KR102202160B1

KR102202160B1 - 조직 구조체 및 그 제작 방법

Info

Publication number: KR102202160B1
Application number: KR1020157028227A
Authority: KR
Inventors: 요코 에지리; 사토루 아야노; 나오토 후쿠하라; 히데키 다니구치; 다카노리 다케베
Original assignee: 주식회사 쿠라레; 고리츠다이가쿠호진 요코하마시리츠다이가쿠
Priority date: 2013-06-10
Filing date: 2014-06-09
Publication date: 2021-01-12
Also published as: CN105283545B; JP6400575B2; JPWO2014199622A1; EP3633030A1; AU2014279568A1; AU2014279568B2; EP3009506A4; WO2014199622A1; US20160122722A1; SG11201508747XA; KR20160018460A; PL3009506T3; US11060065B2; EP3009506B1; CA2913559A1; CN105283545A; CA2913559C; EP3009506A1

Abstract

성숙 세포의 유전자 패턴을 포괄적으로 파악하는 조직 구조체 및 그 제작 방법을 제공한다. 조직 구조체는, 혈관 세포, 간엽계 세포, 혈관 세포로부터 분비되는 인자, 간엽계 세포로부터 분비되는 인자, 혈관 세포와 간엽계 세포의 양방이 존재함으로써 분비되는 인자로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 세포 및/또는 인자와 함께, 간세포 유래의 내배엽, 외배엽 또는 중배엽 세포를 공배양하여 얻어지는 조직 구조체로서, 복수의 기능에 대하여 피어슨의 적률 상관 계수 (Pearson product-moment correlation coefficient) 를 사용하여 검정한 값이, 태아로부터 채취된 세포 또는 생체 조직보다, 성체로부터 채취된 세포 또는 생체 조직으로 구성된다.

Description

조직 구조체 및 그 제작 방법 {TISSUE STRUCTURE AND MANUFACTURING METHOD THEREFOR}

본 발명은 간세포, 예를 들어 인공 다능성 간세포나 배아성 간세포 등의 미분화 세포로부터 성숙 조직에 필적하는 기능을 갖는 조직 구조체 및 그 제작 방법에 관한 것이다.

최근, 여러 가지 기능 세포로 분화되는 능력을 갖는 예를 들어 iPS 세포와 같은 다능성 간세포를, 목적 장기 또는 세포에 특유의 기능을 갖는 세포로 분화시켜, 그것을 신약 개발 스크리닝이나 재생 의료에 이용하는 시도가 행해지고 있다 (예를 들어, 비특허문헌 1). 그러나, 생체내 (in vivo) 의 기능의 일부가 재현되어 있는 것에 불과하여, 그 기능은 생체 내의 기능에 비해 현격히 낮다.

신약 개발 스크리닝 시험에 있어서는, 생체 내에서의 시험, 이른바 in vivo 시험과 동일한 약제 감수성, 독성 반응을 나타낼 것이 요구된다. 이와 같은 용도에서 이용하기 위해서는, 상기 서술한 선행 기술로는 불충분하여, 보다 성숙화된, 즉 생체 내의 세포가 갖는 기능에 필적하는 레벨의 기능이 발현되어 있는 세포가 요구되고 있다.

재생 의료 분야에서는 장기 이식이나 인공 장기 이식이 행해지고 있지만, 도너 부족이나 거절 반응과 같은 문제가 존재한다. 예를 들어, 위독한 장기 부전에 대해, 임상 현장에 있어서는 장기 이식이나 인공 장기에 의한 치환 치료가 행해지고 있다. 그러나, 장기 이식에 대해서는 거절 반응이나 절대적인 도너 부족이 존재하고, 인구 (人口) 장기에 대해서는 기능의 일부만을 단기간 대체할 수 있는 것에 불과한 등 (예를 들어, 특허문헌 1, 2), 근본적인 미해결 과제가 남아 있다. 인간 조직의 인위적 창출에 대해서는, 종말 분화된 세포를 사용하여 단체 (單體) (족장 (足場) 재료) 로의 세포 파종을 실시하는 방법 등이 고안되어 있기는 하지만, 간장 등의 복잡한 고차 기능을 갖는 장기에 대해서는 확립된 수법은 존재하지 않는 것이 현 상황이다 (비특허문헌 2).

이와 같이 최종 분화된 성숙 세포 또는 생체 조직이 요구되고 있지만, 아직 달성되지 않은 것이 현 상황이다. 예를 들어, 간 기능에 대해서 성체와 종래의 분화 세포를 비교한 예를 이하에 서술한다.

간세포의 약물 대사 효소의 하나인 시토크롬 P450 은 57 종류의 유전자가 있는 것으로부터도 알 수 있는 바와 같이, 세포는 매우 많은 기능을 가지고 있다. 이들이 동시에 또는 필요에 따라 기능함으로써 생명을 유지하고 있다.

또, 간세포에 대해서는 80 에나 달하는 유전자의 발현량이 태아기로부터 성체가 되어 감에 따라서 증가하는 것이 확인되어 있다. 또한, 췌장에 대해서는, 비특허문헌 3, 4 에, 발생 과정에 있어서, 세포가 성숙됨에 따라 유전자 발현 프로파일이 변화하는 것이 나타나 있다.

일본 공개특허공보 평9-56814호 일본 공개특허공보 2004-166717호 국제 공개 제2013/047639호 국제 공개 제2007/058105호 국제 공개 제2008/066199호

Maya Schuldiner 외 저술, "Effects of eight growth factors on the differentiation of cells derived from human embryonic stem cells", PNAS, 97 vol 21, 2000년 10월 10일 (Published online), pp.11307-11312 Basak E Uygun 외 저술, "Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix", Nat Med, 16(7), 2010년 6월 13일 (Published online), pp.814-820 Marta Szabat 외 저술, "Kinetics and genomic profiling of adult human and mouse β-cell maturation", Islets 3 : 4, July/August 2011, pp.175-187 Guoqiang Gu 외 저술, "Global expression analysis of gene regulatory pathways during endocrine pancreatic development" Research article, 2003년 9월 30일, pp.165-178 Francesco Pampaloni 외 저술, "The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue", Nature reviews molecular cell biology volume 8, 2007년 10월, pp.839-845 Markus Rimann 외 저술, "Synthetic 3D multicellular systems for drug development" Current Opinion in Biotechnology 2012 23, 2012년, pp.1-7

그러나, 예를 들어 특허문헌 3 에 기재된 기관원기, 특허문헌 4 에 기재된 미분화 세포로부터 췌도 세포를 유도하는 방법, 특허문헌 5 에 기재된 미분화 세포로부터 인슐린 분비 세포로의 유도 방법 등이 개시되어 있지만, 모두 세포 기능의 일부의 기능에 주목하여 한정된 수의 평가 지표에 대해서 분화의 유무가 판단되고 있다. 따라서, 이와 같은 세포나 장기는, 상기와 같이 많은 유전자 패턴을 발현시키고 있는, 이른바 성숙 레벨이라고 단정할 수 없다.

그 때문에, 종래의 평가 지표에 의해 판정된 세포나 장기를 사용하여 약의 작용 효과나 독성 등을 판정하는 경우, 생체 내의 반응을 정확하게 예측할 수 없다는 문제나, 인공 장기가 충분히 기능하지 않는다는 문제가 발생한다.

발명자들은 상기 서술한 문제를 회피하려면, 이들 최종 분화된 성숙 세포 또는 생체 조직의 단백질 발현이나 유전자 패턴을 포괄적으로 파악하는 것이 중요하다는 것을 발견하였다.

우리는 최종 분화된 성숙 세포 또는 생체 조직의 단백질 발현이나 유전자 발현 패턴의 유사성을 지표로 한 새로운 조직 구조체 및 그 제작 방법을 발명하기에 이르렀다.

본 발명의 일 실시형태에 관련된 조직 구조체는, 혈관 세포, 간엽계 세포, 혈관 세포로부터 분비되는 인자, 간엽계 세포로부터 분비되는 인자, 혈관 세포와 간엽계 세포의 양방이 존재함으로써 분비되는 인자로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 세포 및/또는 인자와 함께, 간세포 유래의 내배엽, 외배엽 또는 중배엽 세포를 공배양하여 얻어지는 조직 구조체로서, 복수의 기능에 대하여 피어슨의 적률 상관 계수 (Pearson product-moment correlation coefficient) 를 사용하여 검정한 값이, 태아로부터 채취된 세포 또는 생체 조직보다, 성체로부터 채취된 세포 또는 생체 조직의 값에 가까운 조직 구조체이다.

또, 본 발명의 일 실시형태에 관련된 조직 구조체에 있어서, 상기 복수의 기능이, 10 종류 이상의 유전자의 발현량이고, 상기 10 종류 이상의 유전자가, 상기 간세포 유래의 내배엽, 외배엽 또는 중배엽 세포의 유전자 발현량에 대해, 상기 조직 구조체의 유전자 발현량이 2 배 이상 변동되는 유전자인 것이 바람직하다. 예를 들어, 유전자 발현량이, 모든 유전자 단편이 고정되어 있는 DNA 칩을 사용하여 해석된 값이고, 상기 10 종류 이상의 유전자가, 상기 간세포 유래의 내배엽, 외배엽 또는 중배엽 세포의 유전자 발현량에 대해, 상기 조직 구조체의 유전자 발현량이 2 배 이상 변동되는 모든 유전자인 것이 보다 바람직하다.

또한, 본 발명의 일 실시형태에 관련된 조직 구조체에 있어서, 상기 복수의 기능이, 10 종류 이상의 단백질에 대하여 측정한 단백질량이고, 상기 10 종류 이상의 단백질이, 상기 간세포 유래의 내배엽, 외배엽 또는 중배엽 세포의 단백질량에 대해 상기 조직 구조체의 단백질량이 20 ％ 이상 변동되는 모든 단백질인 것이 바람직하다. 상기 조직 구조체가 스페로이드 형상이고, 스페로이드의 직경이 50 ㎛ ∼ 2 ㎜ 인 것이 보다 바람직하다.

또, 상기 복수의 기능이, 간장 또는 췌장에 특유의 기능인 것이 바람직하다.

본 발명의 일 실시형태에 관련된 조직 구조체의 제작 방법은, (1) 혈관 세포, 간엽계 세포, 혈관 세포로부터 분비되는 인자, 간엽계 세포로부터 분비되는 인자, 혈관 세포와 간엽계 세포의 양방이 존재함으로써 분비되는 인자로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 세포 및/또는 인자와 함께, 간세포 유래의 내배엽, 외배엽 또는 중배엽 세포를 공배양하여 배양 형성물을 제작하고, (2) 상기 배양 형성물이 갖는 복수의 기능에 관하여 피어슨의 적률 상관 계수 (Pearson product-moment correlation coefficient) 를 사용하여 검정하고, (3) 검정한 값이, 태아로부터 채취된 세포 또는 생체 조직보다, 성체로부터 채취된 세포 또는 생체 조직의 값에 가까운 배양 형성물을 조직 구조체로서 추출한다.

또, 본 발명의 일 실시형태에 관련된 조직 구조체의 제작 방법에 있어서, 상기 복수의 기능이, 10 종류 이상의 유전자의 발현량이고, 상기 10 종류 이상의 유전자가, 상기 간세포 유래의 내배엽, 외배엽 또는 중배엽 세포의 유전자 발현량에 대해, 상기 조직 구조체의 유전자 발현량이 2 배 이상 변동되는 유전자인 것, 및 상기 조직 구조체의 추출이, 상기 간세포 유래의 내배엽, 외배엽 또는 중배엽 세포 및 상기 배양 형성물의 유전자 발현량을 측정하고, 상기 간세포 유래의 내배엽, 외배엽 또는 중배엽 세포의 유전자 발현량에 대해, 상기 배양 형성물의 유전자 발현량이 2 배 이상 변동되는 유전자를 10 종류 이상 갖는 배양 형성물을 선택하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 상기 간세포 유래의 내배엽, 외배엽 또는 중배엽 세포와 상기 조직 구조체의 유전자 발현량을, 모든 유전자 단편이 고정되어 있는 DNA 칩을 사용하여 해석했을 때, 상기 10 종류 이상의 유전자가, 상기 간세포 유래의 내배엽, 외배엽 또는 중배엽 세포의 유전자 발현량에 대해, 조직 구조체의 유전자 발현량이 2 배 이상 변동되는 모든 유전자인 것이 보다 바람직하다.

또한, 본 발명의 일 실시형태에 관련된 조직 구조체의 제작 방법에 있어서, 상기 복수의 기능이, 10 종류 이상의 단백질에 대하여 측정한 단백질량이고, 상기 10 종류 이상의 단백질이, 상기 간세포 유래의 내배엽, 외배엽 또는 중배엽 세포의 단백질량에 대해 조직 구조체의 단백질량이 20 ％ 이상 변동되는 모든 단백질인 것, 및 상기 조직 구조체의 추출이, 상기 간세포 유래의 내배엽, 외배엽 또는 중배엽 세포 및 상기 배양 형성물의 단백질량을 측정하고, 상기 간세포 유래의 내배엽, 외배엽 또는 중배엽 세포의 단백질량에 대해, 상기 배양 형성물의 단백질량이 2 배 이상 변동되는 단백질을 10 종류 이상 갖는 배양 형성물을 선택하는 것이 바람직하다.

또, 본 발명의 일 실시형태에 관련된 조직 구조체의 제작 방법에 있어서, 상기 공배양의 공정이, 응집체를 형성시키는 공정, 기관원기를 형성시키는 공정, 추가로 배양을 실시하여 성숙화시키는 공정을 포함하는 것이 바람직하다. 게다가, 응집체, 기관원기, 성숙화시키는 공정에 있어서, 세포끼리가 결합하여 응집되어 있는 것이 바람직하고, 응집체, 기관원기, 성숙화시키는 공정에 있어서, 세포끼리가 결합하여 스페로이드 형상의 덩어리가 형성되어 있는 것이 보다 바람직하다.

본 발명의 일 실시형태에 관련된 조직 구조체의 제작 방법에 있어서, 상기 세포끼리가 형성하는 스페로이드의 직경이 50 ㎛ ∼ 2 ㎜ 인 것이 바람직하다. 상기 간세포 유래의 내배엽, 외배엽 또는 중배엽 세포가, 배아성 간세포 (胎生幹細胞) 또는 인공 다능성 간세포 유래에서 선택되는 세포인 것이 바람직하고, 상기 간세포 유래의 내배엽, 외배엽 또는 중배엽 세포가, 인공 다능성 간세포 유래의 세포로부터 내배엽 계열의 세포로 분화 가능한 세포인 것이 보다 바람직하다.

본 발명의 일 실시형태에 관련된 조직 구조체의 제작 방법에 있어서, 상기 조직 구조체를, 상당 직경이 20 ㎛ 이상 2.5 ㎜ 이하, 깊이가 20 ㎛ 이상 1000 ㎛ 이하의 마이크로 용기에서 배양하는 것이 바람직하다. 게다가, 상기 조직 구조체를, 배양 표면이 세포 비접착 표면인 배양 용기를 사용하여 배양하는 것이 바람직하다. 게다가 또한, 상기 배양 표면이, 인지질, 인지질ㆍ고분자 복합체, 폴리(2-하이드록시에틸메타크릴레이트) (PHEMA), 폴리비닐알코올, 아가로오스, 키토산, 폴리에틸렌글리콜, 및 알부민, 의 그룹에서 선택되는 1 개 또는 이들 조합으로 이루어지는 폴리머가 세포와 접촉하는 배양면에 코트되어 있는 배양 용기인 것이 바람직하다.

본 발명의 일 실시형태에 관련된 조직 구조체의 제작 방법에 있어서, 혈관 세포 : 간세포 유래의 내배엽, 외배엽 또는 중배엽 세포 : 간엽계 세포를, 10 : 7 ∼ 10 : 1 ∼ 2 의 비율로 공배양하고, 또한 마이크로 용기 1 개당 20 개 ∼ 2000 개가 되는 밀도로 세포를 파종하는 것이 바람직하다. 또, 상기 마이크로 용기가, 바닥부와 개구부로 구성되어 있고, 상기 개구부가, 상기 바닥부와의 경계에서부터 단부 (端部) 까지를 둘러싸는 테이퍼각 1 도 이상 20 도 이하의 벽으로 구성되며, 상기 바닥부가, 반구상과 원뿔대 중 어느 형상을 갖는 것이 바람직하다.

일 실시형태에 의하면, 최종 분화된 성숙 세포 (미분화 세포로부터 분화 유도된 조직 구조체) 또는 생체 조직의 단백질 발현이나 유전자 패턴을 포괄적으로 파악하는 조직 구조체 및 그 제작 방법을 제공할 수 있다.

도 1 은 일 실시형태의 배양 용기의 일례를 나타내는 도면이다.
도 2 는 일 실시형태의 오목부를 옆에서 본 형상예를 나타내는 단면도이다.
도 3 은 일 실시형태의 오목부를 위에서 본 형상예를 나타내는 도면이다.
도 4 는 배양 용기의 다른 형상예를 나타내는 도면이다.
도 5 는 도 4 에 나타내는 배양 용기의 V-V 선 단면도이다.
도 6 은 배양 용기의 또 다른 형상예를 나타내는 도면이다.
도 7 은 실시예의 결과 (산포도) 를 나타내는 도면이다.

이하, 실시형태에 대하여 도면을 참조하면서 설명한다. 설명의 명확화를 위해, 이하의 기재 및 도면은 적절히 생략 및 간략화가 이루어져 있다. 각 도면에 있어서 동일한 구성 또는 기능을 갖는 구성 요소 및 상당 부분에는 동일한 부호를 붙이고, 그 설명은 생략한다.

일 실시형태에 관련된 조직 구조체는, 시험관 내에서 분화시킨 성숙 세포 또는 생체 조직으로서, 성체에서 유래하는 (채취한) 성숙 세포 또는 생체 조직의 유전자 발현 패턴의 유사성을 지표로 하여 제작한다. 유전자 발현 패턴에 의해, 성숙 세포가 갖는 기능 또는 성숙 세포가 실현시키는 기능이 유도되는 것으로부터, 「유전자 발현 패턴」을 「복수의 기능」이라고 바꾸어 말할 수도 있다.

생리적인 기관 발생 과정에 있어서, 장기 세포가 혈관 세포 및 미분화 간엽계 세포와 밀접한 세포간 상호 작용을 가짐으로써, 자율적인 조직 구조의 구축과 세포 분화를 수반하는 기관 형성이 진행된다.

그래서, 일 실시형태에서는, 이와 같은 기관 발생의 조기 프로세스를 인위적으로 재현함으로써, 복수의 세포 계보에 의한 상호 작용을 통한 초기 분화 유도를 실시하여, 초기 분화를 이룬 세포의 조직 형성 능력을 유도한다. 그리고, 배양 용기 내에서 성숙 세포가 갖는 복수의 기능을 발현하는, 분화시킨 세포 또는 생체 조직, 예를 들어 조직ㆍ장기의 기원이 되는 기관원기 (organ bud) 를 경유하여 배양 용기 내에서 세포 또는 생체 조직을 배양하여 성숙시켜, 세포와 혈관계로 이루어지는 조직의 제작을 실시하는 것이다.

* 조직 구조체의 설명

일 실시형태의 조직 구조체는, 혈관 세포, 간엽계 세포, 혈관 세포로부터 분비되는 인자, 간엽계 세포로부터 분비되는 인자, 혈관 세포와 간엽계 세포의 양방이 존재함으로써 분비되는 인자로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 세포 및/또는 인자와 함께, 간세포 유래의 내배엽, 외배엽 또는 중배엽 세포를 공배양하여 얻어지는 조직 구조체이다. 게다가, 조직 구조체는, 복수의 기능의 값에 대하여 피어슨의 적률 상관 계수 (Pearson product-moment correlation coefficient) 를 사용하여 검정한 값이, 태아로부터 채취된 세포 또는 태아로부터 채취된 생체 조직보다, 성체로부터 채취된 세포 또는 성체로부터 채취된 생체 조직에 가까운 값이다.

조직 구조체는 적어도 2 종류, (바람직하게는 3 종류) 의 세포를 공배양함으로써 기관원기를 형성시키고, 또한 기관원기를 성숙시켜, 복수의 기능에 대하여 상기 서술한 특징을 갖는 조직 구조체를 형성한다. 기관원기에 대해서는 후술하겠지만, 성숙됨으로써 기관으로 분화할 수 있는 구조체이다.

본 명세서에서는 이하의 용어를 사용한다.

「생체 조직 (biological tissue)」이란, 몇 종류인가 정해진 세포가 일정한 패턴으로 집합된 구조의 단위로, 전체적으로 한 가지의 연관지어 종합된 역할을 갖는다. 예를 들어, 생체 내의 각 기관 (장기) 은, 몇 종류인가의 조직이 정해진 패턴으로 모여 구성되어 있다. 본 명세서에서는, 분화된 세포에 의해 구성되고, 임의의 기능을 갖는 세포의 집합 (세포군) 을 조직이라고 한다.

「간세포 유래의 내배엽, 외배엽 또는 중배엽 세포」(이하, "간세포 유래 3 배엽 세포" 라고 칭한다) 에 대하여 이하에 설명한다.

간세포란 배아성 간세포 (ES 세포) 또는 인공 다능성 간세포 유래 (iPS 세포) 에서 선택되는 세포를 포함하고, 무한 증식성을 가지고 있으며, 또한, 내배엽, 중배엽, 외배엽의 모든 기관으로 분화 가능한 세포를 말한다.

내배엽 세포란, 간장, 췌장, 장관, 폐, 갑상선, 부갑상선, 요로 등의 중배엽성 기관으로 분화 가능한 세포를 말한다.

외배엽 세포란, 뇌, 척수, 부신수질, 표피, 모발ㆍ손발톱ㆍ피부선, 감각 기관, 말초 신경, 수정체 등의 외배엽계 기관으로 분화 가능한 세포를 말한다.

중배엽 세포란, 신장, 요관, 심장, 혈액, 생식선, 부신피질, 근육, 골격, 진피, 결합 조직, 중피 등의 중배엽계 기관으로 분화 가능한 세포를 말한다.

즉, 간세포 유래 3 배엽 세포란, ES 세포 또는 iPS 세포에서 선택된 세포에서 유래하는, 내배엽, 외배엽 또는 중배엽계 기관의 성질을 갖는 세포를 말한다.

어느 세포가 외배엽성 기관, 중배엽성 기관 또는 내배엽성 기관으로 분화 가능한 세포인지 여부는, 마커가 되는 단백질의 발현을 조사함으로써 확인할 수 있다 (마커 단백질 중 어느 1 개 혹은 복수가 발현되어 있으면 내배엽성 기관으로 분화 가능한 세포라고 판단할 수 있다). 예를 들어, 간장으로 분화 가능한 세포에서는 HHEX, SOX2, HNF4A, AFP, ALB 등이 마커가 되고, 췌장으로 분화 가능한 세포에서는 PDX1, SOX17, SOX9 등이 마커가 되고, 장관으로 분화 가능한 세포에서는 CDX2, SOX9 등이 마커가 되고, 신장으로 분화 가능한 세포에서는 SIX2, SALL1, 심장으로 분화 가능한 세포에서는 NKX2-5 MYH6, ACTN2, MYL7, HPPA, 혈액으로 분화 가능한 세포에서는 C-KIT, SCA1, TER119, HOXB4, 뇌나 척수로 분화 가능한 세포에서는 HNK1, AP2, NESTIN 등이 마커가 된다.

「간엽계 세포」란, 주로 중배엽에서 유래하는 결합 조직에 존재하고, 조직에서 기능하는 세포의 지지 구조를 형성하는 결합 조직 세포인데, 간엽계 세포로의 분화 운명이 결정되어 있지만, 아직 간엽계 세포로 분화되지 않은 세포도 포함하는 개념이다. 본 발명에 있어서 사용하는 간엽계 세포는 분화된 것이어도 되고, 미분화의 것이어도 된다. 어느 세포가 미분화 간엽계 세포인지 여부는 마커 단백질, 예를 들어, Stro-1, CD29, CD44, CD73, CD90, CD105, CD133, CD271, Nestin 이 발현되어 있는지 여부를 조사함으로써 확인할 수 있다 (상기 마커 단백질 중 어느 1 개 혹은 복수가 발현되어 있으면 미분화 간엽계 세포라고 판단할 수 있다). 또, 전항 (前項) 의 마커 전부가 발현되어 있지 않은 간엽계 세포는 분화 간엽계 세포라고 판단할 수 있다. 당업자 사이에서 사용되고 있는 용어 중에서, 간엽 간세포 (mesenchymal stem cells), 간엽 전구 세포 (mesenchymal progenitor cells), 간엽 세포 (mesenchymal cells) (R. Peters, et al. PLoS One. 30 ; 5(12) : e15689. (2010)) 등은, 본 발명에 있어서의 간엽계 세포에 포함된다. 간엽계 세포는 주로 인간 유래의 것을 사용하지만, 인간 이외의 동물, 예를 들어, 마우스, 래트, 개, 돼지, 원숭이 등의 동물 유래의 미분화 간엽계 세포를 사용해도 된다.

「혈관 세포」란, 혈관 내피를 구성하는 세포, 또는 그러한 세포로 분화될 수 있는 세포를 말한다. 어느 세포가 혈관 세포인지 여부는 마커 단백질, 예를 들어, TIE2, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, CD41 이 발현되어 있는지 여부를 조사함으로써 확인할 수 있다 (상기 마커 단백질 중 어느 1 개 혹은 복수가 발현되어 있으면 혈관 세포라고 판단할 수 있다). 본 발명에 있어서 사용하는 혈관 세포는 분화된 것이어도 되고, 미분화된 것이어도 된다. 혈관 세포가 분화된 세포인지 여부는, CD31, CD144 에 의해 확인할 수 있다. 당업자 사이에서 사용되고 있는 용어 중에서, 내피 세포 (endothelial cells), 제정맥 내피 세포 (umbilical vein endothelial cells), 내피 전구 세포 (endothelial progenitor cells), 내피 전구체 세포 (endothelial precursor cells), 혈관성 전구 세포 (vasculogenic progenitors), 혈액모세포 (hemangioblast) (HJ. joo, et al. Blood. 25 ; 118(8) : 2094-104. (2011)) 등은, 본 발명에 있어서의 혈관 세포에 포함된다. 혈관 세포는 주로 인간 유래의 것을 사용하지만, 인간 이외의 동물, 예를 들어, 마우스, 래트, 개, 돼지, 원숭이 등의 동물 유래의 혈관 세포를 사용해도 된다.

「기관원기」란, 성숙됨으로써 기관으로 분화될 수 있는 구조체로서, 간세포 유래 3 배엽 세포, 혈관 세포, 및 미분화 간엽계 세포 혹은 그것으로부터 분화된 세포의 3 종류의 세포를 포함하는 구조체를 말한다. 어느 구조체가 기관원기인지 여부는, 예를 들어, 그 구조체를 생체에 이식하여, 목적으로 하는 기관으로 분화될 수 있는지 여부를 조사하는 것 (목적으로 하는 기관으로 분화되어 있으면 기관원기라고 판단할 수 있다), 및/또는 그 구조체가 상기 서술한 3 종류의 세포를 모두 포함하고 있는지 여부를 조사하는 것 (3 종류의 세포를 모두 포함하고 있으면 기관원기라고 판단할 수 있다) 에 의해 확인할 수 있다. 기관원기는 예를 들어, 신장, 심장, 폐장, 비장, 식도, 위, 갑상선, 부갑상선, 흉선, 생식선, 뇌, 척수 등의 기관으로 분화되는 기관원기 등이어도 되지만, 간장으로 분화되는 기관원기 (간 원기 (liver bud), 췌장으로 분화되는 기관원기 (췌장 원기 (pancreatic bud)), 장관으로 분화되는 기관원기 등 내배엽성 기관으로 분화되는 기관원기가 바람직하다. 어느 구조체가 내배엽성 기관으로 분화되는 기관원기인지 여부는, 마커가 되는 단백질의 발현을 조사함으로써 확인할 수 있다 (후술하는 마커 단백질 중 어느 1 개 혹은 복수가 발현되어 있으면 기관원기라고 판단할 수 있다). 예를 들어, 간 원기에서는 HHEX, SOX2, HNF4A, AFP, ALB 등이 마커가 되고, 췌장 원기에서는 PDX1, SOX17, SOX9 등이 마커가 되고, 장관으로 분화되는 기관원기에서는 CDX2, SOX9 등이 마커가 된다. 당업자 사이에서 사용되고 있는 용어 중에서, 간 싹 (liver bud), 간 게실 (liver diverticula), 간 인공조직 (liver organoid), 췌장 싹 (pancreatic (등쪽 (dorsal) 또는 배쪽 (ventral)) buds), 췌장 게실 (pancreatic diverticula), 췌장 인공조직 (pancreatic organoid), 장 싹 (intestinal bud), 장 게실 (intestinal diverticula), 장 인공조직 (intestinal organoid) (K. Matsumoto, et al. Science. 19 ; 294 (5542) : 559-63. (2001)) 등은 본 발명에 있어서의 기관원기에 포함된다.

「태아로부터 채취된 세포」란, 난자로부터 생긴 아이가 어떠한 형태로 모친의 몸과의 연락을 갖고, 모체로부터 영양 등의 공급을 받아 성장하고, 충분히 발육된 후에 태어나는 것으로부터 채취한 세포이다. 예를 들어, 태아로부터 채취된 세포는, 태아의 간장의 생체 조직이나 시판되고 있는 태아 간세포를 포함한다.

「성체로부터 채취된 세포」란 충분히 성장하여, 생식이 가능해진 생물체로부터 채취한 세포이다. 성체로부터 채취된 세포는, 예를 들어, 시판되고 있는 인간 초대 간세포나 바이옵시한 생체 조직을 포함한다.

「성체로부터 채취된 세포 또는 생체 조직」은, 각 회사로부터 인간이나 동물에서 유래하는 세포가 판매되고 있다. 간세포는 찰즈 리버사, KAC 사로부터 구입할 수 있다.

동물로부터 채취하는 것도 가능하다. 예를 들어, 래트나 마우스로부터 채취하는 경우, 2 단계 콜라게나아제 관류법에 의해 간세포를 분리하는 방법이 있다. 예를 들어, 래트의 경우, 문맥으로부터 카뉠레를 넣어 37 도로 가온한 인산 완충액 (전(前)환류액) 으로 탈혈하고, 다음으로 37 도로 가온한 콜라게나아제 용액으로 콜라겐을 분해하여 세포만을 회수하는 방법을 이용할 수 있다.

「태아로부터 채취된 세포 또는 생체 조직」은, 시판되고 있는 것이 있다. 셀 뱅크 등으로부터 입수 가능하다. 예를 들어, 주식회사 베리타스로부터 입수할 수 있다.

「상관 계수 (correlation coefficient)」란, 2 개의 확률 변수 사이의 상관 (유사성의 정도) 을 나타내는 통계학적 지표이다. 원칙, 단위는 없으며, -1 에서 1 사이의 실수값을 취하고, 1 에 가까울 때에는 2 개의 확률 변수에는 정 (正) 의 상관이 있다고 하고, -1 에 가까우면 부 (負) 의 상관이 있다고 한다. 0 (제로) 에 가까울 때에는 원래의 확률 변수의 상관은 약하다. 1 혹은 -1 이 되는 경우에는, 2 개의 확률 변수는 선형 종속의 관계에 있다. 일반적으로, 단순히 상관 계수라고 말하면, 피어슨의 적률 상관 계수 (Pearson product-moment correlation coefficient) 를 가리킨다. 이것의 검정에는 편차의 정규 분포를 가정하는 (파라메트릭) 방법이지만, 그 밖에 이와 같은 가정을 두지 않는 논파라메트릭한 방법으로서, 스피아만의 순위 상관 계수, 켄달의 순위 상관 계수 등도 일반적으로 사용된다.

「피어슨의 적률 상관 계수」란, 2 변수 XY 간의 직선적 관계에 대하여 조사하는 것이다. 피어슨의 적률 상관 계수는 소문자 r 로 표현되며, -1 ≤ r ≤ 1 의 범위를 취한다. ＋ (플러스) 는 정의 상관인 것을 의미하며, 일방이 증가함으로써 다른 일방도 증가하는 정의 관계성을 나타낸다. 또, － (마이너스) 의 경우에는 부의 상관인 것을 의미하며, 일방이 증가함으로써 다른 일방은 감소하는 부의 관계성을 나타낸다.

* 복수의 기능의 설명

복수의 기능은 조직 구조체가 갖는 기능, 바꾸어 말하면, 조직 구조체로부터 검출할 수 있는 기능이다. 일 실시형태에서는, 예를 들어, 유전자 발현량, 단백질량에 의해 측정할 수 있는 기능을 사용하고, 특히, 간세포 유래 3 배엽 세포로부터 조직 구조체로 분화될 때에 변동되는 기능을 사용한다. 구체적으로는, 조직 구조체가 갖는 기능 중에서, 태아로부터 채취된 세포와 성체로부터 채취된 세포가 갖는 기능을 비교했을 때, 기능의 양이 변동되는 기능을 사용한다. 그리고, 조직 구조체는, 태아로부터 채취된 세포보다 성체로부터 채취된 세포에 가까운 기능의 양을 갖는 구조체가 선택 (추출) 된다.

여기에서, 태아로부터 채취된 세포는, 태아로부터 채취된 세포와 그 생체 조직을 포함하고, 성체로부터 채취된 세포는, 성체로부터 채취된 세포와 그 생체 조직을 포함한다.

예를 들어, 복수의 기능은, 10 종류 이상의 유전자의 발현량을 사용할 수 있다.

유전자종을 선택하는 경우에는, 기관원기의 유전자 발현량에 대해 조직 구조체의 유전자 발현량이 2 배 이상 변동되는 유전자종을 포함한다. 단백질종을 선택하는 경우에는, 기관원기의 단백질량에 대해 조직 구조체의 단백질량이 20 ％ 이상 변동되는 단백질종을 포함한다.

또는, 10 종류 이상의 유전자가, 간세포 유래 3 배엽 세포의 유전자 발현량에 대해, 조직 구조체의 유전자 발현량이 2 배 이상 변동되는 유전자를 포함한다. 보다 구체적으로는, 유전자 발현량은, 모든 유전자 단편이 고정되어 있는 DNA 칩을 사용하여 해석된 값을 사용한다. 그리고, 10 종류 이상의 유전자는, 간세포 유래 3 배엽 세포의 유전자 발현량에 대해, 조직 구조체의 유전자 발현량이 2 배 이상 변동되는 모든 유전자를 포함한다.

10 종류 이상의 유전자의 발현량을 사용하는 것은, 유전자의 발현량에 의해 조직 구조체가 간세포 유래 3 배엽 세포로부터 성숙된 것을 판정하기 위한 수를 설정한 것이다.

다른 예로서, 복수의 기능은, 10 종류 이상의 단백질에 대하여 측정한 단백질량을 사용할 수 있다. 이 경우, 간세포 유래 3 배엽 세포 및 조직 구조체의 단백질량을 측정했을 때, 10 종류 이상의 단백질이, 간세포 유래 3 배엽 세포의 단백질량에 대해 조직 구조체의 단백질량이 20 ％ 이상 변동되는 모든 단백질을 포함한다.

또한, 복수의 기능은, 상기 서술한 구체예에 한정되는 것은 아니다. 복수의 기능은, 임의의 장치로 기능의 양이나 크기를 측정할 수 있는 것이나 요소 등이면 된다. 또한, 간세포 유래 3 배엽 세포 또는 기관원기가 조직 구조체로 분화ㆍ성숙될 때, 기능의 양이나 크기를 측정 또는 해석한 값 (측정값, 해석값) 이 변동되는 것이면 되고, 특히 2 배 이상으로 변동되는 것이면 바람직하다.

* 복수의 기능의 측정 (검출) 에 대하여

복수의 기능에 대해서는, 채용하는 기능을 측정하는 기기를 사용하여 측정한다.

유전자 발현량은, 예를 들어 유전자 마이크로어레이 해석 장치를 사용하여 해석할 수 있다. 유전자 해석에서는, 예를 들어, 유전자 해석법의 하나인 칩에 의한 해석을 이용할 수 있으며, 일례가 이하의 URL 에서 소개되어 있다.

http://www.chem-agilent.com/contents.php?id=1002411

http://www.gelifesciences.co.jp/newsletter/biodirect_mail/technical_tips/tips21.html (GE 의 마이크로어레이에 관한 원리 설명)

단백질량은, 예를 들어 단백질 어레이 해석 장치를 사용하여 측정할 수 있다. 단백질 해석에서는, 일례가 이하의 URL 에서 소개되어 있다.

http://www.filgen.jp/Product/Bioscience2/index.htm

http://www.filgen.jp/Product/BioScience22-MS/index2.htm

또한, 목적 장기에서 특징적으로 발현되는 유전자나 단백질을 알고 있는 경우에는, 특정 유전자 발현량이나 단백질량에 대하여 분석하여, 2 배 이상 변동되는지 검증할 수 있다. 목적 장기에서 특징적인 기능의 종류가 10 개 이상 존재하는 것이 바람직하다.

상기와 같은 방법으로 망라적으로 분석하여 2 배 이상 변동되는 것이 10 개 이상 있는 것이 보다 바람직하다.

간조직의 성질을 갖는 조직 구조체의 경우, 아피메트릭스사에서 판매하고 있는 DMET (등록 상표) Plus 를 사용하여 간조직에 특징적인 유전자종 전부 또는 이들에서 선택할 수 있다.

췌장의 성질, 특히 췌도 β 세포를 포함하는 조직 구조체의 경우, 비특허문헌 4 나 5 에서 거론되어 있는 태아와 성체 조직에서 변동되는 유전자종 또는 단백질종 모두 또는 이들에서 선택할 수 있다.

상기 서술한 방법으로 복수의 기능에 대하여 측정값 (해석값) 하여 검정을 실시한다. 검정에 사용하는 유전자 발현량은, 선택한 유전자의 발현량을 하우스키핑 유전자의 발현량을, GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), β-액틴, β2-마이크로글로블린, HPRT 1 (hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1) 로 나누어 정규화한 값을 측정값 (해석값) 으로서 사용할 수 있다. 또는, Shiftile 법과 같은 방법을 이용하여 정규화한 값을 측정값 (해석값) 으로 해도 된다. 본 발명에서 사용하고 있는 유전자 발현량은 특별히 기재가 없는 경우, 이와 같이 하여 정규화한 값을 말한다. 단백질량의 경우에도, 선택된 복수의 기능의 단백질량을 알부민량으로 나눈 값, 혹은 선택된 복수의 기능의 단백질량을 총 단백질량으로 나눈 값을 측정값으로서 사용할 수 있다.

* 조직 구조체의 제작 방법

조직 구조체는 혈관 세포, 간엽계 세포, 혈관 세포로부터 분비되는 인자, 간엽계 세포로부터 분비되는 인자, 혈관 세포와 간엽계 세포의 양방이 존재함으로써 분비되는 인자로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 세포 및/또는 인자와 함께 간세포 유래 3 배엽 세포를 공배양함으로써 제작한다.

상세하게는, 일 실시형태의 조직 구조체의 제작 방법은, 예를 들어, 적어도 2 종류 (바람직하게는 3 종류) 의 세포를 공배양하여 분화된 세포를 형성시키고, 다시 공배양을 계속함으로써 형성한 분화된 세포를 추가로 성숙시킨 배양 형성물을 얻어, 복수의 기능을 발생시킨다. 그리고, 배양 형성물 중에서 복수의 기능을 갖는 것을 조직 구조체로서 추출한다.

「공배양」이란, 일반적으로는, 함께 배양하는 2 종 혹은 그 이상의 상이한 종류의 세포를 혼합하고, 세포를 배양하는 것을 말한다.

또, 일 실시형태의 공배양은, 응집체를 형성시키는 공정, 형성한 응집체를 공배양하여 분화시키는 공정, 추가로 배양을 실시하여 분화된 세포를 성숙화시키는 공정을 포함한다. 여기에서는 설명을 용이하게 하기 위해, 응집체를 공배양하여 기관원기를 형성시키고, 기관원기를 성숙시켜 조직 구조체를 제작하는 경우를 일례로서 설명한다. 그러나, 상기 서술한 바와 같이, 분화된 세포는, 기관원기에 한정되지 않고, 응집체를 분화시켜 형성되는 세포나 조직을 포함하는 것은 말할 필요도 없다.

이하에서 설명하는 공배양은, (1) 응집체를 형성시키는 공정, (2) 기관원기를 형성시키는 공정, (3) 배양을 실시하여 성숙화시키는 공정을 포함한다.

이하, 각 공정에 대하여 설명한다.

(1) 응집체를 형성시키는 공정 (응집체 형성 공정)

응집체를 형성시키는 공정은, 간세포 유래 3 배엽 세포로서 사용하는 응집체를 형성한다.

응집체의 형성 방법으로는, 행잉 드롭법 (hanging drop method) 으로서 알려져 있는 액적 중에 스페로이드를 형성시키는 방법, 배양 용기 바닥면에 나노오더의 필러나 메시 구조의 요철을 갖는 용기를 사용하는 방법, 롤러 보틀을 교반하면서 배지 중에 세포를 부유시킨 상태로 스페로이드를 형성시키는 방법, 아가로오스나 마트리겔 등의 겔 상에서 배양하는 방법, 나아가서는, 세포 비접착 처리가 실시된 배양 용기를 사용하여 정치 (靜置) 하여 스페로이드를 형성시키는 방법 등 여러 가지 방법이 알려져 있으며, 이들 중 어느 방법을 이용해도 된다. 구체적인 수법에 대해서는 여러 가지 문헌에서 소개되어 있으며, 예를 들어, 비특허문헌 5 및 비특허문헌 6 에 소개되어 있다.

(2) 기관원기를 형성시키는 공정 (기관원기 형성 공정)

기관원기를 형성시키는 공정은, 3 종류의 세포, 혈관 세포, 간세포 유래 3 배엽 세포 및 간엽계 세포를 공배양하여 기관원기를 형성시킨다.

공배양에 있어서의 3 종류의 세포의 배양비는, 기관원기를 형성할 수 있는 범위 내이면 특별히 한정되지 않지만, 바람직한 세포수의 비는, 간세포 유래 3 배엽 세포 : 혈관 세포 : 간엽계 세포 = 10 : 10 ∼ 5 : 2 ∼ 1 이다.

또, 혈관 세포와 간엽계 세포 중 어느 일방 또는 양방은, 혈관 세포로부터 분비되는 인자, 간엽계 세포로부터 분비되는 인자, 혈관 세포와 간엽계 세포의 양방이 존재함으로써 분비되는 인자 등의 물질로 대체할 수도 있다.

혈관 세포로부터 분비되는 인자, 간엽계 세포로부터 분비되는 인자, 및 혈관 세포와 간엽계 세포의 양방이 존재함으로써 분비되는 인자 등의 물질의 예로는, FGF2, FGF5, BMF4, BMP6, CTGF 등을 예시할 수 있는데, 이들에 한정되는 것은 아니다.

이들 물질의 첨가량으로는, FGF2 에 대해서는 세포 1 × 10⁶ 개당 10 ∼ 100 ng/㎖ 가 적당하고, 20 ng/㎖ 정도가 바람직하고, BMF4 에 대해서는 세포 1 × 10⁶ 개당 10 ∼ 100 ng/㎖ 가 적당하고, 20 ng/㎖ 정도가 바람직하다.

배양시에 사용하는 배지는, 조직 구조체가 형성되는 것이면 어떠한 것이어도 되지만, 배양용 배지, 간세포 (ES 세포나 iPS 세포 배양용) 배양용 배지, 상기 2 개의 배지를 혼합한 것 등을 사용하는 것이 바람직하다. 혈관 세포 배양용 배지는 어떠한 것을 사용해도 되지만, hEGF (재조합 인간 상피 세포 성장 인자), VEGF (혈관 내피 세포 성장 인자), 하이드로코르티손, bFGF, 아스코르브산, IGF1, FBS, 항생제 (Antibiotics) (예를 들어, 겐타마이신, 암포테리신 B 등), 헤파린 (Heparin), L-글루타민 (L-Glutamine), 페놀레드 (Phenolred), BBE 중 적어도 1 종을 함유하는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 혈관 세포 배양용 배지로는, EGM-2 BulletKit (Lonza 사 제조), EGM BulletKit (Lonza 사 제조), VascuLife EnGS Comp Kit (LCT 사 제조), Human Endothelial-SFM Basal Growth Medium (Invitrogen 사 제조), 인간 미소 혈관 내피 세포 증식 배지 (TOYOBO 사 제조) 등을 사용할 수 있다. 간세포 유래 3 배엽 세포 배양용 배지는 어떠한 것을 사용해도 되지만, 목적으로 하는 조직 구조체가 간장 조직인 경우, 간세포 배양용 배지를 사용하는 것이 바람직하고, 아스코르브산 (ascorbic acid), BSA-FAF, 인슐린 (insulin), 히드로코르티손 (hydrocortisone), GA-1000 중 적어도 1 종을 함유하는 것, 또는, 간세포 배양용 배지로서 시판되고 있는 HCM BulletKit (Lonza 사 제조) 로부터 hEGF (재조합 인간 상피 세포 성장 인자) 를 제거한 것, RPMI1640 (Sigma-Aldrich 사 제조) 에 1 ％ B27 보충물 (Supplements) (GIBCO 사 제조) 와 10 ng/㎖ hHGF (Sigma-Aldrich 사 제조) 를 첨가한 배지 등을 사용하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 GM BulletKit (Lonza 사 제조) 와 HCM BulletKit (Lonza 사 제조) 로부터 hEGF (재조합 인간 상피 세포 성장 인자) 를 제거한 것을 1 : 1 로 혼합한 것에 덱사메타손 (Dexamethasone), 온코스타틴 (Oncostatin) M, HGF 를 첨가한 것을 사용한다.

배양시의 온도는 특별히 한정되지 않지만, 30 ∼ 40 ℃ 로 하는 것이 바람직하고, 37 ℃ 로 하는 것이 더욱 바람직하다.

배양 기간은 특별히 한정되지 않지만, 3 ∼ 50 일로 하는 것이 바람직하고, 15 일로 하는 것이 더욱 바람직하다.

(3) 배양을 실시하여 성숙화시키는 공정 (성숙화 공정)

성숙화 공정에서는, 형성한 기관원기를 성숙시켜 배양 형성물 (조직 구조체 후보 : 하기 조직 구조체 제작 용기에서 배양한 배양 형성물을 가리킨다) 을 형성한다. 바꾸어 말하면, 배양 형성물을 형성하고, 복수의 기능을 검정하여 적절한 (요건을 만족시키는) 배양 형성물을 조직 구조체로 한다.

예를 들어, 조직 구조체를 형성시키기 위해 사용하는 배양 용기 (조직 구조체 제작 용기) 와 동일한 스케일, 스케일 다운 또는 스케일 업한 배양 용기 (시험 용기) 를 별도로 준비한다. 시험 용기의 배양은, 조직 구조체 제작 용기의 경우와 동일한 배지의 조성, 파종 밀도, 배지 교환 빈도, 세포와 배지량의 비율로 한다. 그리고, 시험 용기에서 제작된 배양 형성물을 사용하여 유전자 발현량의 측정을 실시한다. 복수의 기능이 10 종류 이상의 유전자의 발현량이고, 10 종류 이상의 유전자가, 간세포 유래 3 배엽 세포의 유전자 발현량에 대해, 조직 구조체의 유전자 발현량이 2 배 이상 변동되는 유전자를 추출한다.

추출한 유전자종에 대하여, 시험 용기에서 제작된 배양 형성물, 태아로부터 채취된 세포 또는 생체 조직, 성체로부터 채취된 세포 또는 생체 조직의 유전자 발현량을 측정, 판정에 사용한다. 즉, 시험 용기에서 배양한 배양 형성물의 판정 결과를, 조직 구조체 제작 용기에서 제작된 배양 형성물의 판정 결과로 치환할 수 있다.

상기는 셀 스택이나 플라스크를 조직 구조체 제작 용기에 사용, 디시나 작은 플라스크 (24 ㎝²) 를 시험 용기로서 사용한 경우를 상정하고 있다. 웰 플레이트의 경우에는 상이한 웰을 시험 용기 (바꾸어 말하면, 시험 웰) 로서 취급할 수 있다.

성숙화 공정에 있어서, 사용하는 배지는 원하는 조직용 배지를 사용하는 것이 바람직하고, 혈관 세포용 배지나 간세포용 배지를 혼합하는 것이 바람직하다.

(4) 판정 방법에 대하여,

성체와의 유사성을 평가하는 방법으로, 성체에 가까운 기능을 갖는 것이 전제인 점에서, 성체로부터 채취된 세포 또는 생체 조직과, 조직 구조체의 유전자 발현량은 정의 상관을 나타낸다. 부의 상관을 나타낸 경우에는, 성숙화가 불충분하여 성체에 가깝지 않다고 판정한다. 즉, 성체로부터 채취된 세포 또는 생체 조직과 조직 구조체의 유전자 발현량은 정의 상관을 나타내는 것이 필요 조건이다. 이하의 [a], [b] 의 사이에, [a] 가 [b] 보다 작고, 또한 [b] 가 1 보다 작은 관계 (바꾸어 말하면, 식 [a] ＜ [b] ＜ 1 을 만족시키는 관계) 가 얻어지면, 조직 구조체 후보를 조직 구조체라고 인정한다.

[a]「생체로부터 채취된 세포 또는 생체 조직의 유전자 발현량」과 「배양 형성물 (시험 용기) 의 유전자 발현량」의 상관 계수가 정인, 또한, 「태아로부터 채취된 세포 또는 생체 조직의 유전자 발현량」과 「배양 형성물 (시험 용기) 의 유전자 발현량」의 상관 계수

[b]「생체로부터 채취된 세포 또는 생체 조직의 유전자 발현량」과 「배양 형성물 (시험 용기) 의 유전자 발현량」의 상관 계수

피어슨의 상관 계수를 산출하는 방법으로서, 작업을 효율적으로 실시하기 위해서는 (예를 들어, 수백 유전자를 검정하는 것과 같은 경우를 상정) 인포메틱스용 소프트웨어를 사용하는 것이 바람직하다. 소프트웨어로는, 예를 들어, Gene spring, Subio 를 사용하는 것이 바람직하다. 또는 마이크로소프트사의 엑셀 소프트를 사용하여 검정할 수 있다.

기관원기 형성 공정 및 성숙화 공정에서는, 배양 용기를 사용하여 응집체 (스페로이드) 를 배양한다. 또, 응집체 형성 공정에 있어서도 배양 용기를 사용하여 세포를 배양 또는 성숙시키는 모든 공정에 있어서 배양 용기를 사용해도 된다.

응집체 형성 공정, 기관원기 형성 공정, 성숙화 공정에 있어서, 세포끼리가 결합하여 응집되어 있는 것이 바람직하다. 또, 응집체 형성 공정, 기관원기 형성 공정, 성숙화 공정에 있어서, 세포끼리가 결합하여 스페로이드 형상의 덩어리가 형성되어 있는 것이 바람직하다. 게다가 또한, 세포끼리가 형성하는 스페로이드의 직경이 50 ㎛ ∼ 2 ㎜ 인 것이 바람직하다.

배양 용기는, 예를 들어 다음의 구성을 갖는 것을 사용한다.

＜배양 용기＞

도 1 은, 일 실시형태의 배양 용기의 일례를 나타내는 도면이다. 도 1 에서는, 복수의 배양 용기 (1) 를 갖는 배양 플레이트 (3) 의 일부분을 나타낸다. 도 1 의 상단에는, 배양 용기 (1) 의 바닥에 형성되는 복수의 오목부 (10) 의 일부분을 배양 플레이트 (3) 의 위에서 본 도면을 나타낸다. 배양 용기 (1) 는, 복수의 오목부 (10) 가 배치된다. 복수의 오목부 (10) 는, 배양 용기 (1) 의 제조나 세포 배양의 효율의 관점에서 규칙적으로 배치되는 것이 바람직하다. 배양 용기 (1) 는, 예를 들어 복수의 웰을 갖는 웰 플레이트의 1 개의 웰에 상당한다. 바꾸어 말하면, 웰 플레이트의 각 웰에 복수의 오목부 (10) 가 배치되게 된다.

웰 플레이트는, 다수의 패임부 (구멍 또는 웰) 가 생긴 평판으로 이루어지는 실험ㆍ검사 기구로, 각 웰을 시험관 혹은 샬레로서 이용하는 것을 말한다. 웰의 수에는, 예를 들어 6, 24, 96, 384 등이 있으며, 그 이상의 수의 것도 있다. 웰의 바닥은 평평한 것, 둥근 것 외에, 가늘고 긴 마이크로튜브를 다수 조합한 형식의 것 (딥 웰 플레이트) 도 있다.

도 2, 3 은, 실시형태 1 의 오목부의 형상예를 나타내는 도면이다. 도 2 에서는, 1 개의 오목부 (10) 를 옆에서 보았을 때의 단면도를 나타내고, 도 3 은, 1 개의 오목부 (10) 를 위에서 보았을 때의 도면을 나타낸다.

각 오목부 (10) 는, 바닥부 (11) 와 개구부 (12) 로 구성된다. 바닥부 (11) 는, 배양 용기 (1) 의 바닥이 되는 부분이고, 개구부 (12) 는, 바닥부 (11) 의 상부에 배치되는 부분이다. 바닥부 (11) 와 개구부 (12) 가 접하는 부분을 경계라고 기재한다. 도 2 에서는, 부호 R 의 화살표로 나타내는 길이의 부분이 경계의 위치에 대응한다. 또, 도 3 에서는, 경계의 위치를 2 점 파선으로 나타내고 있다. 단, 바닥부 (11) 와 개구부 (12) 는 연속된 면으로 구성되며, 일체로서 제조된다.

도 2, 3 에서는, 배양 용기 (1) 에 형성되는 복수의 오목부 (10) 에 관하여, 상당 직경 (R), 깊이 (높이) (H) 를 나타낸다.

상당 직경 (R) 은, 오목부 (10) 의 바닥부 (11) 에 내접하는 내접원의 직경을 말한다. 여기에서는, 바닥부 (11) 와 개구부 (12) 의 경계에서 내접하는 내접원의 직경을 말한다. 보다 상세하게는, 상당 직경 (R) 은, 경계에 있어서의, 오목부 (10) 의 높이 (H) 의 방향과 수직이 되는 면의 형상의 내접원의 직경을 말한다.

깊이 (H) 는, 바닥부 (11) 의 내측의 바닥에서부터 오목부 (10) 의 위쪽 끝까지의 길이이다. 오목부 (10) 의 위쪽 끝은, 개구부 (12) 의 단부 (위쪽 끝) 와 동일하다. 깊이 (H) 는, 오목부 (10) 가 형성하는 공간의 깊이이다. 바꾸어 말하면, 바닥부 (11) 가 형성하는 공간의 바닥에서부터 개구부 (12) 가 형성되는 공간의 위쪽 끝까지의 깊이이다. 도 2 에서는 오목부 (10) 의 깊이 (H) 에 추가하여, 바닥부 (11) 의 깊이 (H1) 및 개구부 (12) 의 깊이 (H2) 를 나타내고 있다.

바닥부 (11) 는, 세포를 배양하는 공간 (제 1 공간) 을 형성한다. 바닥부 (11) 는, 예를 들어, 반구상의 형상을 갖는다. 예를 들어, 상당 직경 (R) 을 직경으로 하는 구형을 반으로 한 형상을 사용할 수 있다. 바닥부 (11) 의 형상에 대하여 반구상에 한정되는 것은 아니다.

개구부 (12) 는, 세포의 배양 및 회수를 보조하도록 기능하는 공간 (제 2 공간) 을 형성한다. 개구부 (12) 는, 바닥부 (11) 와의 경계에서부터 오목부 (10) 의 단부 (선단) 까지를 둘러싸는 테이퍼각이 1 도 이상 20 도 이하의 벽으로 구성된다. 개구부 (12) 를 구성하는 벽의 테이퍼각이 5 도 이상 15 도 이하인 것이 바람직하고, 10 도가 보다 바람직하다. 그 이유는, 테이퍼각이 지나치게 작으면 회수할 때에 세포가 오목부로부터 배지로 이행하지 못하고, 반대로 지나치게 크면 배지 교환 중에 세포가 이탈하기 때문이다.

도 2 에서는 테이퍼각을 부호 θ1, θ2 로 나타낸다. 도 2, 3 에 나타내는 오목부 (10) 의 형상예에서는, 테이퍼각 (θ1, θ2) 은 거의 동일한 경우를 나타내고 있다.

바닥부 (11) 와 개구부 (12) 의 경계는, 상당 직경 (R) 이 50 ㎛ 이상 1 ㎜ 이하가 되도록 형성된다. 스페로이드의 중심부까지 영양을 공급하고자 하는 경우에는 상당 직경 50 ㎛ 이상 500 ㎛ 이하가 바람직하고, 보다 바람직하게는 100 ㎛ 이상 500 ㎛ 이하가 바람직하다.

또한, 바닥부의 바닥에서부터 단부까지의 깊이 (H) 가 상당 직경 (R) 의 0.5 배 이상 3 배 이하가 되도록 형성된다. 바람직하게는, 깊이 (H) 가 상당 직경 (R) 의 0.7 배 이상 1.2 배 이하이고, 보다 바람직하게는 0.8 ∼ 1 배이다.

또, 배양 용기는, 인접하는 2 개의 오목부 (10) 의 사이가 평탄한 것이 바람직하다. 예를 들어, 2 개의 오목부 (10) 의 거리가 5 ㎛ 내지 50 ㎛ 의 범위인 것이 바람직하다. 그 이유는, 세포가 벽 위에 올라가, 거기에서 세포가 접착하하여 증식, 스페로이드 형성을 저해하는 것을 방지하는 효과가 있다. 단, 얇은 경우에는, 세포 파종시나 배지 교환시의 진동에 의해 용이하게 균열이 생길 가능성이 있다. 그 때문에, 5 ㎛ 이상인 것이 바람직하다. 이와 같은 관점에서 5 ∼ 20 ㎛ 가 바람직하다.

상기 서술한 형상에 더하여, 배양 용기 (1) 는 이하와 같이 제조되는 것이 바람직하다.

배양 용기 (1) 가 아크릴계 수지, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 스티렌계 수지, 아크릴ㆍ스티렌계 공중합 수지, 폴리카보네이트계 수지, 폴리에스테르계 수지, 폴리비닐알코올계 수지, 에틸렌ㆍ비닐알코올계 공중합 수지, 열가소성 엘라스토머, 염화비닐계 수지, 및 실리콘 수지 중 1 개 또는 이들의 조합으로 이루어지는 수지 성형품인 것이 바람직하다.

배양 용기 (1) 가 갖는 각 오목부 (10) 에 플라즈마 처리, 유리 코트, 코로나 방전, UV 오존 처리 중 어느 것 또는 이들 조합으로 이루어지는 표면 개질 처리 방법에 의해 관능기를 형성시켜, 물 접촉각이 45 도 이하가 되도록 처리되는 것이 바람직하다.

또한, 각 오목부 (10) 에 세포 접착을 저해하는 친수성의 폴리머 사슬이 고정화되어 있는 것이 바람직하다. 친수성의 폴리머 사슬은, 상기 서술한 물 접촉각이 45 도 이하가 되도록 처리된 각 오목부 (10) 에 고정화되는 것이 보다 바람직하다.

게다가 또한, 각 오목부 (10) 에 인지질, 또는 인지질ㆍ고분자 복합체가 고정화되어 있는 것이 바람직하다. 이 고정화의 처리는, 상기 서술한 물 접촉각이 45 도 이하가 되도록 처리된 각 오목부 (10), 친수성의 폴리머 사슬이 고정화된 각 오목부 (10), 또는 이들을 조합한 각 오목부 (10) 에 실시되는 것이 보다 바람직하다.

또한, 각 오목부 (10) 에 플라즈마 처리, 유리 코트, 코로나 방전, UV 오존 처리 중 어느 것 또는 이들 조합으로 이루어지는 표면 개질 처리 방법에 의해 관능기를 형성시켜, 물 접촉각을 45 도 이하가 되도록 처리한 후, 세포 접착을 저해하는 친수성의 폴리머 사슬, 및 인지질, 또는 인지질ㆍ고분자 복합체 중 어느 1 개의 폴리머가 고정화되어 있는 세포 비접착 표면인 것이 바람직하다. 이 처리는, 상기 서술한 각 처리, 또는 각 처리의 조합 처리와 함께 실시되는 것이 보다 바람직하다.

또, 상기 서술한 친수성의 폴리머 사슬이 폴리하이드록시에틸메타크릴레이트인 것이 바람직하고, 또한 폴리하이드록시에틸메타크릴레이트의 평균 분자량이 10 만 이상인 것이 보다 바람직하다.

배양 용기 (1) 는, 상기 서술한 도 1 ∼ 3 에 나타내는 것에 더하여, 도 4, 5 에 나타내는 마이크로 패턴을 형성한 배양 용기를 사용해도 된다.

도 4 에, 일 실시형태에서 사용하는 배양 용기의 다른 형상예를 나타낸다. 도 5 는, 도 4 에 나타내는 배양 용기의 V-V 선 단면도이다.

배양 용기 (30) 는 배양 공간 (31) 과, 벽 (32) 과, 바닥부 (33) 를 갖는다.

배양 공간 (31) 은, 벽 (32) 과 바닥부 (33) 에 의해 나누어진 영역으로, 세포를 배양하는 3 차원의 공간 영역 (배양 영역) 이 된다. 배양 공간 (31) 은, 단순히 「공간」 또는 「마이크로 공간」이라고도 칭한다.

벽 (32) 은, 배양 공간 (31) 을 나누는 격벽으로, 배양 용기 (30) 에 요철 패턴을 형성하는 볼록부라고도 할 수 있다.

바닥부 (33) 는, 배양 용기 (30) 의 기판으로서 기능함과 함께, 배양 공간 (31) 이 배치되는 측의 표면은, 배양 영역 (배양 표면) 의 일부가 된다. 바닥부 (33) 는, 예를 들어, 도 1 의 배양 플레이트에 형성된 각 웰의 바닥부와 동일한 영역으로, 각 웰의 바닥부가 사용된다. 바닥부 (33) 는, 배양 공간 (31) 의 바닥을 형성한다. 바닥부 (33) 중에서, 배양 공간 (31) 을 형성하는 면의 일부분이고, 또한 배양 영역이 되는 바닥부의 표면을 「바닥부 배양면 (34)」이라고도 칭한다.

도 4, 5 에서는, 배양 용기 (30) 에 형성되는 배양 공간 (31) 에 관하여, 상당 직경 (D), 높이 (깊이) (H), 벽 (32) 의 폭 (두께) (W) 및 바닥부 (33) 의 두께 (T) 를 나타낸다. 도 4, 5 에서는, 바닥부 (33) 는, 벽 (32) 과 일체로서 제작된 경우를 나타내고 있다.

상당 직경 (D) 은, 도 2 의 상당 직경 (R) 과 동일하고, 배양 공간 (31) 에 내접하는 내접원의 직경을 말한다. 보다 상세하게는, 상당 직경 (D) 은, 배양 공간 (31) 의 바닥부 (33) 와 평행하는 면의 형상 (정면의 형상), 바꾸어 말하면, 배양 공간 (31) 의 높이 (H) 의 방향과 수직이 되는 면의 형상의 내접원의 직경을 말한다. 배양 공간 (31) 의 정면의 형상이, 높이 (H) 에 따라 상이한 경우, 주화 (柱化) 간세포를 배양하는 공간 영역의 최대값을 상당 직경으로 한다.

높이 (H) 는, 배양 공간 (31) 의 바닥 (바닥부 배양면 (34)) 에서부터 벽 (32) 의 상면까지의 길이이며, 배양 공간 (31) 의 깊이라고도 말할 수 있다. 또, 바닥부 배양면 (34) 이 평면인 경우, 높이 (H) 는, 벽 (32) 의 높이와 동일하다.

벽 (32) 의 폭 (W) 은, 벽 (32) 의 두께임과 함께, 인접하는 배양 공간 (31) 사이를 가로막는 거리라고도 말할 수 있다.

배양 용기 (30) 내 (바꾸어 말하면, 각 웰 내) 에 있어서, 복수의 배양 공간 (31) 은, 도 4 에 나타내는 바와 같이 어레이상으로 배치된다. 배양 용기 (30) 에 포함되는 배양 공간 (31) 의 수 또는 크기는, 배양 플레이트에 제작되는 웰의 수 (웰의 크기) 와 배양 공간 (31) 및 벽 (32) 의 크기에 의존하는 것이다. 도 4, 5 에서는, 9 개의 배양 공간 (31) 을 나타내고 있다. 이것은 설명을 위해 나타낸 것으로, 실제의 배양 용기 (30) (각 웰) 에 포함되는 배양 공간 (31) 의 수에 대응하는 것은 아니다.

또한, 배양 용기에 도 6 에 나타내는 오목부 (20D) 를 사용해도 된다. 도 6 은 바닥부가 선상, 바꾸어 말하면 바닥부가 공간을 형성하지 않는 오목부 (20D) 의 형상예를 나타낸다. 도 6 에서는, 상단에 오목부 (20D) 를 위에서 본 정면도, 하단에 단면도를 나타낸다. 오목부 (20D) 는, 개구부 (12) 로 구성된다.

응집체는, 상기 서술한 배양 용기 (1) 의 각 오목부 (10) 내에서 공배양한다. 오목부 (10) 는, 마이크로 용기라고도 기재한다.

상기 서술한 사항에 더하여, 오목부 (10) 는, 다음과 같이 구성되는 것이 바람직하다.

오목부 (10) 는, 상당 직경이 20 ㎛ 이상 2.5 ㎜ 이하, 깊이가 20 ㎛ 이상 2.5 ㎜ 이하인 것이 바람직하다.

조직 구조체를, 배양 표면이 세포 비접착 표면인 배양 용기를 사용하여 배양하는 것이 바람직하다.

배양 표면이 인지질, 인지질ㆍ고분자 복합체, 폴리(2-하이드록시에틸메타크릴레이트) (PHEMA), 폴리비닐알코올, 아가로오스, 키토산, 폴리에틸렌글리콜, 및 알부민의 그룹에서 선택되는 1 개 또는 이들 조합으로 이루어지는 폴리머가 세포와 접촉하는 배양면에 코트되어 있는 배양 용기 (1) 인 것이 바람직하다.

혈관 세포 : 간세포 유래의 내배엽, 외배엽 또는 중배엽 세포 : 간엽계 세포를, 10 : 7 ∼ 10 : 1 ∼ 2 의 비율로 공배양하고, 또한 오목부 (10) (마이크로 용기) 1 개당 20 개 ∼ 2000 개가 되는 밀도로 세포를 파종하는 것이 바람직하다.

오목부 (10) 가, 바닥부 (11) 와 개구부 (12) 로 구성되어 있고, 개구부 (12) 가, 바닥부 (11) 와의 경계에서부터 단부까지를 둘러싸는 테이퍼각 1 도 이상 20 도 이하의 벽으로 구성되며, 바닥부 (11) 가, 반구상과 원뿔대 중 어느 형상을 갖는 것이 바람직하다.

이상과 같이 하여 제작한 조직 구조체는, 신약 개발 스크리닝이나 재생 의료 등에 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은, 상기의 방법에 의해 제작된 조직 구조체를 사용하여 약제를 평가하는 방법도 제공한다. 약제의 평가로는, 예를 들어, 약의 후보 화합물의 약물 대사 프로파일의 예측, 약효 평가, 독성 평가, 약물 상호 작용 평가 등을 들 수 있다.

[실시예]

[실험 방법]

(1) 간세포 유래 3 배엽 세포의 제작

인간 iPS 세포 (인간 피부 유래 TkDA3 hiPSC 클론 (Koji Eto 씨 및 Hiromitsu Nakauchi 씨로부터 양도)) 를 무혈청 배지에 액티빈을 첨가하여 배양함으로써, CXCR4 및 E-cadherin 의 양 양성의 내배엽계 세포를 유도하였다. 얻어진 내배엽계 세포를 BMP4, FGF2 를 첨가하여 2 일간 배양함으로써, CXCR4 음성 HNF4α 양성의 간장 내배엽 집단을 얻었다. CXCR4 및 HNF4α 의 발현은, Hepatology, 51(1), 297-305, 2010 의 기재에 따라 면역 염색 및 유전자 발현 해석에 의해 확인하였다.

(2) 조직 구조체의 제작

세포 파종 비율 : 얻어진 간장 내배엽 세포를, 혈관 내피 세포 (인간 제대혈유래 정맥 내피 세포) (Lonza, Basel, Switzerland) 및 미분화 간엽계 세포 (인간간엽계 간세포) (Lonza, Basel, Switzerland) 를 각각 10 : 5 ∼ 10 : 2 의 비율로 혼합하여 세포 용액을 제작하였다. 혈관 내피 세포 및 미분화 간엽계 세포는, 각각 형광 표지를 실시한 것을 사용하였다.

배지 : 배양액은, 내피 세포 배지 키트-2 : EGM-2 BulletKit (제품 코드 CC-3162 : Lonza) 또는 내피 세포 배지 키트 : EGM BulletKit (제품 코드 CC-3124 : Lonza) 를 사용하였다.

배양 방법 : 실시예 및 비교예 모두 상기 서술한 세포 용액과 배지를 사용하였다.

＜실시예＞

도 1 ∼ 3 에 있어서, 상당 직경이 500 ㎛, 깊이가 500 ㎛ 인 오목부 (공간) 를 갖는 24 웰 플레이트의 배양 용기를 사용하였다. 세포 접착성을 억제하기 위해, 세포가 접촉하는 배양 표면에 p-HEMA 를 코트하였다.

3 일간 ∼ 15 일간 배양을 실시한 결과, 응집체가 형성되었다. 배양 15 일째에 응집체 (배양 형성물) 를 회수하여 유전자 발현 해석을 실시하였다. 이 때, 응집체는 2 ㎜ 이하였다.

＜비교예＞

마트리겔 코트한 φ3 ㎝ 디시를 사용하였다.

원액 내지 2 배 희석의 마트리겔 (BD pharmingen) 의 고상화를 실시한 배양접시 상으로 세포 현탁액을 파종하였다.

3 일간 ∼ 15 일간 배양을 실시한 결과, 응집체가 형성되었다. 응집체의 크기가 2 ㎜ 이상이 되고, 그 이후 배양하면, 중심부에 영양분이 공급되지 않아 괴사하는 점에서, 응집체의 직경이 2 ㎜ 가 된 시점에서 배양을 종료하였다. 이와 같이 하여 제작한 배양 형성물의 유전자 발현 해석을 실시하였다.

(3) 복수 기능의 검정

1, 복수 기능의 값의 선택

셀 뱅크로부터 입수한 iPS 세포, 10 주령 태아 유래 간세포 및 30 세의 성인 유래 간세포를 사용하여, 유전자 발현량을 GeneChip (애질런트ㆍ테크놀로지 주식회사 ; 전체 인간 게놈 (Whole Human Genome) DNA 마이크로어레이 4x44K v2 G4845A) 을 사용하여 망라적으로 해석하였다 (이하, 성체 유래 간세포의 유전자 발현량의 값을 "값 B", 태아 유래 간세포의 유전자 발현량의 값을 "값 C" 로 한다). 성숙됨에 따라서 (iPS 세포 → 태아 유래 간세포 → 성체 유래 간세포) 유전자 발현량이 상승하는 인간으로 발현되는 유전자종 70 유전자를 추출하였다 (표 1-1 내지 표 1-3). 또한, 특허문헌 3 에 따라 제작한 간 원기의 유전자 발현량 (값 A) 과 실시예의 조직 구조체의 유전자 발현량 (값 D) 을 산출하였다. 값 A 에 대해 값 D 가 2 배 이상, 10 배 이상 및 100 배 이상 상승하는 유전종을 각각 추출하였다 (표 2-1, 표 2-2). 10 배 이상 상승하는 유전자는 49 유전자였다. 2 배 이상 상승하는 유전자종은 61 종, 100 배 이상 상승하는 유전자종은 38 유전자였다.

[표 1-1]

[표 1-2]

[표 1-3]

[표 2-1]

[표 2-2]

2, 성체 유래 간세포의 유전자 발현량의 산출

값 A, B, C 및 D 는 상기 서술한 1, 복수 기능의 값의 선택의 항에서 사용한 값을 사용하였다. 비교예의 각종 유전자 발현량을 측정하였다 (값 E). 또한, 여기에서 말하는 유전자 발현량은, 각 샘플로부터 얻어진 어레이 결과 (전체 Probe 의 값) 를 75 ％ shiftile 값 (75 퍼센타일값) 으로 보정, 표준화한 값을 말한다.

도 7 에 생체 유래 간세포, 태아 유래 간세포, 실시예 및 비교예에 대하여, 49 유전자의 유전자 발현량의 값의 일부를 나타냈다.

검정

표 1-1 내지 표 1-3 에 나타낸 49 유전자에 대하여, 각종 유전자 발현량을 구하고, Gene Spring 을 사용하여 피어슨의 적률 상관 계수를 산출하였다.

(4) 결과

＜실시예＞

10 배 이상 변동되는 유전자 49 유전자

(값 C) 와 (값 D) 의 상관 계수는 0.4757 이었다.

(값 B) 와 (값 D) 의 상관 계수는 0.6314 였다.

도 7 에 산포도를 나타냈다.

따라서, 값 B 의 성체의 간세포쪽이 1 에 가까운 점에서 조직 구조체라고 인정할 수 있었다.

＜비교예＞

10 배 이상 변동되는 유전자 49 유전자

(값 C) 와 (값 E) 의 상관 계수는 -0.5000 이었다.

(값 B) 와 (값 E) 의 상관 계수는 -0.3496 이었다.

생체로부터 채취된 세포의 유전자 발현량 (값 B) 과 비교예의 유전자 발현량의 상관 계수는 부의 상관을 나타냈다. 이것으로부터, 필요 조건인 "정의 상관" 의 조건을 만족시키지 않는 조직 구조체라고 인정할 수 없다.

이 출원은, 2013년 6월 10일에 출원된 일본 특허출원 2013-122190호를 기초로 하는 우선권을 주장하고, 그 개시 전부를 여기에 도입한다.

1, 30 : 배양 용기
3 : 배양 플레이트
10, 20D : 오목부
11 : 바닥부
12 : 개구부
31 : 배양 공간
32 : 벽
33 : 바닥부
34 : 바닥부 배양면

Claims

인간 혈관 내피 세포 및 인간 간엽 간세포와 함께, 인간 인공 다능성 간세포 유래의 간장 내배엽 세포를 공배양하여 얻어지는 간조직 구조체로서,
복수의 기능에 대하여 피어슨의 적률 상관 계수 (Pearson product-moment correlation coefficient) 를 사용하여 검정한 값이, 태아로부터 채취된 세포 또는 생체 조직보다, 성체로부터 채취된 세포 또는 생체 조직의 값에 가깝고,
상기 조직 구조체가 스페로이드 형상을 갖고, 스페로이드의 직경이 50 ㎛ 내지 2 ㎜ 이고,
상기 복수의 기능이 VKORC1, UBD, TNFSF10, TDO2, TAP1, SORD, SERPING1, PXMP2, PSMB9, PSMB8, PNPLA7, PLG, ORM2, ORM1, NFIC, MX1, MGLL, MAT1A, LRG1, KNG1, KLF9, ITIH4, ILI3RA1, IGFBP4, IFIT1, HSD3B7, HRG, HP, HGD, HAMP, G0S2, FGGY, FBP1, F12, ETFDH, DEFB1, CTSO, CLDN2, CFI, CFH, CFB, C3, APOC3, ANG, ALDOB, ALDH3A2, ACAT1, ABCC3 및 ABCA6 을 포함하는 유전자의 발현량인, 간조직 구조체.
삭제
제 1 항에 있어서,
유전자 발현량이, 모든 유전자 단편이 고정되어 있는 DNA 칩을 사용하여 해석된 값인, 간조직 구조체.
삭제
삭제
제 1 항 또는 제 3 항에 있어서,
상기 복수의 기능이 간장에 특유의 기능인, 간조직 구조체.
인간 혈관 내피 세포 및 인간 간엽 간세포와 함께, 인간 인공 다능성 간세포 유래의 간장 내배엽 세포를 공배양하여 배양 형성물을 제작하고,
상기 배양 형성물이 갖는 복수의 기능에 관하여 피어슨의 적률 상관 계수 (Pearson product-moment correlation coefficient) 를 사용하여 검정하고,
검정한 값이, 태아로부터 채취된 세포 또는 생체 조직보다, 성체로부터 채취된 세포 또는 생체 조직의 값에 가까운 배양 형성물을 조직 구조체로서 추출하는 간조직 구조체의 제작 방법으로서,
상기 공배양이, 상당 직경이 20 ㎛ 내지 2.5 ㎜ 이고, 깊이가 20 ㎛ 내지 1000 ㎛ 인 마이크로 용기를 사용하여 수행되고,
상기 마이크로 용기가, 바닥부와 개구부로 구성되어 있고,
상기 개구부가, 상기 바닥부와의 경계에서부터 단부 (端部) 까지를 둘러싸는 테이퍼각 1 도 내지 20 도의 벽으로 구성되고,
상기 바닥부가, 반구상과 원뿔대 중 어느 형상을 갖고,
상기 복수의 기능이 VKORC1, UBD, TNFSF10, TDO2, TAP1, SORD, SERPING1, PXMP2, PSMB9, PSMB8, PNPLA7, PLG, ORM2, ORM1, NFIC, MX1, MGLL, MAT1A, LRG1, KNG1, KLF9, ITIH4, ILI3RA1, IGFBP4, IFIT1, HSD3B7, HRG, HP, HGD, HAMP, G0S2, FGGY, FBP1, F12, ETFDH, DEFB1, CTSO, CLDN2, CFI, CFH, CFB, C3, APOC3, ANG, ALDOB, ALDH3A2, ACAT1, ABCC3 및 ABCA6 을 포함하는 유전자의 발현량인, 간조직 구조체의 제작 방법.
삭제
제 7 항에 있어서,
유전자 발현량이, 모든 유전자 단편이 고정되어 있는 DNA 칩을 사용하여 해석되는, 간조직 구조체의 제작 방법.
삭제
제 7 항 또는 제 9 항에 있어서,
상기 공배양의 공정이, 응집체를 형성시키는 공정, 기관원기를 형성시키는 공정, 및 기관원기에 추가로 배양을 실시하여 성숙화시키는 공정을 포함하는, 간조직 구조체의 제작 방법.
제 11 항에 있어서,
응집체를 형성시키는 공정, 기관원기를 형성시키는 공정, 및 기관원기에 추가로 배양을 실시하여 성숙화시키는 공정에 있어서, 세포끼리가 결합하여 응집되어 있는, 간조직 구조체의 제작 방법.
제 11 항에 있어서,
응집체를 형성시키는 공정, 기관원기를 형성시키는 공정, 및 기관원기에 추가로 배양을 실시하여 성숙화시키는 공정에 있어서, 세포끼리가 결합하여 스페로이드 형상의 덩어리가 형성되어 있는, 간조직 구조체의 제작 방법.
제 13 항에 있어서,
상기 세포끼리가 형성하는 스페로이드의 직경이 50 ㎛ ∼ 2 ㎜ 인, 간조직 구조체의 제작 방법.
삭제
삭제
제 7 항 또는 제 9 항에 있어서,
상기 복수의 기능이 간장에 특유의 기능인, 간조직 구조체의 제작 방법.
삭제
제 7 항에 있어서,
상기 조직 구조체를, 배양 표면이 세포 비접착 표면인 배양 용기를 사용하여 배양하는, 간조직 구조체의 제작 방법.
제 19 항에 있어서,
상기 배양 표면이, 인지질, 인지질ㆍ고분자 복합체, 폴리(2-하이드록시에틸메타크릴레이트) (PHEMA), 폴리비닐알코올, 아가로오스, 키토산, 폴리에틸렌글리콜, 및 알부민의 그룹에서 선택되는 1 개 또는 이들 조합으로 이루어지는 폴리머가 세포와 접촉하는 배양면에 코트되어 있는 배양 용기인, 간조직 구조체의 제작 방법.
제 7 항에 있어서,
간장 내배엽 세포 : 인간 혈관 내피 세포 : 인간 간엽 간세포를, 하기의 비율로 공배양하고,
간장 내배엽 세포: 10
인간 혈관 내피 세포: 5 ∼ 10
인간 간엽 간세포: 1 ∼ 2,
또한 마이크로 용기 1 개당 20 개 ∼ 2000 개가 되는 밀도로 세포를 파종하는, 간조직 구조체의 제작 방법.
삭제