WO2017150366A1 - 規則的に配置された同一サイズのスフェロイド及びその利用 - Google Patents

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WO2017150366A1
WO2017150366A1 PCT/JP2017/007029 JP2017007029W WO2017150366A1 WO 2017150366 A1 WO2017150366 A1 WO 2017150366A1 JP 2017007029 W JP2017007029 W JP 2017007029W WO 2017150366 A1 WO2017150366 A1 WO 2017150366A1
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spheroids
well
screening
cell
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米満　吉和
結 原田
洋介 諸富
紘司 寺石
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米満　吉和
株式会社ガイアバイオメディシン
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    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Definitions

  • the present invention relates to a culture containing a plurality of spheroids of uniform size and position, and use thereof.
  • the culture of the present invention can be used for screening for compounds that inhibit spheroid formation.
  • Spheroids have the potential to be used as in vitro models to test the toxicity of various concentrations of compounds.
  • the use of spheroids in in vitro models as a repeatable and reliable indicator of toxicity is a desirable alternative to using living animals.
  • spheroids having a three-dimensional structure can better reflect in vivo behavior in many cells as compared to two-dimensional cultures. Mutation between tumor and immune cells using spheroids Studies of effects and screening for drug development have been reported.
  • Patent Document 1 discloses an analysis method in which spheroids are exposed to a compound to be analyzed, and whether spheroid cell growth inhibition occurs is observed.
  • Patent document 2 describes the step of culturing cells on a culture substrate capable of forming spheroids, the step of bringing the cells into contact with the test substance, and the effect of the test substance on the maintenance of epitheliality of the cells.
  • a method for screening a substance that acts on maintaining the epitheliality of a cell comprising the step of evaluating the change in the amount as an index.
  • cells are cultured on a culture substrate having a predetermined uneven structure that functions as a cell adhesion surface.
  • Patent Document 3 discloses a compound screening method for determining whether a test compound is toxic to hepatocytes based on the spheroid survival rate.
  • Various methods for producing three-dimensional structures of cells represented by spheroids have been studied (for example, Patent Document 4). Such three-dimensional structures are also being considered for use in experiments such as screening.
  • the present inventors have prepared spheroids that are effective for highly reliable screening and effective for elucidating the mechanisms of diseases or conditions involving the formation of spheroids such as peritoneal dissemination and for developing therapeutic methods.
  • Various techniques have been studied. As a result, it was found that a plurality of spheroids of the same size arranged regularly can be obtained by culturing cells capable of forming spheroids under specific conditions.
  • the present inventors have found that such a screening method using homogeneous spheroids can actually be implemented in a systematic manner.
  • the gist of the present invention is as follows.
  • the culture according to 1 or 2 wherein each well has a U-shaped bottom having low adsorption.
  • the culture according to any one of 1 to 4 wherein the cell is cancerous.
  • the culture according to any one of 1 to 5 for use in screening for compounds.
  • a screening method for a substance that acts on spheroid formation comprising the following steps: (1) A plate in which a plurality of wells are regularly arranged (well plate), and each well is seeded at a density effective for spheroid formation in a well plate having a U-shaped bottom with low adsorption.
  • a method for producing a plurality of regularly arranged spheroids of the same size including the following steps: (1) A plate in which a plurality of wells are regularly arranged (well plate), and each well is seeded at a density effective for spheroid formation in a well plate having a U-shaped bottom with low adsorption. And (2) culturing cells in each well. [14] The production method according to 13, wherein the cell is cancerous.
  • the Z ′ value used as an index for measuring the optimum degree and accuracy of the screening condition is calculated by the following equation.
  • Z ' 1- (3SD of high control + 3SD of low control) / (mean of high control-mean of low control)
  • the goal is to have a Z 'value greater than 0.5 for optimization.
  • high throughput screening (HTS) the Z' value is calculated for each microplate. The assay is judged to be inaccurate (Zhang. JH et al., J. Biomol. Screen., 4, 67-73 (1999)).
  • high-accuracy screening with a Z ′ value exceeding 0.5 can be performed.
  • no spheroids were formed by adding EDTA.
  • Results of tertiary screening Comparison between 2D culture and 3D culture (using spheroids prepared using a U-bottom well plate with 96 wells).
  • PD0325901 was identified as a compound with high ability to inhibit spheroid formation. Results of tertiary screening.
  • the numerical value range “X to Y” includes numerical values X and Y at both ends unless otherwise specified. “A and / or B” means at least one of A and B, unless otherwise specified.
  • the present invention provides a culture of cells supported on a plate (well plate) in which a plurality of wells are regularly arranged, each well containing one or less spheroids.
  • the culture contains a group of spheroids of uniform size and position.
  • a spheroid is a cell in which a large number of cells aggregate to form a cell mass and form a three-dimensional state. The cell mass is usually close to a sphere.
  • One or less spheroids in each well means that the number of spheroids is one or there is no spheroid. For example, if no spheroids were formed in various controls provided for the purpose of confirming that the experiment was appropriate, or in screening for drugs that inhibit spheroid formation, the wells should not contain spheroids. There is.
  • the cell may be a cell associated with a condition or disease associated with spheroid formation.
  • Specific examples of applicable cells include undifferentiated cells such as cultured cells (cell lines), stem cells (ES cells, umbilical cord blood-derived cells, undifferentiated mesenchymal stem cells, etc.) that can form spheroids, or differentiated forms thereof. Cell etc.
  • organs from which cells are derived include liver, pancreas, large intestine, blood vessels, nerves, adipose tissue such as bones and breasts, ligaments, tendons, teeth, auricles, and nose.
  • the origin of the cell may be an animal (eg, a laboratory animal such as a mouse, rabbit, rat, guinea pig, dog, pig, goat, cow, or human).
  • the cells may also be genetically engineered.
  • the spheroid does not necessarily need to be formed as an aggregate of a single type of cell, and may be formed from a plurality of types of cell types as long as the spheroid is formed.
  • the cell may also be cancerous or non-cancerous. Cancerous cell lines include colon cancer, prostate cancer, breast cancer, multiple myeloma, B cell lymphoma, malignant glioblastoma, kidney cancer, liver cancer, prostate cancer, and small cell lung cancer It can be derived from.
  • the size of spheroids in each well is the same. Whether or not they are the same can be determined visually or by observation using an optical microscope.
  • One spheroid formed by seeding the same amount of cells in each well usually has the same size.
  • the size of one spheroid is, for example, about 0.1 to 10.0 ⁇ 10 3 cells, although it depends on the cells and conditions used.
  • the diameter of such spheroids is typically 60 ⁇ m to 500 ⁇ m.
  • the formed spheroids are formed at intended positions and regularly arranged.
  • “Regularly arranged” means one-dimensionally, two-dimensionally or three-dimensionally arranged at regular intervals, and whether or not they are regularly arranged is determined visually. Or by observation using an optical microscope.
  • a spheroid is usually formed at the center of the U bottom in each well, and a group of spheroids regularly arranged according to the arrangement of the wells is obtained.
  • the regularly arranged state may be referred to as an array.
  • the interval between the spheroids can be variously adjusted by adjusting the interval between the wells.
  • a plurality of such regularly arranged spheroids of the same size can be obtained by a manufacturing method including the following steps. : (1) A plate in which a plurality of wells are regularly arranged (well plate), and each well is seeded at a density effective for spheroid formation in a well plate having a U-shaped bottom with low adsorption. And (2) culturing cells in each well.
  • Step (1) is a step of seeding cells in a well plate at a density effective for spheroid formation.
  • the well plate is also called a microplate or a microtiter plate, and refers to an experimental / inspection instrument composed of a flat plate with a number of wells.
  • the whole plate is rectangular, with wells arranged in a ratio of 2: 3, the number of wells is 6, 24, 96, 384, 1536, etc., and the volume of the well is several ⁇ L to several mL .
  • those having 96, 384, or 1536 wells can be used particularly suitably.
  • the material of the well plate is not particularly limited as long as it is non-cytotoxic and suitable for cell culture.
  • Acrylic resin polylactic acid, polyglycolic acid, styrene resin, acrylic / styrene copolymer resin, polycarbonate
  • a resin a polyester resin, a polyvinyl alcohol resin, an ethylene / vinyl alcohol copolymer resin, a thermoplastic elastomer, a vinyl chloride resin, and a silicon resin, or a combination thereof can be selected.
  • total light transmittance total luminous transmittance
  • JIS K7375 Japanese Industrial Standard
  • the inner surface of the well (particularly the bottom surface of the well) has a low adsorptivity.
  • Low adsorptivity refers to the property of low protein / cell adsorption / adhesion.
  • a material having an immediate water contact angle of 45 degrees or less, preferably 40 degrees or less, more preferably 20 degrees or less may be used, or surface treatment may be performed.
  • the surface treatment include corona discharge treatment, plasma treatment, flame plasma treatment, UV treatment using a low-pressure mercury lamp, excimer UV treatment, laser treatment, electron beam treatment, and coating treatment.
  • the immediate water contact angle is measured using a target material or a surface-treated flat plate.
  • the contact angle refers to an angle formed between a tangent drawn on the surface of the edge of the liquid and the solid surface in a state where the liquid is in contact with the solid surface.
  • the contact angle refers to a value measured by a contact method using a water droplet
  • the immediate water contact angle refers to a contact angle measured 1 minute after dropping the water droplet on the solid surface.
  • Y ⁇ Ikada Surface modification of polymers for medical applications, Biomaterials 1994, vol.15 No.10, pp. 725- 736.
  • a substance that suppresses cell adhesion may be coated.
  • a phospholipid / polymer complex or poly (2-hydroxyethyl methacrylate) may be coated.
  • the inner surface of the well can have an immediate water contact angle of 45 degrees or less, preferably in the range of 0 to 20 degrees, from the viewpoint of placing the medium in the well.
  • each well of the well plate includes a flat bottom, a U bottom, a V bottom, and the like.
  • the shape of the bottom of the plate can be appropriately selected according to the cells to form spheroids.
  • the well plate is not particularly limited, but as described above, it is preferable that each well has a U-shaped bottom having low adsorptivity.
  • Cells are seeded at a density effective for spheroid formation.
  • This density can be appropriately determined by a person skilled in the art depending on the cells and well plates used, and if necessary, by performing preliminary experiments, etc., but a low-adsorbing U-bottom well plate having 96 or more wells is used.
  • a low-adsorbing U-bottom well plate having 96 or more wells is used.
  • when used for example, be a 0.1 ⁇ 10 4 cells / mL or more, preferably to 0.5 ⁇ 10 4 cells / mL or more, and more preferably set to 1.0 ⁇ 10 4 cells / mL or more.
  • Upper limit may be less 3.0 ⁇ 10 4 cells / mL, is preferably 3.0 ⁇ 10 4 cells / mL, more preferably not more than 3.0 ⁇ 10 4 cells / mL.
  • step (2) the seeded cells are cultured in each well.
  • This step is a step of forming one spheroid in the seeded cells using the space in the well. Culturing can be performed for 6 to 96 hours using a culture solution suitable for the cells to be used and under conditions suitable for cell culture (eg, 37 ° C., 5% CO 2 , 95% Air).
  • a culture solution suitable for the cells to be used and under conditions suitable for cell culture eg, 37 ° C., 5% CO 2 , 95% Air.
  • the culture environment is changed, for example, by adding the target drug before or during the culture process. Can be made.
  • the spheroid group and the process for forming the spheroid group include screening of drugs, various cell assays, monitoring of spheroid formation, elucidation of mechanisms of conditions or diseases associated with spheroid formation. Can be used for etc.
  • the present invention also provides a plurality of regularly arranged spheroids of the same size, one for each well, and a process for forming such spheroids. Therefore, highly reliable screening can be performed.
  • sputum spheroids have different metabolic activities depending on their size. For this reason, different metabolic activity values are obtained from spheroids having different sizes, and highly accurate results cannot be obtained.
  • the metabolic function of extremely small spheroids is extremely low. When such spheroids are used, the amount of reactive metabolite produced is small, and the measurement sensitivity may be reduced. In a system composed of a spheroid group having a certain size and the same size, such inconveniences are extremely small.
  • the Z ′ value which is an index for measuring the optimality and accuracy of the screening conditions, is usually targeted for the Z ′ value to exceed 0.5 in the optimization, but according to the present invention that provides a spheroid group of the same size. , High-accuracy screening with a Z ′ value exceeding 0.5 can be performed.
  • the present invention is used for HTS for screening a compound having a desired activity from a compound library composed of an enormous variety of compounds, for example, using an automated robot, etc., for drug screening. Very suitable.
  • the present invention provides a screening method for a substance that acts on spheroid formation, comprising the following steps (1) to (3): (1) A plate in which a plurality of wells are regularly arranged (well plate), and each well is seeded at a density effective for spheroid formation in a well plate having a U-shaped bottom with low adsorption. Culturing cells in a plurality of wells; (2) a step of bringing a cell into contact with a test substance; and (3) observing whether or not the cell after contact with the test substance forms spheroids, and the test substance affects spheroid formation using the obtained observation result as an index. A process of evaluating the action.
  • the screening step (1) is a step of seeding cells in a well plate at a density effective for spheroid formation and culturing the cells in a plurality of wells.
  • the well plate, the seeding conditions, and the culture conditions reference can be made to the matters described in the above spheroids or the production method thereof.
  • the screening step (2) is a step of bringing cells into contact with the test substance.
  • This screening step may be performed before the screening step (1) or may be performed in the middle of the screening step (1).
  • it can be carried out, for example, by including a test substance in a cell suspension liquid when cells are seeded.
  • it is performed in the middle of the screening step (1) for example, it can be performed by seeding cells in a well, culturing for several hours if necessary, and then adding a test substance to the well.
  • screening may be performed using a substance having a known anticancer activity in addition to the test substance.
  • substances are cisplatin, carboplatin, oxaliplatin, cyclophosphamide, ifosfamide, melphalan, busulfan, dacarbazine, ranimustine, nimustine, vincristine, irinotecan, docetaxel, paclitaxel, adriamycin, mitomycin, doxorubicin, norrubicin, And anticancer agents such as bleomycin.
  • the contact time between the test substance and the cell is not particularly limited, but can be, for example, 6 hours or longer, or 12 hours or longer. You may observe whether a spheroid is formed later, for every 24 hours, 48 hours, 72 hours, 96 hours, etc. which are mentioned later.
  • the screening step (3) is a step of observing whether or not cells after contact with the test substance form spheroids, and evaluating the effect of the test substance on spheroid formation using the obtained observation results as an index.
  • the presence or absence of spheroid formation can be observed not only by direct visual confirmation, but also by quantifying the expression level of a specific gene using a reporter gene, measuring cell viability, and the like.
  • reporter examples include green fluorescent protein (GFP), Discosoma sp. Red Fluorescent Protein (DsRed), chloramphenicol acetyltransferase (CAT), ⁇ -glucuronidase (GUS) and the like.
  • Examples of the method for measuring cell viability include ATP assay method, MTT assay method, intracellular glutathione assay method, LDH assay method and the like.
  • the screening method of the present invention can be used for screening a drug candidate compound for use in the treatment (prevention or therapy) of a condition or disease associated with spheroid formation, or a lead compound or seed compound thereof.
  • Conditions or diseases associated with spheroid formation include peritoneal dissemination.
  • the screening method of the present invention can be performed at each stage of drug screening and can be repeated.
  • a phenotype assay using a high content analysis primary screening
  • a phenotype assay using a high content analysis to confirm the dose response of a test substance secondary screening
  • It can be performed as a phenotype assay (tertiary screening) to narrow down candidate drugs.
  • cryopreserved cells were thawed by the following method, subcultured, and used for the following screening.
  • Cell lysis 1. Remove the CT26 GFP + vial (2.0 ⁇ 10 6 cells / 1mL / ampule) from the liquid nitrogen tank and thaw it in a 37 ° C water bath. In addition, the used cell can introduce
  • FBS-RPMI-1640 Dulbecco
  • CT26 GFP + subculture 1. CT26 GFP + is passaged after growing to sub-confluent or confluent state. 2. Aspirate the culture medium and wash the cells with Phosphate buffered saline (PBS, Invitrogen). 3. After removing PBS, add 0.05% Trypsin solution [0.25% Trypsin, 1 mmol / L EDTA ⁇ 4Na (Invitrogen) diluted 5 times with PBS], and continue to 37 ° C, 5% until the cells are detached from the dish. Reacts under CO2 and 95% Air conditions. 4. Add 10% FBS-RPMI-1640 to suspend and collect the cells. 5.
  • PBS Phosphate buffered saline
  • BIOMEK registered trademark
  • NXP BECKMAN COULTER
  • Drug preparation for primary and secondary screening: 1. Add 10% FBS-RPMI-1640 to the compound plate from which the required volume has been dispensed with BIOMEK (registered trademark) NXP to make a drug plate for addition. 2. Add 10 ⁇ L from the drug plate to the seeded cell plate using BIOMEK (registered trademark) NXP and pipette. DMSO concentration should be 0.1% to 0.3%. Add the drug as soon as possible after sowing, or 1 day later. In the primary screening, the evaluation is performed with a single compound of 1 dose. In the secondary screening, the dose response of the compound is 4dose (can be changed as appropriate).
  • BIOMEK registered trademark
  • NXP BECKMAN COULTER
  • BIOMEK registered trademark
  • NXP BECKMAN COULTER
  • ATP assay (primary / secondary screening): 1. On the last day of evaluation, add CellTiter-Glo (registered trademark) 3D Cell Viability Assay to BIOMEK (registered trademark) NXP in the same volume as the culture volume, and pipette after 15 to 30 minutes. 2. If necessary, transfer 20 ⁇ L of cell lysate to a black plate and measure luminescence with a luminometer (such as Enspire).
  • a luminometer such as Enspire
  • CV value coefficient of variation
  • CV (%) standard deviation (SD) / average (Av)
  • the amount of night after dispensing and fluctuations in measured values of plate reader, etc. .
  • the CV value is preferably within 10%.
  • the system is preferable if the Z ′ value is 0.5 or more.
  • both the CV value and the Z′-factor were good. In order to take into account, two concentrations were examined.
  • ATP assay On the last day of evaluation, add CellTiter-Glo (registered trademark) 3D Cell Viability Assay in the same volume as the culture volume, and pipet after 15 to 30 minutes. Next, if necessary, 120 ⁇ L of the cell lysate is transferred to the Black plate, and luminescence is measured with a luminometer (such as Enspire).
  • a luminometer such as Enspire
  • mice Male BALB / c mice: The following mice were used (weeks of use: 6-8 weeks). 2. Store up to 5 animals per cage in a plastic cage (W 136 mm x L 208 mm x H 115 mm) with sterilized flooring (Pepper Clean, Japan SLC) until the experiment. 3. During the breeding period, tap water is freely consumed in the solid feed CRF-1 (Oriental Yeast Co., Ltd.) and water supply bottles. 4. At the time of arrival, individual identification (identification number: 01-) is performed by ear punch. Cell lysis and passage are the same as above.
  • Intraperitoneal transfer 1. After CT26 GFP + has grown to subconfluent or confluent, the culture medium is aspirated and the cells are washed with Phosphate buffered saline (PBS, Invitrogen). 2. After removing PBS, add 0.05% Trypsin solution [0.25% Trypsin, 1 mmol / L EDTA ⁇ 4Na (Invitrogen) diluted 5 times with PBS], and continue to 37 ° C, 5% until the cells are detached from the dish. React under CO2 and 95% Air conditions. 3. Suspend and collect cells by adding 10% FBS-RPMI-1640.
  • PBS Phosphate buffered saline
  • Grouping Arrange the mouse weights in descending order on the day of intraperitoneal transfer (Day 0) and assign random numbers to the necessary groups (stratified by weight).
  • Drug preparation Prepare the drug solution according to the optimal route of administration.
  • Drug administration Dosage should be adjusted according to the drug.
  • Evaluation indicators and evaluation items Seeding nodule amount; GFP Ascites weight; ascites survival; Day Weight change; weight
  • Evaluation methods (1) Amount of seeded nodule On the final evaluation day, the mouse is dislocated after cervical dislocation and recovered by a midline incision. The digestive tract from the duodenum to the rectum is removed and stored in ice-cold PBS. The extracted digestive tract is spread on a 100 mm dish, and the whole image of the digestive tract is acquired with BZ9000 in bright field and fluorescence. The acquired images are digitized by ImageJ and used as the seeding nodule amount. (2) Ascites weight After the cervical dislocation of the mouse on the final evaluation day, the ascites recovered by a midline incision and collected in the abdominal cavity is collected with a pre-weighted absorbent cotton. After collection, the weight is measured to obtain the ascites weight. (3) Survival period Record the date when the death of the mouse was confirmed during the test period. (4) Change in body weight During the test period, the body weight of the mouse is recorded once every 2-3 days.
  • Non-Patent Document 1 Y Kasagi et al. Peritoneal Dissemination Requires an Sp1-Dependent CXCR4 / CXCL12 Signaling Axis and Extracellular Matrix-Directed Spheroid Formation. Cancer Res; 76 (2) January 15, 2016, 347-357, (Published Online First January (7, 2016; DOI: 10.1158 / 0008-5472.CAN-15-1563)
  • Non-Patent Document 2 Y Ikeda et al. Simian immunodeficiency virus-based lentivirus vector for retinal gene transfer: a preclinical safety study in adult rats. Gene Therapy (2003) 10, 1161-1169
  • the spheroid group of uniform size and position obtained by the present invention can be used for screening of compounds useful as anticancer agents and the like, as well as elucidation and prevention / treatment means of pathological conditions involving spheroid formation such as peritoneal dissemination It is also useful for the establishment of

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Abstract

大量の候補化合物を精度よく評価するための、サイズ及び位置の揃ったスフェロイド群を用いたスクリーニング方法を提供することを課題とする。以下の工程を含む、スフェロイド形成に作用する物質のスクリーニング方法による：（１）複数のウェルが規則的に配置されたプレート（ウェルプレート）であって、各ウェルが低吸着性のＵ型の底を有するウェルプレートに、細胞をスフェロイド形成上有効な密度で播種して、複数のウェル内で細胞を培養する工程；（２）細胞と被験物質とを接触させる工程；及び（３）被験物質接触後の細胞がスフェロイドを形成するか否かを観測し、得られた観測結果を指標として被験物質がスフェロイド形成に及ぼす作用を評価する工程。

Description

規則的に配置された同一サイズのスフェロイド及びその利用
　本発明は、サイズ及び位置の揃った複数のスフェロイドを含む培養物、及びその利用に関する。本発明の培養物は、スフェロイドの形成を阻害する化合物のスクリーニング等に用いることができる。
　スフェロイドはさまざまな濃度の化合物の毒性を試験するために、インビトロモデルとして使用される重要な可能性を持つ。繰り返すことができ、信頼できる毒性の指標としてのインビトロモデルにおけるスフェロイドの使用は、生きている動物を使用することの望ましい代替法である。また、３次元構造を有するスフェロイドは、２次元培養物と比較して、多くの細胞においてｉｎｖｉｖｏでの挙動をよりよく反映し得ることが知られており、スフェロイドを使用した腫瘍－免疫細胞の相互作用の研究や薬物開発のためのスクリーニングなどが報告されている。
　スフェロイドを用いた種々の薬剤のスクリーニング方法などが検討されてきている。例えば、特許文献１は、分析されるべき化合物にスフェロイドをさらし、スフェロイド細胞増殖阻害が起こるかどうか観察する分析方法を開示する。また特許文献２は、スフェロイド形成可能な培養基材上で細胞を培養する工程と、前記細胞と被験物質とを接触させる工程と、被験物質が前記細胞の上皮性維持に及ぼす効果をスフェロイドの形態の変化を指標として評価する工程とを含む細胞の上皮性維持に作用する物質のスクリーニング方法を開示する。ここでは、細胞の培養を、細胞接着面として機能する所定の凹凸構造を有する培養基材上で行うことが記載されている。さらに特許文献３は、スフェロイドの生存率に基づいて被験化合物が肝細胞に対して毒性を有するか否かを判定する化合物のスクリーニング方法を開示する。またスフェロイドに代表される細胞の立体構造体の製造方法も種々検討されてきている（例えば、特許文献４）。このような立体構造体もまた、スクリーニング等の実験への利用が検討されている。
国際公開ＷＯ２００３／０５８２５１（特表２００５－５１４０４２号公報） 国際公開ＷＯ２０１４／０３８０２５（特開２０１５－３３３８４号公報） 特開２０１４－７９２２７号公報 国際公開ＷＯ２００８／１２３６１４（特許第４５１７１２５号）
  スフェロイドを用いて薬物のスクリーニングを行うに際しては、大量の候補化合物を精度よく評価する必要がある。その際には、均質なスフェロイドが必要となるが、従来のスフェロイドの形成方法では、この点、十分ではなかった。
　一方、がん細胞のスフェロイドの形成は、消化器系がん腹膜播種その他の各種の遠隔移転が懸念される悪性度の高いがんに関与する。このようながんのメカニズムの解明や革新的治療技術の開発にはスフェロイドの形成阻害が重要であると考えられる。
　本発明者らは、信頼性の高いスクリーニングを行うために有効であり、また腹膜播種等のスフェロイドの形成が関わる疾患又は状態のメカニズムの解明や治療法の開発のために有効な、スフェロイドを調製する技術を種々検討してきた。その結果、スフェロイドを形成することが可能な細胞を、特定の条件で培養することにより、規則的に配置された、複数の同一サイズのスフェロイドを得ることができることを見出した。またこのような均質なスフェロイドを用いたスクリーニング方法が、実際に制度よく実施できることを見出し、本発明を完成した。
  本発明の要旨は以下の通りである。
［１］　複数のウェルが規則的に配置されたプレート（ウェルプレート）に支持された、細胞の培養物であって、各ウェルが１個以下のスフェロイドを含む、培養物。
［２］　各ウェルのスフェロイドのサイズが同一である、１に記載の培養物。
［３］　各ウェルが低吸着性のＵ型の底を有する、１又は２に記載の培養物。
［４］　ウェルプレートが96個、384個、又は1536個のウェルを有する、１～３のいずれか１項に記載の培養物。
［５］　細胞ががん性である、１～４のいずれか１項に記載の培養物。
［６］　化合物のスクリーニングに用いるための、１～５のいずれか１項に記載の培養物。
［７］　スクリーニングが抗がん剤の候補化合物を選抜するためのものである、６に記載の培養物。
［８］　スフェロイドの形成が関連する状態又は疾患のメカニズムの解明に用いるための、１～５のいずれか１項に記載の培養物。
［９］　スフェロイドの形成が関連する状態又は疾患が腹膜播種である、８に記載の培養物。
［１０］　以下の工程を含む、スフェロイド形成に作用する物質のスクリーニング方法：
（１）複数のウェルが規則的に配置されたプレート（ウェルプレート）であって、各ウェルが低吸着性のＵ型の底を有するウェルプレートに、細胞をスフェロイド形成上有効な密度で播種して、複数のウェル内で細胞を培養する工程；
（２）細胞と被験物質とを接触させる工程；及び
（３）被験物質接触後の細胞がスフェロイドを形成するか否かを観測し、得られた観測結果を指標として被験物質がスフェロイド形成に及ぼす作用を評価する工程。
［１１］　細胞ががん性である、１０に記載のスクリーニング方法。
［１２］　スフェロイド形成上有効な密度が1.0×104cells/mL～3.0×104cells/mLである、１０又は１１に記載のスクリーニング方法。
［１３］　以下の工程を含む、規則的に配置された複数の同一サイズのスフェロイドの製造方法：
（１）複数のウェルが規則的に配置されたプレート（ウェルプレート）であって、各ウェルが低吸着性のＵ型の底を有するウェルプレートに、細胞をスフェロイド形成上有効な密度で播種する工程；及び
（２）各ウェル内で細胞を培養する工程。
［１４］　細胞ががん性である、１３に記載の製造方法。
  本発明により、信頼性の高いスクリーニング結果を得ることができる。スクリーニング条件の最適度、精度を測定する指標として利用されているZ'値は、次式で算出される。
　Z'=1-(3SD of high control + 3SD of low control)/ (mean of high control - mean of low control) 
　通常、最適化に際してはZ'値が0.5を越すことに目標がおかれ、 ハイスループットスクリーニング (High throughput screening、HTS）ではマイクロプレート毎にZ'値を算出し、0.5を下回るとそのマイクロプレートのアッセイは精度不良と判定される（Zhang.J.H.et al., J. Biomol.Screen., 4, 67-73 (1999)）。本発明により、Z'値が0.5を超えた精度の高いスクリーニングを行うことができる。
384個のウェルを有するＵ底ウェルプレートを用いた、規則的に配置された同一サイズのスフェロイドの調製例。矢印で示した列は、ＥＤＴＡ添加によりスフェロイド形成なし。左右各２列は、細胞播種なし。 図１で枠で囲んだ部分を拡大した写真。 本発明の方法により調製されたスフェロイドの形態の例。 ３次スクリーニングの結果。2D培養と3D培養（96個のウェルを有するＵ底ウェルプレートを用いて調製したスフェロイド群を用いた。）との比較。PD0325901がスフェロイド形成を阻害する能力が高い化合物として特定された。 ３次スクリーニングの結果。薬物は、播種後速やかに添加（pre処置）、もしくは1日後に添加した（post処置）。 腹膜播種に対するPD0325901の効果（最終評価日において摘出した消化管からの蛍光量）。最終日におけるvehicle群との比較（Tukey-Kramer HSD検定）。スクリーニングで特定された化合物PD0325901の活性を、マウスを用いてin vivoで確認した。 腹膜播種に対するPD0325901の効果（最終評価日において回収した腹水の重量）。最終日におけるvehicle群との比較（Tukey-Kramer HSD検定）。スクリーニングで特定された化合物PD0325901の活性を、マウスを用いてin vivoで確認した。
　数値範囲「Ｘ～Ｙ」は、特に記載した場合を除き、両端の数値Ｘ及びＹを含む。「Ａ及び／又はＢ」は、特に記載した場合を除き、Ａ及びＢのうちのすくなくとも一方の意である。
［サイズ及び位置の揃ったスフェロイド群］
　本発明は、複数のウェルが規則的に配置されたプレート（ウェルプレート）に支持された、細胞の培養物であって、各ウェルが１個以下のスフェロイドを含む、培養物を提供する。培養物は、サイズ及び位置の揃ったスフェロイド群を含む。スフェロイドとは、細胞が多数凝集して細胞塊を形成し、３次元状態を形成しているものをいう。細胞塊は、通常、球形に近い。各ウェルにスフェロイドが１個以下とは、スフェロイドの数が１個であるか、又はスフェロイドが存在しないことを意味する。例えば、実験が適切であることを確認する目的等で設けた各種対照において、又はスフェロイド形成を阻害する薬物のスクリーニングにおいて、スフェロイドが形成されなかった場合には、ウェルにはスフェロイドが含まれないことがある。
　本発明には、スフェロイド形成可能な各種の細胞を適用しうる。細胞は、スフェロイドの形成が関連する状態又は疾患に関連する細胞であってもよい。適用可能な細胞の具体的な例は、スフェロイド形成可能な、培養細胞（細胞株）、幹細胞（ＥＳ細胞、臍帯血由来細胞、未分化間葉系幹細胞等）などの未分化細胞又はその分化型細胞等である。細胞が由来する臓器は、肝臓、すい臓、大腸、血管、神経のほか、骨、乳房などの脂肪組織、靱帯、腱、歯、耳介、鼻などが挙げられる。細胞の由来は、動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、イヌ、ブタ、ヤギ、ウシなどの実験動物、又はヒト）であり得る。細胞はまた、遺伝子操作を行ったものでもよい。また、スフェロイドは、必ずしも単一の種類の細胞の凝集体として形成される必要はなく、スフェロイドが形成される限り、複数種類の細胞種から形成されてもよい。細胞はまた、がん性であってもよく、非がん性であってもよい。がん性の細胞株は、大腸がん、前立腺がん、乳がん、多発性骨髄腫、B細胞リンパ腫、悪性神経膠芽腫、腎臓がん、肝臓がん、前立腺がん、及び小細胞性肺がんに由来するものであり得る。
　本発明においては、各ウェルのスフェロイドのサイズは同一である。同一か否かは、目視により、又は光学顕微鏡を用いた観察により、判定できる。各ウェルに同じ量の細胞を播種することにより形成された１個のスフェロイドは、通常、同一の大きさとなる。１個のスフェロイドのサイズは、用いる細胞及び条件にもよるが、例えば、0.1～10．0×103cells程度の細胞からなる。このようなスフェロイドの直径は典型的には60μm～500μmである。
　本発明においては、形成されるスフェロイドは、それぞれ意図した位置に形成され、規則的に配置されている。規則的に配置されているとは、一次元的、二次元的、又は三次元的に等間隔に並んでいることを指し、規則的に配置されている状態であるか否かは、目視により、又は光学顕微鏡を用いた観察により、判定できる。Ｕ底の、形の均一な各ウェルを用いた場合は、通常、各ウェルにおいてＵ底の中心にスフェロイドが各々形成され、ウェルの配置に応じた規則的に配列されたスフェロイド群が得られる。規則的に配置された状態を、アレイ状ということがある。各スフェロイドの間隔は、ウェルの間隔を調整することにより、様々に調整することができる。
［規則的に配置された複数の同一サイズのスフェロイドの製造方法］
　このような規則的に配置された複数の同一サイズのスフェロイドは、以下の工程を含む製造方法により得られる。：
（１）複数のウェルが規則的に配置されたプレート（ウェルプレート）であって、各ウェルが低吸着性のＵ型の底を有するウェルプレートに、細胞をスフェロイド形成上有効な密度で播種する工程；及び
（２）各ウェル内で細胞を培養する工程。
工程（１）
　工程（１）は、ウェルプレートに、細胞をスフェロイド形成上有効な密度で播種する工程である。
　ウェルプレートは、マイクロプレート又はマイクロタイタープレート（Microtiter plate）とも称され、多数のくぼみ（ウェル）のついた平板からなる実験・検査器具を指す。一般的には、プレート全体は長方形であり、ウェルが2：3の割合で並んでおり、ウェルの数は6、24、96、384、1536等、ウェルの容量は数μL～数mLである。本発明においては、特に限定されないが、ウェルの数が96、384、又は1536個のものを特に好適に用いることができる。
　ウェルプレートの素材は、細胞毒性がなく、細胞培養に適したものである限り、特に限定されないが、アクリル系樹脂、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、スチレン系樹脂、アクリル・スチレン系共重合樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリエステル系樹脂、ポリビニルアルコール系樹脂、エチレン・ビニルアルコール系共重合樹脂、熱可塑性エラストマー、塩化ビニル系樹脂、及びシリコン樹脂のうちの１つ又はこれらの組み合わせから選択することができる。
  ウェルの底部は、後述するスクリーニングを行うに際し、蛍光・吸収光を使用した光学分析を利用することが多いことから、構成するポリマーの全光線透過率が、８５％以上９９％未満である素材を用いることが好ましい。全光線透過率（total luminous transmittance）は、日本工業規格（ＪＩＳ  Ｋ７３７５）により測定することができる。
  ウェル内で効率よくスフェロイドを形成させるとの観点からは、ウェル内面（特にウェル底面）は、低吸着性であることが好ましい。低吸着性とは、タンパク質又は細胞の吸着・接着が少ない性質のことを指す。低吸着性とするために、例えば、即時水接触角が４５度以下、好ましくは４０度以下、より好ましくは２０度以下になるような素材を用いるか、又は表面処理を施してもよい。表面処理の例としては、コロナ放電処理、プラズマ処理、フレームプラズマ処理、低圧水銀ランプによるＵＶ処理、エキシマＵＶ処理、レーザー処理、及び電子線処理、並びにコーティング処理がある。なお、即時水接触角は、対象となる素材又は表面処理を施した平板を用いて測定する。接触角は、固体表面上に液体が接している状況で、液体の縁の表面に引いた接線と固体表面と成す角度をいう。接触角は、水液滴を用いて接触法により測定した値をいい、即時水接触角は、水液滴を固体表面に滴下して1分後に測定した接触角をいう。低吸着性（細胞接着性を抑制すること）と即時水接触角との関係は、例えば、Y Ikada著、Surface modification of polymers for medical applications、Biomaterials 1994, vol.15 No.10, pp. 725-736に記載されている。低吸着性とするためには、細胞接着性を抑制する物質をコートしてもよい。例えば、リン脂質・高分子複合体やポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）をコートしてもよい。ウェル内面は、ウェル内に培地を入れるためとの観点からは、即時水接触角を４５度以下、好ましくは０度～２０度の範囲とすることができる。
　一般に、ウェルプレートの各ウェルの底の形状には、平底、Ｕ底、Ｖ底等がある。本発明においては、プレートの底の形状は、スフェロイドを形成しようとする細胞に応じて適宜に選択し得るが、意図した位置に１個のスフェロイドを良好に形成させるとの観点からは、平底ではないものを用いることが好ましく、Ｕ底のものを用いることがより好ましい。
　ウェルプレートは、特に限定されないが、上述のように、各ウェルが低吸着性のＵ型の底を有しているものが好ましい。
　細胞は、スフェロイド形成上有効な密度で播種される。この密度は、当業者であれば用いる細胞やウェルプレートに応じ、必要であれば予備実験等を行い、適宜決定し得るが、96個以上のウェルを有する低吸着性のＵ底のウェルプレートを用いる場合は、例えば0.1×104cells/mL以上とすることができ、0.5×104cells/mL以上とすることが好ましく、1.0×104cells/mL以上とすることがより好ましい。上限値は、3.0×104cells/mL以下とすることができ、3.0×104cells/mLであることが好ましく、3.0×104cells/mL以下であることがより好ましい。播種する際の細胞密度が低い場合、続く工程（２）の培養において所定の時間内に所望するスフェロイドが得られないことが想定される。また、十分な大きさのスフェロイドが得られないことが想定される。極小さいサイズのスフェロイドは、測定感度低下につながる。細胞密度が高い場合はスフェロイドを形成しない細胞が生じうることになると考えられる。スフェロイドを形成しない細胞が多数ある場合、スフェロイド形成の有無により判定を行う際の障害になりうると考えられる。
工程（２）
　工程（２）では、播種された細胞を、各ウェル内で培養する。この工程は、ウェル内空間を用いて、播種した細胞に１個のスフェロイドを形成させる工程である。培養は、用いる細胞に適した培養液を用い、細胞培養に適した条件（例えば、37℃、5%CO2、95%Air）で、6～96時間行うことができる。後述するように、本発明によるスフェロイド群又はスフェロイド群の形成工程を、後述のスクリーニング等のために用いる場合は、培養工程の前又は途中に、対象薬物を添加する等、培養環境に変化を生じさせることができる。
［スフェロイド群の用途］
　３次元構造を有するスフェロイドは、従来の２次元培養物と比較して、多くの細胞においてin vivoでの挙動をよりよく反映し得ることが知られている。そのため、スフェロイドを使用した腫瘍－免疫細胞の相互作用の研究や薬物開発のためのスクリーニングなどが報告されている。したがって、本発明によって提供されるスフェロイド群、及びスフェロイド群を形成するための工程は、薬物等のスクリーニング、種々の細胞アッセイ、スフェロイド形成のモニタリング、スフェロイドの形成が関連する状態又は疾患のメカニズムの解明等のために使用することができる。
　また本発明により、各ウェルに１個ずつの、規則的に配置された複数の同一サイズのスフェロイド群、及びそのようなスフェロイド群を形成するための工程が提供されるが、このようなスフェロイド群により、信頼性の高いスクリーニングを行うことができる。
  スフェロイドは、その大きさによって代謝活性が異なることが知られている。そのためサイズが異なるスフェロイドからは、異なる代謝活性値が得られ、精度の高い結果が得られない。また、極小さいスフェロイドの代謝機能は極端に低いことが知られており、このようなスフェロイドを用いるとすると、反応性代謝物の生成量が少量となり、測定感度が低下しうる。一定以上の同一サイズのスフェロイド群からなる系では、このような不都合が極少ない。スクリーニング条件の最適度、精度を測定する指標であるZ'値は、通常、最適化に際してはZ'値が0.5を越すことに目標がおかれるが、同一サイズのスフェロイド群を提供する本発明により、Z'値が0.5を超えた精度の高いスクリーニングを行うことができる。
　また、スフェロイドが規則的に配置されていることにより、自動化されたロボットによる操作が容易となり、一度に大量のサンプルを処理することが可能となる。
　したがって、本発明は、薬物等スクリーニングのため、特に膨大な種類の化合物から構成される化合物ライブラリーの中から、自動化されたロボットなどを用いて、目的の活性を持つ化合物を選別するHTSに用いるのに、非常に適している。
［スクリーニング方法］
　本発明は、以下の工程（１）～（３）を含む、スフェロイド形成に作用する物質のスクリーニング方法を提供する：
（１）複数のウェルが規則的に配置されたプレート（ウェルプレート）であって、各ウェルが低吸着性のＵ型の底を有するウェルプレートに、細胞をスフェロイド形成上有効な密度で播種して、複数のウェル内で細胞を培養する工程；
（２）細胞と被験物質とを接触させる工程；及び
（３）被験物質接触後の細胞がスフェロイドを形成するか否かを観測し、得られた観測結果を指標として被験物質がスフェロイド形成に及ぼす作用を評価する工程。
スクリーニング工程（１）
　スクリーニング工程（１）は、ウェルプレートに、細胞をスフェロイド形成上有効な密度で播種して、複数のウェル内で細胞を培養する工程である。用いる細胞、ウェルプレート、播種条件、培養条件は、上述のスフェロイド又はその製造方法において説明した事項を参照することができる。
スクリーニング工程（２）
　スクリーニング工程（２）は、細胞と被験物質とを接触させる工程である。このスクリーニング工程は、スクリーニング工程（１）の前に行ってもよく、スクリーニング工程（１）の途中で行ってもよい。スクリーニング工程（１）の前に行う場合、例えば、細胞を播種する際の細胞懸濁する液に被験物質を含ませることにより、実施することができる。スクリーニング工程（１）の途中で行う場合、例えば、ウェルに細胞を播種し、必要であれば数時間培養を行い、その後にウェルに被験物質を添加することにより行うことができる。
　スフェロイドの形成を阻害する薬物の選択を目的にスクリーニングを行う場合、被験物質のほか、抗がん作用が分かっている物質を対照としてスクリーニングを実施してもよい。このような物質の例として、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、ブスルファン、ダカルバジン、ラニムスチン、ニムスチン、ビンクリスチン，イリノテカン、ドセタキセル、パクリタキセル、アドリアマイシン、マイトマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、ブレオマイシン等の抗がん剤を挙げることができる。
　被験物質と細胞との接触時間は特に限定されないが、例えば、6時間以上とすることができ、12時間以上としてもよい。24時間、48時間、72時間、96時間等の経過ごとに、後述する、スフェロイドを形成するか否かの観測を行ってもよい。
スクリーニング工程（３）
　スクリーニング工程（３）は、被験物質接触後の細胞がスフェロイドを形成するか否かを観測し、得られた観測結果を指標として被験物質がスフェロイド形成に及ぼす作用を評価する工程である。
　スフェロイドの形成の有無は、目視による直接的な形成の確認の他、レポーター遺伝子を用いた特定遺伝子の発現量の定量、細胞生存率の測定等によっても観測できる。レポーターの例は、緑色蛍光タンパク質（GFP）、Discosoma sp. Red Fluorescent Protein (DsRed)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、β-グルクロニダーゼ（GUS）等である。細胞生存率の測定方法の例は、ＡＴＰアッセイ法、ＭＴＴアッセイ法、細胞内グルタチオンアッセイ法、ＬＤＨアッセイ法等である。これらのレポーター及び細胞生存率の測定方法は、当業者にはよく知られている。
　本発明のスクリーニング方法は、スフェロイドの形成が関連する状態又は疾患の処置（予防、治療）に用いるための医薬候補化合物、又はそのリード化合物もしくはシード化合物をスクリーニングするために用いることができる。スフェロイドの形成が関連する状態又は疾患には、腹膜播種が含まれる。
　本発明のスクリーニング方法は、薬物スクリーニングの各段階で行うことができ、また繰り返し行うことができる。例えば、被験物質の１の濃度について行う、ハイコンテントアナリシスを用いたフェノタイプアッセイ（一次スクリーニング）、被験物質の容量反応性を確認するハイコンテントアナリシスを用いたフェノタイプアッセイ（二次スクリーニング）、及び／又は候補薬物を絞るためのフェノタイプアッセイ（三次スクリーニング）として、実施することができる。
  以下、実施例により本発明を具体的に説明する。ただし、本発明は以下の記述に限定されるものではない。
［スクリーニングに用いる細胞の調製］
　次の方法で、凍結保存された細胞を融解し、継代培養を行って、下記のスクリーニングに用いた。
細胞融解：
1.  CT26 GFP+が入ったバイアル（2.0×106 cells/1mL/ampule）を液体窒素タンクより取り出し37℃の湯浴中で融解．なお、用いた細胞は、ATCCから購入した親株にSIVベクターでGFPを導入し、Single cell cloningで作成することができる（後掲非特許文献１、２参照）．
2.  バイアル中の細胞浮遊液の全量を10％ FBS-RPMI-1640（10％牛胎児血清，100 units/mL Penicillin-100μg/mL Streptomycinを含むDulbecco’s modified eagle medium）に加えた後，4℃にて遠心分離（100g，3分間）．
3.  沈渣（細胞）を10 mLの10％ FBS- RPMI-1640にて再懸濁し，100 mm dish（BD Biosciences）1枚に播種した後，37℃，5％ CO2，95％ Air条件下で培養する．
CT26 GFP + の継代培養：
1.  CT26 GFP+はサブコンフルエントあるいはコンフルエント状態まで増殖した後に継代する．
2.  培養液を吸引除去し，Phosphate buffered saline（PBS，Invitrogen）にて細胞を洗浄する．
3.  PBSを除去後，0.05％ Trypsin溶液［0.25％ Trypsin，1 mmol/L EDTA・4Na（Invitrogen）をPBSにて5倍希釈］を加え，細胞がディッシュより剥離されるまで37℃，5％ CO2，95％ Air条件下で反応．
4.  10％ FBS- RPMI-1640を加えて細胞を懸濁し回収する．
5.  4℃にて遠心分離（400g，3分間）を行った後，沈渣（細胞）を10％ FBS- RPMI-1640にて再懸濁する．
6.  細胞懸濁液の一部を0.4％ Trypan Blue溶液（Sigma-Aldrich）と混合し，細胞計数盤（ワンセルカウンター，株式会社ワンセル）を用いて位相差顕微鏡下で生細胞数を計測する．
7.  2.0×105 cells/dishとなるように10％ FBS- RPMI-1640にて細胞懸濁液を希釈し播種する．
8.  残余細胞は廃棄する．
［１次スクリーニング、２次スクリーニング］
＜方法＞
　東京大学創薬機構（旧名称：東大創薬オープンイノベーションセンター）より入手したValidated Compound Library（既知活性化合物とoff patent医薬品からなるライブラリー、約3,000種）を用い、下記の方法で１次スクリーニング及び２次スクリーニングを行った。
384plateへの播種（1次、2次スクリーニング用）：
1.  CT26 GFP+はサブコンフルエントあるいはコンフルエント状態まで増殖した後、培養液を吸引除去し，Phosphate buffered saline（PBS，Invitrogen）にて細胞を洗浄する．
2.  PBSを除去後，0.05％ Trypsin溶液［0.25％ Trypsin，1 mmol/L EDTA・4Na（Invitrogen）をPBSにて5倍希釈］を加え，細胞がディッシュより剥離されるまで37℃，5％ CO2，95％ Air条件下で反応させる．
3.  10％ FBS- RPMI-1640を加えて細胞を懸濁し回収する．
4.  4℃にて遠心分離（400g，3分間）を行った後，沈渣（細胞）を10％ FBS- RPMI-1640にて再懸濁する．
5.  細胞懸濁液の一部を0.4％ Trypan Blue溶液（Sigma-Aldrich）と混合し，細胞計数盤（ワンセルカウンター，株式会社ワンセル）を用いて位相差顕微鏡下で生細胞数を計測する．
6.  2D培養の場合は、3.0×104 cells/mLとなるように10％ FBS- 0.1%DMSO-RPMI-1640にて細胞懸濁液を希釈し、BIOMEK（登録商標） NXP（BECKMAN COULTER）にて20μL/wellの容量で培養プレート（ViewPlate-384, PerkinElmer）に細胞を播種する.
7.  3D培養の場合は、5.0×104 cells/mLとなるように10％ FBS- 0.1%DMSO- RPMI-1640にて細胞懸濁液を希釈し、BIOMEK（登録商標） NXPにて20μL/wellの容量で低接着プレート（PrimeSurface（登録商標）384Uプレート，住友ベークライト株式会社）に細胞を播種する.
8.  播種した細胞は37℃，5％ CO2，95％ Air条件下で培養する．
  1次スクリーニング、２次スクリーニング共に384plateを使用する.
　細胞播種、セルタイター吸い上げ（2D 3D 共通）の際のBIOMEK（登録商標） NXP（BECKMAN COULTER）の設定画面の例を下記に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
薬物調製（1次2次スクリーニング用）：
1.  必要な容量を分取された化合物プレートにBIOMEK（登録商標） NXPにて10％ FBS- RPMI-1640を加え，添加用薬物プレートとする.
2.  次いで播種済みの細胞プレートにBIOMEK（登録商標） NXPにて薬物プレートより10μL添加しピペッティングを行う.
  DMSO濃度は0.1%から0.3%とする.
　薬物の添加時期は播種後速やかに添加する、もしくは1日後に添加する.
　1次スクリーニングでは1化合物 1doseのsingleで評価を実施する.
  ２次スクリーニングでは化合物の用量反応性を4dose（適宜変更可）で実施する.
　薬物希釈（化合物プレートへの培地添加：2D3D共通）の際のBIOMEK（登録商標） NXP（BECKMAN COULTER）の設定画面の例を下記に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　薬物添加（2D）の際のBIOMEK（登録商標） NXP（BECKMAN COULTER）の設定画面の例を下記に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　薬物添加（3D）の際のBIOMEK（登録商標） NXP（BECKMAN COULTER）の設定画面の例を下記に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
観察（1次2次スクリーニング）：
1.  薬物処置72時間後にIN Cell Analyzer 2000（GE Healthcare）を用いて明視野及び蛍光の２種類でスフェロイドの形態を確認する.
2.  スフェロイドはGFPから得られる総蛍光量（Dencity×Area）を指標として評価する.
3.  1次スクリーニングではDMSO処置wellと比較して50%以上の変動を確認できたwellをHIT候補として扱う.
  最終評価は次項に示すATP assayを併せて総合的に判断する.
ATP assay（1次2次スクリーニング）：
1.  評価最終日において、CellTiter-Glo（登録商標） 3D Cell Viability AssayをBIOMEK（登録商標） NXPにて培養容量と同量添加し、15から30分経過後、ピペッティングを行う.
2.  次いで必要に応じてBlack plateへ細胞溶解液を20μL移し発光をルミノメーター（Enspireなど）にて測定する.
＜結果＞
　384plateを用いて調製したスフェロイド群の写真を図１～３に示した。各スフェロイドは、同じ大きさであり、各ウェルには、U底の中心に位置する１個のスフェロイドが観られた。また、各ウェルのスフェロイドのサイズはほぼ同一であった。
　また、CV値（変動係数、coefficient of variation)、計算式：CV (%)＝練準偏差(SD)/平均(Av)、分注後の分注夜量やプレートリーダーの測定値のぶれ等。概ねCV値が10%以内であることが好ましい。）及びZ'-factor（計算式Z'=1-(3 x SD 100% + 3 x SD)/(Av l00% - Av O%、アッセイ系の質の目安となる数字で、精度を表す需要な指標。一般に、Z'値が0.5以上あれば系として好ましい。）を求めた。下表に示す通り、CV値、Z'-factor共に良好であった。なお、化合物添加に伴うDMSOの影響を考慮するために、2つの濃度で検討を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　スフェロイド群を用いて行った１次スクリーニングでは、１２７個の化合物がヒットし、また２次スクリーニングでは８個の化合物がヒットした。
［3次スクリーニング］
＜方法＞
　下記の方法で３次スクリーニングを行った。
96plateへの播種：
1.  CT26 GFP+はサブコンフルエントあるいはコンフルエント状態まで増殖した後、培養液を吸引除去し，Phosphate buffered saline（PBS，Invitrogen）にて細胞を洗浄する．
2.  PBSを除去後，0.05％ Trypsin溶液［0.25％ Trypsin，1 mmol/L EDTA・4Na（Invitrogen）をPBSにて5倍希釈］を加え，細胞がディッシュより剥離されるまで37℃，5％ CO2，95％ Air条件下で反応させる．
3.  10％ FBS- RPMI-1640を加えて細胞を懸濁し回収する．
4.  室温にて遠心分離（400g，3分間）を行った後，沈渣（細胞）を10％ FBS- RPMI-1640にて再懸濁する．
5.  細胞懸濁液の一部を0.4％ Trypan Blue溶液（Sigma-Aldrich）と混合し，細胞計数盤（ワンセルカウンター，株式会社ワンセル）を用いて位相差顕微鏡下で生細胞数を計測する．
6.  2D培養の場合は、1.1×104 cells/mLとなるように10％ FBS- 0.1%DMSO-RPMI-1640にて細胞懸濁液を希釈し、ピペットにて90μL/wellの容量で培養プレートに細胞を播種する.
7.  3D培養の場合は、2.2×105 cells/mLとなるように10％ FBS- 0.1%DMSO- RPMI-1640にて細胞懸濁液を希釈し、ピペットにて90μL/wellの容量で低接着プレート（Nunclon Sphera96，Thermo Scientific）に細胞を播種する.
8.  播種した細胞は37℃，5％ CO2，95％ Air条件下で培養する．
薬物調製：
1.  化合物を公比1/10で最高濃度20μMより7dose段階希釈（1% DMSO）を培地で行う.
2.  次いで播種済みの細胞プレートに段階希釈した化合物を10μL添加しピペッティングを行う.
3.  薬物の添加時期は播種後速やかに添加する（pre処置）、もしくは1日後に添加する（post処置）.
  基本single（n=1）で評価を実施する.
ATP assay：
　評価最終日において、CellTiter-Glo（登録商標） 3D Cell Viability Assayを培養容量と同量添加し、15から30分経過後、ピペッティングを行う。次いで必要に応じてBlack plateへ細胞溶解液を120μL移し発光をルミノメーター（Enspireなど）にて測定する。
＜結果＞
　結果を図４及び５に示した。３次スクリーニングの結果、PD0325901がスフェロイド形成を阻害する能力が高い化合物として特定された。
［In vivo試験］
　スクリーニングで特定された化合物PD0325901の活性を、in vivoで確認した。
＜方法＞
動物：
1.  雄性BALB/c マウス：以下，マウス（使用時週齢：6～8週齢）を使用した．
2.  実験に供するまでは滅菌した床敷き（ペパークリーン，日本エスエルシー株式会社）を敷いたプラスチックケージ（W 136 mm×L 208 mm×H 115 mm）に1ケージ当り5匹以内を収容する.
3.  飼育期間中は固型飼料CRF-1（オリエンタル酵母工業株式会社）及び給水びんにて上水道水を自由摂取させる．
4.  入荷時に耳パンチにより個体識別（識別番号：01～）を行う．
  細胞融解、継代は同上.
腹腔内移入：
1.  CT26 GFP+はサブコンフルエントあるいはコンフルエント状態まで増殖した後、培養液を吸引除去し，Phosphate buffered saline（PBS，Invitrogen）にて細胞を洗浄する．
2.  PBSを除去後，0.05％ Trypsin溶液［0.25％ Trypsin，1 mmol/L EDTA・4Na（Invitrogen）をPBSにて5倍希釈］を加え，細胞がディッシュより剥離されるまで37℃，5％ CO2，95％ Air条件下で反応させる．
3.  10％ FBS- RPMI-1640を加えて細胞を懸濁し回収する．4℃にて遠心分離（400g，3分間）を行った後，沈渣（細胞）を10％ FBS- RPMI-1640にて再懸濁する．
4.  細胞懸濁液の一部を0.4％ Trypan Blue溶液（Sigma-Aldrich）と混合し，細胞計数盤（ワンセルカウンター，株式会社ワンセル）を用いて位相差顕微鏡下で生細胞数を計測し、1.0×107 cells/mLとなるようにHBSSにて細胞懸濁液を調製した.
5.  26G注射針付シリンジ（テルモ株式会社）を用いて，細胞懸濁液をマウスの腹腔に0.2 mLずつ注入した（2.0×106 cells/body）．
群分け：
腹腔内移入日（Day 0）にマウスの体重を降順に並べ，乱数を割り付けて必要な群に振り分ける（体重による層別無作為化法）．
薬物調製：最適な投与経路に応じた薬液調製を実施する.
薬液投与：用法用量は薬物に応じて適宜調整する.
投与開始時期：Day1又はDay4から開始する.
評価指標及び評価項目：
播種結節量；GFP
腹水重量；腹水
生存期間；Day
体重変化；体重
評価方法：
(1) 播種結節量　最終評価日においてマウスを頸椎脱臼後、正中切開にて回復し十二指腸から直腸までの消化管を摘出し氷冷したPBS中に保管する。摘出した消化管を100mm ディッシュ上で広げBZ9000にて明視野及び蛍光で消化管の全体像を取得する。取得した画像はImageJにて数値化し播種結節量とする。
(2) 腹水重量　最終評価日においてマウスを頸椎脱臼後、正中切開にて回復し腹腔内に貯留した腹水を予め重量測定した脱脂綿にて回収する。回収後、重量を測定し腹水重量とする。
(3) 生存期間　試験期間中、マウスの死亡を確認した日付を記録する。
(4) 体重変化　試験期間中、マウスの体重を2～3日に1回記録する。
＜結果＞
　結果を図６及び７に示した。
［実施例の項で引用した文献］
非特許文献１：Y Kasagi et al. Peritoneal Dissemination Requires an Sp1-Dependent CXCR4/CXCL12 Signaling Axis and Extracellular Matrix-Directed Spheroid Formation.  Cancer Res; 76(2) January 15, 2016, 347-357,(Published OnlineFirst January 7, 2016; DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-15-1563)
非特許文献２：Y Ikeda et al. Simian immunodeficiency virus-based lentivirus vector　for retinal gene transfer: a preclinical safety study in adult rats. Gene Therapy (2003) 10, 1161-1169
  本発明により得られる、サイズ及び位置の揃ったスフェロイド群は、抗がん剤等として有用な化合物のスクリーニングに用いることができるほか、腹膜播種等のスフェロイド形成が関わる病態の解明と予防・治療手段の確立のためにも有用である。

Claims (14)

  1. 　複数のウェルが規則的に配置されたプレート（ウェルプレート）に支持された、細胞の培養物であって、各ウェルが１個以下のスフェロイドを含む、培養物。
  2. 　各ウェルのスフェロイドのサイズが同一である、請求項１に記載の培養物。
  3. 　各ウェルが低吸着性のＵ型の底を有する、請求項１又は２に記載の培養物。
  4. 　ウェルプレートが96個、384個、又は1536個のウェルを有する、請求項１～３のいずれか１項に記載の培養物。
  5. 　細胞ががん性である、請求項１～４のいずれか１項に記載の培養物。
  6. 　化合物のスクリーニングに用いるための、請求項１～５のいずれか１項に記載の培養物。
  7. 　スクリーニングが抗がん剤の候補化合物を選抜するためのものである、請求項６に記載の培養物。
  8. 　スフェロイドの形成が関連する状態又は疾患のメカニズムの解明に用いるための、請求項１～５のいずれか１項に記載の培養物。
  9. 　スフェロイドの形成が関連する状態又は疾患が腹膜播種である、請求項８に記載の培養物。
  10. 　以下の工程を含む、スフェロイド形成に作用する物質のスクリーニング方法：
    （１）複数のウェルが規則的に配置されたプレート（ウェルプレート）であって、各ウェルが低吸着性のＵ型の底を有するウェルプレートに、細胞をスフェロイド形成上有効な密度で播種して、複数のウェル内で細胞を培養する工程；
    （２）細胞と被験物質とを接触させる工程；及び
    （３）被験物質接触後の細胞がスフェロイドを形成するか否かを観測し、得られた観測結果を指標として被験物質がスフェロイド形成に及ぼす作用を評価する工程。
  11. 　細胞ががん性である、請求項１０に記載のスクリーニング方法。
  12. 　スフェロイド形成上有効な密度が1.0×104cells/mL～3.0×104cells/mLである、請求項１０又は１１に記載のスクリーニング方法。
  13. 　以下の工程を含む、規則的に配置された複数の同一サイズのスフェロイドの製造方法：
    （１）複数のウェルが規則的に配置されたプレート（ウェルプレート）であって、各ウェルが低吸着性のＵ型の底を有するウェルプレートに、細胞をスフェロイド形成上有効な密度で播種する工程；及び
    （２）各ウェル内で細胞を培養する工程。
  14. 　細胞ががん性である、請求項１３に記載の製造方法。
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