TW201734201A - 經規則配置之相同尺寸的細胞凝集塊及其利用 - Google Patents
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Abstract
本發明之課題在於提供一種使用尺寸及位置一致之細胞凝集塊群的篩選方法,其用以精度良好地評估大量之候選化合物。一種對細胞凝集塊形成發揮作用之物質之篩選方法,其包括以下步驟:(1)於規則地配置有複數個孔之板(孔板)且各孔具有低吸附性之U型底之孔板中,以對形成細胞凝集塊有效之密度種植細胞,於複數個孔內培養細胞之步驟;(2)使細胞與被試驗物質接觸之步驟;及(3)觀測與被試驗物質接觸後之細胞是否形成細胞凝集塊,以所獲得之觀測結果作為指標,評估被試驗物質對細胞凝集塊形成所產生之作用之步驟。
Description
本發明係關於一種包含尺寸及位置一致之複數個細胞凝集塊的培養物及其利用。本發明之培養物可用於抑制細胞凝集塊形成之化合物之篩選等。
細胞凝集塊具有為了試驗各種濃度之化合物之毒性而用作活體內模型之重要可能性。可反覆使用,關於作為可靠之毒性指標的細胞凝集塊於活體內模型中之使用係代替使用活動物之理想方法。又,已知具有三維結構之細胞凝集塊與二維培養物相比,於很多細胞中能夠更好地反映活體內之舉動,報告有使用細胞凝集塊的腫瘤-免疫細胞相互作用之研究或用以開發藥物之篩選等。 研究有使用細胞凝集塊之各種藥劑之篩選方法等。例如專利文獻1揭示有將細胞凝集塊置於待分析化合物中,觀察是否出現細胞凝集塊細胞增生抑制之分析方法。又,專利文獻2揭示有對細胞之上皮性維持發揮作用之物質之篩選方法,其包括:於能夠形成細胞凝集塊之培養基材上培養細胞之步驟;使上述細胞與被試驗物質接觸之步驟;及以細胞凝集塊之形態變化作為指標,評估被試驗物質對上述細胞之上皮性維持所產生之效果之步驟。此處,記載有於具有作為細胞接著面發揮功能之特定凹凸結構之培養基材上進行細胞培養之情況。進而,專利文獻3揭示有根據細胞凝集塊之生存率而判定試驗化合物對肝細胞是否具有毒性的化合物之篩選方法。又,亦研究有各種細胞凝集塊所代表之細胞之立體構造體之製造方法(例如專利文獻4)。又,研究有將此種立體構造體利用於篩選等實驗之情況。 [先前技術文獻] [專利文獻] [專利文獻1]國際公開WO2003/058251(日本專利特表2005-514042號公報) [專利文獻2]國際公開WO2014/038025(日本專利特開2015-33384號公報) [專利文獻3]日本專利特開2014-79227號公報 [專利文獻4]國際公開WO2008/123614(專利第4517125號)
[發明所欲解決之問題] 使用細胞凝集塊進行藥物之篩選時,需要對大量之候選化合物精度良好地進行評估。此時,需要均質之細胞凝集塊,但先前之細胞凝集塊之形成方法於該方面並不充分。 另一方面,癌細胞之細胞凝集塊之形成係與擔憂消化系統癌腹膜種植及其他各種遠處轉移之惡性度較高之癌相關。對於此種癌之機制之解析或革新性治療技術之開發而言,認為重要的是抑制細胞凝集塊形成。 [解決問題之技術方法] 本發明者等人對製備如下細胞凝集塊之技術進行了各種研究,該細胞凝集塊對於進行可靠性較高之篩選有效,又,對於腹膜種植等與細胞凝集塊形成相關之疾病或狀態之機制之解析或治療方法之開發有效。結果發現,藉由以特定條件培養能夠形成細胞凝集塊之細胞,可獲得經規則配置之複數個相同尺寸的細胞凝集塊。又,發現使用此種均質細胞凝集塊之篩選方法實際上可精度良好地實施,從而完成本發明。 本發明之主旨如下所示。 [1]一種培養物,其係由規則地配置有複數個孔之板(孔板)所支持的細胞之培養物,並且各孔含有1個以下之細胞凝集塊。 [2]如1所記載之培養物,其中各孔之細胞凝集塊之尺寸相同。 [3]如1或2所記載之培養物,其中各孔具有低吸附性之U型底。 [4]如1至3中任一項所記載之培養物,其中孔板具有96個、384個、或1536個孔。 [5]如1至4中任一項所記載之培養物,其中細胞為癌性。 [6]如1至5中任一項所記載之培養物,其用於化合物之篩選。 [7]如6所記載之培養物,其中篩選係用以選拔抗癌劑之候選化合物者。 [8]如1至5中任一項所記載之培養物,其用於解析與細胞凝集塊形成相關之狀態或疾病之機制。 [9]如8所記載之培養物,其中與細胞凝集塊形成相關之狀態或疾病為腹膜種植。 [10]一種對細胞凝集塊形成發揮作用之物質之篩選方法,其包括以下步驟: (1)於規則地配置有複數個孔之板(孔板)且各孔具有低吸附性之U型底之孔板中,以對形成細胞凝集塊有效之密度種植細胞,於複數個孔內培養細胞之步驟; (2)使細胞與被試驗物質接觸之步驟;及 (3)觀測與被試驗物質接觸後之細胞是否形成細胞凝集塊,以所獲得之觀測結果作為指標,評估被試驗物質對細胞凝集塊形成所產生之作用之步驟。 [11]如10所記載之篩選方法,其中細胞為癌性。 [12]如10或11所記載之篩選方法,其中對形成細胞凝集塊有效之密度為1.0×104
cells/mL~3.0×104
cells/mL。 [13]一種經規則配置之複數個相同尺寸之細胞凝集塊之製造方法,其包括以下步驟: (1)於規則地配置有複數個孔之板(孔板)且各孔具有低吸附性之U型底之孔板中,以對形成細胞凝集塊有效之密度種植細胞之步驟;及 (2)於各孔內培養細胞之步驟。 [14]如13所記載之製造方法,其中細胞為癌性。 [發明之效果] 根據本發明,可獲得可靠性較高之篩選結果。用作測定篩選條件之最適度、精度之指標的Z'值係根據下式而算出。 Z'=1-(高對照之3SD+低對照之3SD)/(高對照之平均值-低對照之平均值) 通常,最佳化時目標為Z'值超過0.5,於高通量篩選(High throughput screening,HTS)中,對每個微量板算出Z'值,當低於0.5時,判定為該微量板之檢測精度差(Zhang.J.H.et al., J. Biomol. Screen., 4, 67–73(1999))。根據本發明,可進行Z'值超過0.5之精度較高之篩選。
關於數值範圍「X~Y」,除了特別記載之情形以外,包括兩端之數值X及Y。關於「A及/或B」,除了特別記載之情形以外,意指A及B中之至少一者。 [尺寸及位置一致之細胞凝集塊群] 本發明提供一種培養物,其係由規則地配置有複數個孔之板(孔板)所支持的細胞之培養物,並且各孔含有1個以下之細胞凝集塊。培養物含有尺寸及位置一致之細胞凝集塊群。所謂細胞凝集塊意指大量細胞凝集形成細胞塊,而形成三維狀態者。細胞塊通常接近球形。各孔有細胞凝集塊1個以下意指細胞凝集塊數量為1個,或不存在細胞凝集塊。例如,在基於確認實驗恰當等目的而設置之各種對照中,或於抑制細胞凝集塊形成之藥物之篩選中,未形成細胞凝集塊之情形時,孔內有時不含細胞凝集塊。 於本發明中,可應用能夠形成細胞凝集塊之各種細胞。細胞亦可為與細胞凝集塊形成相關之狀態或疾病相關之細胞。能夠應用細胞之具體例為能夠形成細胞凝集塊之培養細胞(細胞株)、幹細胞(ES細胞、來自臍帶血的細胞、未分化間葉系幹細胞等)等未分化細胞或其分化型細胞等。作為細胞來源之器官除了肝臟、胰臟、大腸、血管、神經以外,亦可列舉骨、乳房等脂肪組織、韌帶、肌腱、牙齒、耳廓、鼻等。細胞可源自動物(例如小鼠、兔、大鼠、豚鼠、狗、豬、山羊、牛等實驗動物、或人)。細胞亦可為經過基因操作者。又,細胞凝集塊並非必須以單一種類之細胞之凝集體之形式形成,只要形成細胞凝集塊,則亦可由複數種細胞種形成。又,細胞可為癌性,亦可為非癌性。癌性之細胞株可為源自大腸癌、攝護腺癌、乳癌、多發性骨髓瘤、B細胞淋巴瘤、惡性神經膠質母細胞瘤、腎癌、肝癌、攝護腺癌、及小細胞性肺癌者。 於本發明中,各孔細胞凝集塊之尺寸相同。是否相同可藉由目視進行判定,或藉由使用光學顯微鏡進行觀察而判定。藉由向各孔內種植相同量之細胞而形成之1個細胞凝集塊通常成為相同大小。1個細胞凝集塊之尺寸雖然亦取決於所使用之細胞及條件,但例如包含0.1~10.0×103
cells左右之細胞。此種細胞凝集塊之直徑典型而言為60 μm~500 μm。 於本發明中,所形成之細胞凝集塊分別形成於目標位置並規則地配置。規則配置意指一維、二維、或三維地進行等間距排列,是否為規則地配置之狀態可藉由目視進行判定,或藉由使用光學顯微鏡進行觀察而判定。於使用U形底之均勻之各孔之情形時,通常於各孔中於U底之中心形成各個細胞凝集塊,獲得根據孔之配置而規則地排列之細胞凝集塊群。有時將經規則配置之狀態稱為陣列狀。各細胞凝集塊之間距可藉由調整孔之間距而進行各種調整。 [經規則配置之複數個相同尺寸之細胞凝集塊之製造方法] 此種經規則配置之複數個相同尺寸之細胞凝集塊係藉由包括以下步驟之製造方法而獲得。 (1)於規則地配置有複數個孔之板(孔板)且各孔具有低吸附性之U型底之孔板中,以對形成細胞凝集塊有效之密度種植細胞之步驟;及 (2)於各孔內培養細胞之步驟。步驟 (1)
步驟(1)係於孔板中以對形成細胞凝集塊有效之密度種植細胞之步驟。 孔板亦稱為微量板或微量滴定板(Microtiter plate),係指包含附帶大量凹部(孔)之平板的實驗-檢查器具。一般而言,板整體為長方形,孔以2:3之比率排列,孔之數量為6、24、96、384、1536等,孔之容量為數μL~數mL。於本發明中,並無特別限定,可尤其適宜地使用孔之數量為96、384、或1536個者。 作為孔板之素材,只要為無細胞毒性且適於細胞培養者,則無特別限定,可自丙烯酸系樹脂、聚乳酸、聚乙醇酸、苯乙烯系樹脂、丙烯酸-苯乙烯系共聚合樹脂、聚碳酸酯系樹脂、聚酯系樹脂、聚乙烯醇系樹脂、乙烯-乙烯醇系共聚合樹脂、熱塑性彈性體、氯乙烯系樹脂、及矽樹脂中之一種或該等之組合中加以選擇。 由於進行下述之篩選時利用使用螢光、吸收光之光學分析之情況居多,因此孔之底部較佳為使用構成聚合物之全光線透過率為85%以上且未達99%之素材。全光線透過率(total lμminous transmittance)可藉由日本工業規格(JIS K7375)進行測定。 就於孔內高效率地形成細胞凝集塊之觀點而言,孔內面(尤其是孔底面)較佳為低吸附性。所謂低吸附性意指蛋白質或細胞之吸附、接著較少之性質。為了設為低吸附性,例如可使用即時水接觸角成為45度以下、較佳為40度以下、更佳為20度以下之素材,或者亦可實施表面處理。作為表面處理之例,有電暈放電處理、電漿處理、火焰電漿處理、利用低壓水銀燈所進行之UV處理、準分子UV處理、雷射處理、及電子束處理、以及塗佈處理。再者,即時水接觸角係使用對象素材或實施過表面處理之平板進行測定。接觸角係指於固體表面上有液體相接之狀況下,液體之邊緣表面所作之切線與固體表面所成之角度。接觸角係指使用水液滴並藉由接觸法所測得之值,即時水接觸角係指將水液滴滴下至固體表面1分鐘後所測得之接觸角。低吸附性(抑制細胞接著性)與即時水接觸角之關係例如記載於Y Ikada著,Surface modification of polymers for medical applications,Biomaterials 1994, vol. 15 No. 10, pp. 725 - 736中。為了設為低吸附性,亦可塗佈抑制細胞接著性之物質。例如亦可塗佈磷脂質-高分子複合體或聚(甲基丙烯酸2-羥基乙酯)。就於孔內放入培養基之觀點而言,孔內面之即時水接觸角可設為45度以下,較佳為設為0度~20度之範圍。 一般而言,孔板之各孔底之形狀有平底、U底、V底等。於本發明中,板底之形狀可根據欲形成細胞凝集塊之細胞進行適當選擇,但就於目標位置良好地形成1個細胞凝集塊之觀點而言,較佳為使用非平底者,更佳為使用U底者。 孔板並無特別限定,如上所述,較佳為各孔具有低吸附性之U型底者。 細胞係以對形成細胞凝集塊有效之密度進行種植。關於該密度,從業者可根據所使用之細胞或孔板,視需要進行預備實驗等而適當決定,但於使用具有96個以上孔之低吸附性U底之孔板之情形時,可設為例如0.1×104
cells/mL以上,較佳為設為0.5×104
cells/mL以上,更佳為設為1.0×104
cells/mL以上。上限值可設為3.0×104
cells/mL以下,較佳為3.0×104
cells/mL,更佳為3.0×104
cells/mL以下。於種植時細胞密度較低之情形時,預計於後續步驟(2)之培養中,於特定時間內無法獲得所需之細胞凝集塊。又,預計無法獲得充分大小之細胞凝集塊。極小尺寸之細胞凝集塊會導致測定感度低下。於細胞密度較高之情形時,認為能夠產生不形成細胞凝集塊之細胞。於不形成細胞凝集塊之細胞占多數之情形時,認為會成為根據有無形成細胞凝集塊進行判定時之障礙。步驟 (2)
於步驟(2)中,將所種植之細胞於各孔內進行培養。該步驟係使用孔內空間,使所種植之細胞形成1個細胞凝集塊之步驟。培養可使用適合於所使用之細胞之培養液,以適合於細胞培養之條件(例如37℃、5%CO2
、95%空氣)進行6~96小時。如下所述,於將本發明之細胞凝集塊群或細胞凝集塊群之形成步驟用於下述篩選等之情形時,可於培養步驟前或過程中添加對象藥物等,而使培養環境發生變化。 [細胞凝集塊群之用途] 已知具有三維結構之細胞凝集塊與先前二維培養物相比,於多數細胞中能夠更好地反映活體內之舉動。因此,報告有使用細胞凝集塊之腫瘤-免疫細胞之相互作用之研究或用於藥物開發之篩選等。因此,藉由本發明而提供之細胞凝集塊群、及用以形成細胞凝集塊群之步驟可用於藥物等之篩選、各種細胞檢測、細胞凝集塊形成之監控、與細胞凝集塊形成相關之狀態或疾病之機制之解析等。 又,根據本發明,提供各孔1個之經規則配置之複數個相同尺寸之細胞凝集塊群、及形成此種細胞凝集塊群之步驟,藉由此種細胞凝集塊群,可進行可靠性較高之篩選。 已知細胞凝集塊根據其大小而代謝活性不同。因此,由尺寸不同之細胞凝集塊獲得不同之代謝活性值,無法獲得精度較高之結果。又,已知極小之細胞凝集塊之代謝功能極低,若使用此種細胞凝集塊時,則反應性代謝物之生成量會減少,測定感度降低。對於包含一定以上之相同尺寸之細胞凝集塊群之系,此種不良情況極少。關於測定篩選條件之最適度、精度之指標即Z'值,通常最佳化時之目標為Z'值超過0.5,藉由提供相同尺寸之細胞凝集塊群之本發明,可進行Z'值超過0.5之精度較高之篩選。 又,藉由規則地配置細胞凝集塊,變得容易利用自動化機器人進行操作,可一次處理大量樣品。 因此,本發明非常適合於為了篩選藥物等,而自由種類特別龐大之化合物構成之化合物庫中,使用自動化機器人等篩選具有活性之目標化合物之HTS。 [篩選方法] 本發明提供一種對細胞凝集塊形成發揮作用之物質之篩選方法,其包括以下之步驟(1)~(3): (1)於規則地配置有複數個孔之板(孔板)且各孔具有低吸附性之U型底之孔板中,以對形成細胞凝集塊有效之密度種植細胞,於複數個孔內培養細胞之步驟; (2)使細胞與被試驗物質接觸之步驟;及 (3)觀測與被試驗物質接觸後之細胞是否形成細胞凝集塊,以所獲得之觀測結果作為指標,評估被試驗物質對細胞凝集塊形成所產生之作用之步驟。篩選 步驟 (1)
篩選步驟(1)係於孔板中以對形成細胞凝集塊有效之密度種植細胞,於複數個孔內培養細胞之步驟。所用之細胞、孔板、種植條件、培養條件,可參照於上述細胞凝集塊或其製造方法中所說明之事項。篩選 步驟 (2)
篩選步驟(2)係使細胞與被試驗物質接觸之步驟。該篩選步驟可於篩選步驟(1)之前進行,亦可於篩選步驟(1)之過程中進行。於篩選步驟(1)之前進行之情形時,例如可藉由使種植細胞時之細胞懸浮液含有被試驗物質而實施。於篩選步驟(1)之過程中進行之情形時,例如可藉由向孔內種植細胞,視需要進行數小時培養,其後向孔內添加被試驗物質而進行。 於為了選擇抑制細胞凝集塊形成之藥物而進行篩選之情形時,除了被試驗物質以外,亦可已知有抗癌作用之物質作為對照而實施篩選。作為此種物質之例,可列舉:順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、環磷醯胺、異環磷醯胺、美法侖、白消安、達卡巴𠯤、雷莫司汀、尼莫司汀、長春新鹼、伊立替康、歐洲紫杉醇、太平洋紫杉醇、阿德力黴素、絲裂黴素、多柔比星、表柔比星、道諾黴素、博萊黴素等抗癌劑。 被試驗物質與細胞之接觸時間並無特別限定,例如可設為6小時以上,亦可設為12小時以上。亦可每經過24小時、48小時、72小時、96小時等而進行下述之是否形成細胞凝集塊之觀測。篩選 步驟 (3)
篩選步驟(3)係觀測與被試驗物質接觸後之細胞是否形成細胞凝集塊,以所獲得之觀測結果作為指標,評估被試驗物質對細胞凝集塊形成所產生之作用的步驟。 有無形成細胞凝集塊除了藉由目視而直接確認形成以外,亦可藉由使用報導基因之特定基因之表現量之定量、細胞生存率之測定等而進行觀測。報導之例為綠色螢光蛋白質(GFP)、珊瑚紅色螢光蛋白質(DsRed,Discosoma sp. Red Fluorescent Protein)、氯黴素乙酞轉移酶(CAT)、β-葡萄糖醛酸酶(GUS)等。細胞生存率之測定方法之例為ATP檢測法、MTT檢測法、細胞內麩胱甘肽檢測法、LDH檢測法等。該等報導及細胞生存率之測定方法對於業者而言已熟知。 本發明之篩選方法可用於篩選用於與細胞凝集塊形成相關之狀態或疾病之處置(預防、治療)的醫藥候選化合物、或其先導化合物或種子化合物。與細胞凝集塊形成相關之狀態或疾病包括腹膜種植。 本發明之篩選方法可於藥物篩選之各階段進行,又,可反覆進行。例如可設為如下檢測而實施:針對被試驗物質之一種濃度所進行之使用高內涵分析之表現型檢測(一次篩選)、確認被試驗物質之容量反應性的使用高內涵分析之表現型檢測(二次篩選)、及/或縮小候選藥物範圍之表現型檢測(三次篩選)。 以下,藉由實施例對本發明進行具體說明。但,本發明並不限定於以下之記述。 [實施例] [篩選所用細胞之製備] 藉由以下方法,將經凍結保存之細胞溶解,進行繼代培養,並用於下述篩選。細胞溶解 :
1.將裝有CT26 GFP+
之小瓶(2.0×106
cells/1 mL/ampule)自液態氮瓶中取出,於37℃之熱水浴中進行融解。再者,所使用之細胞可利用SIV載體對自ATCC購買之母株導入GFP,並藉由單細胞選殖(Single cell cloning)而製作(參照下文所揭示之非專利文獻1、2)。 2.將小瓶中之細胞浮遊液之全部量加入至10%FBS-RPMI-1640(包含10%胎牛血清、100 units/mL青黴素-100 μg/mL鏈黴素之杜爾貝科改良伊格爾培養基)中之後,於4℃下進行離心分離(100g,3分鐘)。 3.將沈積物(細胞)再懸浮於10 mL之10%FBS-RPMI-1640中,並種植於1張100 mm培養皿(BD Biosciences)上之後,於37℃、5%CO2
、95%空氣之條件下進行培養。CT26 GFP+ 之 繼 代 培養:
1.CT26 GFP+
係於增生至亞融合或融合狀態後進行繼代。 2.抽吸去除培養液,使用磷酸緩衝生理食鹽水(PBS,Invitrogen)將細胞洗淨。 3.去除PBS後,加入0.05%胰蛋白酶溶液[將0.25%胰蛋白酶、1 mmol/LEDTA・4Na(Invitrogen)利用PBS稀釋5倍],於37℃、5%CO2
、95%空氣之條件下使其反應直至細胞自培養皿剝離為止。 4.加入10%FBS-RPMI-1640使細胞懸浮並回收。 5.於4℃下進行離心分離(400g,3分鐘)後,將沈積物(細胞)再懸浮於10%FBS-RPMI-1640中。 6.使細胞懸浮液之一部分與0.4%錐蟲藍溶液(Sigmα-Aldrich)混合,使用細胞計數板(One Cell Counter,One Cell股份有限公司)於相位差顯微鏡下計測活細胞數。 7.以達到2.0×105
cells/dish之方式使用10%FBS-RPMI-1640稀釋細胞懸浮液並加以種植。 8.廢棄剩餘細胞。 [1次篩選、2次篩選] <方法> 使用自東京大學創藥機構(舊名:東大創藥開放創新中心)取得之驗證化合物庫(Validated Compound Library)(包含已知活性化合物與過專利保護之醫藥品的庫,約3,000種),藉由下述方法進行1次篩選及2次篩選。於 384 孔培養板中種植 (1 次、 2 次 篩選 用 ) :
1.CT26 GFP+
係增生至亞融合或融合狀態後,抽吸去除培養液,使用磷酸緩衝生理食鹽水(PBS,Invitrogen)將細胞洗淨。 2.去除PBS後,加入0.05%胰蛋白酶溶液[將0.25%胰蛋白酶、1 mmol/LEDTA・4Na(Invitrogen)利用PBS稀釋5倍],於37℃、5%CO2
、95%空氣之條件下使其反應直至細胞自培養皿剝離為止。 3.加入10%FBS-RPMI-1640使細胞懸浮並回收。 4.於4℃下進行離心分離(400g,3分鐘)後,將沈積物(細胞)再懸浮於10%FBS-RPMI-1640中。 5.使細胞懸浮液之一部分與0.4%錐蟲藍溶液(Sigmα-Aldrich)混合,使用細胞計數板(One Cell Counter,One Cell股份有限公司)於相位差顯微鏡下計測活細胞數。 6.於2D培養之情形時,以成為3.0×104
cells/mL之方式利用10%FBS-0.1%DMSO-RPMI-1640稀釋細胞懸浮液,並利用BIOMEK(註冊商標)NXP(BECKMAN COULTER)以20 μL/well之容量於培養板(ViewPlate-384,PerkinElmer)中種植細胞。 7.於3D培養之情形時,以成為5.0×104
cells/mL之方式利用10%FBS-0.1%DMSO-RPMI-1640稀釋細胞懸浮液,並利用BIOMEK(註冊商標)NXP以20 μL/well之容量於低接著板(PrimeSurface(註冊商標)384U板,Sumitomo Bakelite股份有限公司)中種植細胞。 8.所種植之細胞係於37℃、5%CO2
、95%空氣之條件下進行培養。 1次篩選、2次篩選均使用384孔培養板。 細胞種植、CellTiter吸取(2D 3D通用)時之BIOMEK(註冊商標)NXP(BECKMAN COULTER)之設定畫面之例如下所示。 [表1] 藥 物 製 備 (1 次 2 次 篩選 用 ) :
1.向分取有必須容量之化合物板中,利用BIOMEK(註冊商標)NXP加入10%FBS-RPMI-1640,製成添加用藥物板。 2.繼而,向種植完畢之細胞板中,利用BIOMEK(註冊商標)NXP自藥物板添加10 μL並移液。 DMSO濃度設為0.1%至0.3%。 藥物之添加時間為種植後迅速添加,或1天後添加。 於1次篩選中,藉由1化合物之單一劑量實施評估。 於2次篩選中,對於化合物之用量反應性,以4劑量(可適當變更)實施。 藥物稀釋(向化合物板添加培養基:2D 3D通用)時之BIOMEK(註冊商標)NXP(BECKMAN COULTER)之設定畫面之例如下所示。 [表2]藥物添加(2D)時之BIOMEK(註冊商標)NXP(BECKMAN COULTER)之設定畫面之例如下所示。 [表3]藥物添加(3D)時之BIOMEK(註冊商標)NXP(BECKMAN COULTER)之設定畫面之例如下所示。 [表4] 觀 察 (1 次 2 次 篩選 ) :
1.藥物處置72小時後使用IN Cell Analyzer 2000(GE Healthcare)以明視野及螢光兩種類型確認細胞凝集塊之形態。 2.細胞凝集塊係以自GFP所獲得之總螢光量(Dencity×Area)為指標進行評估。 3.於1次篩選中,將與DMSO處置孔相比確認到50%以上變動之孔視為HIT候選。 最終評估係與以下之項所示之ATP檢測一併綜合地加以判斷。ATP 檢測 (1 次 2 次 篩選 ) :
1.評估最終日,利用BIOMEK(註冊商標)NXP以與培養容量相等之量添加CellTiter-Glo(註冊商標)3D細胞活力檢測試劑,經過15至30分鐘後,進行移液。 2.繼而,視需要將細胞溶解液20 μL移至黑色培養板中,利用照度計(Enspire等)測定發光。 <結果> 將使用384孔培養板所製備之細胞凝集塊群之照片示於圖1~3。各細胞凝集塊為相同大小,可見各孔中位於U底中心之1個細胞凝集塊。又,各孔細胞凝集塊之尺寸幾乎相同。 又,求出CV值(變異係數,coefficient of variation,計算式:CV(%)=標準偏差(SD)/平均(Av),分注後之分注液量或讀板儀之測定值之偏差等;較佳為CV值大致為10%以內)及Z'-係數(計算式Z'=1-(3×SD100%+3×SD)/(Avl00%-AvO%),以成為檢測系統之性質之標準之數字來表示精度的所需指標;一般而言,若Z'值為0.5以上,則作為系統而言較佳)。如下表所示,CV值、Z'-係數均良好。再者,為了考慮添加化合物所伴隨之DMSO之影響,使用兩種濃度進行研究。 [表5]
於使用細胞凝集塊群所進行之1次篩選中,有127個化合物符合,又,於2次篩選中,有8個化合物符合。 [3次篩選] <方法> 藉由下述方法進行3次篩選。向 96 孔培養板之種植:
1.CT26 GFP+
係增生至亞融合或融合狀態後,抽吸去除培養液,使用磷酸緩衝生理食鹽水(PBS,Invitrogen)將細胞洗淨。 2.去除PBS後,加入0.05%胰蛋白酶溶液[將0.25%胰蛋白酶、1 mmol/L EDTA・4Na(Invitrogen)利用PBS稀釋5倍],於37℃、5%CO2
、95%空氣之條件下使其反應直至細胞自培養皿剝離為止。 3.加入10%FBS-RPMI-1640使細胞懸浮並回收。 4.於室溫下進行離心分離(400g,3分鐘)後,將沈積物(細胞)再懸浮於10%FBS-RPMI-1640中。 5.將細胞懸浮液之一部分與0.4%錐蟲藍溶液(Sigmα-Aldrich)混合,使用細胞計數板(One Cell Counter,One Cell股份有限公司)於相位差顯微鏡下計測活細胞數。 6.於2D培養之情形時,以成為1.1×104
cells/mL之方式利用10%FBS-0.1%DMSO-RPMI-1640稀釋細胞懸浮液,利用移液管以90 μL/well之容量於培養板中種植細胞。 7.於3D培養之情形時,以成為2.2×105
cells/mL之方式使用10%FBS-0.1%DMSO-RPMI-1640稀釋細胞懸浮液,利用移液管以90 μL/well之容量於低接著板(Nunclon Sphera96,Thermo Scientific)中種植細胞。 8.所種植之細胞係於37℃、5%CO2
、95%空氣之條件下進行培養。藥 物 製 備 :
1.將化合物以公比1/10於培養基中進行自最高濃度20 μM起之7劑量階段稀釋(1%DMSO)。 2.繼而,向種植完畢之細胞板添加經階段稀釋之化合物10 μL並進行移液。 3.藥物之添加時間為種植後迅速添加(前處置),或1天後添加(後處置)。 利用基本單劑量(n=1)實施評估。ATP 檢測:
於評估最終日,以與培養容量相等之量添加CellTiter-Glo(註冊商標)3D細胞活力檢測試劑,經過15至30分鐘後,進行移液。繼而,視需要將細胞溶解液120 μL移至黑色培養板中,利用照度計(Enspire等)測定發光。 <結果> 將結果示於圖4及5。3次篩選之結果為,特定出PD0325901為抑制細胞凝集塊形成能力較高之化合物。 [活體內試驗] 於活體內進行確認藉由篩選而特定之化合物PD0325901之活性。 <方法> 動物: 1.雄性BALB/c 小鼠:以下使用小鼠(使用時週齡:6~8週齡)。 2.供給於實驗之前,以每籠5隻以內收容至鋪有經滅菌之床墊(Paperclean,Japan SLC股份有限公司)之塑料籠(寬136 mm×長208 mm×高115 mm)中。 3.飼養期間使其自由攝取固型飼料CRF-1(Oriental Yeast股份有限公司)及利用供水瓶自由攝取自來水。 4.進貨時藉由耳穿孔進行個體識別(識別編號:01~)。 細胞溶解、繼代同上。 腹腔內移入: 1.CT26 GFP+
係增生至亞融合或融合狀態後,抽吸去除培養液,使用磷酸緩衝生理食鹽水(PBS,Invitrogen)將細胞洗淨。 2.去除PBS後,加入0.05%胰蛋白酶溶液[將0.25%胰蛋白酶、1 mmol/LEDTA・4Na(Invitrogen)利用PBS稀釋5倍],於37℃、5%CO2
、95%空氣之條件下使其反應直至細胞自培養皿剝離為止。 3.加入10%FBS-RPMI-1640使細胞懸浮並回收。於4℃下進行離心分離(400g,3分鐘)後,將沈積物(細胞)再懸浮於10%FBS-RPMI-1640中。 4.將細胞懸浮液之一部分與0.4%錐蟲藍溶液(Sigmα-Aldrich)混合,使用細胞計數板(One Cell Counter,One Cell股份有限公司)於相位差顯微鏡下計測活細胞數,以成為1.0×107
cells/mL之方式利用HBSS而製備細胞懸浮液。 5.使用附帶26G注射針之注射器(TERUMO股份有限公司),對每隻小鼠腹腔注入細胞懸浮液0.2 mL(2.0×106
cells/body)。 分群: 於腹腔內移入日(Day0),將小鼠體重以降序排列,隨機分成所需之群(根據體重之分層隨機分配法)。 藥物製備:實施根據最適投予途徑之藥液製備。 藥液投予:用法用量根據藥物而適當調整。 投予開始時期:自Day1或Day4開始。 評估指標及評估項目: 種植結節量,GFP 腹水重量,腹水 存活期間,天 體重變化,體重 評估方法: (1)種植結節量 於最終評估日,將小鼠頸椎脫臼後,正中切開腹部,摘取自十二指腸至直腸之消化道,保管於經冰冷之PBS中。將摘取之消化道於100 mm培養皿上展開,並利用BZ9000以明視野及螢光取得消化道之整體圖像。所取得之圖像係使用ImageJ進行數值化而設為種植結節量。 (2)腹水重量 於最終評估日,使小鼠頸椎脫臼後,正中切開腹部,將儲存於腹腔內之腹水藉由預先測定重量之脫脂棉進行回收。回收後,測定重量設為腹水重量。 (3)存活期間 記錄試驗期間,確認小鼠死亡之日期。 (4)體重變化 試驗期間,2~3天記錄一次小鼠之體重。 <結果> 將結果示於圖6及7。 [實施例項目中之引用文獻] 非專利文獻1:Y Kasagi et al. Peritoneal Dissemination Requires an Sp1 - Dependent CXCR4 / CXCL12 Signaling Axis and Extracellular Matrix – Directed Spheroid Formation. Cancer Res; 76 (2) January 15, 2016, 347 - 357, ( Published OnlineFirst January 7, 2016; DOI: 10. 1158 / 0008 - 5472. CAN - 15 - 1563) 非專利文獻2:Y Ikeda et al. Simian immunodeficiency virus - based lentivirus vector for retinal gene transfer: a preclinical safety study in adult rats. Gene Therapy (2003) 10, 1161 – 1169 [產業上之可利用性] 藉由本發明所獲得之尺寸及位置一致之細胞凝集塊群除了可用於作為抗癌劑等有用之化合物之篩選以外,對於腹膜種植等與細胞凝集塊形成相關之病態之解析及預防、治療方法之確立亦有用。
圖1係使用具有384個孔之U底孔板的經規則配置之相同尺寸之細胞凝集塊之製備例。箭頭所示之排因添加EDTA而不形成細胞凝集塊。左右各2排未種植細胞。 圖2係將圖1中由方框包圍之部分放大之照片。 圖3係藉由本發明之方法所製備之細胞凝集塊之形態之例。 圖4係3次篩選之結果。其係2D培養與3D培養(利用使用具有96個孔之U底孔板所製備之細胞凝集塊群)之比較。PD0325901被特定為抑制細胞凝集塊形成之能力較高之化合物。 圖5係3次篩選之結果。藥物係於種植後迅速添加(前處置),或1天後添加(後處置)。 圖6係PD0325901針對腹膜種植之效果(來自在最終評估日摘取之消化道之螢光量)。其係與最終日之媒劑群之比較(Tukey-Kramer HSD檢測)。使用小鼠,於活體內進行確認藉由篩選而特定之化合物PD0325901之活性。 圖7係PD0325901針對腹膜種植之效果(於最終評估日回收之腹水之重量)。其係與最終日之媒劑群之比較(Tukey-Kramer HSD檢測)。使用小鼠,於活體內進行確認藉由篩選而特定之化合物PD0325901之活性。
Claims (14)
- 一種培養物,其係由規則地配置有複數個孔之板(孔板)所支持之細胞之培養物,各孔含有1個以下之細胞凝集塊。
- 如請求項1之培養物,其中各孔之細胞凝集塊之尺寸相同。
- 如請求項1或2之培養物,其中各孔具有低吸附性之U型底。
- 如請求項1至3中任一項之培養物,其中孔板具有96個、384個、或1536個孔。
- 如請求項1至4中任一項之培養物,其中細胞為癌性。
- 如請求項1至5中任一項之培養物,其用於化合物之篩選。
- 如請求項6之培養物,其中篩選係用以選拔抗癌劑之候選化合物。
- 如請求項1至5中任一項之培養物,其用於解析與細胞凝集塊形成相關之狀態或疾病之機制。
- 如請求項8之培養物,其中與細胞凝集塊形成相關之狀態或疾病為腹膜種植。
- 一種對細胞凝集塊形成發揮作用之物質之篩選方法,其包括以下步驟: (1)於規則地配置有複數個孔之板(孔板)且各孔具有低吸附性之U型底之孔板中,以對形成細胞凝集塊有效之密度種植細胞,於複數個孔內培養細胞之步驟; (2)使細胞與被試驗物質接觸之步驟;及 (3)觀測與被試驗物質接觸後之細胞是否形成細胞凝集塊,以所獲得之觀測結果作為指標,評估被試驗物質對細胞凝集塊形成所產生之作用之步驟。
- 如請求項10之篩選方法,其中細胞為癌性。
- 如請求項10或11之篩選方法,其中對形成細胞凝集塊有效之密度為1.0×104 cells/mL~3.0×104 cells/mL。
- 一種經規則配置之複數個相同尺寸之細胞凝集塊之製造方法,其包括以下步驟: (1)於規則地配置有複數個孔之板(孔板)且各孔具有低吸附性之U型底之孔板中,以對形成細胞凝集塊有效之密度種植細胞之步驟;及 (2)於各孔內培養細胞之步驟。
- 如請求項13之製造方法,其中細胞為癌性。
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