポリエステル社製、ＭＡ−１３４４）を用いて、射出成形（成形機：日精樹脂工業社製６０ｔ、シリンダー温度：２５０℃−２６０℃−２６０℃−２３０℃、射出圧力：７００ｋｇ／ｃｍ²、金型冷却：３０℃）により高さ１２０ｍｍ、内径１４．８ｍｍのチューブ（遠沈管）を成形した。得られたチューブにプラズマ処理装置（ＢＲＡＮＳＯＮ／ＩＰＣ社製ＳＥＲＩＥＳ７０００）を用いてプラズマ処理（酸素プラズマ５分間）を行い、水溶性樹脂として側鎖にアジド基を有するポリビニルアルコール（東洋合成工業社製ＡＷＰ、平均重合度１６００、感光基の導入率０．６５ｍｏｌ％）をアルミ箔で遮光をしたガラス容器中で、２０容量％エタノール水溶液に溶解し、０．６重量％の溶液を調整した。
上述のチューブに上記水溶性樹脂の水溶液１５ｍＬを分注し１分間後、分注した水溶性樹脂の水溶液を排出し、チューブを裏返した状態で４０℃６０分間一次乾燥した後、ＵＶランプで２５０ｎｍのＵＶ光を０．１ｍＷ／ｃｍ²×３分間照射して水溶性樹脂を硬化した後純水で３回繰り返し洗浄し、乾燥後、γ線を吸収線量１０ｋＧｙで照射（ラジエ工業株式会社）して、本発明の生化学用容器（チューブ）を得た。
得られたチューブの表面には、上記水溶性樹脂で形成される層が厚さ１００ｎｍで形成されていた。なお、層の厚さは液体窒素中で破断したディッシュの破断面を電子顕微鏡（ＦＥＩ社製Ｑｕａｎｔａ４００Ｆ）を用いて測定した。

（比較例１）
実施例１の工程から水溶性樹脂の分注、及びＵＶランプによる硬化、洗浄、乾燥までの工程を除き、チューブを得た。

（比較例２）
樹脂材料としてポリプロピレン樹脂（プライムポリマー社製、Ｊ２４６ＭＡ）を用い、射出成形の条件を以下のようにした以外は、実施例１と同様にしてチューブを得た。
射出成形を成形機：日精樹脂工業製６０ｔ、シリンダー温度：２２５℃−２２０℃−１９５℃−１８５℃、射出圧力：６８０ｋｇ／ｃｍ²、金型冷却：３０℃の条件で行なった。

（比較例３）
樹脂材料としてメチルペンテン（ＴＰＸ）樹脂（三井石油化学社製、ＲＴ−３１）を用い、射出成形の条件を以下のようにした以外は、実施例１と同様にしてチューブを得た。
射出成形を成形機：日精樹脂工業製６０ｔ、シリンダー温度：２９０℃−２７０℃−２５５℃−２５５℃、射出圧力：７００ｋｇ／ｃｍ²、金型冷却：５０℃の条件で行なった。

（比較例４）
樹脂材料としてポリスチレン樹脂（ＰＳジャパン社製ＨＦ７７）用い、射出成形の条件を以下のようにした以外は、実施例１と同様にしてチューブを得た。
射出成形を成形機：日精樹脂工業製６０ｔ、シリンダー温度：２６５℃−２６５℃−２４０℃−１９０℃、射出圧力：７００ｋｇ／ｃｍ²、金型冷却：６０℃の条件で行なった。
得られたチューブについて、以下の評価を行なった。評価項目、内容及び得られた結果を表１に示す。

１．細胞回収率
ラット新生児由来ミクログリア細胞を含む培養液を実施例及び各比較例で得られたチューブに各々１０ｍＬづつ分注し、１０００ｒｐｍ、５分間遠心分離操作をおこなった。
遠心分離後各チューブから上清を捨て、７ｍＬの培養液で再分散し血球計算版にて細胞数をカウントした。

２．生体由来物質吸着性
２．１ウシ血清イムノグロブリン吸着性
ウシ血清イムノグロブリンの吸着性を次のように評価した。ウシ血清イムノグロブリン（Ｂｏｖｉｎｅｇａｍｍａｇｌｏｂｕｌｉｎｓｔａｎｄａｒｄ２３２１０ＰＩＥＲＣＥ社製）をヨウ素（¹²⁵Ｉ）標識し、１．０Ｅ^-7ｇ／ｍＬの濃度にリン酸バッファー（ｐＨ７．４）で希釈し、実施例及び各比較例で得られたチューブに各々１．０ｍＬづつ分注し、３７℃で１時間静置した。その後、０．０５容量％のＴｗｅｅｎ２０含有リン酸バッファーで３回洗浄を繰り返し、各チューブ本体をγ線カウンターで測定した。
別途作成した検量線から各チューブ本体に残留したヨウ素（¹²⁵Ｉ）標識ウシ血清イムノグロブリンの重量を求め、各溶液濃度の吸着率を算出した。

２．２ウシ血清アルブミン吸着性
ウシ血清アルブミンの吸着性を次のように評価した。ウシ血清アルブミン（２３２０９ＰＩＥＲＣＥ社製）を０．５μｇ／ｍＬに希釈した溶液を、実施例及び各比較例で得られたチューブに各々５．０ｍＬづつ分注し、３７℃で１時間インキュベートした後０．０５容量％ｔｗｅｅｎ２０入りリン酸緩衝液ｐＨ７．４で３回洗浄した。
次にブロッキングとして３．０重量％スキムミルク入りリン酸緩衝液ｐＨ７．４溶液を５．５ｍＬづつ分注し、３７℃で１時間インキュベートした後０．０５容量％ｔｗｅｅｎ２０入りリン酸緩衝液ｐＨ７．４で３回洗浄した。次にペルオキシターゼ標識坑ウシ血清アルブミン抗体（５５２８５ＣＡＰＰＥＬ社製）をリン酸緩衝液ｐＨ７．４で１．０μｇ／ｍＬに希釈した溶液を各チューブに５．０ｍＬづつ分注し室温で３０分インキュベートした後０．０５容量％ｔｗｅｅｎ２０入りリン酸緩衝液ｐＨ７．４で３回洗浄し、ぺルオキシターゼ用発色キット（ＳＵＭＩＬＯＮＭＬ−１１２０Ｔ住友ベークライト社製）を使用して発色させた後プレートリーダーを使用して４５０／６３０ｎｍの吸光度を測定した。
別途作成した検量線から各チューブ本体に残留したペルオキシターゼ標識坑ウシ血清アルブミン抗体＝ウシ血清アルブミンの重量を求め、吸着率を算出した。

２．３ペルオキシターゼ標識アビジン吸着性
ペルオキシターゼ標識アビジンの吸着性を次のように評価した。ペルオキシターゼ標識アビジン（４３−４４２３ＺＹＭＥＤ社製）を０．５μｇ／ｍＬに希釈した溶液を実施例及び各比較例で得られたチューブに各々５．０ｍＬづつ分注し、室温で１時間静置した後、０．０５％ｔｗｅｅｎ２０入りリン酸緩衝液ｐＨ７．４で３回洗浄し、ぺルオキシターゼ用発色キット（ＳＵＭＩＬＯＮＭＬ−１１２０Ｔ住友ベークライト社製）を使用して発色させた後プレートリーダーを使用して４５０／６３０ｎｍの吸光度を測定した。
別途作成した検量線から各チューブ本体に残留したペルオキシターゼ標識アビジンの重量を求め、吸着率を算出した。

３．保存安定性
実施例及び各比較例で得られたチューブを５０℃の恒温槽に入れ、３０日間保存後に上記２．３ペルオキシターゼ標識アビジン吸着性と同一の評価をおこない生体由来物質吸着制御性について劣化の有無を確認した。

４．耐溶剤性
実施例及び各比較例で得られたチューブに各々メタノール、エタノール、クロロホルム、を５．０ｍＬづつ分注し、１０分間放置した後、影響の有無を目視で判断した。

５．遠心強度
遠心強度は、遠心機を用いて評価した。
実施例及び各比較例で得られたチューブに各々純水１．５ｍＬを分注し、遠心機（ＣＦ１６ＲＸ形日立多用途小型遠心機）にセットし、２５℃、４６４０Ｇで１０分間遠心した後で、目視により各チューブの変形、割れを確認した。

６．耐寒性の評価
実施例及び各比較例で得られたチューブに各々純水１．５ｍＬを分注し、−８０℃のディープフリーザーに２４時間静置した後、純水を廃棄し、目視によりチューブ本体の変形、割れを確認した。

表１から明らかなように本発明の生化学用容器を用いた実施例は、細胞回収率に優れ、生体由来物質の吸着性も抑えることができた。更に保存安定性試験においても生体由来物質吸着性に変化はなく、耐溶剤性、遠心強度、耐寒性全てにおいて良好な結果が得られ、これにより生化学用容器に好適に使用できることが示された。
一方、本発明の生化学用容器を用いなかった比較例１〜４においては、比較例１では細胞回収率が低く、生体由来物質の吸着性も認められた。
比較例２、３、４においては細胞回収率および生体由来物質の吸着性は実施例と同等であるが、比較例２、３では保存安定性試験において劣化が確認され、耐溶剤性、遠心強度、耐寒性については比較例２、３、４の何れも全ての項目を満足できるものはなかった。

Claims

一端が開口されている容器部材を有する生化学用容器であって、前記容器部材はポリエステル樹脂又はポリエステル共重合体を含むものであり、更に前記容器部材内表面の少なくとも一部が側鎖に感光性の官能基を有する水溶性樹脂で被覆されていることを特徴とする生化学用容器。
前記水溶性樹脂がポリ酢酸ビニルのけん化物、ポリビニルピロリドン及び、ポリエチレングリコールの中から選ばれるものである請求項１記載の生化学用容器。
遠心分離用に用いられる容器を含むものである請求項１又は２記載の生化学用容器。