CN105283545B - 组织结构体及其制作方法 - Google Patents

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Abstract

提供全面地捕捉成熟细胞的基因模式的组织结构体及其制作方法。组织结构体是通过与从血管细胞、间充质细胞、由血管细胞分泌的因子、由间充质细胞分泌的因子、由血管细胞与间充质细胞两者存在而分泌的因子所组成的组中选择的至少一种细胞和/或因子一起，将来自干细胞的内胚层、外胚层或中胚层细胞进行共培养而得到的组织结构体；对于多种功能使用皮尔逊积差相关系数(Pearson product‑moment correlation coefficient)测定出的值，所述组织结构体由该值相比于从胎儿采集的细胞或生物体组织更接近从成人体采集的细胞或生物体组织的值的生物体组织而构成。

Description

组织结构体及其制作方法
技术领域
本发明涉及由干细胞例如人工多能性干细胞等未分化细胞发展成具有能够匹敌成熟组织的功能的组织结构体及其制作方法。
背景技术
近年来，进行了如下尝试：使具有向各种功能细胞分化的能力的例如iPS细胞这样的多能性干细胞分化成具有目标脏器或细胞所特有的功能的细胞，将其用于创新药筛选、再生医疗(例如，非专利文献1)。但是，这只不过是将体内(in vivo)的功能的一部分得以再现而已，其功能与生物体内的功能相比较显著地低。
在创新药筛选试验中，要求表现出与在生物体内的试验即所谓的in vivo试验同样的药物敏感性、毒性反应。为了在这样的用途中应用，上述的现有技术是不充分的，正在寻求一种更成熟化的、即表现出与生物体内的细胞所具有的功能相匹敌水平的功能的细胞。
虽然在再生医疗领域中进行着脏器移植、人工脏器移植，但却存在有供体不足、排斥反应这样的问题。例如，对于严重的脏器衰竭，在临床现场进行脏器移植、利用人工脏器的置换治疗。但是，对于脏器移植而言，存在有排斥反应、绝对的供体不足；对于人工脏器而言，只不过是仅将功能的一部分短时间替代而已，等等(例如，专利文献1、2)，仍然存在着根本性的未解决问题。对于人为制造出人体组织而言，虽然可以考虑使用终末分化的细胞向单体(支架材料)进行细胞接种的方法等；但对于肝脏等具有复杂的高级功能的脏器，现状是还不存在确立的方法(非专利文献2)。
这样，虽然正在寻求最终分化的成熟细胞或生物体组织，但现状是尚未实现。例如，对于肝功能，以下说明对成人体和现有的分化细胞进行比较的例。
作为肝细胞的药物代谢酶之一的细胞色素P450具有57种基因，由此可知细胞具有非常多的功能。通过它们同时起作用或者根据需要起作用而维持生命。
另外，可以确认，肝细胞中甚至到达80的基因的表达量随着从胎儿期至成为成人体而增加。进而，对于胰脏，非专利文献3、4中示出了在生成过程中，随着细胞成熟基因表达分布图发生变化。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平9-56814号公报
专利文献2：日本特开2004-166717号公报
专利文献3：国际公开第2013/047639号
专利文献4：国际公开第2007/058105号
专利文献5：国际公开第2008/066199号
非专利文献
非专利文献1：Maya Schuldiner、等著"Effects of eight growth factors onthe differentiation of cells derived from human embryonic stem cells"、PNAS,97vol21、2000年10月10日(Published online)、pp.11307-11312
非专利文献2：Basak E Uygun、等著"Organ reengineering throughdevelopment of a transplantable recellularized liver graft usingdecellularized liver matrix"、Nat Med,16(7),2010年6月13日(Published online)、pp.814-820
非专利文献3：Marta Szabat、等著"Kinetics and genomic profiling of adulthuman and mouseβ-cell maturation"、Islets 3:4、July/August 2011、pp.175-187
非专利文献4：Guoqiang Gu、等著"Global expression analysis of generegulatory pathways during endocrine pancreatic development"Research article、2003年9月30日、pp.165-178
非专利文献5:Francesco Pampaloni、等著"The third dimension bridges thegap between cell culture and live tissue"、Nature reviews molecular cellbiology volume 8、2007年10月、pp.839-845
非专利文献6:Markus Rimann、等著"Synthetic 3D multicellular systems fordrug development"Current Opinion in Biotechnology 2012 23、2012年、pp.1-7
发明内容
发明要解决的问题
然而，虽然公开了例如：专利文献3中记载的器官芽、专利文献4中记载的由未分化细胞诱导胰岛细胞的方法；专利文献5中记载的由未分化细胞向胰岛素分泌细胞的诱导方法等，但均是着眼于细胞功能中的一部分功能，对于个数有限的评价指标判断分化的有无。因此，这样的细胞、脏器不能判定为如上所述表达出多个基因模式的所谓的成熟水平。
因此，使用通过现有的评价指标所判定的细胞、脏器来对药物的作用效果、毒性等进行判定的情况下，产生不能正确地预测生物体内的反应这样的问题、人工脏器不能充分地起作用这样的问题。
发明人等发现，为了回避上述的问题，重要的是全面地捕捉这些最终分化的成熟细胞或生物体组织的蛋白表达、基因模式。
用于解决问题的方案
我们发明了以最终分化的成熟细胞或生物体组织的蛋白表达、基因表达模式的相似性作为指标的新的组织结构体及其制作方法。
本发明的一实施方式的组织结构体是通过与从血管细胞、间充质细胞、由血管细胞分泌的因子、由间充质细胞分泌的因子、由血管细胞与间充质细胞两者存在而分泌的因子所组成的组中选择的至少一种细胞和/或因子一起，将来自干细胞的内胚层、外胚层或中胚层细胞进行共培养而得到的；对于多种功能使用皮尔逊积差相关系数(Pearsonproduct-moment correlation coefficient)测定出的值，所述组织结构体的该值相比于从胎儿采集的细胞或生物体组织更接近从成人体采集的细胞或生物体组织的值。
另外，本发明的一实施方式的组织结构体优选的是，前述多种功能为10种以上的基因的表达量，前述10种以上的基因为前述组织结构体的基因表达量相对于前述来自干细胞的内胚层、外胚层或中胚层细胞的基因表达量改变2倍以上的基因。更优选的是，例如：基因表达量是使用全部基因片段被固定的DNA芯片而分析的值；前述10种以上的基因为前述组织结构体的基因表达量相对于前述来自干细胞的内胚层、外胚层或中胚层细胞的基因表达量改变2倍以上的全部基因。
进而，本发明的一实施方式的组织结构体优选的是，前述多种功能为对10种以上的蛋白质测定的蛋白质量；前述10种以上的蛋白质为前述组织结构体的蛋白量相对于前述来自干细胞的内胚层、外胚层或中胚层细胞的蛋白质量改变20％以上的全部蛋白质。更优选的是，前述组织结构体为球状体形状，球状体的直径为50μm～2mm。
另外，前述多种功能优选为肝脏或胰脏所特有的功能。
本发明的一实施方式的组织结构体的制作方法是：(1)与从血管细胞、间充质细胞、由血管细胞分泌的因子、由间充质细胞分泌的因子、由血管细胞与间充质细胞两者存在而分泌的因子所组成的组中选择至少一种细胞和/或因子一起，将来自干细胞的内胚层、外胚层或中胚层细胞进行共培养而制作培养形成物；(2)关于前述培养形成物所具有的多种功能，使用皮尔逊积差相关系数(Pearson product-moment correlation coefficient)进行测定；(3)提取测定的值相比于从胎儿采集的细胞或生物体组织更接近从成人体采集的细胞或生物体组织的值的培养形成物作为组织结构体。
另外，本发明的一实施方式的组织结构体的制作方法中，优选的是，前述多种功能为10种以上的基因的表达量，前述10种以上的基因为前述组织结构体的基因表达量相对于前述来自干细胞的内胚层、外胚层或中胚层细胞的基因表达量改变2倍以上的基因；以及，前述组织结构体的提取是：测定前述来自干细胞的内胚层、外胚层或中胚层细胞和前述培养形成物的基因表达量，选择具有10种以上前述培养形成物的基因表达量相对于前述来自干细胞的内胚层、外胚层或中胚层细胞的基因表达量改变2倍以上的基因的培养形成物。更优选的是，例如：使用全部基因片段被固定的DNA芯片对于前述来自干细胞的内胚层、外胚层或中胚层细胞与前述组织结构体的基因表达量进行分析时，前述10种以上的基因为组织结构体的基因表达量相对于前述来自干细胞的内胚层、外胚层或中胚层细胞的基因表达量改变2倍以上的全部基因。
进而，本发明的一实施方式的组织结构体的制作方法中，优选的是，前述多种功能为对于10种以上的蛋白质测定的蛋白质量，前述10种以上的蛋白质为组织结构体的蛋白量相对于前述来自干细胞的内胚层、外胚层或中胚层细胞的蛋白量改变20％以上的全部蛋白质；以及，前述组织结构体的提取是：测定前述来自干细胞的内胚层、外胚层或中胚层细胞和前述培养形成物的蛋白质量，选择具有10种以上前述培养形成物的蛋白质量相对于前述来自干细胞的内胚层、外胚层或中胚层细胞的蛋白质量改变2倍以上的蛋白质的培养形成物。
另外，本发明的一实施方式的组织结构体的制作方法中，前述共培养的工序优选包括：形成聚集体的工序；形成器官芽的工序；进而进行培养使器官芽成熟化的工序。在此基础上，在形成聚集体、形成器官芽、使器官芽成熟化的工序中，优选细胞彼此结合而聚集；在形成聚集体、形成器官芽、使器官芽成熟化的工序中，更优选细胞彼此结合而形成球状体形状的块。
本发明的一实施方式的组织结构体的制作方法中，前述细胞彼此形成的球状体的直径优选为50μm～2mm。前述来自干细胞的内胚层、外胚层或中胚层细胞优选为从来自人工多能性干细胞中选择的细胞，前述来自干细胞的内胚层、外胚层或中胚层细胞更优选为能够从来自人工多能性干细胞的细胞分化成内胚层系列的细胞的细胞。
另外，前述多种功能优选为肝脏或胰脏所特有的功能。
本发明的一实施方式的组织结构体的制作方法中，优选用当量直径为20μm以上且2.5mm以下、深度为20μm以上且1000μm以下的微容器培养前述组织结构体。在此基础上，优选使用培养表面为细胞非粘接表面的培养容器培养前述组织结构体。进而在此基础上，优选的是，前述培养容器的培养表面是与细胞接触的培养面且涂布有聚合物，所述聚合物包含从磷脂、磷脂·高分子复合物、聚甲基丙烯酸2-羟乙酯(PHEMA)、聚乙烯醇、琼脂糖、壳聚糖、聚乙二醇和白蛋白的组中选择的一种或者它们的组合。
本发明的一实施方式的组织结构体的制作方法中，优选的是，将血管细胞:来自干细胞的内胚层、外胚层或中胚层细胞:间充质细胞以10:7～10:1～2的比例进行共培养，并且以成为每1个微容器20个～2000个的密度接种细胞。另外，前述微容器是底部和开口部构成；前述开口部由包围自其与前述底部的边界至端部的区域的、锥角为1度以上且20度以下的壁构成；前述底部优选具有半球状与圆锥台的任一者的形状。
发明的效果
根据一实施方式，能够提供全面地捕捉最终分化的成熟细胞(由未分化细胞分化诱导的组织结构体)或生物体组织的蛋白表达、基因模式的组织结构体及其制作方法。
附图说明
图1是表示一实施方式的培养容器的一例的图。
图2是表示从横向观察一实施方式的凹部的形状例的截面图。
图3是表示从上面观察一实施方式的凹部的形状例的图。
图4是表示培养容器的其他形状例的图。
图5是图4所示的培养容器的沿V-V线的截面图。
图6是进一步表示培养容器的其他形状例的图。
图7是表示实施例的结果(散点图)的图。
具体实施方式
以下，一边参照附图一边对实施方式进行说明。为了使说明明确，以下的记载和附图被适宜地省略和简略化。各附图中，对于具有相同的构成或功能的构成要素和相当部分赋予相同的符号，省略其说明。
一实施方式的组织结构体是试验管内分化的成熟细胞或生物体组织，以来自成人体的(采集的)成熟细胞或生物体组织的基因表达模式的相似性作为指标而制作的。通过基因表达模式诱导出成熟细胞所具有的功能或成熟细胞所实现的功能，所以也可以将“基因表达模式”说成是“多种功能”。
在生理的器官发生过程中，脏器细胞具有与血管细胞和未分化的间充质细胞紧密的细胞间相互作用，伴随着自律的组织结构的构筑和细胞分化进行器官形成。
因此，一实施方式中，为了人为再现这样的器官发生的早期过程，通过利用多个细胞系谱的相互作用进行初期分化诱导，诱导了实现了初期分化的细胞的组织形成能力。接着，经由在培养容器内表现出成熟细胞所具有的多种功能的、分化的细胞或生物体组织例如组织·脏器的起源即器官芽(organ bud)，在培养容器内对细胞或生物体组织进行培养使之成熟，从而制作包括细胞和血管系统的组织。
*组织结构体的说明
一实施方式的组织结构体是从与血管细胞、间充质细胞、由血管细胞分泌的因子、由间充质细胞分泌的因子、由血管细胞与间充质细胞两者存在而分泌的因子所组成的组中选择至少一种细胞和/或因子一起，将来自干细胞的内胚层、外胚层或中胚层细胞进行共培养而得到的组织结构体。在此基础上，对于组织结构体的多种功能的值是使用皮尔逊积差相关系数(Pearson product-moment correlation coefficient)进行测定的值，相比于从胎儿采集的细胞或从胎儿采集的生物体组织更接近从成人体采集的细胞或从成人体采集的生物体组织的值。
组织结构体通过对至少二种(优选为三种)的细胞进行共培养，使之形成器官芽，进一步使器官芽成熟，对于多种功能，形成具有上述的特征的组织结构体。后面对器官芽进行叙述，是能够通过成熟而分化成器官的结构体。
本说明书中使用以下的术语。
“生物体组织(biological tissue)”是指某种确定的细胞以一定的模式集合而成的结构单元，作为整体具有一个总和的作用。例如，生物体内的各器官(脏器)是某种组织以确定的模式集合而构成的。本说明书中，将由分化的细胞构成且具有任意功能的细胞的集合(细胞群)称为组织。
对于“来自干细胞的内胚层、外胚层或中胚层细胞”(以下，称为“来自干细胞的三胚层细胞”)，以下进行说明。
干细胞是指：包括从来自人工多能性干细胞(iPS细胞)中选择的细胞，具有无限增殖性并且能够分化成内胚层、中胚层、外胚层的全部器官的细胞。
内胚层细胞是指能够分化成肝脏、胰脏、肠管、肺、甲状腺、副甲状腺、尿路等中胚层器官的细胞。
外胚层细胞是指能够分化成脑、脊髓、肾上腺髓质、表皮、毛发·指/趾甲·皮肤腺、感受器官、末梢神经、晶状体等外胚层系器官的细胞。
中胚层细胞是指能够分化成肾脏、尿管、心脏、血液、生殖腺、肾上腺皮质、肌肉、骨骼、真皮、结缔组织、中皮等中胚层系器官的细胞。
即，来自干细胞的三胚层细胞是指来自从iPS细胞中选择的细胞的、具有内胚层、外胚层或中胚层系器官的性质的细胞。
某种细胞是否为能够分化成外胚层性器官、中胚层性器官或内胚层性器官的细胞，可以通过调查成为标记物的蛋白质的表达来确认(只要标记蛋白质的任一者或多种表达，则可判定为能够分化成内胚层性器官的细胞。)。例如，能够分化成肝脏的细胞中，HHEX、SOX2、HNF4A、AFP、ALB等成为标记物；能够分化成胰脏的细胞中，PDX1、SOX17、SOX9等成为标记物；能够分化成肠管的细胞中，CDX2、SOX9等成为标记物；能够分化成肾脏的细胞中，SIX2、SALL1成为标记物；能够分化成心脏的细胞中，NKX2-5MYH6、ACTN2、MYL7、HPPA成为标记物；能够分化成血液的细胞中，C-KIT、SCA1、TER119、HOXB4成为标记物；能够分化成脑、脊髓的细胞中，HNK1、AP2、NESTIN等成为标记物。
“间充质细胞”是指主要存在于来自中胚层的结缔组织、形成以组织起作用的细胞的支撑结构的结缔组织细胞；决定着向间充质细胞的分化命运，也包括还没有向间充质细胞分化的细胞的概念。本发明中使用间充质细胞可以是分化的，也可以是未分化的。某细胞是否为未分化间充质细胞可以通过调查标记蛋白质例如Stro-1、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD133、CD271、Nestin是否表达来确认(只要前述标记蛋白质的任一者或多种表达，则能够判断为未分化间充质细胞。)。另外，前项的标记物均没有表达的间充质细胞可以判定为分化间充质细胞。本领域技术人员间所使用的术语中，间充质干细胞(mesenchymalstem cells)、间充质祖细胞(mesenchymal progenitor cells)、间充质细胞(mesenchymalcells)(R.Peters,et al.PLoS One.30；5(12):e15689.(2010))等包括在本发明的间充质细胞中。间充质细胞主要使用来自于人的细胞，但也可以使用来自除了人以外的动物，例如小鼠、大鼠、犬、猪、猴等动物的未分化间充质细胞。
“血管细胞”是指构成血管内皮的细胞或能够分化成这样的细胞的细胞。某种细胞是否为血管细胞可以通过调查标记蛋白质例如TIE2、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、CD41是否表达来确认(只要前述标记蛋白质的任一者或多种表达，则能够判定为血管细胞。)。本发明中使用的血管细胞可以是分化的，也可以是未分化的。血管细胞是否为分化的细胞可以通过CD31、CD144来确认。本领域技术人员间所使用的术语中，内皮细胞(endothelialcells)、脐静脉内皮细胞(umbilical vein endothelial cells)、内皮祖细胞(endothelial progenitor cells)、内皮前体细胞(endothelial precursor cells)、血管生成祖细胞(vasculogenic progenitors)、成血管细胞(hemangioblast)(HJ.joo,etal.Blood.25；118(8):2094-104.(2011))等包括于本发明的血管细胞中。血管细胞主要使用来自人的细胞，也可以使用来自人以外的动物，例如小鼠、大鼠、犬、猪、猴子等动物的血管细胞。
“器官芽”是指能够通过成熟而分化成器官的且包括来自干细胞的三胚层细胞、血管细胞和未分化间充质细胞或由它们分化的细胞的三种细胞的结构体。某种结构体是否为器官芽可以通过例如将该结构体向生物体移植，调查是否分化成目标器官(只要向目标器官分化，则能够判定为器官芽。)和/或该结构体是否包含所有的上述三种细胞(只要包含所有的三种细胞，则能够判定为器官芽。)来确认。器官芽可以为分化成例如肾脏、心脏、肺脏、脾脏、食道、胃、甲状腺、副甲状腺、胸腺、生殖腺、脑、脊髓等器官的器官芽等；但优选为分化成肝脏的器官芽(肝芽)、分化成胰脏的器官芽(胰芽)、分化成肠管的器官芽等分化成内胚层性器官的器官芽。某结构体是否为分化成内胚层性器官的器官芽可以通过调查成为标记物的蛋白质的表达来确认(只要后述的标记蛋白质的任一者或多种表达，则可判定为是器官芽。)。例如，肝芽中，HHEX、SOX2、HNF4A、AFP、ALB等成为标记物；胰芽中，PDX1、SOX17、SOX9等成为标记物；分化成肠管的器官芽中，CDX2、SOX9等成为标记物。本领域技术人员间所使用的术语中，肝脏芽(liver bud)、肝盲囊(liver diverticula)、肝细胞器(liverorganoid)、胰(脊背或腹部)芽(pancreatic(dorsal or ventral)buds)、胰腺憩室(pancreatic diverticula)、胰细胞器(pancreatic organoid)、肠道芽(intestinalbud)、肠憩室(intestinal diverticula)、肠细胞器(intestinal organoid)(K.Matsumoto,et al.Science.19；294(5542):559-63.(2001))等包括于本发明的器官芽中。
“从胎儿采集的细胞”是指从胎儿采集的细胞，所述胎儿是由受精卵产生的以某种形式与母亲的身体保持联系、从母体接受营养等供给而成长，充分发育之后而生下来的。例如，从胎儿采集的细胞包括：胎儿的肝脏的生物体组织、市售的胎儿肝细胞。
“从成人体采集的细胞”是指从充分成长且能够生殖的生物体采集的细胞。从成人体采集的细胞包括例如：市售的人初代肝细胞、生物体组织检查切片。
“从成人体采集的细胞或生物体组织”是由各社贩卖的来自人、动物的细胞。肝细胞可以从Charles River Laboratories International,Inc.和KAC Co.,Ltd.购买。
也可以从动物采集。例如，从大鼠、小鼠采集的情况下，有通过2阶段胶原酶灌流法分离肝细胞的方法。可以利用如下方法例如：为大鼠的情况下，通过门静脉插入插管，用加温至37度的磷酸盐缓冲液(前回流液)去除血液，接着用加温至37度的胶原酶溶液分解胶原而只回收细胞。
“从胎儿采集的细胞或生物体组织”有市售的物质。可以由细胞银行等买到。例如，可以从VERITAS Corporation.买到。
“相关系数(correlation coefficient)”是指表示2个随机变量间的相关(相似性的程度)的统计学的指标。原则上，没有单位，取从-1至1间的实数值，可以说接近1时，2个随机变量存在正相关；接近-1时存在负相关。接近0(零)时，原本的随机变量的相关弱。成为1或-1的情况下，2个随机变量存在线性相关关系。通常地，简单地称为相关系数，是指皮尔逊积差相关系数(Pearson product-moment correlation coefficient)。该测定中，存在假定偏差的正态分布的(参数的)方法，其他作为没有设置这样的假设的非参数的方法，通常使用斯皮尔曼秩相关系数(Spearman's rank correlation coefficient)、肯德尔秩相关系数(Kendall rank correlation coefficient)等。
“皮尔逊积差相关系数”是对2变量XY间的线性关系进行调查的结果。皮尔逊积差相关系数用小写字母r表现，取-1≤r≤1的范围。+(正号)是指正相关，表示由于一者增加而另一者也增加的正相关性。另外，为－(负号)的情况是指负相关，表示由于一者增加而另一者减少的负相关性。
*多种功能的说明
多种功能是指组织结构体所具有的功能，换言之，是能够由组织结构体检测到的功能。一实施方式中，使用例如能够通过基因表达量、蛋白质量测定的功能；特别是，使用由来自干细胞的三胚层细胞分化成组织结构体时变异的功能。具体而言，组织结构体所具有的功能中，可以使用将从胎儿采集的细胞和从成人体采集的细胞所具有的功能进行比较时，功能的量改变的功能。接着，组织结构体选择(提取)具有相比于从胎儿采集的细胞更接近从成人体采集的细胞的功能的量的结构体。
此处，从胎儿采集的细胞包括从胎儿采集的细胞及其生物体组织；从成人体采集的细胞包括从成人体采集的细胞及其生物体组织。
例如，多种功能可以使用10种以上的基因的表达量。
选择基因种的情况下，包含组织结构体的基因表达量相对于器官芽的基因表达量改变2倍以上的基因种。选择蛋白种的情况下，包含组织结构体的蛋白量相对于器官芽的蛋白量改变20％以上的蛋白种。
或者，10种以上的基因包含相对于来自干细胞的三胚层细胞的基因表达量，组织结构体的基因表达量改变2倍以上的基因。更具体而言，基因表达量应用使用全部基因片段被固定的DNA芯片进行分析而得到的值。并且，10种以上的基因包括组织结构体的基因表达量相对于来自干细胞的三胚层细胞的基因表达量改变2倍以上的全部基因。
使用10种以上的基因的表达量是用于通过基因的表达量来设定判定组织结构体由来自干细胞的三胚层细胞成熟的个数。
作为其他的例子，多种功能可以使用对于10种以上的蛋白质进行测定的蛋白质量。该情况下，对于来自干细胞的三胚层细胞和组织结构体的蛋白质量进行测定时，10种以上的蛋白质包括组织结构体的蛋白量相对于来自干细胞的三胚层细胞的蛋白质量改变20％以上的全部蛋白质。
需要说明的是，多种功能并不限定于上述的具体例。多种功能只要是能够用任意的装置测定功能的量、大小的功能、要素等即可。在此基础上，来自干细胞的三胚层细胞或器官芽分化·成熟成为组织结构体时，只要使功能的量、大小进行测定或分析的值(测定值、分析值)有所改变即可，特别是只要改变2倍以上的就为优选。
*对于多种功能的测定(检测)
对于多种功能，使用测定所采用的功能的机器进行测定。
基因表达量可以例如，使用基因微阵列分析装置进行分析。基因分析中，例如，可以使用作为基因分析法之一的用芯片的分析，一例用以下的URL进行介绍。
http://www.chem-agilent.com/contents.php？id＝1002411
http://www.gelifesciences.co.jp/newsletter/biodirect_mail/technical_tips/tips21.html(涉及GE的微阵列的原理说明)
蛋白质量可以例如使用蛋白质阵列分析装置进行测定。蛋白质分析中，一例用以下的URL进行介绍。
http://www.filgen.jp/Product/Bioscience2/index.htm
http://www.filgen.jp/Product/BioScience22-MS/index2.htm
在此基础上，目标脏器中特征地表达的基因、蛋白质已知的情况下，对于特定的基因表达量、蛋白质量进行分析，可以验证是否有2倍以上改变。目标脏器中特征的功能种优选存在10个以上。
更优选为用上述方法综合地进行分析而2倍以上改变的为10个以上。
组织结构体具有肝组织的性质的情况下，使用由Affymetrix社贩卖的DMET(注册商标)Plus，从肝组织的全部或部分的特征基因种中选择。
组织结构体包含胰脏的性质、特别是包含胰岛β细胞的情况下，可以从非专利文献4、5所列举的在胎儿和成人体组织中变异的全部或部分基因种或蛋白种中选择。
用上述的方法中对于多种功能的测定值(分析值)进行测定。对于测定中使用的基因表达量，可以使用通过将选择的基因的表达量除以管家基因的表达量、GAPDH(甘油醚-3-磷酸脱氢酶、glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、β-肌纤蛋白、β2-微球蛋白、HPRT 1(次黄嘌呤磷酸核糖转移酶、hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1)而归一化的值作为测定值(分析值)。另外，也可以将使用Shiftile法这样的方法归一化的值作为测定值(分析值)。对于本发明中使用的基因表达量，没有特别的记载的情况下，是指这样归一化的值。为蛋白质量的情况下，可以使用所选择的多种功能蛋白量除以白蛋白量的值、或者将所选择的多种功能的蛋白量除以总蛋白量的值作为测定值。
*组织结构体的制作方法
组织结构体通过与从血管细胞、间充质细胞、由血管细胞分泌的因子、由间充质细胞分泌的因子、由血管细胞和间充质细胞两者存在而分泌的因子所组成的组中选择至少一种细胞和/或因子一起，将来自干细胞的三胚层细胞进行共培养而制作。
详细而言，一实施方式的组织结构体的制作方法是例如：将至少二种(优选为三种)细胞进行共培养而形成分化的细胞，进一步继续共培养使形成的分化的细胞进一步成熟，得到培养形成物，生成多种功能。接着，从培养形成物中，提取具有多种功能的培养物作为组织结构体。
“共培养”通常是指将一起培养的2种或其以上的不同种类的细胞混合而培养细胞。
另外，一实施方式的共培养包括：形成聚集体的工序；对形成的聚集体进行共培养使之分化的工序；以及，进一步进行培养使分化的细胞成熟化的工序。此处，为了容易地进行说明，对聚集体进行共培养而形成器官芽，使器官芽成熟，从而制作组织结构体，以该情况作为一例进行说明。然而，如上所述，分化的细胞不限定于器官芽，可以说也包括使聚集体分化而形成的细胞、组织。
以下说明的共培养包括：(1)形成聚集体的工序；(2)形成器官芽的工序；和(3)进行培养使器官芽成熟化的工序。
以下，对于各工序进行说明。
(1)形成聚集体的工序(聚集体形成工序)
形成聚集体的工序形成作为来自干细胞的三胚层细胞而使用的聚集体。
作为聚集体的形成方法，已知有：作为悬滴法而已知的在液滴中形成球状体的方法；使用在培养容器底面具有纳米级的柱或网眼结构的凹凸的容器的方法；以边搅拌滚瓶边在培养基中使细胞悬浮的状态形成球状体的方法；在琼脂糖、基质胶等凝胶上进行培养的方法；进而，使用实施了细胞非粘接处理的培养容器静置而形成球状体的方法等各种各样的方法，可以使用其中任一者的方法。对于具体的手法，如各种文献中介绍的；例如，非专利文献5和非专利文献6所介绍的。
(2)形成器官芽的工序(器官芽形成工序)
形成器官芽的工序是对三种细胞即血管细胞、来自干细胞的三胚层细胞和间充质细胞进行共培养而形成器官芽。
对于共培养中的三种细胞的培养比，只要在能够形成器官芽的范围内，则没有特别的限定，优选的细胞的个数比为：来自干细胞的三胚层细胞:血管细胞:间充质细胞＝10:10～5:2～1。
另外，血管细胞和间充质细胞的任一者或两者也可以用如下物质代替：由血管细胞分泌的因子、由间充质细胞分泌的因子、由血管细胞与间充质细胞两者存在而分泌的因子等。
作为由血管细胞分泌的因子、由间充质细胞分泌的因子、由血管细胞与间充质细胞两者存在而分泌的因子等物质的例子，可例示出FGF2、FGF5、BMF4、BMP6、CTGF等，但并不限定于这些。
作为这些物质的添加量，对于FGF2，合适的为每1x106个细胞10～100ng/ml，优选为20ng/ml左右；对于BMF4，合适的为每1x106个细胞10～100ng/ml，优选为20ng/ml左右。
对于培养时使用的培养基，只要是能够形成组织结构体的培养基则可以是任何培养基，优选使用培养用的培养基、干细胞(ES细胞或iPS细胞培养用)培养用的培养基、将前述2种培养基混合而成的培养基等。作为血管细胞培养用的培养基，可以使用任一种培养基，优选使用包含hEGF(重组人上皮细胞生长因子)、VEGF(血管内皮细胞生长因子)、氢化可的松、bFGF、抗坏血酸、IGF1、FBS、抗生素(Antibiotics，例如，庆大霉素、两性霉素B等)、肝素(Heparin)、L-谷氨酰胺(L-Glutamine)、酚红(Phenolred)、BBE的至少一种培养基。作为血管细胞培养用的培养基，可以使用：EGM-2BulletKit(Lonza社制)、EGM BulletKit(Lonza社制)、VascuLife EnGS Comp Kit(LCT社制)、人内皮细胞-SFM基础生长培养基(HumanEndothelial-SFM Basal Growth Medium)(Invitrogen社制)、人微小血管内皮细胞増殖培养基(TOYOBO社制)等。来自干细胞的三胚层细胞培养用的培养基可以使用任一种培养基，目标的组织结构体为肝脏组织的情况下，优选使用肝细胞培养用的培养基，优选使用包含抗坏血酸(ascorbic acid)、BSA-FAF、胰岛素(insulin)、氢化可的松(hydrocortisone)、GA-1000至少一种的培养基，或者优选使用从作为肝细胞培养用的培养基市售的HCMBulletKit(Lonza社制)去除了hEGF(重组人上皮细胞生长因子)的培养基；向RPMI1640(Sigma-Aldrich社制)中添加了1％B27Supplements(GIBCO社制)和10ng/mL hHGF(Sigma-Aldrich社制)的培养基等。更优选使用的是，从GM BulletKit(Lonza社制)和HCMBulletKit(Lonza社制)中去除了hEGF(重组人上皮细胞生长因子)、以1:1混合，并向其中添加了地塞米松(Dexamethasone)、抑癌蛋白M(Oncostatin M)、HGF的培养基。
对于培养时的温度，没有特别的限定，优选设为30～40℃，更优选设为37℃。
对于培养时间，没有特别的限定，优选设为3～50天，更优选设为15天。
(3)进行培养使之成熟化的工序(成熟化工序)
成熟化工序中，使形成的器官芽成熟而形成培养形成物(组织结构体候补物：是指用下述组织结构体制作容器培养的培养形成物)。换言之，形成培养形成物，测定多种功能并将适当的(满足条件的)培养形成物作为组织结构体。
分别准备例如：与用于形成组织结构体而使用的培养容器(组织结构体制作容器)相同比例、比例下降或比例提高了的培养容器(试验容器)。试验容器的培养可以设为与组织结构体制作容器的情况相同的培养基的组成、接种密度、培养基更换频率、细胞与培养基量的比率。接着，使用用试验容器制作的培养形成物进行基因表达量的测定。多种功能是10种以上的基因的表达量，10种以上的基因提取组织结构体的基因表达量相对于来自干细胞的三胚层细胞的基因表达量改变2倍以上的基因。
对于提取的基因种，用于用试验容器制作的培养形成物、从胎儿采集的细胞或生物体组织、从成人体采集的细胞或生物体组织的基因表达量进行测定、判定。即，可以将用试验容器培养的培养形成物的判定结果替换为用组织结构体制作容器制作的培养形成物的判定结果。
上述是假定将细胞堆栈(cell stack)、烧瓶用于组织结构体制作容器，使用培养皿、小的烧瓶(24cm2)作为试验容器的情况。孔板的情况下，可以采取不同的孔作为试验容器(换言之，试验孔)。
成熟化工序中，使用的培养基优选使用所希望的组织用的培养基，优选将血管细胞用的培养基、干细胞用的培养基进行混合。
(4)对于判定方法
判定方法是对与成人体的相似性进行评价的方法，前提是具有与成人体接近的功能，因此从成人体采集的细胞或生物体组织与组织结构体的基因表达量表现出正相关。表现出负相关的情况下，判定为成熟化不充分且不接近成人体。即，必要条件是由成人体采集的细胞或生物体组织与组织结构体的基因表达量表现出正相关。以下的[a]、[b]之间，只要是能够得到[a]小于[b]且[b]小于1的关系(换言之，满足式[a]＜[b]＜1的关系)，则将组织结构体候补物认定为组织结构体。
[a]“由生物体采集的细胞或生物体组织的基因表达量”与“培养形成物(试验容器)的基因表达量”的相关系数为正，并且“从胎儿采集的细胞或生物体组织的基因表达量”与“培养形成物(试验容器)的基因表达量”的相关系数
[b]“由生物体采集的细胞或生物体组织的基因表达量”与“培养形成物(试验容器)的基因表达量”的相关系数
作为计算出皮尔逊相关系数的方法，为了有效地进行作业(例如，设想了测定数百基因这样的情况)，优选使用信息学(informatics)用的软件。作为软件，优选使用例如Genespring、Subio。或者可以使用Microsoft社的Excel software进行测定。
在器官芽形成工序和成熟化工序中，使用培养容器对聚集体(球状体)进行培养。另外，也可以在聚集体形成工序中使用培养容器，也可以在培养细胞或使之成熟的所有工序中使用培养容器。
聚集体形成工序、器官芽形成工序、成熟化工序中，优选细胞彼此结合而聚集。另外，聚集体形成工序、器官芽形成工序、成熟化工序中，优选细胞彼此结合而形成球状体形状的块。进而在此基础之上，细胞彼此形成的球状体的直径优选为50μm～2mm。
培养容器使用例如具有如下构成的容器。
＜培养容器＞
图1是表示一实施方式的培养容器的一例的图。图1中表示具有多个培养容器1的培养平板3的一部分。图1的上段表示从培养平板3的上面观察在培养容器1的底形成的多个凹部10的一部分的图。培养容器1配置有多个凹部10。从培养容器1的制造、细胞培养的效率的观点出发，多个凹部10优选规则地配置。培养容器1例如，相当于具有多个孔的孔板的一个孔。换言之，孔板的各孔配置有多个凹部10。
孔板是包含带有多个凹陷(穴或孔)的平板的实验·检查器具，利用各孔作为试验管或培养皿。孔的个数例如有6、24、96、384等，也有其以上的个数。孔的底除了平底或圆底之外，也有组合了多个细长的微管的形式的底(深孔板)。
图2、3是表示实施方式1的凹部的形状例的图。图2表示从横向观察一个凹部10时的截面图；图3表示从上面观察一个凹部10时的图。
各凹部10由底部11和开口部12构成。底部11是成为培养容器1的底的部分；开口部12是配置于底部11的上部的部分。将底部11与开口部12相接触的部分记载为边界。图2中，用符号R的箭头表示的长度的部分与边界的位置对应。另外，图3中，用双点划线表示边界的位置。其中，底部11与开口部12由连续的面构成而作为一体制造。
图2、3中，关于形成于培养容器1的多个凹部10，示出当量直径R、深度(高度)H。
当量直径R是指与凹部10的底部11内接的内切圆的直径。此处，是指在底部11与开口部12的边界内接的内切圆的直径。更详细而言，当量直径R是指在边界的、与凹部10的高度H的方向垂直的面的形状的内切圆的直径。
深度H是由底部11的内侧的底至凹部10的上端为止的长度。凹部10的上端与开口部12的端部(上端)相同。深度H是凹部10所形成的空间的深度。换言之，是由底部11所形成的空间的底至开口部12所形成的空间的上端为止的深度。图2中，除了凹部10的深度H之外，还示出了底部11的深度H1和开口部12的深度H2。
底部11形成培养细胞的空间(第1空间)。底部11具有例如半球状的形状。例如，可以使用将当量直径R作为直径的球形半分的形状。对于底部11的形状，不限定于半球状。
开口部12形成辅助地进行细胞的培养和回收的空间(第2空间)。开口部12由自其与底部11的边界至凹部10的端部(前端)的区域的、锥角为1度以上且20度以下的壁。构成开口部12的壁的锥角优选为5度以上且15度以下度以下，更优选为10度。其理由是因为，锥角如果过小，则回收时细胞不能由凹部转移至培养基；相反地如果过大，则在培养基更换中细胞脱离。
图2中，将锥角用符号θ1、θ2表示。图2、3所示的凹部10的形状例中，示出锥角θ1、θ2大致相同的情况。
底部11与开口部12的边界以当量直径R成为50μm以上且1mm以下的方式形成。想要供给营养至球状体的中心部为止的情况下，当量直径优选为50μm以上且500μm以下，更优选为100μm以上且500μm以下。
除此之外，由底部的底至端部为止的深度H以成为当量直径R的0.5倍以上且3倍以下的方式形成。优选的是，深度H为当量直径R的0.7倍以上且1.2倍以下，更优选为0.8～1倍。
另外，培养容器优选相邻的两个凹部10之间为平坦的。例如，两个凹部10的距离优选为5μm至50μm的范围。其理由是，具有防止细胞登上壁的上面、在那里细胞粘接而增殖从而阻碍球状体形成的效果。但是，距离薄的情况下，则有在细胞接种时、培养基更换时由于震动而容易产生龟裂的可能性。因此，优选为5μm以上。从这样的观点出发，优选为5～20μm。
在上述的形状的基础上，培养容器1优选如下制造。
培养容器1优选为包含丙烯酸系树脂、聚乳酸、聚乙醇酸、苯乙烯系树脂、丙烯酸·苯乙烯系共聚树脂、聚碳酸酯系树脂、聚酯系树脂、聚乙烯醇系树脂、乙烯·乙烯醇系共聚树脂、热塑性弹性体、氯乙烯系树脂和硅树脂中的一种或它们的组合的树脂成形品。
优选通过对培养容器1所具有的各凹部10实施等离子体处理、玻璃涂布、电晕放电、UV臭氧处理的任一者或者包括它们组合的表面改性处理方法而形成官能团，并以水接触角成为45度以下的方式进行处理。
除此之外，优选阻碍细胞向各凹部10粘接的亲水性聚合物链被固定化。亲水性的聚合物链更优选被固定化在以上述的水接触角成为45度以下的方式被处理的各凹部10。
进而在此基础上，磷脂或磷脂·高分子复合物优选被固定化在各凹部10。该固定化的处理更优选对以上述的水接触角成为45度以下的方式被处理的各凹部10、亲水性的聚合物链被固定化的各凹部10、或者将它们组合的各凹部10进行实施。
进而，更优选的是，通过对各凹部10进行等离子体处理、玻璃涂布、电晕放电、UV臭氧处理的任一者或包括它们组合的表面改性处理方法而形成官能团，处理成水接触角为45度以下之后，阻碍细胞粘接的亲水性的聚合物链以及磷脂或磷脂·高分子复合物中的任一种聚合物被固定化的细胞非粘接表面。该处理更优选与上述的各处理、或组合了各处理的处理一起实施。
另外，上述的亲水性的聚合物链优选为聚甲基丙烯酸羟乙酯，进而优选聚甲基丙烯酸羟乙酯的平均分子量为10万以上。
培养容器1除了上述的图1-3所示的培养容器之外，也可以使用形成了图4、5所示的微图案的培养容器。
图4表示一实施方式所使用的培养容器的其他的形状例。图5是图4所示的培养容器的V-V线的截面图。
培养容器30具有培养空间31、壁32和底部33。
培养空间31是用壁32和底部33分隔的区域，成为对细胞进行培养的三维的空间区域(培养区域)。培养空间31也简单地称为“空间”或“微空间”。
壁32是分隔培养空间31的隔壁，也可以说是在培养容器30形成凹凸图案的凸部。
底部33在作为培养容器30的基板发挥作用的同时，在配置有培养空间31一侧的表面成为培养区域(培养表面)的一部分。底部33是与例如图1的形成于培养平板的各孔的底部相同的区域，用作各孔的底部。底部33形成培养空间31的底。将底部33中的形成培养空间31的面的一部分且成为培养区域的底部的表面也称为“底部培养面34”。
图4、5中，关于培养容器30中形成的培养空间31，示出：当量直径D、高度(深度)H、壁32的宽度(厚度)W和底部33的厚度T。图4、5中示出了底部33与壁32作为一体制作的情况。
当量直径D与图2的当量直径R是同样的，是指与培养空间31内接的内切圆的直径。更详细而言，当量直径D是指与培养空间31的底部33平行的面的形状(正面的形状)，即与培养空间31的高度H的方向垂直的面的形状的内切圆的直径。培养空间31的正面的形状根据高度H而不同的情况下，将培养株化肝细胞的空间区域的最大值作为当量直径。
高度H是由培养空间31的底(底部培养面34)至壁32的上表面为止的长度，也可以说是培养空间31的深度。另外，底部培养面34为平面的情况下，高度H与壁32的高度相同。
壁32的宽度W是壁32的厚度，并且也可以说是与相邻的培养空间31间相间隔的距离。
培养容器30内(换言之，各孔内)，多个培养空间31如图4所示，配置成阵列状。包含于培养容器30的培养空间31的个数或大小依赖于培养平板所制作的孔的个数(孔的大小)、培养空间31和壁32的大小。图4、5中示出9个培养空间31。这是用于说明而示出的，而并非是对应于实际包含于培养容器30(各孔)的培养空间31的个数。
进而，作为培养容器，也可以使用图6所示的凹部20D。图6是示出底部为线状、换言之底部为没有形成空间的凹部20D的形状例。图6中，上部表示从上观察凹部20D的主视图，下部表示截面图。凹部20D是由开口部12构成的。
聚集体在上述的培养容器1的各凹部10内进行共培养。凹部10也记载为微容器。
在上述的事项的基础上，凹部10优选如下构成。
凹部10优选当量直径为20μm以上且2.5mm以下、深度为20μm以上且2.5mm以下。
优选使用培养表面为细胞非粘接表面的培养容器对组织结构体进行培养。
培养容器1的培养表面是与细胞接触的培养面且涂布有聚合物，所述聚合物是包括从磷脂、磷脂·高分子复合物、聚甲基丙烯酸2-羟乙酯(PHEMA)、聚乙烯醇、琼脂糖、壳聚糖、聚乙二醇和白蛋白的组中选择的一种或者包括它们的组合。
优选将血管细胞:来自干细胞的内胚层、外胚层或中胚层细胞:间充质细胞以10:7～10:1～2的比例进行共培养，并且以成为每1个凹部10(微容器)20个～2000个的密度接种细胞。
优选的是，凹部10由底部11和开口部12构成；开口部12由包围自其与底部11的边界至端部的区域的、锥角为1度以上且20度以下的壁构成；底部11具有半球状与圆锥台的任一者的形状。
如上方式制作的组织结构体可以应用于创新药筛选、再生医疗等。
进而，本发明还提供使用通过上述的方法制作的组织结构体，对药剂进行评价的方法。作为药剂的评价，可列举出例如：药物的候补化合物的药物代谢分布的预测、药效评价、毒性评价、药物相互作用评价等。
[实施例]
[实验方法]
(1)来自干细胞的三胚层细胞的制作
通过在无血清培养基中添加激活素而对人iPS细胞(来自人皮肤的TkDA3hiPSC克隆(由Koji Eto氏和Hiromitsu Nakauchi氏转让))进行培养，从而诱导了CXCR4和E-cadherin(E-钙粘着蛋白)双阳性的内胚层系细胞。通过添加BMP4、FGF2对得到的内胚层系细胞进行2天培养，由此得到CXCR4阴性HNF4α阳性的肝脏内胚层群。CXCR4和HNF4α的表达按照Hepatology,51(1),297-305,2010的记载，通过免疫染色和基因表达分析进行确认。
(2)组织结构体的制作
细胞接种比例：将得到的肝脏内胚层细胞与血管内皮细胞(来自人脐带血的静脉内皮细胞)(Lonza、Basel、Switzerland)和未分化间充质细胞(人间充质干细胞)(Lonza、Basel、Switzerland)分别以10:5-10:2的比例进行混合，从而制作细胞溶液。使用对血管内皮细胞和未分化间充质细胞分别进行了荧光标记的细胞。
培养基：培养液使用内皮细胞培养基试剂盒-2：EGM-2Bullet Kit(产品代码CC-3162：Lonza)或者内皮细胞培养基试剂盒：EGM Bullet Kit(产品代码CC-3124：Lonza)。
培养方法：实施例和比较例均使用上述的细胞溶液和培养基。
＜实施例＞
图1～3中，使用具有当量直径为500μm、深度为500μm的凹部(空间)的24孔板的培养容器。为了抑制细胞粘接性，对细胞所接触的培养表面涂布p-HEMA。
进行了3天～15天培养而形成聚集体。在培养第15天，回收聚集体(培养形成物)进行基因表达分析。此时，聚集体为2mm以下。
＜比较例＞
使用涂布了基质胶(Matrigel)的φ3cm培养皿。
在进行了原液乃至2倍稀释的基质胶(BD pharmingen)的固相化的培养皿上接种细胞悬浮液。
进行了3天～15天培养而形成聚集体。如果在聚集体的大小成为2mm以上时继续培养，则中心部没有被供给营养成分而坏死，由此在聚集体的直径达到2mm的时点结束培养。对于这样制作的培养形成物进行基因表达分析。
(3)多种功能的测定
1、多种功能的值的选择
使用由细胞银行买到的iPS细胞、来自10周龄胎儿的肝细胞和来自30岁的成人的肝细胞，使用GeneChip(Agilent Technologies Co.,Ltd.；全部人类基因组(Whole HumanGenome DNA)微阵列4x44K v2G4845A)对基因表达量综合地进行分析(以下，将来自成人体的肝细胞的基因表达量的值作为“值B”；将来自胎儿的肝细胞的基因表达量的值作为“值C”)。对于基因表达量随着成熟(iPS细胞→来自胎儿的肝细胞→来自成人体的肝细胞)而上升的人所表达的基因种70基因进行提取(表1-1～表1-3)。进而，计算出按照专利文献3制作的肝芽的基因表达量(值A)和实施例的组织结构体的基因表达量(值D)。分别提取值D相对于值A上升2倍以上、10倍以上和100倍以上的基因种(表2-1、表2-2)。上升10倍以上的基因为49基因。上升2倍以上的基因种为61种，上升100倍以上的基因种为38基因。
[表1-1]
[表1-2]
[表1-3]
[表2-1]
[表2-2]
2、来自成人体的肝细胞的基因表达量的计算
值A、B、C和D使用上述的“1、多种功能的值的选择”项中所使用的值。测定比较例的各种基因表达量(值E)。需要说明的是，此处所说的基因表达量是指将由各样品得到的阵列结果(总雾度的值)用75％shiftile值(百分之75的值)进行校正、标准化而得到的值。
图7中示出对于实施例和比较例，来自生物体的肝细胞、来自胎儿的肝细胞的49基因的基因表达量的值的一部分。
测定
对于表1-1～表1-3所示的49基因，求出各种基因表达量，使用GeneSpring计算出皮尔逊积差相关系数。
(4)结果
＜实施例＞
改变10倍以上的基因 49基因
(值C)与(值D)的相关系数为0.4757
(值B)与(值D)的相关系数为0.6314
图7示出分布图。
由此，值B的成人体的肝细胞接近1，所以可以认定为组织结构体。
＜比较例＞
改变10倍以上的基因 49基因
(值C)与(值E)的相关系数为-0.5000
(值B)与(值E)的相关系数为-0.3496
从生物体采集的细胞的基因表达量(值B)与比较例的基因表达量的相关系数表示负相关。由此，不满足作为必要条件的“正相关”的条件，不能认定为组织结构体。
该申请以2013年6月10日申请的日本专利申请2013-122190为基础，主张优先权，将其全部内容援引至此。
附图标记说明
1、30 培养容器
3 培养平板
10、20D 凹部
11 底部
12 开口部
31 培养空间
32 壁
33 底部
34 底部培养面

Claims (11)

1.一种组织结构体，其是通过使用培养表面为细胞非粘接表面的培养容器将来自人工多能性干细胞的肝脏内胚层细胞与血管内皮细胞以及间充质干细胞进行共培养而得到的，
其中所述肝脏内胚层细胞：血管内皮细胞：间充质干细胞是以10：5～10：1～2的比例进行共培养，并且以成为每1个微容器20个～2000个的密度接种细胞，
对于多种功能使用皮尔逊积差相关系数测定出的值，所述组织结构体的该值相比于从胎儿采集的细胞或生物体组织更接近从成人体采集的细胞或生物体组织的值，
所述组织结构体为球状体形状，球状体的直径为50μm～2mm，
所述多种功能为选自VKORC1、UBD、TNFSF10、TDO2、TAP1、STARD10、SORD、SMPDL3A、SERPING1、SARDH、RGN、PXMP2、PSMB9、PSMB8、PNPLA7、PLG、ORM2、ORM1、NFIC、MX1、MGLL、MAT1A、MAGIX、LRG1、KNG1、KLF9、ITIH4、IL13RA1、IGFBP4、IFIT1、HSD3B7、HRG、HP、HGD、HAMP、HAAO、G0S2、FTCD、FGGY、FBP1、F12、ETFDH、ENTPD8、DHRS1、DEFB1、CTSO、CLDN2、CFI、CFH、CFB、CES2、C3、APOC3、ANG、ALDOB、ALDH3A2、ALAS1、ACOX1、ACAT1、ABCC3和ABCA6所述的61种具有2倍改变倍率的基因中的基因表达水平，并且所选择的基因包括VKORC1、UBD、TNFSF10、TDO2、TAP1、SORD、SERPING1、PXMP2、PSMB9、PSMB8、PNPLA7、PLG、ORM2、ORM1、NFIC、MX1、MGLL、MAT1A、LRG1、KNG1、KLF9、ITIH4、IL13RA1、IGFBP4、IFIT1、HSD3B7、HRG、HP、HGD、HAMP、G0S2、FGGY、FBP1、F12、ETFDH、DEFB1、CTSO、CLDN2、CFI、CFH、CFB、C3、APOC3、ANG、ALDOB、ALDH3A2、ACAT1、ABCC3和ABCA6所述的49种具有10倍改变倍率的基因。
2.根据权利要求1所述的组织结构体，其特征在于，
所述基因中每一个的表达量为使用全部基因片段被固定的DNA芯片进行分析而得到的值。
3.根据权利要求1或2所述的组织结构体，其特征在于，所述多种功能为肝脏所特有的功能。
4.一种组织结构体的制作方法，
通过使用培养表面为细胞非粘接表面的培养容器将来自人工多能性干细胞的肝脏内胚层细胞与血管内皮细胞以及间充质干细胞进行共培养而制作培养形成物，
其中所述肝脏内胚层细胞：血管内皮细胞：间充质干细胞是以10：5～10：1～2的比例进行共培养，并且以成为每1个微容器20个～2000个的密度接种细胞，
关于所述培养形成物所具有的多种功能，使用皮尔逊积差相关系数进行测定，
提取测定的值相比于从胎儿采集的细胞或生物体组织更接近从成人体采集的细胞或生物体组织的值的培养形成物作为组织结构体，其中
用当量直径为20μm以上且2.5mm以下、深度为20μm以上且1000μm以下的微容器培养所述组织结构体，
所述微容器由底部和开口部构成，
所述开口部由包围自其与所述底部的边界至端部的区域的、锥角为1度以上且20度以下的壁构成，
所述底部具有半球状和圆锥台的任一者的形状，
所述多种功能为选自VKORC1、UBD、TNFSF10、TDO2、TAP1、STARD10、SORD、SMPDL3A、SERPING1、SARDH、RGN、PXMP2、PSMB9、PSMB8、PNPLA7、PLG、ORM2、ORM1、NFIC、MX1、MGLL、MAT1A、MAGIX、LRG1、KNG1、KLF9、ITIH4、IL13RA1、IGFBP4、IFIT1、HSD3B7、HRG、HP、HGD、HAMP、HAAO、G0S2、FTCD、FGGY、FBP1、F12、ETFDH、ENTPD8、DHRS1、DEFB1、CTSO、CLDN2、CFI、CFH、CFB、CES2、C3、APOC3、ANG、ALDOB、ALDH3A2、ALAS1、ACOX1、ACAT1、ABCC3和ABCA6所述的61种具有2倍改变倍率的基因中的基因表达水平，并且所选择的基因包括VKORC1、UBD、TNFSF10、TDO2、TAP1、SORD、SERPING1、PXMP2、PSMB9、PSMB8、PNPLA7、PLG、ORM2、ORM1、NFIC、MX1、MGLL、MAT1A、LRG1、KNG1、KLF9、ITIH4、IL13RA1、IGFBP4、IFIT1、HSD3B7、HRG、HP、HGD、HAMP、G0S2、FGGY、FBP1、F12、ETFDH、DEFB1、CTSO、CLDN2、CFI、CFH、CFB、C3、APOC3、ANG、ALDOB、ALDH3A2、ACAT1、ABCC3和ABCA6所述的49种具有10倍改变倍率的基因。
5.根据权利要求4所述的组织结构体的制作方法，其特征在于，所述共培养的工序包括：
形成聚集体的工序；
形成器官芽的工序；和
进一步进行培养使器官芽成熟化的工序。
6.根据权利要求5所述的组织结构体的制作方法，其特征在于，形成聚集体、形成器官芽、使器官芽成熟化的工序中，细胞彼此结合而聚集。
7.根据权利要求5所述的组织结构体的制作方法，其特征在于，形成聚集体、形成器官芽、使器官芽成熟化的工序中，细胞彼此结合而形成球状体形状的块。
8.根据权利要求7所述的组织结构体的制作方法，其特征在于，所述细胞彼此形成的球状体的直径为50μm～2mm。
9.根据权利要求4～8中任一项所述的组织结构体的制作方法，其特征在于，所述肝脏内胚层细胞来自人工多能性干细胞。
10.根据权利要求4～8中的任一项所述的组织结构体的制作方法，其特征在于，所述多种功能为肝脏所特有的功能。
11.根据权利要求4～8中任一项所述的组织结构体的制作方法，其特征在于，所述培养容器的培养表面是与细胞接触的培养面且涂布有聚合物，所述聚合物包含从磷脂、磷脂-高分子复合物、聚甲基丙烯酸2-羟乙酯(PHEMA)、聚乙烯醇、琼脂糖、壳聚糖、聚乙二醇和白蛋白的组中选择的一种或者它们的组合。
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