WO2023089732A1 - 微生物観察用デバイス - Google Patents

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WO2023089732A1
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compartments
region
internal space
microorganism
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真奈美 伊藤
壮輔 今村
和宏 高谷
佳織 高柳
伸明起 遠藤
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日本電信電話株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/34—Measuring or testing with condition measuring or sensing means, e.g. colony counters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to a device for observing microorganisms.
  • soil particles restrict the diffusion of substances between cell populations in soil microorganisms. For this reason, soil microorganisms are segregated according to relationships such as symbiotic relationships and competitive relationships.
  • a method for discovering symbiotic relationships between soil microorganisms is to select multiple soil microorganisms and co-cultivate them.
  • such methods can only be applied to microorganisms that can be isolated and cultured.
  • such methods are very time consuming when observing a large number of combinations of multiple microorganisms.
  • Non-Patent Document 1 describes the preparation of a plurality of droplets consisting of a bacterial fluid containing several microorganisms and a lipid membrane surrounding this bacterial fluid. and observing these droplets.
  • the purpose of the present invention is to provide a device for observing microorganisms that can continuously culture and observe microorganisms.
  • a device main body comprising a culture vessel having a hollow structure and a partition wall provided in the culture vessel and partitioning an internal space of the culture vessel into a plurality of compartments, wherein the culture vessel comprises the interior
  • One or more inflow holes and outflow holes are provided for communicating the space and the external space, respectively, and light transmitting portions having light transmittance are provided at the positions of the plurality of partitions, and the partition wall a device body that allows fluid movement between each of the plurality of compartments and the one or more inlet holes and between each of the plurality of compartments and the outlet hole; a culture medium filling each of the plurality of compartments; and a plurality of types of microorganisms located within the internal space
  • a microorganism observation device is provided in which at least one of the plurality of compartments contains two or more of the plurality of types of microorganisms and does not contain one or more of the plurality of types of microorganisms.
  • a culture vessel which has an internal space, and one or more inflow holes and outflow holes for communicating the internal space and the external space, respectively, and has a light-transmitting portion having a light-transmitting property. and supplying a microorganism-containing liquid containing a plurality of types of microorganisms, a photocurable resin, and a culture solution to the internal space; Part of the microorganism-containing liquid is irradiated with light through the light-transmitting portion to form a partition wall made of a cured product of the photocurable resin and partitioning the internal space into a plurality of partitions of the plurality of partitions.
  • the culture solution is continuously or intermittently supplied to the microorganism observation device according to the first aspect through the one or more inlets to culture the plurality of types of microorganisms.
  • a method for culturing microorganisms comprising:
  • the fourth aspect of the present invention among the plurality of types of microorganisms included in the device for observing microorganisms according to the first aspect, those located in one or more of the plurality of compartments are selected from the light-transmitting portions.
  • a method of observing microorganisms including observing through.
  • a device for observing microorganisms capable of continuously culturing and observing microorganisms is provided.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing an example of a top view of a device for observing microorganisms according to an embodiment.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view of the microorganism observation device shown in FIG. 1 taken along line II-II.
  • FIG. 3 is an enlarged view of the microorganism observation device shown in FIG.
  • FIG. 4 is a cross-sectional view showing an example of a method for manufacturing a device for observing microorganisms according to an embodiment.
  • FIG. 5 is a schematic diagram showing an example of a top view of a device for observing microorganisms according to another embodiment.
  • FIG. 6 is a schematic diagram showing an example of a top view of a device for observing microorganisms according to still another embodiment.
  • FIG. 7 is a schematic diagram showing an example of a top view of a device for observing microorganisms according to still another embodiment.
  • FIG. 8 is a schematic diagram showing an example of a droplet generation device
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing an example of a top view of a device for observing microorganisms according to an embodiment of the present invention.
  • This microbe observation device 1 includes a device main body 2 , a culture solution 3 and a plurality of types of microbes 4 .
  • the device main body 2 includes a culture container 20 having a hollow structure and a partition wall 21 provided inside the culture container 20 .
  • the culture vessel 20 is provided with one or more inflow holes 200 and one or more outflow holes 201 that allow the internal space 202 and the external space of the culture vessel 20 to communicate with each other.
  • the culture vessel 20 has light-transmitting portions that are light-transmitting at positions of a plurality of compartments.
  • the culture vessel 20 as a whole is light transmissive, but the culture vessel 20 may be light transmissive only at the positions of a plurality of compartments. A plurality of partitions will be described later.
  • the internal space 202 includes a first portion A1 communicating with one or more outflow holes 201, a second portion A2 communicating with the outflow holes, and a third portion A3 communicating the first portion A1 and the second portion A2. contains.
  • the partition wall 21 divides the internal space 202 of the culture vessel 20, specifically the third portion A3, into a plurality of compartments P.
  • the partition walls 21 are grid-like.
  • the partition wall 21 allows liquid to move between each of the plurality of compartments P and one or more inflow holes 200 and between each of the plurality of compartments P and the outflow hole 201 .
  • the partition wall 21 prevents the multiple types of microorganisms 4 located in a certain compartment from moving to another compartment.
  • a plurality of partitions P shown in FIG. 1 form one or more rows each composed of a plurality of partitions P arranged in the first direction.
  • the one or more inflow holes 200, the one or more rows, and the outflow holes 201 are arranged in this order in a second direction intersecting the first direction.
  • the culture solution 3 fills each of the multiple compartments P.
  • the culture solution 3 is, for example, a liquid for culturing multiple types of microorganisms 4 .
  • a plurality of types of microorganisms 4 are located within the internal space 202 .
  • the multiple types of microorganisms 4 are, for example, soil microorganisms.
  • two or more of the plurality of types of microorganisms 4 are present and one or more of the plurality of types of microorganisms 4 are not present.
  • two or three microorganisms are present in each of at least one of the plurality of compartments P.
  • a combination of multiple types of microorganisms 4 located in a certain compartment P among multiple compartments P and a combination of multiple types of microorganisms 4 located in at least one other compartment P are preferably different.
  • At least one of the plurality of compartments P does not have to contain multiple types of microorganisms 4 .
  • multiple types of microorganisms 4 may exist in the partition wall 21 .
  • FIG. 2 is a cross-sectional view of the microorganism observation device shown in FIG. 1 taken along line II-II.
  • the culture vessel 20 is composed of a first substrate 20A and a plate-like second substrate 20B bonded to the first substrate 20A.
  • the main surface of the first substrate 20A on the side facing the second substrate 20B is provided with two through holes and a recess that communicates with the through holes.
  • the two through holes and recesses correspond to the inflow hole 200, the outflow hole 201 and the internal space 202, respectively.
  • the inner surface of the culture container 20 includes a first region R1 and a second region R2 facing each other. Moreover, the partition wall 21 extends from the first region R1 toward the second region R2 and is separated from the second region R2. Thus, since the partition wall 21 is separated from the second region R2, in the microorganism observation device 1 shown in FIG. and the outflow hole 201 is possible. Moreover, the partition 21 is separated from the second region R2 to such an extent that the plurality of types of microorganisms 4 cannot pass through between the partition 21 and the second region R2.
  • D1 shown in FIG. 2 is the length of the partition wall 21 .
  • D2 shown in FIG. 2 is the height of the internal space 202 .
  • the difference D2-D1 is preferably in the range of 500 nm to 1000 nm.
  • FIG. 3 is an enlarged view of the microorganism observation device 1 shown in FIG. D3 shown in FIG. 3 is the width of the third portion A3.
  • the width D3 is preferably in the range of 100 ⁇ m to 10000 ⁇ m.
  • the vertical width D4 shown in FIG. 3 is the vertical width of the third portion A3.
  • the vertical width D4 is preferably in the range of 100 ⁇ m to 10000 ⁇ m.
  • each partition P is preferably in the range of 10 ⁇ m to 100 ⁇ m.
  • the vertical width of each section P is preferably in the range of 10 ⁇ m to 100 ⁇ m.
  • the microorganism observation device 1 shown in FIG. 1 can be manufactured, for example, by the following method.
  • an internal space 202 and one or more inflow holes 200 and outflow holes 201 for communicating the internal space 202 and the external space, respectively, are provided, and a light-transmitting portion having a light-transmitting property is provided.
  • a culture container 20 is prepared. Here, it is assumed that the entire culture vessel 20 is light transmissive.
  • a microorganism-containing liquid containing multiple types of microorganisms 4, a photocurable resin, and a culture solution is supplied to the internal space 202.
  • the amount of multiple types of microorganisms 4 contained in the microorganism-containing liquid can be adjusted according to the number of microorganisms positioned in each compartment P, for example.
  • the mask 5 is placed on or above the upper surface of the culture container 20.
  • the mask 5 has a light shielding portion corresponding to the internal space 202 and a transmitting portion corresponding to the partition wall 21 .
  • FIG. 4 a part of the microorganism-containing liquid is irradiated with ultraviolet rays 6 through a mask 5 .
  • the hollow arrow shown in FIG. 4 indicates the propagation direction of the ultraviolet rays 6 .
  • the photocurable resin is cured only in the part of the microorganism-containing liquid that has been irradiated with the ultraviolet rays 6.
  • the partition wall 21 that divides the internal space 202 into a plurality of sections P is formed from a cured product of a photocurable resin.
  • the partition wall 21 enables movement of liquid between each of the plurality of compartments P and one or more inflow holes 200 and between each of the plurality of compartments P and the outflow hole 201, At least one is formed so that two or more of the plurality of types of microorganisms 4 exist and one or more of the plurality of types of microorganisms 4 do not exist.
  • the partition wall 21 is formed so as to extend from the first region R1 toward the second region R2 and be separated from the second region R2. As described with reference to FIG. 2, the partition wall 21 is separated from the second region R2 to such an extent that the plurality of types of microorganisms 4 cannot pass through between the partition wall 21 and the second region R2 of the inner surface of the culture vessel 20. ing.
  • Such partition walls 21 can be formed, for example, by adjusting the conditions of light irradiation. For example, if the irradiation time is relatively short, the curing of the photocurable resin is likely to progress on the first region R1 side, and the curing of the photocurable resin is difficult to progress on the second region R2 side. partition wall 21 can be formed. The method of manufacturing the microorganism observation device 1 shown in FIG. 1 has been described above.
  • the microorganism observation device 1 described above can be used in a method for culturing microorganisms.
  • a method of culturing microorganisms includes, for example, continuously or intermittently supplying a culture medium through one or more inlet holes 200 described above to culture a plurality of types of microorganisms 4 .
  • the composition of the culture solution may be changed over time.
  • the microorganism observation device 1 described above can be used for a microorganism observation method.
  • the method of observing microorganisms includes, for example, observing through a light-transmitting portion, among the plurality of types of microorganisms 4 provided in the microorganism observation device 1, those located in one or more of the plurality of sections P. include.
  • the culture and observation of microorganisms described above can also be performed simultaneously.
  • FIG. 5 is a schematic diagram showing an example of a top view of the microorganism observation device 1 according to another embodiment.
  • the culture container 20 is provided with two inlets 200, that is, an inlet 200A and an inlet 200B. Further, in the first portion A1 of the device main body 2 shown in FIG. is provided. Microorganism observation device 1 shown in FIG. It is the same as the observation device 1.
  • the concentration gradient generator G shown in FIG. 5 consists of a first concentration gradient generator G1 and a second concentration gradient generator G2.
  • the first concentration gradient generator G1 includes two first flow paths F1 and three branched second flow paths F2.
  • the inlets of the two first flow paths F1 are connected to the inflow hole 200A and the inflow hole 200B, respectively.
  • Each second flow path F2 meanders.
  • Two of the three second flow paths F2 each have their inlet connected to one of the outlets that one of the two first flow paths F1 has.
  • the remaining three second flow paths F2 have their inlets connected to one of the two outlets of the two first flow paths F1 and one of the outlets of the other.
  • the second concentration gradient generating section G2 includes three branched third flow paths F3 and four fourth flow paths F4.
  • the three third flow paths F3 have their inlets connected to the outlets of the three second flow paths, respectively.
  • Each fourth flow path F4 meanders.
  • Two of the four fourth flow paths F4 each have their inlet connected to one of the outlets that one of the three third flow paths F3 has.
  • the remaining four fourth flow paths F4 have their inlets connected to one of the outlets of two of the three third flow paths F3 and one of the outlets of the other. there is The outlets of the four fourth flow paths F4 are connected to the plurality of compartments P, respectively.
  • the microorganism observation device 1 shown in FIG. 5 described above by supplying culture solutions having different compositions to the inlet 200A and the inlet 200B, respectively, the four compartments arranged in the horizontal direction in FIG. , it is possible to supply culture solutions with different compositions. For example, when a high-concentration culture solution is supplied to the inflow hole 200A and a low-concentration culture solution is supplied to the inflow hole 200B, the concentration of the culture solution can be decreased from the left compartment to the right compartment.
  • the first concentration gradient generating section G1 described above includes two first flow paths F1 and three second flow paths F2, the first concentration gradient generating section G1 includes three or more first flow paths F1 and four flow paths F2.
  • the above second flow path F2 may be included.
  • the second concentration gradient generator G2 may be omitted.
  • the microorganism observation device 1 shown in FIG. 5 has been described above.
  • FIG. 6 is a schematic diagram showing an example of a top view of a device for observing microorganisms according to still another embodiment.
  • the microorganism observation device 1 shown in FIG. 6 is the same as the microorganism observation device 1 shown in FIG. 1 except that the shape of the partition wall 21 is different from the shape of the partition wall 21 shown in FIG.
  • the partition wall 21 shown in FIG. 6 is composed of an assembly of a plurality of columns 211A.
  • each pillar 211A is cylindrical.
  • Each pillar 211A extends from the first region R1 to the second region R2. That is, the partition wall 21 shown in FIG. 1 is separated from the second region R2, but the pillar 211A shown in FIG. 6 is in contact with the second region R2.
  • gaps are provided that allow liquid to move between each of the plurality of compartments P and the inflow hole 200 and between each of the plurality of compartments P and the outflow hole 201. It is The size of this gap is set to a size that does not allow movement of microorganisms.
  • the microorganism observation device 1 shown in FIG. 6 has been described above.
  • FIG. 7 is a schematic diagram showing an example of a top view of a device for observing microorganisms according to still another embodiment.
  • the microorganism observation device 1 shown in FIG. 7 is the same as the microorganism observation device 1 shown in FIG. 1 except that the shape of the partition wall 21 is different from the shape of the partition wall 21 shown in FIG.
  • the partition wall 21 shown in FIG. 7 extends from the first region R1 to the second region R2. That is, the partition 21 shown in FIG. 1 is separated from the second region R2, but the partition 21 shown in FIG. 7 is in contact with the second region R2.
  • the partition wall 21 shown in FIG. 7 has flow paths that allow liquid to move between each of the plurality of compartments P and the inflow hole 200 and between each of the plurality of compartments P and the outflow hole 201. is provided.
  • the size of this channel is set to a size that does not allow movement of microorganisms.
  • the microorganism observation device 1 shown in FIG. 7 has been described above.
  • the microorganism observation device 1 described above has a light-transmitting portion having light-transmitting properties at the positions of a plurality of sections P. Therefore, of the plurality of types of microorganisms 4 provided in the microorganism observation device 1 described above, those located in one or more of the plurality of sections P can be observed through the light transmitting portion. . Thus, according to the microorganism observation device 1 described above, it is possible to observe the symbiotic relationships of a plurality of combinations of microorganisms.
  • Another example of a method for co-cultivating multiple types of microorganisms is a method using a droplet generator.
  • the droplet generation device will be described below with reference to FIG.
  • FIG. 8 is a schematic diagram showing an example of the droplet generation device 7.
  • the droplet generation device 7 includes a culture solution supply section 70 , a droplet generation section 71 , an oil film material supply section 72 and a droplet storage section 73 .
  • the culture solution supply unit 70 contains a microbial culture solution 700 containing multiple types of microorganisms.
  • the culture medium supply unit 70 is connected to the droplet generation unit 71 .
  • the culture solution supply unit 70 can intermittently supply the microbial culture solution 700 to the droplet generation unit 71 .
  • the oil film material supply unit 72 is connected to the droplet generation unit 71.
  • the oil film material supply unit 72 can supply the oil film material to the droplet generation unit 71 .
  • the outline arrow shown in FIG. 8 indicates the direction in which the oil film material supply unit 72 supplies the oil film material to the droplet generation unit 71 .
  • the droplet generation unit 71 is connected to the culture fluid supply unit 70, the oil film material supply unit 72, and the droplet storage unit 73.
  • the microbial culture solution 700 supplied from the droplet generator 71 is encapsulated with the oil film material supplied to the droplet generator 71 .
  • This encapsulation produces a droplet 74 consisting of a microbial culture solution 700 and an oil film 740 covering the microbial culture solution 700 .
  • the droplet storage unit 73 is a container that stores the droplets 74 generated by the droplet generation unit 71 .
  • the droplet storage part 73 is filled with an aqueous medium.
  • the droplet generation device 7 described above generates droplets 74 by the following method.
  • the microbial culture solution 700 is intermittently supplied from the culture solution supply unit 70 to the droplet generation unit 71 .
  • the microbial culture solution 700 supplied to the droplet generation unit 71 passes through the droplet generation unit 71 and enters the droplet storage unit 73, it is supplied to the droplet generation unit 71 by the oil film material supply unit 72.
  • the microbial culture solution 700 is encapsulated by the oil film material.
  • a droplet 74 is generated by this encapsulation.
  • the method of generating the droplet 74 has been described above.
  • the composition of the culture solution cannot be changed for each droplet. For this reason, if the substance required for survival differs for each droplet, it is not possible to observe the symbiotic relationship between multiple types of microorganisms in some droplets.
  • the partition wall 21 allows liquid to move between each of the plurality of compartments P and one or more inflow holes 200 and between each of the plurality of compartments P and the outflow hole 201. is possible. Therefore, it is possible to continuously or intermittently supply a liquid such as the culture medium 3 to the plurality of compartments P. Therefore, with the microorganism observation device 1 described above, it is possible to culture a plurality of types of microorganisms 4 for a long period of time. It can be seen that in the section P successfully cultured by the above-described method for culturing microorganisms, multiple types of microorganisms 4 located in the section P can coexist with each other.
  • the concentration of the culture solution filling a certain section P and the culture solution filling another section P can be made different.
  • the composition of the culture solution can be changed according to the combination of microorganisms.
  • microorganism observation device 1 it is possible to culture a plurality of types of microorganisms 4 for a long period of time, that is, to continuously culture them. Further, as described above, according to the microorganism observation device 1 described above, it is possible to observe a symbiotic relationship between a plurality of combinations of microorganisms. Therefore, according to the microorganism observation device 1 described above, it is possible to continuously culture and observe various combinations of microorganisms.
  • microorganism observation device 1 described above includes the partition wall 21 described above, it is possible to change the type of culture solution that fills the compartment P over time.

Abstract

微生物を連続培養及び観察することが可能な微生物観察用デバイスを提供する。微生物観察用デバイスは、中空構造を有している培養容器と、前記培養容器内に設けられ、前記培養容器の内部空間を複数の区画へ区分する隔壁とを備えたデバイス本体であって、前記培養容器は、前記内部空間と外部空間とを各々が連通させる１以上の流入孔と流出孔とが設けられ、前記複数の区画の位置で光透過性を有している光透過部分を有し、前記隔壁は、前記複数の区画の各々と前記１以上の流入孔との間及び前記複数の区画の各々と前記流出孔との間での液体の移動を可能とするデバイス本体と、前記複数の区画の各々を満たした培養液と、前記内部空間内に位置した複数種類の微生物とを備え、前記複数の区画の少なくとも１つには、前記複数種類の微生物の２種類以上が存在し且つ前記複数種類の微生物の１種類以上が存在しない。

Description

微生物観察用デバイス
　本発明は、微生物観察用デバイスに関する。
　水中に存在する微生物とは異なり、土壌微生物は土壌粒子により細胞集団間の物質拡散が制限されている。このため、共生関係及び競争関係等の関係に応じて土壌微生物は棲み分けられている。
　土壌微生物の共生関係を発見する方法として、任意の土壌微生物を複数選択し、これら土壌微生物を共培養する方法が挙げられる。しかしながら、このような方法は単離培養が可能な微生物にしか適用することができない。また、このような方法によると、複数の微生物からなる多数の組み合わせを観察する場合には莫大な時間がかかる。
　複数の微生物からなる多数の組み合わせを観察する方法として、例えば、非特許文献１には、数個の微生物を含んだ菌液とこの菌液を取り囲んだ脂質膜とからなる複数のドロップレットを作成し、これらドロップレットを観察することが記載されている。
Toju, Hirokazu, Kabir G. Peay, Masato Yamamichi, Kazuhiko Narisawa, Kei Hiruma, Ken Naito, Shinji Fukuda, et al.、「Core Microbiomes for Sustainable Agroecosystems.」、Nature Plants、4 (5): p.247－57
　本発明は、微生物を連続培養及び観察することが可能な微生物観察用デバイスを提供することを目的とする。
　本発明の第１側面によると、
　中空構造を有している培養容器と、前記培養容器内に設けられ、前記培養容器の内部空間を複数の区画へ区分する隔壁とを備えたデバイス本体であって、前記培養容器は、前記内部空間と外部空間とを各々が連通させる１以上の流入孔と流出孔とが設けられ、前記複数の区画の位置で光透過性を有している光透過部分を有し、前記隔壁は、前記複数の区画の各々と前記１以上の流入孔との間及び前記複数の区画の各々と前記流出孔との間での液体の移動を可能とするデバイス本体と、
　前記複数の区画の各々を満たした培養液と、
　前記内部空間内に位置した複数種類の微生物と
を備え、
　前記複数の区画の少なくとも１つには、前記複数種類の微生物の２種類以上が存在し且つ前記複数種類の微生物の１種類以上が存在しない微生物観察用デバイスが提供される。
　本発明の第２側面によると、
　内部空間と、前記内部空間と外部空間とを各々が連通させる１以上の流入孔と流出孔とが設けられ、光透過性を有している光透過部分を有している培養容器を準備することと、
　複数種類の微生物と光硬化性樹脂と培養液とを含んだ微生物含有液を前記内部空間に供給することと、
　前記光透過部分を介して前記微生物含有液の一部に光を照射して、前記光硬化性樹脂の硬化物からなり、前記内部空間を複数の区画に区分する隔壁を、前記複数の区画の各々と前記１以上の流入孔との間、及び前記複数の区画の各々と前記流出孔との間での液体の移動を可能とし、且つ前記複数の区画の少なくとも１つに、前記複数種類の微生物の２種類以上が存在し且つ前記複数種類の微生物の１種類以上が存在しないように形成することと
を含んだ微生物観察用デバイスの製造方法が提供される。
　本発明の第３側面によると、第１側面に係る微生物観察用デバイスに、前記１以上の流入孔を介して、前記培養液を連続又は断続的に供給して前記複数種類の微生物を培養することを含んだ微生物の培養方法が提供される。
　本発明の第４側面によると、第１側面に係る微生物観察用デバイスが備えている前記複数種類の微生物のうち、前記複数の区画の１以上に位置しているものを、前記光透過部分を介して観察することを含んだ微生物の観察方法が提供される。
　本発明によると、微生物を連続培養及び観察することが可能な微生物観察用デバイスが提供される。
図１は、実施形態に係る微生物観察用デバイスの上面図の一例を示す模式図である。 図２は、図１に示す微生物観察用デバイスのＩＩ－ＩＩ線に沿った断面図である。 図３は、図１に示す微生物観察用デバイスの拡大図である。 図４は、実施形態に係る微生物観察用デバイスの製造方法の一例を示す断面図である。 図５は、他の実施形態に係る微生物観察用デバイスの上面図の一例を示す模式図である。 図６は、更に他の実施形態に係る微生物観察用デバイスの上面図の一例を示す模式図である。 図７は、更に他の実施形態に係る微生物観察用デバイスの上面図の一例を示す模式図である。 図８は、ドロップレット生成装置の一例を示す模式図である。
　以下、本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。以下に参照する図面において、同一部分には同一符号を付し、重複する説明は省略する。なお、本発明は、以下の実施形態には限定されない。
　＜１．微生物観察用デバイス＞
　図１は、本発明の実施形態に係る微生物観察用デバイスの上面図の一例を示す模式図である。　
　この微生物観察用デバイス１は、デバイス本体２と培養液３と複数種類の微生物４とを備えている。
　デバイス本体２は、中空構造を有している培養容器２０と、培養容器２０内に設けられた隔壁２１とを備えている。
　培養容器２０には、培養容器２０の内部空間２０２と外部空間とを各々が連通させる１以上の流入孔２００と流出孔２０１とが設けられている。また、培養容器２０は、複数の区画の位置で光透過性を有している光透過部分を有している。ここでは、培養容器２０の全体が光透過性を有しているが、培養容器２０は複数の区画の位置でのみ光透過性を有していてもよい。複数の区画については後述する。
　内部空間２０２は、１以上の流出孔２０１と連通した第１部分Ａ１と、流出孔と連通した第２部分Ａ２と、第１部分Ａ１と第２部分Ａ２とを連通させる第３部分Ａ３とを含んでいる。
　隔壁２１は、培養容器２０の内部空間２０２、具体的には、第３部分Ａ３を複数の区画Ｐへ区分している。ここでは、隔壁２１は、格子状である。隔壁２１は、複数の区画Ｐの各々と１以上の流入孔２００との間及び複数の区画Ｐの各々と流出孔２０１との間での液体の移動を可能としている。また、隔壁２１は、ある区画内に位置している複数種類の微生物４が、別の区画へ移動することを妨げている。
　図１に示す複数の区画Ｐは、第１方向へ配列した複数の区画Ｐから各々がなる１以上の列を形成している。また、１以上の流入孔２００と、上記の１以上の列と、流出孔２０１とは、上述した第１方向に対して交差する第２方向へこの順に配列している。
　培養液３は、複数の区画Ｐの各々を満たしている。培養液３は、例えば、複数種類の微生物４を培養するための液体である。
　複数種類の微生物４は、内部空間２０２内に位置している。複数種類の微生物４は、例えば、土壌微生物である。
　複数の区画Ｐの少なくとも１つには、複数種類の微生物４の２種類以上が存在し且つ複数種類の微生物４の１種類以上が存在しない。
　複数の区画Ｐの少なくとも１つの各々には、例えば、２個又は３個の微生物が存在している。
　また、複数の区画Ｐのうち、ある区画Ｐの中に位置している複数種類の微生物４の組み合わせと、他の少なくとも１つの区画Ｐの中に位置している複数種類の微生物４の組み合わせとは異なることが好ましい。
　なお、複数の区画Ｐの少なくとも１つには、複数種類の微生物４が存在していなくてもよい。また、隔壁２１の中に、複数種類の微生物４が存在していてもよい。
　図２は、図１に示す微生物観察用デバイスのＩＩ－ＩＩ線に沿った断面図である。　
　図２に示すように、培養容器２０は、第１基板２０Ａと、第１基板２０Ａと貼り合わされた板状の第２基板２０Ｂとからなる。第２基板２０Ｂと対向している側の、第１基板２０Ａの主面には、２つの貫通孔と、これら貫通孔を連通させる凹部とが設けられている。２つの貫通孔及び凹部は、それぞれ、流入孔２００、流出孔２０１及び内部空間２０２に対応している。
　培養容器２０の内面は、互いに向き合った第１領域Ｒ１及び第２領域Ｒ２を含んでいる。また、隔壁２１は、第１領域Ｒ１から第２領域Ｒ２に向けて伸び且つ第２領域Ｒ２から離間している。このように、隔壁２１は第２領域Ｒ２から離間しているため、図１に示す微生物観察用デバイス１では、複数の区画Ｐの各々と１以上の流入孔２００との間及び複数の区画Ｐの各々と流出孔２０１との間での液体の移動が可能である。また、隔壁２１は、複数種類の微生物４が隔壁２１と第２領域Ｒ２との間を通り抜けられない程度に、第２領域Ｒ２から離間している。
　図２に示すＤ１は、隔壁２１の長さである。また、図２に示すＤ２は、内部空間２０２の高さである。差分Ｄ２－Ｄ１は、５００ｎｍ乃至１０００ｎｍの範囲内にあることが好ましい。
　図３は、図１に示す微生物観察用デバイス１の拡大図である。　
　図３に示すＤ３は、第３部分Ａ３の横幅である。横幅Ｄ３は、１００μｍ乃至１００００μｍの範囲内にあることが好ましい。
　図３に示すＤ４は、第３部分Ａ３の縦幅である。縦幅Ｄ４は、１００μｍ乃至１００００μｍの範囲内にあることが好ましい。
　各区画Ｐの横幅は、１０μｍ乃至１００μｍの範囲内にあることが好ましい。　
　また、各区画Ｐの縦幅は、１０μｍ乃至１００μｍの範囲内にあることが好ましい。
　＜２．微生物観察用デバイスの製造方法＞
　図１に示す微生物観察用デバイス１は、例えば、以下の方法により製造することができる。
　この方法では、先ず、内部空間２０２と、内部空間２０２と外部空間とを各々が連通させる１以上の流入孔２００と流出孔２０１とが設けられ、光透過性を有している光透過部分を有している培養容器２０を準備する。ここでは、培養容器２０全体が光透過性であるとする。
　次に、複数種類の微生物４と光硬化性樹脂と培養液とを含んだ微生物含有液を内部空間２０２に供給する。
　微生物含有液が含む複数種類の微生物４の量は、例えば、各区画Ｐ内に位置させる微生物の個数に応じて調節することができる。
　次に、図４に示すように、培養容器２０の上面の上又はその上方にマスク５を設置する。マスク５は、内部空間２０２に対応した遮光部と、隔壁２１に対応した透過部とを有している。
　次に、図４に示すように、マスク５を介して微生物含有液の一部に紫外線６を照射する。図４に示す白抜き矢印は、紫外線６の伝播方向を示す。
　この紫外線照射により、微生物含有液のうち、紫外線６が照射された部分のみで光硬化性樹脂を硬化させる。この照射により、光硬化性樹脂の硬化物からなり、内部空間２０２を複数の区画Ｐに区分する隔壁２１を形成する。隔壁２１は、複数の区画Ｐの各々と１以上の流入孔２００との間、及び複数の区画Ｐの各々と流出孔２０１との間での液体の移動を可能とし、且つ複数の区画Ｐの少なくとも１つに、複数種類の微生物４の２種類以上が存在し且つ複数種類の微生物４の１種類以上が存在しないように形成する。
　ここでは、図２に示すように、隔壁２１を第１領域Ｒ１から第２領域Ｒ２へ向けて伸び且つ第２領域Ｒ２から離間するように形成する。図２を用いて説明した通り、隔壁２１は、複数種類の微生物４が隔壁２１と培養容器２０の内面のうち第２領域Ｒ２との間を通り抜けられない程度に、第２領域Ｒ２から離間している。このような隔壁２１は、例えば、光照射の条件を調節することで形成することができる。例えば、照射時間を比較的短くすると、第１領域Ｒ１側で光硬化性樹脂の硬化が進行させやすく、第２領域Ｒ２側では光硬化性樹脂の硬化を進行させにくいため、図２に示すような隔壁２１を形成することができる。　
　以上、図１に示す微生物観察用デバイス１の製造方法について述べた。
　＜３．培養方法及び観察方法＞
　上述した微生物観察用デバイス１は、一例によると、微生物の培養方法に用いることができる。微生物の培養方法は、例えば、上述した１以上の流入孔２００を介して、培養液を連続又は断続的に供給して複数種類の微生物４を培養することを含む。培養液を連続又は断続的に供給する場合、培養液の組成は経時的に変更させてもよい。
　また、上述した微生物観察用デバイス１は、他の例によると、微生物の観察方法に用いることができる。微生物の観察方法は、例えば、微生物観察用デバイス１が備えている複数種類の微生物４のうち、複数の区画Ｐの１以上に位置しているものを、光透過部分を介して観察することを含む。　
　上述した微生物の培養及び観察は同時に行うことも可能である。
　＜４．変形例＞
　図５は、他の実施形態に係る微生物観察用デバイス１の上面図の一例を示す模式図である。図５に示す微生物観察用デバイス１では、培養容器２０に２つの流入孔２００、即ち、流入孔２００Ａと流入孔２００Ｂとが設けられている。また、図５に示すデバイス本体２の第１部分Ａ１、即ち、内部空間２０２内であって、流入孔２００Ａ及び流入孔２００Ｂと複数の区画Ｐからなる配列との間に、濃度勾配生成部Ｇが設けられている。図５に示す微生物観察用デバイス１は、培養容器２０に２つの流入孔が設けられていることと、デバイス本体２に濃度勾配生成部Ｇが設けられていること以外は、図１に示す微生物観察用デバイス１と同じである。
　図５に示す濃度勾配生成部Ｇは、第１濃度勾配生成部Ｇ１と第２濃度勾配生成部Ｇ２とからなる。　
　第１濃度勾配生成部Ｇ１は、各々が分岐した２つの第１流路Ｆ１と３つの第２流路Ｆ２とを含んでいる。２つ第１流路Ｆ１は、それらの入口が、流入孔２００Ａ及び流入孔２００Ｂにそれぞれ接続されている。各第２流路Ｆ２は蛇行している。３つの第２流路Ｆ２の２つの各々は、その入口が２つの第１流路Ｆ１の１つが有している出口の１つに接続されている。また、３つの第２流路Ｆ２の残りは、その入口が２つの第１流路Ｆ１の２つの一方が有している出口の１つと他方が有している出口の１つとに接続されている。
　第２濃度勾配生成部Ｇ２は、各々が分岐した３つの第３流路Ｆ３と４つの第４流路Ｆ４とを含んでいる。３つの第３流路Ｆ３は、それらの入口が、３つの第２流路の出口にそれぞれ接続されている。各第４流路Ｆ４は蛇行している。４つの第４流路Ｆ４の２つの各々は、その入口が、３つの第３流路Ｆ３の１つが有している出口の１つに接続されている。また、４つの第４流路Ｆ４の残りは、その入口が３つの第３流路Ｆ３の２つの一方が有している出口の１つと他方が有している出口の１つとに接続されている。４つの第４流路Ｆ４は、それらの出口が、複数の区画Ｐにそれぞれ接続されている。
　上述した図５に示す微生物観察用デバイス１では、流入孔２００Ａと流入孔２００Ｂとに、互いに組成が異なる培養液をそれぞれ供給することで、図５において横方向に並んだ４つの区画に対して、互いに異なる組成の培養液を供給することができる。例えば、流入孔２００Ａに高濃度の培養液を供給し、流入孔２００Ｂに低濃度の培養液を供給した場合、左側の区画から右側の区画にかけて、培養液の濃度を小さくすることができる。
　なお、上述した第１濃度勾配生成部Ｇ１は２つの第１流路Ｆ１と３つの第２流路Ｆ２とを含むが、第１濃度勾配生成部Ｇ１は３以上の第１流路Ｆ１と４以上の第２流路Ｆ２とを含んでいてもよい。また、第２濃度勾配生成部Ｇ２は省略してもよい。　
　以上、図５に示す微生物観察用デバイス１について述べた。
　図６は、更に他の実施形態に係る微生物観察用デバイスの上面図の一例を示す模式図である。図６に示す微生物観察用デバイス１は、隔壁２１の形状が、図１に示す隔壁２１の形状と異なること以外は、図１に示す微生物観察用デバイス１と同じである。
　図６に示す隔壁２１は、複数の柱２１１Ａの集合体からなる。ここでは、各柱２１１Ａは、円柱状である。各柱２１１Ａは、第１領域Ｒ１から第２領域Ｒ２まで伸びている。即ち、図１に示す隔壁２１は第２領域Ｒ２から離間していたが、図６に示す柱２１１Ａは第２領域Ｒ２と接している。隣り合う２つの柱２１１Ａの間には、複数の区画Ｐの各々と流入孔２００との間及び複数の区画Ｐの各々と流出孔２０１との間での液体の移動を可能とする間隙が設けられている。この間隙の大きさは、微生物の移動が生じ得ない大きさとする。　
　以上、図６に示す微生物観察用デバイス１について述べた。
　図７は、更に他の実施形態に係る微生物観察用デバイスの上面図の一例を示す模式図である。図７に示す微生物観察用デバイス１は、隔壁２１の形状が、図１に示す隔壁２１の形状と異なること以外は、図１に示す微生物観察用デバイス１と同じである。
　図７に示す隔壁２１は、第１領域Ｒ１から第２領域Ｒ２まで伸びている。即ち、図１に示す隔壁２１は第２領域Ｒ２から離間していたが、図７に示す隔壁２１は第２領域Ｒ２と接している。また、図７に示す隔壁２１には、複数の区画Ｐの各々と流入孔２００との間及び複数の区画Ｐの各々と流出孔２０１との間での液体の移動を可能とする流路が設けられている。この流路の大きさは、微生物の移動が生じ得ない大きさとする。　
　以上、図７に示す微生物観察用デバイス１について述べた。
　＜５．効果＞
　ところで、複数種類の微生物を共培養する方法の一例として、区画が設けられていない培養容器で複数種類の微生物を培養する方法がある。しかしながら、この方法によって培養した複数種類の微生物を観察する場合、培養容器から観察用プレートへ複数種類の微生物を移動させる必要があった。このため、このような方法では観察する際に手間が生じる。また、微生物の種類が多い場合においては、観察する際に特に手間が生じる。
　一方、上述した微生物観察用デバイス１は、複数の区画Ｐの位置で光透過性を有している光透過部分を有している。このため、上述した微生物観察用デバイス１が備えている複数種類の微生物４のうち、複数の区画Ｐの１以上に位置しているものを、光透過部分を介して観察することが可能である。このように、上述した微生物観察用デバイス１によると複数の組み合わせの微生物の共生関係等を観察することができる。
　また、複数種類の微生物を共培養する方法の他の一例として、ドロップレット生成装置を用いた方法がある。以下、図８を参照しながらドロップレット生成装置について説明する。
　図８は、ドロップレット生成装置７の一例を示す模式図である。ドロップレット生成装置７は、培養液供給部７０とドロップレット生成部７１と油膜材料供給部７２とドロップレット収容部７３とを備えている。
　培養液供給部７０は、複数種類の微生物を含む微生物培養液７００を収容している。培養液供給部７０は、ドロップレット生成部７１と接続されている。培養液供給部７０は、微生物培養液７００をドロップレット生成部７１に断続的に供給することが可能である。
　油膜材料供給部７２は、ドロップレット生成部７１と接続されている。油膜材料供給部７２は、油膜材料をドロップレット生成部７１に供給することが可能である。図８に示す白抜き矢印は、油膜材料供給部７２がドロップレット生成部７１へ油膜材料を供給する方向を示す。
　ドロップレット生成部７１は、培養液供給部７０、油膜材料供給部７２、及びドロップレット収容部７３と接続されている。ドロップレット生成部７１では、ドロップレット生成部７１から供給された微生物培養液７００が、ドロップレット生成部７１に供給された油膜材料でカプセル化される。このカプセル化によって、微生物培養液７００と、微生物培養液７００を被覆する油膜７４０とからなるドロップレット７４が生成される。
　ドロップレット収容部７３は、ドロップレット生成部７１で生成されたドロップレット７４を収容する容器である。ドロップレット収容部７３は、水系媒体で満たされている。
　上述したドロップレット生成装置７では、以下の方法によってドロップレット７４が生成される。　
　先ず、培養液供給部７０から、ドロップレット生成部７１に微生物培養液７００が断続的に供給される。次に、ドロップレット生成部７１に供給された微生物培養液７００がドロップレット生成部７１を通過し、ドロップレット収容部７３に入る際に、油膜材料供給部７２によってドロップレット生成部７１に供給された油膜材料によって微生物培養液７００がカプセル化される。このカプセル化によってドロップレット７４が生成される。　
　以上、ドロップレット７４の生成方法について説明した。
　上述したドロップレット生成装置７を用いて得られたドロップレットでは、複数種類の微生物を共培養することが可能である。例えば、１つのドロップレット内で２又は３個の微生物を共培養することが可能である。このような方法は、複数種類の微生物からなる多数の組み合わせの各々について共培養する場合に適している。しかしながら、このようなドロップレットでは、ドロップレットの内部と外部との間で培養液等の物質の移動が生じにくい。このため、ドロップレット内の微生物は、ドロップレット内の栄養が不足すると成長が止まる。従って、ドロップレット内の微生物を長時間培養及び観察することが難しい。また、上述したドロップレット生成装置７によると、ドロップレット毎に培養液の組成を変更することができない。このため、ドロップレット毎に生存に必要な物質が異なる場合、一部のドロップレットにおいて、複数種類の微生物の共生関係を観察することができない。
　一方、上述した微生物観察用デバイス１では、隔壁２１は、複数の区画Ｐの各々と１以上の流入孔２００との間及び複数の区画Ｐの各々と流出孔２０１との間での液体の移動を可能としている。従って、培養液３等の液体を複数の区画Ｐに連続的又は断続的に供給することが可能である。よって、上述した微生物観察用デバイス１では、複数種類の微生物４を長時間培養することが可能である。上述した微生物の培養方法によって培養に成功した区画Ｐでは、その区画Ｐに位置している複数種類の微生物４は互いに共存することが可能であることが分かる。
　また、上述した濃度勾配生成部Ｇが設けられた微生物観察用デバイス１を用いると、ある区画Ｐを満たす培養液と別の区画Ｐを満たす培養液との濃度を異ならしめることができる。このように、上述した濃度勾配生成部Ｇが設けられた微生物観察用デバイス１によると、微生物の組み合わせに応じて培養液の組成を変更することができる。
　このように、上述した微生物観察用デバイス１では、複数種類の微生物４を長時間培養、即ち、連続培養することが可能である。また、上述した通り、上述した微生物観察用デバイス１によると複数の組み合わせの微生物の共生関係等を観察することができる。このため、上述した微生物観察用デバイス１によると、様々な組み合わせの微生物の連続培養及び観察が可能である。
　また、上述した微生物観察用デバイス１は、上述した隔壁２１を備えているため、区画Ｐを満たす培養液の種類を経時的に変更することが可能である。
　　１…微生物観察用デバイス
　　２…デバイス本体
　　３…培養液
　　４…微生物
　　５…マスク
　　６…紫外線
　　７…ドロップレット生成装置
　　２０…培養容器
　　２０Ａ…第１基板
　　２０Ｂ…第２基板
　　２１…隔壁
　　７０…培養液供給部
　　７１…ドロップレット生成部
　　７２…油膜材料供給部
　　７３…ドロップレット収容部
　　７４…ドロップレット
　　２００…流入孔
　　２００Ａ…流入孔
　　２００Ｂ…流入孔
　　２０１…流出孔
　　２０２…内部空間
　　２１１Ａ…柱
　　７００…微生物培養液
　　７４０…油膜
　　Ａ１…第１部分
　　Ａ２…第２部分
　　Ａ３…第３部分
　　Ｆ１…第１流路
　　Ｆ２…第２流路
　　Ｆ３…第３流路
　　Ｆ４…第４流路
　　Ｇ…濃度勾配生成部
　　Ｇ１…第１濃度勾配生成部
　　Ｇ２…第２濃度勾配生成部
　　Ｐ…区画
　　Ｒ１…第１領域
　　Ｒ２…第２領域

Claims (8)

  1. 　中空構造を有している培養容器と、前記培養容器内に設けられ、前記培養容器の内部空間を複数の区画へ区分する隔壁とを備えたデバイス本体であって、前記培養容器は、前記内部空間と外部空間とを各々が連通させる１以上の流入孔と流出孔とが設けられ、前記複数の区画の位置で光透過性を有している光透過部分を有し、前記隔壁は、前記複数の区画の各々と前記１以上の流入孔との間及び前記複数の区画の各々と前記流出孔との間での液体の移動を可能とするデバイス本体と、
    　前記複数の区画の各々を満たした培養液と、
    　前記内部空間内に位置した複数種類の微生物と
    を備え、
    　前記複数の区画の少なくとも１つには、前記複数種類の微生物の２種類以上が存在し且つ前記複数種類の微生物の１種類以上が存在しない微生物観察用デバイス。
  2. 　前記培養容器の内面は、互いに向き合った第１領域及び第２領域を含み、前記隔壁は、前記第１領域から前記第２領域へ向けて伸び且つ前記第２領域から離間している請求項１に記載の微生物観察用デバイス。
  3. 　前記１以上の流入孔は２以上の流入孔であり、
    　前記デバイス本体には、前記内部空間内であって、前記２以上の流入孔と前記複数の区画からなる配列との間に、各々が分岐した２以上の第１流路と３以上の第２流路とを含んだ濃度勾配生成部が設けられ、
    　前記２以上の第１流路はそれらの入口が前記２以上の流入孔にそれぞれ接続され、
    　前記３以上の第２流路の２つの各々は、その入口が前記２以上の第１流路の１つが有している出口の１つに接続され、
    　前記３以上の第２流路の残りの各々は、その入口が前記２以上の第１流路の２つの一方が有している出口の１つと他方が有している出口の１つとに接続された請求項１又は２に記載の微生物観察用デバイス。
  4. 　前記複数の区画は、第１方向へ配列した複数の区画から各々がなる１以上の列を形成しており、前記１以上の流入孔と、前記１以上の列と、前記流出孔とは、前記第１方向に対して交差する第２方向へこの順に配列している請求項１乃至３の何れか１項に記載の微生物観察用デバイス。
  5. 　内部空間と、前記内部空間と外部空間とを各々が連通させる１以上の流入孔と流出孔とが設けられ、光透過性を有している光透過部分を有している培養容器を準備することと、
    　複数種類の微生物と光硬化性樹脂と培養液とを含んだ微生物含有液を前記内部空間に供給することと、
    　前記光透過部分を介して前記微生物含有液の一部に光を照射して、前記光硬化性樹脂の硬化物からなり、前記内部空間を複数の区画に区分する隔壁を、前記複数の区画の各々と前記１以上の流入孔との間、及び前記複数の区画の各々と前記流出孔との間での液体の移動を可能とし、且つ前記複数の区画の少なくとも１つに、前記複数種類の微生物の２種類以上が存在し且つ前記複数種類の微生物の１種類以上が存在しないように形成することと
    を含んだ微生物観察用デバイスの製造方法。
  6. 　前記培養容器の内面は、互いに向き合った第１領域及び第２領域を含み、前記隔壁は、前記第１領域から前記第２領域へ向けて伸び且つ前記第２領域から離間するように形成する請求項５に記載の微生物観察用デバイスの製造方法。
  7. 　請求項１乃至４の何れか１項に記載の微生物観察用デバイスに、前記１以上の流入孔を介して、前記培養液を連続又は断続的に供給して前記複数種類の微生物を培養することを含んだ微生物の培養方法。
  8. 　請求項１乃至４の何れか１項に記載の微生物観察用デバイスが備えている前記複数種類の微生物のうち、前記複数の区画の１以上に位置しているものを、前記光透過部分を介して観察することを含んだ微生物の観察方法。
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