JPWO2012124353A1 - 培養方法、成熟脂肪細胞群及び薬物スクリーニング方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明にかかる、2個以上の細胞の集合体である凝集塊の大きさは、非特許文献1、2に基づくと、凝集体の中心部まで栄養分や酸素を供給させ、生存させるためには、培地と接着する最外層からの距離が250μm以内の大きさの凝集体好ましい。ウェル内の細胞の状態を均一に保つためには、凝集体は均一な500μm以下の直径を有する球または半球状の凝集体がより好ましい。
実施形態1では、培養底面と培養底面に対して垂直方向に配置された壁を有する培養容器を用いて、脂肪細胞を試験等に利用しやすいように培養する細胞培養方法を、次のようにして実現する。(1)脂肪細胞を培養液中に浮遊させずに、生体内に存在する成熟脂肪細胞に類似した形態で培養する。即ち、球状で肥大化した脂肪滴を細胞内に有した状態で培養する。(2)試験等に利用しやすい培養容器を用いる。
図1は、本実施の形態に係る培養容器の構成を示す平面図であり、図2は図1のII−II断面図である。図1に示すように、培養容器10は培養底面14に対して垂直な壁(以下適宜、垂直な壁を「壁」とも称する)12を備える。脂肪細胞を培養底面14と壁12とに接着させて培養する。このため、培養底面14と壁12との交点近傍が細胞培養位置となる。培養容器10は、脂肪細胞が接着することができる細胞培養位置を複数備えているのが好ましい。ここで、培養底面14(培養面)は、細胞を培養する空間における底になる部分(培養空間における底部)を意味する。
向かい合う壁12の距離aは、70μm〜300μmが好ましい。壁12の幅bは特に限定されないが、壁12の上に細胞が接着しないよう、20μm以下であることが好ましく、15μm以下であるのがより好ましい。
培養底面14と壁12とがなす角度は、細胞が乗り上げない角度でなければならないため、側面の上部から50%以上の部分は80°〜90°が好ましく、特に、85°〜90°であることが好ましい。
図3Bは、一つの脂肪細胞9が区画化された領域11で、一方の壁12と培養底面14の2箇所で接着した状態で肥大化した状態を示す。図3Cは、脂肪細胞が培養領域を構成している複数の壁と培養底面14の3箇所以上と接着した状態で肥大化した状態を示す。このように、区画化された培養領域に1個脂肪細胞が培養される場合において、1個の脂肪細胞が、培養底面14と壁12に2箇所以上接着していれば良い。
さらに、培養面に形成される壁12は、図7A,図7Bに示すように、連続した壁12が、培養面の一端から他端まで形成される場合であってもよい。図7Bは、図7AのVII−VII断面を示す図である。
壁12は、図面に示した形状に限られることはない。壁12は、脂肪細胞が壁12の側壁に接着しやすい形状であることが好ましい。
本実施形態では、培養底面14に対して垂直な壁12を有する培養容器10として、上述した図1の形状を用いる。脂肪細胞を培養底面14と壁12に接着させた状態で培養する。この培養方法により、細胞内に球状の脂肪滴を有する立体的な形状の成熟脂肪細胞を得る。ここで、立体的なとは、球状の脂肪滴が蓄積された球状の形態、即ち、生体内の脂肪細胞の形状により近づけることを指す。
本明細書では、細胞培養方法を説明するにあたって、次の用語を用いる。
脂肪細胞は、骨髄間質細胞、間葉系幹細胞、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞から分化させた細胞を含む。ここで言う骨髄間質細胞は、骨髄中に存在する網目構造をした組織のことをいう。間葉系幹細胞は、骨細胞や脂肪細胞などの間葉組織に存在する幹細胞で、間葉(脂肪細胞、骨等)の細胞に分化することができる細胞のことをいう。間葉系幹細胞は、骨髄や脂肪組織から分離することができる。動物の発生初期段階である胚盤胞期の胚の一部に属する内部細胞塊より作られる幹細胞細胞株のことである。生体外にて、理論上すべての組織に分化する分化多能性を保ちつつ、ほぼ無限に増殖させる事ができる。誘導多能性幹細胞とは万能細胞の一種であり、胚性幹細胞と同様に増殖して各種の細胞へと分化することが可能な細胞である。iPS細胞は皮膚細胞などから作り出すことができる。
用語「脂肪滴」は、細胞質内に存在する脂肪の少滴で、脂肪細胞への分化過程などにみられる。細胞が成熟するに従い、この小滴が結合し、次第に大きな球状の脂肪滴が形成される。
用語「分化誘導」は、生物の発生分化で、特定の組織や化学物質が、自然にもしくは人為的に別の組織や細胞の分化を引き起こすことを指す。分化誘導を引き起こす物質を、「分化誘導物質」という。
用語「継代培養」は、細胞培養において、細胞の一部を新しい培養容器に移し、再び培養することをいう。
この細胞培養方法では、例えば、特許文献2に開示されているような、培養容器(フラスコ)の天井面に接着させて培養することなく、例えば、ウェルプレート上で細胞を培養することができる。
培養によって得られる肥大化した成熟脂肪細胞は、直径が20μm〜180μmの球状の脂肪滴、即ち、脂肪滴の体積が4×103μm3〜3×106μm3の範囲であって、脂肪滴の最小直径(短径)を最大直径(長径)で割った値(演算値)が0.4〜1.0の範囲であることが好ましい。
また、培養する脂肪細胞が2層以上になる場合、具体的には、脂肪細胞が培養底面14を完全に覆っていて、増殖するスペースが無くなり、脂肪細胞が層状になる場合には、90%以上のコンフルエントの状態から分化誘導を開始する。
1.培養容器
培養底面に対して垂直な壁を形成させた培養面として、上述した図1,2に示した培養面をもつ1cm×1cmのフィルムをウェルプレート形状の培養容器の底面に貼り付けて、株化脂肪前駆細胞(3T3−L1)を培養した。
実施例はこのフィルムの部分を、比較例はフィルムのない平らな部分を培養面とした。
実施例1及び2で用いる、培養底面14に対して垂直な壁12を有する培養面として、次の区画化された領域11を有する2種類のフィルムを用意した。実施例1は、図1の距離aが200μm、図2の高さcが50μmであり、実施例2は図1の距離aが200μm、図2の高さcが100μmである。
比較例1は、1cm×1cmのフィルム以外の平らな部分を培養面とした。
2−1.実施例1及び2
株化脂肪前駆細胞(3T3−L1)を25cm2 フラスコで継代培養し、70%コンフルエントになったところで、各ウェルに細胞を播種した。
ここで、コンフルエントは、培養面全体に占める細胞の占める面積の割合をいう。例えば、25cm2の面積をもつフラスコを用いた場合、その面積の50%を細胞が占めていれば、50%コンフルエントという。70%コンフルエントは、培養面全体の70%が細胞に覆われている状態を指す。ここでは、単に「コンフルエントになる」というように、数値を記載していない場合、90%以上のコンフルエントになることをいう。
培養液は、コンフルエントになるまで、D-MEM(Gibco-Invitrogen, #11965-084 or #12100-046)+10% Donor Calf Serum (Tissue Culture Biologicals, #301D)+Antibiotic-Antimycotic (Gibco-Invitrogen, #15240-062)を用い、2日に1回の頻度で培養液を交換した。
細胞染色で用いる蛍光染色は、次の特徴を備える。蛍光色素は、光をあてると電子が励起される。しかし、電子は安定な場所へ戻る。戻る時にエネルギーを放出して元に戻るが、エネルギーをロスするため、放出されたエネルギーは光から得たエネルギーよりも小さいエネルギーとして放出される。Bodipy493/503は中性脂肪に選択的に溶け込む蛍光色素であり、青の光を吸収して緑の光を放出する。Hoechst33342はDNA選択的に結合する蛍光色素であり、紫(UV)の光を吸収して青の光を放出する。撮影した画像の白黒映像では、緑部分が白となる。
実施例1、2の平板部分とした。そのため、培養底面が異なる以外は全く同じ条件となる。
細胞を播いてから分化誘導20日目に、実施例1,2と同様に、倒立顕微鏡を用いて観察を行った。
3−1.分化20日後の細胞
実施例1−3、または比較例1のそれぞれの条件で培養した、分化20日後の細胞の写真を参照して、培養結果を説明する。
図10に比較例1の分化20日後の細胞を撮影した写真を示す。図10において、丸で囲んだ部分が細胞一個である。図10において、丸で囲んだ細胞の脂肪滴は、50μm程の大きさであった。複数の大きな脂肪滴を含んでいるため、細胞が球状にはならなかった。
図11に実施例1の分化20日後の細胞を撮影した写真を示す。図11において、丸で囲んだ部分が細胞一個である。四角で囲んだ部分は細胞が集まって集団になっている。分化20日後では、区画化された領域の中央付近に細胞が集まっていることが観察される。
分化20日が経過するまでの観察では、マイクロ容器の中央付近のみでなく、壁(側壁)付近にも細胞が存在し、底を埋め尽くしていた。しかし、細胞が成熟していくと、マイクロ容器の中央付近に細胞が集まってきた。図11の40倍の写真では、脂肪滴が重なって見えることから、一つ一つの細胞が中央付近に集中して塊を作っていることが観察された。これは、自己組織的に細胞凝集体を形成していることが推測される。
加えて、一つの細胞の大きさが比較例1と比べて小さい傾向があった。これは、実施例1では、細胞の体積が小さいのではなく、細胞形態が扁平ではなく球状になったためであると推測される。
図12に実施例2の分化20日後の細胞を撮影した写真を示す。図12において、四角で囲んだ部分は一つの細胞がマイクロ容器の中央付近に集まり、脂肪細胞の塊を作っていた。
図13A−13Gに、実施例2について、細胞染色して撮影したスライス画像シーケンスの写真を示す。写真中の右下に示すスケールは、30μmの長さを示している。X軸及びY軸を固定し、Z軸方向を移動させて、染色した細胞を上から撮影した。図13Aが底部の細胞の写真であり、順に上方の細胞へ移行し、図13Gが上部の細胞である。図13A−13Gにおいて、白く見える部分が脂肪滴である。図13A−13Gにおいて、左上、左下、及び右上に見える点線状の斜線がマイクロ容器の壁である。
図13D(Z=30μm)の矢印で示した細胞も、細胞質が一つの脂肪滴で占められており、X−Y平面での直径は30μmと認められる。これに対し、Z軸方向の観察においては、図13C(Z=20μm)から図13E(Z=40μm)ではっきり見えるが、図13A(Z=0μm)及び図13F(Z=50μm)でぼやけている。
いずれの細胞もZ軸方向の直径は20〜40μmと推察できる。直径は上述したように20〜30μmであるので、実施例2の細胞凝集体を形成している細胞の脂肪滴、細胞の形態は球状である。
8 培地
9 細胞
10 培養容器
11 区画化された領域
12 壁
13 開口部
14 培養底面
23 スポット
24 スポットの側壁
Claims (23)
- 培養底面と培養底面に対して垂直方向に配置された壁とを有する培養容器を用いて、培養する脂肪細胞を、前記培養底面と前記壁とに接着させ、培養液中に浮遊させることなく、球状で肥大化した脂肪滴が蓄積された球状の成熟脂肪細胞を得ることを特徴とする脂肪細胞の培養方法。
- 前記培養する脂肪細胞が0.5×103μm3未満の脂肪滴を有することを特徴とする請求項1に記載の培養方法。
- 前記培養する脂肪細胞が骨髄間質細胞、間葉系幹細胞、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞から分化させた脂肪細胞であることを特徴とする請求項1に記載の培養方法。
- 前記培養する脂肪細胞が前駆脂肪細胞であることを特徴とする請求項1に記載の培養方法。
- 前記前駆脂肪細胞を、90%コンフルエント状態になるまで増殖させた後、分化誘導させる工程を含む請求項4に記載の培養方法。
- 前記分化誘導工程が、(1)デキサメタゾン、インスリンを含む培地で培養した後、(2)デキサメタゾンを含まず、インスリンを含む培地で培養し、(3)インスリン、デキサメタゾンを含まない培地で培養する工程を含む請求項5に記載の培養方法。
- 前記培養容器に対し、0.1×104個/cm2〜1×106個/cm2播種密度で細胞を播種する工程を有する請求項1乃至6のいずれか一項に記載の培養方法。
- 前記培養容器において、培養底面に対して垂直方向に配置された壁の高さが、10μm〜500μmであることを特徴とする請求項1乃至7のいずれか一項に記載の培養方法。
- 前記培養容器において、培養底面に対して垂直方向に配置された壁が連続している請求項1乃至8のいずれか一項に記載の培養方法。
- 前記培養容器において、培養底面に対して垂直方向に配置された壁が連続していない請求項1乃至8のいずれか一項に記載の培養方法。
- 前記培養容器において、培養底面に対して前記垂直方向に配置された壁により区画化された領域が形成されていることを特徴とする請求項1乃至10のいずれか一項に記載の培養方法。
- 前記区画化された領域が規則的に配列していることを特徴とする請求項11に記載の培養方法。
- 前記培養容器において、培養底面に対して垂直方向に配置された壁の任意の1つと該壁に向かい合う他の壁との最も近い距離が10μm以上である請求項1乃至12のいずれか一項に記載の培養方法。
- 前記区画化された領域の底面積の内接円の直径が側壁の高さの、0.1倍〜4倍の範囲である請求項11または12に記載の培養方法。
- 球状の肥大化した脂肪滴の体積が0.5×103μm3〜3×106μm3である請求項1乃至14のいずれか一項に記載の培養方法。
- 脂肪滴の最小直径(短径)を最大直径(長径)で割った値が、0.4〜1.0である形状である1乃至15のいずれか一項に記載の培養方法。
- 前記培養容器の底面が、透明であることを特徴とする請求項1乃至16のいずれか一項に記載の培養方法。
- 前記培養容器において、極性官能基を有する培養底面及び培養底面に対して垂直方向に配置された壁であることを特徴とする請求項1乃至16のいずれか一項に記載の培養方法。
- 前記培養容器において、培養底面及び培養底面に対して垂直方向に配置された壁の表面に無機物がコートされている請求項17の培養方法。
- 前記培養容器において、培養底面及び培養底面に対して垂直方向に配置された壁の表面に、コラーゲン、フィブロネクチンに代表される、細胞外マトリクスがコートされている、請求項17乃至19のいずれか一項に記載の培養方法。
- 前記培養容器において、培養底面及び培養底面に対して垂直方向に配置された壁の表面に、合成物質がコートされている請求項17乃至19のいずれか一項に記載の培養方法。
- 培養底面と培養底面に対して垂直方向に配置された壁とからなる細胞培養位置を複数有する培養容器において、前記培養底面と前記培養底面に対して垂直に配置された壁とに接着させて、培養液中に浮遊させることなく培養された、球状かつ0.5×103μm3〜3×106μm3の体積に肥大化した脂肪滴を蓄積した複数の成熟脂肪細胞からなる成熟脂肪細胞群。
- 請求項21に記載の成熟脂肪細胞群の成熟脂肪細胞に薬物を作用させることにより、当該薬物の脂肪組織に対する影響を試験する薬物スクリーニング方法。
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