CN110215448A - 一种含有转运蛋白抑制剂的药物、药物组合物及用途 - Google Patents

一种含有转运蛋白抑制剂的药物、药物组合物及用途 Download PDF

Info

Publication number
CN110215448A
CN110215448A CN201810176164.8A CN201810176164A CN110215448A CN 110215448 A CN110215448 A CN 110215448A CN 201810176164 A CN201810176164 A CN 201810176164A CN 110215448 A CN110215448 A CN 110215448A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
expression
kyn
disease
drug
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201810176164.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110215448B (zh
Inventor
黄波
刘玉英
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Basic Medical Sciences of CAMS
Original Assignee
Institute of Basic Medical Sciences of CAMS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Basic Medical Sciences of CAMS filed Critical Institute of Basic Medical Sciences of CAMS
Priority to CN201810176164.8A priority Critical patent/CN110215448B/zh
Priority to PCT/CN2019/074548 priority patent/WO2019165884A1/zh
Priority to JP2020568583A priority patent/JP7150885B2/ja
Priority to US16/977,217 priority patent/US20210154162A1/en
Priority to EP19761332.6A priority patent/EP3760197B1/en
Publication of CN110215448A publication Critical patent/CN110215448A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110215448B publication Critical patent/CN110215448B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/135—Amines having aromatic rings, e.g. ketamine, nortriptyline
    • A61K31/136—Amines having aromatic rings, e.g. ketamine, nortriptyline having the amino group directly attached to the aromatic ring, e.g. benzeneamine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/196—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino group being directly attached to a ring, e.g. anthranilic acid, mefenamic acid, diclofenac, chlorambucil
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid or pantothenic acid
    • A61K31/198—Alpha-amino acids, e.g. alanine or edetic acid [EDTA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
    • A61K31/7076—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines containing purines, e.g. adenosine, adenylic acid
    • A61K31/708—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines containing purines, e.g. adenosine, adenylic acid having oxo groups directly attached to the purine ring system, e.g. guanosine, guanylic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

本公开提供一种含有转运蛋白抑制剂的药物、药物组合物及用途。本公开具体提供一种转运蛋白抑制剂在制备预防或治疗伴随PD‑1表达上升的疾病的药物中的应用。本公开提供的药物，能够有效地降低特异性CD8+T细胞PD‑1的表达，增强特异性CD8+T细胞对肿瘤细胞的杀伤。

Description

一种含有转运蛋白抑制剂的药物、药物组合物及用途
技术领域
本公开涉及分子生物学、药物和肿瘤学领域。更具体地，提供了含有转运蛋白抑制剂的药物、药物组合物及用途。
背景技术
肿瘤仍然是人类健康的最致命威胁之一。实体瘤对大多数那些死亡负有责任。虽然某些肿瘤的医学治疗有显著进步，但是所有肿瘤的总体5年存活率在过去20年中仅仅改善了约10％。肿瘤或恶性肿瘤以不受控制的方式快速生长和转移，使得及时检测和治疗极其困难。
肿瘤免疫治疗是继手术、放射治疗、化学治疗之后的又一种对治疗肿瘤有明确效果的肿瘤治疗方法，它是通过激活人体自身免疫系统来抵御、杀死肿瘤细胞，是未来肿瘤治疗发展的方向之一。
不同患者使用不同的免疫疗法均会表现出不同的信息，这就需要对肿瘤免疫治疗患者进行特异性的免疫系统评估以监控肿瘤免疫治疗效果。
程序性死亡受体1(PD-1)是一种已经与慢性感染，妊娠，组织同种异体移植物，自身免疫病，和肿瘤期间免疫系统应答的遏制联系起来的蛋白质。 PD-1通过结合在T细胞，B细胞，和单核细胞的表面上表达的称作程序性死亡受体1(PD-L1)的抑制性受体来调节免疫应答。PD-1免疫疗法的作用机制是针对PD-1或PD-L1设计特定的蛋白质抗体，阻止PD-1和PD-L1的识别过程，部分恢复具有抗原特异性的肿瘤特异性细胞毒性CD8+淋巴细胞(CTL)功能，从而使之可以杀死肿瘤细胞。
然而，尽管程序性细胞死亡受体1(PD-1)抗体针对许多类型的肿瘤的临床应用空前成功，但PD-1在肿瘤微环境中在肿瘤特异性细胞毒性CD8+淋巴细胞(CTL)中如何调节的潜在机制仍然没有很好表征。与此同时，考虑到肿瘤复发与残余致瘤细胞之间的关系，即使从PD-1信号的抑制作用缓解后，CTL也可不破坏可再生肿瘤的干细胞样癌细胞[肿瘤再生细胞(TRC)]。这些 TRCs是自我更新、高致瘤性癌细胞亚群，其在肿瘤发生的启动、促进和演进中起关键作用。
此外，部分最初反应并表现出出色治疗结果的治疗患者群体仍然存在复发的情形，因此，医疗人员仍然需要一种新的用于治疗肿瘤疾病的方案。
发明内容
发明要解决的问题
为了解决以上问题，本公开提供了一种新的用于治疗肿瘤疾病的方案。所述方案包括提供一种药物，以及利用所述药物治疗伴随PD-1表达上升的疾病，特别是伴随PD-1表达上升的肿瘤的治疗方法。
用于解决问题的方案
本公开提供一种转运蛋白抑制剂在制备预防或治疗伴随PD-1表达上升的疾病的药物中的应用。
本公开中，所述疾病选自伴随PD-1表达上升而产生肿瘤所导致的疾病；优选的，所述伴随PD-1表达上升而产生肿瘤所导致的疾病选自伴随PD-1表达上升的黑色素瘤、伴随PD-1表达上升的肝癌、伴随PD-1表达上升的乳腺癌、伴随PD-1表达上升的肺癌、伴随PD-1表达上升的结肠直肠癌、伴随PD-1表达上升的卵巢癌或伴随PD-1表达上升的白血病中的一种或多种。
本公开中，所述转运蛋白选自色氨酸转运子或Kyn转运子中的一种或其组合；优选的，所述色氨酸转运子选自SLC1A5，所述Kyn转运子选自SLC7A8 或PAT4。
本公开中，所述转运蛋白抑制剂选自GPNA，SAR、BCH及其药理学上可以接受的盐中的一种或多种。
本公开中，所述药物还包含其它治疗伴随PD-1表达上升的疾病的试剂；优选的，所述其它治疗伴随PD-1表达上升的疾病的试剂选自免疫调节剂、 IDO抑制剂，AhR抑制剂、放疗剂或化疗剂中的一种或多种；可选的，所述免疫调节剂选自免疫检查点调节剂或促进或介导促进细胞介导的免疫应答的抗原呈递的试剂。
本公开还提供一种转运蛋白抑制剂在制备用于和其它可以治疗伴随 PD-1表达上升的疾病的药物联合预防或治疗伴随PD-1表达上升的疾病的药物的应用。
本公开中，所述治疗伴随PD-1表达上升的疾病的药物选自如权利要求5 所述的其它治疗伴随PD-1表达上升的疾病的试剂。
本公开还提供一种药物，其用于预防或治疗伴随PD-1表达上升的疾病，其中，所述药物包含转运蛋白抑制剂。
本公开中所述转运蛋白选自色氨酸转运子或Kyn转运子中的一种或其组合；优选的，所述色氨酸转运子选自SLC1A5，所述Kyn转运子选自SLC7A8 或PAT4；可选的，所述转运蛋白抑制剂选自GPNA，SAR、BCH及其药理学上可以接受的盐中的一种或多种。
本公开中，所述药物还包含如权利要求5所述的其它治疗伴随PD-1表达上升的疾病的试剂。
本公开还提供一种伴随PD-1表达上升的疾病的预防或治疗方法，其特征在于，所述方法包括施用预防或治疗有效量的的药物的步骤。
本公开中，所述方法还包括施用治疗有效量的如权利要求5所述的其它治疗伴随PD-1表达上升的疾病的试剂；可选的，所述方法进一步包括手术治疗的步骤。
本公开中，所述药物进一步包含药用辅料。
发明的效果
本公开提供的药物，能够有效地降低特异性CD8+T细胞PD-1的表达，增强特异性CD8+T细胞对肿瘤细胞的杀伤。
可选的，本公开提供的药物以及通过施用所述药物或和其它有关药物的组合，可以有效的治疗伴随PD-1表达上升的疾病。
附图说明
图1所示的是来自CTL的IFN-γ刺激TRC在CTL中上调PD-1表达。
图2所示的是Kyn在CD8+T细胞中上调PD-1表达。
图3所示的是Kyn活化芳香烃受体(AhR)用于PD-1的上调。
图4所示的是AhR上调SLC7A8和PAT4的表达从而促进Kyn的转运。
图5所示的是TCR信号传导促进通过Kyn上调PD-1。
图6所示的是Kyn通过活化AhR在体内上调PD-1表达。
图7所示的是PD-1表达通过患者体内的Kyn-AhR通路调节。
图8所示的是抑制肿瘤细胞色氨酸转运子SLC1A5对特异性CD8+T细胞 PD-1表达的影响检测。其中，图8A显示在OVA-B16黑色素瘤细胞培养体系中加入IFN-γ的情况下，加入色氨酸转运子SLC1A5抑制剂GPNA，检测肿瘤细胞对色氨酸的摄取情况；图8B显示将3D培养的OVA-B16细胞与特异性 OT-1CD8+T细胞共培养，在培养体系中加入SLC1A5抑制剂GPNA，检测其对CD8+T细胞PD-1表达的影响。
图9所示的是抑制小鼠CD8+T细胞Kyn转运子PAT4和SLC7A8对CD8+T 细胞PD-1表达的影响检测。其中，图9A显示在激活的OT-1CD8+T细胞培养体系中加入Kyn，检测转运子PAT4和SLC7A8的表达情况；图9B显示在体外培养激活的OT-1CD8+T细胞中加入Kyn，同时加入PAT4和SLC7A8抑制剂 SAR和BCH，检测SAR和BCH对CD8+T细胞PD-1表达的影响；图9C显示将3D 培养的OVA-B16细胞与特异性OT-1CD8+T细胞共培养，在培养体系中加入 SAR或BCH，检测特异性T细胞对肿瘤细胞的杀伤情况。
图10所示的是抑制人外周血CD8+T细胞Kyn转运子PAT4和SLC7A8对 CD8+T细胞PD-1表达的影响检测。其中，图10A显示在激活的人外周血CD8+T 细胞培养体系中加入Kyn，检测转运子PAT4和SLC7A8的表达情况；图10B显示在激活的人外周血CD8+T细胞中加入Kyn，同时加入PAT4和SLC7A8抑制剂SAR或BCH，检测SAR和BCH对CD8+T细胞PD-1表达的影响。
具体实施方式
定义
当在权利要求和/或说明书中与术语“包含”联用时，词语“一(a)”或“一(an)”可以指“一个”，但也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。
如在权利要求和说明书中所使用的，词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
在整个申请文件中，术语“约”表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。
虽然所公开的内容支持术语“或”的定义仅为替代物以及“和/或”，但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外，权利要求中的术语“或”是指“和/或”。
术语“转运蛋白”或“转运子”表示组织细胞膜上的一种载体蛋白。在本公开中，上述术语可以交替使用，表示的含义相同。
术语“药物”的定义为能够预防或治疗疾病的物质。其可以含有一种用于治疗疾病的有效成分，也可以含有两种或以上的治疗疾病的有效成分。可选的，所述药物可以为疫苗。所述“药物”还可以根据需要，加入例如有利于延长药物存储时间、稳定性或更佳的被患者吸收的成分。示例性的，所述成分可以选自药用辅料。
术语“免疫调节剂”包含免疫检查点调节剂，例如免疫检查点蛋白受体及其配体介导T细胞介导的细胞毒性的抑制，并且通常由肿瘤或在肿瘤微环境中的无反应性T细胞上表达，并允许肿瘤逃避免疫攻击。免疫抑制检查点蛋白受体及其配体的活性的抑制剂可以克服免疫抑制性肿瘤环境，以允许肿瘤的细胞毒性T细胞攻击。免疫检查点蛋白质的实例包括但不限于PD-1、 PD-L1、PDL2、CTLA4、LAG3、TIM3、TIGIT和CD103。此类蛋白质的活性的调节(包括抑制)可以通过免疫检查点调节剂完成，其可以包括例如靶向检查点蛋白质的抗体、适体、小分子和检测点受体蛋白质的可溶性形式，等等。PD-1靶向抑制剂包括经批准的药物试剂派姆单抗(pembrolizumab)和纳武单抗(nivolumab)，而易普利姆玛(ipilimumab)是经批准的CTLA-4抑制剂。对 PD-L1、PD-L2、LAG3、TIM3、TIGIT和CD103特异性的抗体是已知的和/ 或商品化的，并且也可以由本领域技术人员产生。
除了免疫检查点调节剂之外免疫调节剂还包括促进或介导促进细胞介导的免疫应答的抗原呈递的试剂。此类免疫调节剂可以包括例如肿瘤抗原疫苗。肿瘤抗原疫苗可以包括包含特定肿瘤抗原或一组已知肿瘤抗原的制剂，其具有或不具有受试者自己的树突细胞或佐剂。或者，肿瘤抗原疫苗可以包含来自患者肿瘤的相对粗制的肿瘤细胞抗原制剂，当离体暴露于从患者细胞体外产生的树突细胞时，其可以在将树突细胞疫苗引入患者中时允许T细胞介导的肿瘤攻击。在一个实施方案中，免疫调节剂包括肿瘤抗原疫苗。在另一个实施方案中，肿瘤抗原疫苗包含树突细胞肿瘤抗原疫苗。
术语“IDO”(吲哚胺2,3-双加氧酶)是一种与色氨酸代谢有关的蛋白酶。吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1)调节免疫细胞功能至一种抑制的表型，并因此部分造成肿瘤逃避宿主的免疫监视。IDO1降解必需氨基酸色氨酸为犬尿氨酸和其它的代谢产物。这些代谢产物和色氨酸的缺乏导致效应物T-细胞功能的抑制和调节性T细胞的增强的分化。IDO抑制剂是已知的和/或商品化的，并且也可以由本领域技术人员产生。
术语“犬尿氨酸(kynurenine,Kyn)”是色氨酸在人体内的一种代谢中间产物。
术语“AhR(芳基烃受体)抑制剂”或“AhR拮抗剂”是指这样的药剂或化合物：其抑制一种或多种AhR信号传递和下游效应器通路，包括组成型AhR 信号传递。因此，术语AhR抑制剂是指这样的药剂：其抑制AhR多肽或编码 AhR的多核苷酸的表达，或者其结合，部分或全部阻断所述AhR多肽或编码 AhR的多核苷酸的刺激作用，降低、阻止、延迟所述AhR多肽或多核苷酸的激活作用，失活、脱敏或下调所述AhR多肽或编码AhR的多核苷酸的活性。这样的AhR抑制剂能够例如抑制AhR表达，例如，AhR翻译，AhR的翻译后加工，AhR多肽的稳定、降解或者核定位或胞质定位，或者编码AhR的多核苷酸的转录、转录后加工、稳定或降解，或者结合至部分或全部地阻断刺激作用，DNA结合，或者AhR的转录因子活性。AhR抑制剂能够直接或间接地起作用。AhR抑制剂是已知的和/或商品化的，并且也可以由本领域技术人员产生。
术语“放疗剂”包括使用引起DNA损伤的药物。放疗已广泛用于癌症和疾病治疗，并且包括通常称为γ射线、X射线的那些和/或将放射性同位素定向递送至肿瘤细胞。
术语“化疗剂”是可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的类别包括，但不限于：烷化剂、抗代谢产物、激酶抑制剂、纺锤体毒物植物生物碱、细胞毒/抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、光敏剂、抗-雌激素和选择性雌激素受体调节剂、抗-孕酮、雌激素受体下调剂、雌激素受体拮抗剂、促黄体激素释放激素激动剂、抗-雄激素类、芳香化酶抑制剂、EGFR抑制剂、VEGF 抑制剂、抑制涉及异常细胞增殖或肿瘤生长的基因表达的反义寡核苷酸。可用于本公开的治疗方法的化疗剂包括细胞生长抑制剂和/或细胞毒性剂。
术语“药用辅料”是药物制剂的基础材料和重要组成部分。它不仅赋予药物一定剂型，而且与提高药物的疗效、降低不良反应有很大的关系。药用辅料除了赋形、充当载体、提高稳定性外，还具有增溶、助溶、缓控释等重要功能，是可能会影响到药品的质量、安全性和有效性的重要成分。所述药用辅料可分为溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、 pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂等类型。
实施例
本公开的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是，应当理解的是，详细描述和具体实施例(虽然表示本公开的具体实施方式)仅为解释性目的而给出，因为在阅读该详细说明后，在本公开的精神和范围内所作出的各种改变和修饰，对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
本公开采用的实验动物、试剂及耗材如下：
雌性C57BL/6小鼠(6-8周大)，OT-I转基因小鼠，Pmel-1转基因小鼠， AhR-/-小鼠，MMTV-PyMT小鼠均购自商业机构。这些动物在无病原体条件下保存在申请人的相应设施中。所有涉及小鼠的研究均由动物护理与使用委员会批准。
小鼠肿瘤细胞系OVA-B16(黑色素瘤)，H22(肝细胞癌)和ID8(卵巢癌)和人肿瘤细胞系A375(黑色素瘤)和HepG2(肝细胞癌)购自中国典型培养物保藏中心(中国北京)，并在具有10％胎牛血清(FBS)(Gibco，USA)的 DMEM(Thermo Scientific)中培养，不同之处在于H22细胞在含有10％FBS的 RPMI1640培养基(Gibco，USA)中生长。
从Origene(MD,USA)购买pGFP-C-shLenti-shIDO1、 pGFP-C-shLenti-shSLC1A5、pGFP-V-RS-shPAT4、pGFP-V-RS-shSLC7A8和 pCMV6-Entry-DDK-SLC1A5。犬尿氨酸、犬尿喹啉酸、硫酸吲哚酚、褪黑激素、1-L-MT、3',4'-二甲氧基黄酮(DMF)、TCDD、肌苷酸(SAR)、2-氨基-2- 去甲菠烷羧酸(BCH)、L-γ-谷氨酰-3-羧基-4硝基苯胺(GPNA)和抗PAT4抗体来自Sigma-Aldrich(ST，USA)。环孢菌素A来自SelleckChemicals。从BioLegend 购买抗-IFN-γ、TNF-α、PD-1和PD-L1中和抗体以及抗-PD-1、CD3、CD8、 IFN-γ、TNF-α和CD107a抗体。IFN-γ购自R&D Systems。鲑鱼纤维蛋白原、凝血酶和分散酶来自Reagent Proteins(CA，USA)。嘌呤霉素来自 Invitrogen(SD，USA)。
人类外周血，切除的人乳腺癌或结肠癌组织来自医院的患者。伦理许可由相应医院的临床试验伦理委员会授予。所有患者均提供书面知情同意书来参与该研究。
实验方法
(1)生物标志物的检测方法
在任何前述方法中，通过测定生物标志物的蛋白质表达水平来测量生物标志物的存在和/或表达水平/量。在某些实施方案中，所述方法包括使生物学样品与特异性结合本文中描述的生物标志物的抗体(例如抗PD-1抗体)在允许生物标志物结合的条件下接触，并检测抗体与生物标志物之间是否形成复合物。此类方法可以是体外或体内方法。在一些情况中，使用抗体来选择符合使用PD-1轴结合拮抗剂疗法的资格的受试者，例如用于选择个体的生物标志物。可以使用本领域已知的或本文中提供的任何测量蛋白质表达水平的方法。例如，在一些实施方案中，使用选自下组的方法测定生物标志物(例如 PD-1)的蛋白质表达水平：流式细胞术(例如荧光激活细胞分选(FACSTM))， Western印迹，酶联免疫吸附测定法(ELISA)，免疫沉淀，免疫组织化学(IHC)，免疫荧光，放射免疫测定法，点印迹，免疫检测方法，表面等离振子共振，光谱术，质谱术，和HPLC。
(2)在2D硬性培养皿或3D纤维蛋白凝胶中培养的肿瘤细胞
对于常规2D细胞培养，将肿瘤细胞维持在具有完整培养基的硬性培养皿中。具体的，用T7缓冲液(pH 7.4,50mM Tris，150mM NaCl)将纤维蛋白原 (Searun HoldingsCompany，Freeport，ME)稀释至2mg/ml。然后，制成1： 1(体积)的纤维蛋白原和细胞溶液的混合物。将250μl细胞/纤维蛋白原混合物接种到24孔板中并与预先添加的5μl凝血酶(0.1U/μl，Searun控股公司)充分混合。在37℃孵育30分钟后，向这些细胞补充1ml完全培养基。培养5天后，加入分散酶II并在37℃消化培养的凝胶10分钟。收获球状体并进一步用0.25％胰蛋白酶消化3分钟以获得用于以下实验的单细胞悬液。
(3)统计分析方法
所有实验至少进行三次。结果以平均值±SEM表示。并通过Student's t 检验进行分析。P值<0.05被认为是统计学显着的。分析使用Graphpad 6.0软件进行。样本排除从未进行过。
实施例1：肿瘤特异性CD8+T细胞中的PD-1表达由IFN-γ刺激的TRC诱导
本实施例采用的技术方案的步骤及相应的结果如下：
(1)将抗CD3/CD28珠活化的OVA-CTL单独或与来自常规的培养瓶的 OVA-B16细胞(分化的OVA-B16)或在3D纤维蛋白基质中生长的OVA-B16 TRC一起培养24小时。PD-1表达通过流式细胞术测定。测定结果如图1A所示。
(2)将CTL与分化的OVA-B16细胞或OVA-B16TRC的共培养上清液或完全培养基(阴性对照)通过冷冻干燥浓缩并且与抗CD3/CD28珠活化的 OVA-CTL温育24小时。PD-1表达通过流式细胞术测定。测定结果如图1B所示。
(3)将CD3/CD28珠活化的OVA-CTL培养24小时并且上清液通过ELISA 分析。测定结果如图1C所示。
(4)将抗CD3/CD28珠活化的OVA-CTL与OVA-B16TRC共培养24h。T细胞和肿瘤细胞中的IFN-γ产生通过流式细胞术分析。测定结果如图1D所示。
(5)将抗CD3/CD28珠活化的OVA-CTL用PBS(磷酸盐缓冲液)或来自由 IFN-γ刺激的CTL或OVA-B16TRC的条件培养基处理24h。OVA-CTL的PD-1 表达随后通过流式细胞术测定。测定结果如图1E所示。
(6)将来自常规的培养瓶的OVA-B16细胞或来自3D纤维蛋白凝胶的 OVA-B16TRC与抗CD3/CD28珠活化的OVA-CTL以1:30的比例共培养4h。 CD45-肿瘤细胞凋亡通过流式细胞术测定。测定结果如图1F所示。
(7)在中和抗PD-1抗体或IgG同型对照(isotype control)的存在下，将 OVA-B16TRC与抗CD3/CD28珠活化的OVA-CTL以1:30的比例共培养。在4h 之后，细胞活力通过流式细胞术分析。测定结果如图1G所示。
从实施例1的结果来看，使用表达模型肿瘤抗原白蛋白(OVA)的B16黑色素瘤TRC和源自OT-1T-细胞受体转基因小鼠的OVA-特异性CTL，我们发现 TRC强烈地诱导抗-CD3/CD28珠激活的(bead-activated)OT-1T细胞以在共培养(共培养)期间上调PD-1表达(图1A)。这类PD-1上调也在gp100-特异性CD8+ T细胞以及OVA肽激活的OT-1细胞中确认。值得注意的是，PD-1+细胞的上述增加归因于PD-1-至PD-1+T细胞的转化，但不是由于PD-1-细胞的耗尽(depletion)或PD-1+细胞的扩增，这基于PD-1-OT-1细胞与OVA-B16TRC的共培养，其中PD-1+T细胞出现，以及PD-1+细胞与或不与TRC的共培养，其中 PD-1+T细胞的增殖不改变，而PD-1表达上调。此外，上述共培养上清液能够在不相关的CD8+T细胞中上调PD-1表达(图1B)，这表明TRC或T细胞本身释放某些因子以诱导PD-1表达。为了识别在T细胞中增强PD-1表达的、由相互作用的细胞产生的因子，我们发现来自TRC单一培养的上清液不能提升 PD-1表达，这说明T细胞是上调PD-1的可溶性因子的产生所需要的。激活的 T细胞向上清液释放大量细胞因子，最显著的是IFN-γ(图1C)。明显地，我们发现IFN-γ中和阻碍了上述PD-1上调，而TNF-α中和则不会。与此相一致地，发现IFN-γ仅由OT-1细胞但不由TRC表达(图1D)。已经识别IFN-γ作为关键分子，我们单独地用重组IFN-γ处理T细胞和TRC，并且发现仅来自IFN-γ处理的TRC的上清液能够对T细胞上调PD-1表达(图1E)。因此，这些数据表明在 TRC与肿瘤浸润的T细胞的相互作用期间，T细胞产生的IFN-γ直接刺激TRC 以释放促进PD-1表达的因子。在此，我们还验证，该上调的PD-1是功能性的。我们发现OVA特异性CTL很难杀伤针对上述共培养中的OVA-TRC(图1F)，然而添加中和的抗PD-1抗体可显著提高CTL对TRC的杀伤(图1G)。抗PD-1抗体发挥作用不是由于PD-L1的上调。的确IFN-γ上调PD-L1表达；然而，对共培养额外补充抗PD-L1抗体对TRC的杀伤并没有影响。
实施例2：识别由TRC产生的犬尿氨酸介导PD-1的上调，并且IFN-γ在TRC中上调色 氨酸转运蛋白SLC1A5从而促进Trp摄取和Kyn产生
本实施例采用的技术方案的步骤及相应的结果如下：
(1)将抗CD3/CD28珠活化的OVA-CTL与来自常规的培养瓶的OVA-B16 细胞或在3D纤维蛋白基质中生长的OVA-B16TRC共培养24小时。上清液中的Kyn通过ELISA测定。测定结果如图2A所示。
(2)在中和抗IFN-γ抗体或同型对照的存在下，将CD3/CD28珠活化的OVA-CTL与OVA-B16TRC共培养24小时。上清液中的Kyn水平通过ELISA测定。测定结果如图2B所示。
(3)将在培养瓶中生长的OVA-B16细胞或OVA-B16TRC用IFN-γ (10ng/ml)处理24h。上清液中的Kyn的水平通过ELISA测定。测定结果如图2C 所示。
(4)在不同浓度的Kyn的存在下，将分离的脾脏的CD8+T细胞与抗 CD3/CD28珠温育。PD-1表达通过流式细胞术测定。测定结果如图2D所示。
(5)与(4)相同，但是将CD8+T细胞用200μM Kyn处理如所示的不同的时间。测定结果如图2E所示。
(6)将抗CD3/CD28珠活化的CTL用PBS、200μM Kyn或来自色氨酸通路的其它代谢产物(500μM)(褪黑色素、犬尿氨酸(kynurinic acid)和吲哚硫酸盐) 处理。在24h之后，PD-1表达通过流式细胞术测定。测定结果如图2F所示。
(7)将对照(scramble)或shIDO1-(Sh1或Sh2)-OVA B16TRC与抗CD3/CD28 珠活化的OT-1T细胞共培养。在4h或24h之后，TRC凋亡(如图2G)或在T细胞上的PD-1表达(如图2H)通过流式细胞术分析。分析结果分别如图2G和图2H 所示。
(8)在IFN-γ的存在或不存在下，在对照和shSLC1A5-(Sh1或Sh2)-B16 TRC中通过ELISA测量细胞裂解物中的色氨酸水平24h。测量结果如图2I所示。
(9)将对照和shSLC1A5-(Sh1或Sh2)-OVA B16TRC与抗CD3/CD28珠活化的OT-1T细胞共培养。在4h或24h之后，TRC凋亡(如图2J)或PD-1表达(如图 2K)通过流式细胞术分析。分析结果分别如图2J和图2K所示。
(10)将B16TRC用载体或Flag-SLC1A5质粒瞬时转染。SLC1A5的过表达通过免疫印迹(western blot)(左)确认。上清液中的色氨酸水平通过ELISA测定并且计算Trp消耗(右)。确认结果如图2L所示。
(11)将载体(Vec-)或在硬性平板(rigid plate)中培养的SLC1A5-B16细胞用 PBS或IFN-γ(10ng/ml)处理24h。上清液中的Kyn水平通过ELISA测定。测定结果如图2M所示。*p<0.05，**p<0.01。数据表示平均值±SEM。
从实施例2的结果来看，与分化的B16细胞-T细胞共培养的上清液相比，在B16TRC-T细胞共培养的上清液中发现更高水平的Kyn(图2A)，并且IFN-γ中和抑制Kyn的产生(图2B)。与该结果一致，我们发现IFN-γ可以直接刺激B16 TRC、而不是分化的B16细胞，从而释放高水平的Kyn(图2C)。此外，从其他肿瘤类型(鼠H22肝癌和人类A375黑色素瘤)产生的TRC也在IFN-γ刺激下释放显著量的Kyn。为了证实OVA-B16TRC使用Kyn在CD8+T细胞中上调PD-1 表达，我们在抗CD3/CD28微珠的存在下直接向CD8+T细胞加入Kyn，结果显示，T细胞以剂量和时间依赖性方式显着上调PD-1表达(图2D和2E)。我们还发现Kyn增加的PD-1+细胞是归因于PD-1-至PD-1+T细胞的转化，但不是由于PD-1-的耗尽或PD-1+细胞的扩增。除Kyn外，还试验了其他色氨酸分解代谢产物(犬尿喹啉酸、硫酸吲哚酚和褪黑激素)的上调PD-1表达的能力。然而，我们发现它们中没有能够改变T细胞上的PD-1表达(图2F)。在此，我们还使用无色氨酸培养基共培养OT-1细胞和TRC来作为可比较的方法从而进一步研究Kyn调控PD-1上调。我们发现色氨酸缺乏导致T细胞中的PD-1下调，伴随着IFN-γ、TNF-α和CD107a(穿孔素/粒酶B的脱粒标记)的表达的上调，以及 TRC凋亡的增强。另外，来自无色氨酸共培养的上清液不能在抗CD3/CD28 激活的OT-1T细胞中上调PD-1表达。总之，这些数据表明由IFN-γ刺激的TRC 释放的Kyn能够在T细胞中上调PD-1表达。
与此同时，相对于分化的对应物，所有类型的TRC中的基础IDO1表达高得多，并且其可以通过IFN-γ进一步上调。另外，当与激活的OT-1T细胞共培养时，在OVA-B16TRC中IDO1表达上调，但未检测到TDO。另一方面，在 OVA-B16TRC中由抑制剂1-MT阻断IDO1活性或敲低(knock down)IDO1导致共培养系统中更多的TRC凋亡(图2G)，以及PD表达的下调-1(图2H)，但上调 IFN-γ、TNF-α和CD107a的表达，这表明IDO1-Kyn特异性调节CD8+T细胞中的PD-1表达。尽管IDO1表达的诱导清楚地对于快速Kyn产生的初始阶段是关键的，但在TRC中维持高Kyn产生需要输入足够的胞外色氨酸作为IDO1的底物，特别是考虑到Kyn可进一步代谢并且释放到胞外空间。尽管由于高IDO1 活性，TRC中色氨酸的消耗量高，但相对于分化的肿瘤细胞，胞质色氨酸水平不降低，这表明TRC通过主动运输补充其色氨酸存储。因此，我们继续研究将必需氨基酸转运入细胞的三种常见中性氨基酸转运蛋白(SLC7A5、 SLC7A8和SLC1A5)的表达。我们发现TRC具有较高的SLC1A5表达但不是 SLC7A5或SLC7A8，并且SLC1A5的表达在mRNA和蛋白质水平两者都通过 IFN-γ处理进一步增强。此外，通过shRNA敲低SLC1A5或通过抑制剂L-谷氨酸γ-(对硝基苯胺)盐酸盐(GPNA)阻断SLC1A5活性降低TRC色氨酸胞内水平 (图2I)，伴随着更多TRC细胞凋亡以及PD-1下调和IFN-γ、TNF-α和CD107a的表达的上调(图2J、2K)。相反地，SLC1A5的过量表达增加了色氨酸消耗(图 2L)，并促进了分化细胞中的Kyn产生(图2M)。总之，这些数据表明IFN-γ-上调的SLC1A5增加了色氨酸摄取，并且因此使得TRC维持活性色氨酸 -IDO1-Kyn代谢途径。
实施例3：Kyn激活T细胞中的PD-1上调的芳基烃受体(AhR)
本实施例采用的技术方案的步骤及相应的结果如下：
(1)将从脾脏分离的CD8+T细胞用200μM Kyn或Kyn+抗CD3/CD28珠刺激48h。将CD8+T细胞固定、用抗AhR抗体染色并且通过共聚焦显微镜成像。成像结果如图3A所示。误差棒(Bar)，10μM。
(2)除了在AhR的免疫印迹分析之前将胞质蛋白和核蛋白部分分离以外，与(1)相同。计算相对于静息/Kyn组的强度。计算结果如图3B所示。
(3)用PBS或Kyn(200μM)处理48h的静息CD8+T细胞和抗CD3/CD28珠活化的CD8+T细胞中的AhR表达的免疫印迹分析。Nuc/Cyt的AhR比例相对于 Kyn(-)组来计算。分析结果如图3C所示。
(4)将由抗CD3/CD28珠活化的CD8+T细胞用PBS、Kyn或Kyn/DMF(10或 20μM)处理72h。PD-1的表达通过流式细胞术测定。测定结果如图3D所示。
(5)将抗CD3/CD28珠活化的野生型或AhR-/-OT-1小鼠与OVA-B16细胞或 OVA-B16TRC共培养。肿瘤细胞凋亡(如图3E)或T细胞中的PD-1表达(如图3F) 通过流式细胞术分析。分析结果分别如图3E、图3F所示。
(6)将HEK293T细胞用偶联至PD-1启动子的荧光素酶报告基因PGL3与 AhR或空质粒一起瞬时共转染24h然后用Kyn处理另外48h。检测结果如图3G 所示。
(7)将活化的CD8+T细胞用TCDD处理48h然后PD-1表达通过qPCR(左)和流式细胞术(右)分析。分析结果如图3H所示。**p<0.01。数据表示平均值±SEM。
从实施例3的结果来看，如荧光显微镜和蛋白质印迹所证明的，我们发现Kyn的加入导致细胞质AhR转运至激活的T细胞的核(图3A和3B)。有趣的是，除了AhR激活外，我们还发现AhR虽然在初始和激活的T细胞中低表达，但是在Kyn刺激下、在静息T细胞中上调，在激活的T细胞中进一步增加(图 3C)。另一方面，使用DMF或CH-223191抑制AhR活性阻碍PD-1的Kyn依赖性升高(图3D)。为了进一步具体确认AhR在PD-1上调中的作用，我们使用 AhR-/-OT-1T细胞与OVA-B16TRC共培养。的确，AhR缺陷导致更多的TRC 凋亡(图3E)，伴随着PD-1下调(图3F)。此外，当我们用PD-1萤光素酶报告基因和驱动AhR的过表达的质粒共转染HEK293T细胞时，我们发现加入Kyn导致萤光素酶活性在具有内在AhR表达的HEK293T细胞(用空对照质粒转染)中增加4倍、以及过表达AhR的细胞中增加12倍(图3G)。由于AhR识别各种外源毒素的功能发挥，我们还试验了TCDD、即AhR的外源配体。与我们的假设一致，TCDD也上调T细胞中的PD-1表达(图3H)。总之，这些数据表明Kyn 可以通过诱导和激活AhR来上调CD8+T细胞中的PD-1表达。
实施例4：AhR在转录水平调控CD8+T细胞转运蛋白的表达从而摄取外源性Kyn
本实施例采用的技术方案的步骤及相应的结果如下：
(1)将静息或抗CD3/CD28珠活化的CD8+T细胞(1×104个细胞)裂解并且 Kyn水平通过ELISA分析。分析结果如图4A所示。
(2)将活化的CD8+T细胞用PBS或Kyn(200μM)处理24h。PAT4和SLC7A8 的表达通过实时PCR(左)和免疫染色(右)测定。测定结果如图4B所示。误差棒(Bar)，10μM。
(3)将对照shRNA或针对SLC7A8和PAT4的shRNA经由逆转录病毒递送至活化的CD8+T细胞24h，然后将转导的T细胞用Kyn(200μM)处理48h。上清液中的Kyn水平通过ELISA测定并且计算Kyn消耗。测定结果如图4C所示。
(4)与(3)相同，但是PD-1的表达通过流式细胞术分析。分析结果如图4D 所示。
(5)将活化的OT-1T细胞用对照shRNA、PAT4shRNA(Sh1和Sh2)或 SLC7A8shRNA(Sh1和Sh2)转染72h，然后与OVA-B16TRC共培养。TRC凋亡通过流式细胞术分析。分析结果如图4E所示。
(6)在用PBS、Kyn、Kyn/CH-223191(10μM)或Kyn/DMF(20μM)处理48h 的活化的CD8+T细胞中测定PAT4和SLC7A8的mRNA表达。测定结果如图4F 所示。
(7)将静息或活化的CD8+T细胞用PBS或Kyn处理48h。使用抗AhR抗体和对SLC7A8或PAT4启动子具有特异性的qPCR引物进行Chip-qPCR分析。分析结果如图4G所示。
(8)将HEK 293T细胞用AhR载体和偶联至SLC7A8或PAT4启动子的荧光素酶报告基因PGL3瞬时共转染，然后用Kyn处理另外48h。测定结果如图4H 所示。**p<0.01。数据表示平均值±SEM。
从实施例4的结果来看，我们继续研究外源Kyn如何进入T细胞。在CD8+ T细胞中几乎检测不到内源性Kyn(图4A)，并且发现这些T细胞表达非常低水平的IDO1，这表明CD8+T细胞依靠外源性Kyn激活AhR进而上调PD-1表达。将Kyn运输至细胞中的包括SLC1A5、SLC7A5、SLC7A8和PAT4的几种转运蛋白。尽管发现这四种转运蛋白在CD8+T细胞中表达，但Kyn的加入惊人地导致SLC7A8和PAT4的表达的上调(图4B)。值得注意的是，与静息CD8+T细胞相比，SLC7A8和PAT4的表达在抗CD3/CD28珠激活的CD8+T细胞中上调，并且通过Kyn处理进一步增强。此外，我们发现IFN-γ处理不影响CD8+T细胞中PAT4和SLC7A8的表达。这些结果促使我们推测这两种转运蛋白是CD8+T 细胞中主要的Kyn输入。因此，我们使用逆转录病毒将SLC7A8和PAT4shRNA 递送至原代T细胞或用针对SLC7A8的抑制剂2-氨基-2-降冰片烷羧酸(BCH) 或针对PAT4的肌氨酸处理的T细胞。结果显示，抑制或敲低SLC7A8和PAT4 阻断Kyn进入T细胞(图4C)，抑制AhR活性，消除PD-1上调(图4D)，并且增加了OT-1T细胞对OVA-B16TRC的细胞毒性(图4E)。与此同时，我们发现AhR 抑制剂DMF或CH-223191能有效抑制Kyn诱导的SLC7A8和PAT4上调(图4F)。芯片-PCR分析进一步证实AhR的确与SLC7A8和PAT4基因的启动子结合(图 4G)。萤光素酶分析还证明，在AhR结合时，SLC7A8和PAT4的表达增强(图 4H)。关于许多运输系统中的反向运输功能，我们还分析了SLC7A8和PAT4 对其他必需氨基酸运输的影响。用或不用Kyn处理48小时后，抗CD3/CD28 珠激活的CD8+T细胞用于通过LC-QE-MS分析细胞溶质中的必需氨基酸。结果显示除了苏氨酸强度的一些降低外，Kyn处理对多数必需氨基酸没有影响。总之，这些数据表明AhR转录地激活Kyn转运蛋白并促进T细胞吸收外源性Kyn。
实施例5：Kyn-AhR调控的PD-1通路不依赖于TCR信号传导但可由TCR信号传导促进
本实施例采用的技术方案的步骤及相应的结果如下：
(1)将CD8+T细胞用Kyn(200μM)处理所示的时间。PD-1的表达通过流式细胞术测定。测定的结果如图5A所示。
(2)在从野生型或AhR-/-小鼠分离的静息或抗CD3/CD28珠活化的CD8+T 细胞中通过流式细胞术测定PD-1表达。测定的结果如图5B所示。
(3)静息和CD3/CD28珠活化的CD8+T细胞中的PD-1表达通过流式细胞术在所示的时间点测定。测定的结果如图5C所示。
(4)将CD8+T细胞用抗CD3/CD28珠预处理4h，然后用PBS或Kyn处理24h。 PD-1表达通过流式细胞术测定。测定的结果如图5D所示。
(5)静息或抗CD3/CD28珠活化的CD8+T细胞中的SLC7A8或PAT4的mRNA水平。测定的结果如图5E所示。
(6)将抗CD3/CD28珠活化的CD8+T细胞用CsA(1μM)处理48h。PAT4和 SLC7A8的mRNA表达通过实时PCR测定。测定结果如图5F所示。
(7)在CsA(1μM)的存在或不存在下，将活化的CD8+T细胞用Kyn(200μM) 处理48h。将细胞裂解并且Kyn水平通过ELISA试验测定。测定结果如图5G 所示。
(8)将静息或活化的CD8+T细胞用PBS、Kyn(200μM)、CsA(1μM)、 Kyn/CsA处理48h。PD-1水平通过流式细胞术测定。测定结果如图5H所示。
(9)使用抗NFATc1抗体和对PAT4或SLC7A8启动子具有特异性的qPCR引物在静息或活化的CD8+T细胞中进行Chip-qPCR分析。分析结果如图5I所示。
(10)在IgG或抗PD-1中和抗体(10μg/ml)的存在下，将脉冲释放(pulsed with)OVA257-264(2μg/ml)的脾脏的APC与OT-1CD8+T细胞共培养72h。IFN-γ表达通过流式细胞术测量(左)。或将来自OT-1小鼠的CD8+T细胞用 Kyn(200μM)处理72h，然后与加载OVA-肽的APC共培养并且使用或不使用抗 PD-1中和抗体处理72h(右)。测量结果如图J所示。**p<0.01。数据表示平均值±SEM。
从实施例5的结果来看，我们发现Kyn-AhR通路和TCR信号传导可以彼此独立地诱导PD-1表达。不论在T细胞活化信号的存在下前述通过Kyn的 PD-1上调如何(图2D和2E)，单独的Kyn实际上足以上调静息的CD8+T细胞中的PD-1(图5A)。然而，这样的诱导是一个缓慢的过程，在48小时的时间点起始增加。另一方面，具有AhR缺陷的CD8+T细胞在T细胞活化信号传导时也上调了PD-1的表达(图5B)。值得注意的是，我们发现TCR信号传导诱导的 PD-1表达是一个快速的过程，在起始小时的时间点起始增加(图5C)。我们将 CD8+T细胞与抗-CD3/CD8微珠温育4小时。在珠移除后，将这些细胞用Kyn 处理。我们发现这一短暂的TCR-活化导致较高PD-1表达(图5D)，表明TCR 信号传导通过Kyn-AhR促进PD-1诱导。由于Kyn输入是Kyn-AhR依赖性通路中的限制性步骤，我们研究了TCR信号传导是否影响Kyn-转运蛋白以及是如何影响的。我们发现原始(naive)T细胞表达低水平的SLC7A8和PAT4，而活化的T细胞具有两种转运蛋白显著较高的表达(图5E)。在CD8+T细胞活化期间，大量的TCR信号传导触发的转录因子被活化并且可能参与PD-1的表达增强。其中，活化T细胞c1的核因子(NFATc1)似乎是至关重要的。NFATc1通常以磷酸化失活形式定位于胞质溶胶中但在去磷酸化时转位至细胞核内。抑制剂环孢霉素A(CsA)阻断NFATc1核转位并抑制PD-1在CD8+T细胞中的表达。当我们使用CsA来阻断NFATc1时，我们发现SLC7A8和PAT4在活化的CD8+T细胞中的上调也被阻断(图5F)，且与之一致的是，我们还观察到Kyn的摄入减弱(图5G)。TCR信号传导对Kyn/AhR-诱导的PD-1表达的促进作用也被CsA抑制(图5H)。此外，使用Jaspar和Genomatrix软件的分析揭示了NFATc1与 SLC7A8和PAT4的启动子的结合用的多个共有顺式元件的存在，这通过ChIP 测定得到确认，表明NFATc1的确结合至所述启动子(图5I)。通过共培养 CD8+T细胞和抗原提呈细胞(APC)，我们发现PD-1阻断抑制了IFN-γ的产生，而Kyn处理在PD-1阻断时却上调了IFN-γ的产生(图5J)。总之，这些数据表明 Kyn-AhR调控的PD-1通路不依赖于TCR信号传导但可由TCR信号传导来促进。
实施例6：Kyn/AhR调控荷瘤小鼠中CD8+T细胞的PD-1表达
本实施例采用的技术方案的步骤及相应的结果如下：
(1)WT C57BL/6小鼠腹腔注射PBS或Kyn(50μg，每天1次)5天，并且通过 FACS从脾脏和肠系膜淋巴结分选CD8+T细胞。PD-1表达通过流式细胞术测定(图6A)。将来自脾脏的一些CD8+T细胞用AhR和DAPI免疫染色(图6B)，并且PAT4和SLC7A8的mRNA表达通过实时PCR测定(图6C)。上述实验结果分别如图6A、图6B、图6C所示。误差棒(Bar)，10μM。
(2)除了使用AhR-/-小鼠以外，与(1)相同。实验结果如他6D所示。
(3)从注射PBS或Kyn 5天的AhR-/-C57BL/6小鼠分离的静息或抗 CD3/CD28珠活化的脾脏的CD8+T细胞中的PD-1表达。表达的测定结果如图 6E所示。
(4)WT或AhR-/-C57BL/6小鼠注射或不注射抗CD3抗体(5μg，i.p.)不同的时间并且PD-1表达通过流式细胞术测定。测定结果如图6F所示。
(5)C57BL/6小鼠注射抗CD3抗体72h，然后给予这些小鼠Kyn(50μg)。脾脏的CD8+T细胞中的PD-1表达在48h之后通过流式细胞术测定。测定结果如图6G所示。
(6)将具有5×5mm OVA-B16黑色素瘤的C57BL/6小鼠用CFSE标记的OT-1 CD8+T细胞(4×106个/小鼠，每3天1次)过继转移3次。同时，一些小鼠腹腔注射Kyn(50μg/小鼠，每2天1次)3次。在转移之后的第7天，将CFSE+CD8+T细胞从肿瘤分离用于PD-1表达的流式细胞分析。分析结果如图6H所示。
(7)将4×106个用杂乱、shPAT4-或shSLC7A8-逆转录病毒转染的CD45.2 OT-1T细胞过继转移至具有5×5mm OVA-B16黑色素瘤的CD45.1小鼠3次(每3 天1次)。测量肿瘤生长(左)并且分析长期存活率(右)。测量结果如图6I所示。
(8)除了将C57BL/6小鼠用Kyn、DMF(5μg/小鼠，o.t.，每天2次)或 Kyn+DMF处理6天以外，与(7)相同。将来自肿瘤的CFSE+CD8+T细胞分离用于PD-1表达的流式细胞分析。分析结果如图6J所示。
(9)将具有5×5mm B16黑色素瘤的C57BL/6小鼠用PBS、Kyn(50μg/小鼠， i.p.，每2天1次)、DMF(5μg/小鼠，o.t.，每天1次)或Kyn+DMF处理6天。从肿瘤分离的CD8+T细胞中的PD-1表达通过流式细胞术(n＝5)测定。测定结果如图6K所示。
(10)C57BL/6小鼠腹腔注射1×106个ID8卵巢癌细胞。在10天之后，小鼠用PBS、Kyn、DMF或Kyn+DMF腹腔给药6天。将来自腹水的CD8+T细胞分离并且PD-1表达通过流式细胞术测定(n＝5)。测定结果如图6L所示。
(11)在MMTV-PyMT小鼠中从自发形成的乳腺肿瘤中分选CD45-ALDH+和CD45-ALDH-肿瘤细胞。将细胞分别接种至90Pa软的3D纤维蛋白凝胶。在 4天之后，计数集落数。计数结果如图6M所示。
(12)将CD45+、CD45-ALDH+和CD45-ALDH-细胞裂解并且Kyn水平通过 ELISA测定。测定结果如图6N所示。
(13)将具有5×5mm OVA-B16黑色素瘤的C57BL/6小鼠每3天1次使用或不使用OT-1CD8+T细胞(4×106个细胞/小鼠)过继转移3次。同时，将这些小鼠用PBS、DMF(5μg/小鼠，o.t.，每天2次)或抗PD-1中和抗体(250μg/天，每2天 1次，2次)处理20天。测量肿瘤生长(左)并且分析长期存活率(右)。测量结果如图6O所示。
(14)与(9)相同，但是将肿瘤称重。称重结果如图6P所示。*p<0.05， **p<0.01；相对于CTL组#p<0.05，##p<0.01。数据表示平均值±SEM。
从实施例6的结果来看，脾脏和淋巴结的分析表明CD8+T细胞在第5天并未经历增殖但上调PD-1表达(图6A)。同时，我们观察到这些CD8+T细胞中的 AhR转位至细胞核(图6B)，并且Kyn转运单白SLC7A8和PAT4上调(图6C)。与上述体外数据一致，这种外源Kyn不能诱导AhR-/-小鼠中的PD-1表达(图6D和 6E)。另一方面，在WT或AhR-/-小鼠中注射刺激性抗CD3抗体在6小时时间点处观察到迅速上调了脾脏CD8+T细胞的PD-1，但在72小时后开始下降(图 6F)。在该72小时时间点处，我们给小鼠注射了Kyn。我们发现Kyn诱导的PD-1 表达被第一TCR信号传导增强(图6G)，进一步表明TCR信号传导促进了通过 Kyn-AhR的PD-1诱导。为了研究PD-1在体内肿瘤模型中的上调，我们CD45.2 OT-1T细胞过继转移到皮下注射OVA-B16TRC(5×105/小鼠)三天后的 CD45.1小鼠中，在不同时间点，我们分析了PD-1表达并测量了肿瘤部位的 Kyn浓度。我们发现Kyn水平逐渐增加并在第9天达到平台期。巧合的是，CD45.2OT-1T细胞中的PD-1表达也逐渐升高并在第9天达到平台期，这暗示了Kyn和PD-1表达之间的固有关系。然后，在过继转移CFSE-标记的OT-1T 细胞后，我们用Kyn处理荷有OVA-B16黑色素瘤(5×5mm)的小鼠。与上述数据一致，我们在肿瘤浸润的CFSE+T细胞中观察到更高水平的PD-1表达(图 6H)。
接下来，我们将对照的shPAT4或shSLC7A8OT-1T细胞过继转移至荷有 3×3mmOVA-B16黑色素瘤的CD45.1小鼠中。我们发现PAT4或SLC7A8敲低显著降低了PD-1表达，但增加了OT-1T细胞中IFN-γ和TNF-α的表达，伴随着延迟的肿瘤生长以及小鼠的延长存活(图6I)，表明Kyn触发肿瘤微环境中的 PD-1表达。此外，如在从肿瘤块、脾脏或淋巴结分离的CFSE+T细胞中观察到的，在存在AhR-抑制剂DMF的情况下，这种Kyn触发的肿瘤特异性CD8+T细胞中PD-1表达的上调被废除(图6J)。一致地，观察到T细胞中IFN-γ和TNF-α的表达上调。此外，B16黑色素瘤荷瘤小鼠还接受用Kyn、Kyn+DMF或DMF 的处理。一致地，我们发现Kyn可以上调从肿瘤、脾脏或淋巴结分离的CD8+ T细胞中的PD-1表达，然而其被DMF阻断(图6K)。包括卵巢癌的腹膜瘤被通常上调PD-1表达的CD8+T细胞浸润。在这里，我们另外使用了ID8卵巢癌和 H22肝癌腹水两种小鼠腹膜肿瘤模型来验证上述PD-1表达结果。同样，Kyn 促进了腹膜、脾脏或淋巴结CD8+T细胞中的PD-1表达，抑制了IFN-γ和TNF-α的表达(图6L)，而PD-1、IFN-γ和TNF-α表达模式被DMF逆转。
在自发形成的乳腺癌MMTV-PyMT小鼠中，已经将CD45-ALDH+肿瘤细胞鉴定为致瘤细胞。我们进一步将它们鉴定为TRC，因为在90Pa 3D柔性纤维蛋白凝胶中只有CD45-ALDH+而不是CD45-ALDH-肿瘤细胞生长成集落(图 6M)。正如所料，CD45-ALDH-肿瘤细胞以及CD45+免疫细胞中的IDO1表达和Kyn水平非常低，但在CD45-ALDH+TRC中显著高(图6N)。一致地，来自IFN-γ处理的CD45-ALDH+但不是CD45-ALDH-细胞的上清液上调CD8+T细胞中的PD-1表达。另一方面，我们将相同数量的OVA-B16TRC或OVA-B16细胞瘤内注射到荷黑色素瘤的CD45.1C57BL/6小鼠中，同时过继转移CD45.2 OT-1细胞。我们发现OVA-B16TRC组中的OT-1T细胞在3天后表达比 OVA-B16组更高的PD-1。同时，在B16TRC形成的黑色素瘤中的IDO1敲低，导致过继转移的gp-100特异性CD8+T细胞中的PD-1表达的显著降低，以及这些T细胞中IFN-γ和TNF-α表达的增加。
我们将OVA-B16TRC、B16TRC、OVA-B16细胞或B16细胞与OVA特异性CD45.2OT-1T细胞和OVA非特异性CD45.1CD8+T细胞共培养24小时。我们发现非特异性CD45.1CD8+T细胞中的PD-1上调不是由上述肿瘤细胞类型诱导的；OVA-B16细胞仅轻度诱导抗原特异性OT-1T细胞中的PD-1上调；然而，OT-1T细胞中的PD-1上调明显地被OVA-B16TRC诱导，表明PD-1表达不仅受到抗原限制，而且受到局部Kyn浓度的控制。OVA特异性CD8+T细胞的过继转移产生了抗小鼠OVA-B16黑色素瘤的治疗效果，其通过施用PD-1 抗体而增强(图6O)。与PD-1抗体相比，使用DMF也导致相同的处理效果(图 6O)。此外，用Kyn处理所见加速的肿瘤生长也被DMF处理逆转(图6P)。总之，这些数据表明荷瘤小鼠中CD8+T细胞的PD-1表达是通过Kyn-AhR通路调节的。
实施例7：癌症患者的CD8+T细胞中PD-1表达通过Kyn-AhR通路上调
本实施例采用的技术方案的步骤及相应的结果如下：
(1)从健康受试者(n＝50)或患有乳腺癌(n＝84)、结肠癌(n＝28)或肺癌(n＝15)的患者的外周血分离CD8+T细胞。或者，从乳腺癌(n＝9)或结肠癌(n＝17)肿瘤组织分离CD8+T细胞。PD-1表达通过流式细胞术分析。分析结果如图7所示。
(2)测量健康受试者(n＝31)和患有乳腺癌(n＝73)、肺癌(n＝10)或结肠癌 (n＝26)的患者的血清中的Kyn水平。或者，制备来自新鲜的人乳腺(n＝11)或结肠(n＝8)肿瘤组织和相邻的正常组织的裂解物并且测量Kyn水平。测量结果如图7B所示。
(3)健康人(左，n＝37)和患有乳腺癌的患者(右，n＝62)中的PD-1表达与Kyn 水平之间的相关性。分析结果如图7C所示。
(4)将从患有乳腺癌或肺癌的患者的PBMC分离的CD8+T细胞通过抗 CD3/CD28珠活化并且用PBS、Kyn(200μM)或Kyn/DMF(20μM)处理48h。PD-1 的表达通过流式细胞术测定。测定结果如图7D所示。
(5)将从乳腺癌或肺癌患者分离的CD8+T细胞用DMF(20μM)处理48h。 PD-1表达通过流式细胞术测定(n＝6)。测定结果如图7E所示。
(6)从健康的供体或患有乳腺癌或肺癌的患者的PBMC分选PD-1高CD8+或PD-1低CD8+T细胞。实时PCR分析AhR mRNA的表达(n＝8，图7F)。将这些细胞群也用抗AhR抗体和DAPI免疫染色并且通过共聚焦显微镜成像(图 7G)。实验结果分别如图7F和图7G所示。误差棒(Bar)，10μM。
(7)AhR结合至PD-1启动子的Chip-qPCR分析。分析结果如图7H所示。
(8)将来自乳腺癌患者的CD8+T细胞用PBS、Kyn(200μM)、 Kyn/DMF(20μM)或Kyn/CH(50μM)处理48h。PAT4和SLC7A8的表达通过实时 PCR测定。测定结果如图7I所示。
(9)来自乳腺癌和肺癌患者的PD-1高CD8+T细胞或PD-1低CD8+T细胞中的PAT4或SLC7A8的mRNA表达。表达结果如图7J所示。
(10)在从乳腺癌患者的PBMC分离的PD-1高CD8+T细胞或PD-1低CD8+ T细胞中用抗AhR抗体和对SLC7A8或PAT4的启动子具有特异性的qPCR引物进行Chip-qPCR分析。分析结果如图7K所示。数据表示平均值±SEM。
(11)示出PD-1在CD8+T细胞中如何被上调的示意图。结果如图7L所示。 **p<0.01，***p<0.001。数据表示平均值±SEM。
从实施例7的结果来看，流式细胞术分析显示，与健康供体对照相比，来自乳腺癌、结肠癌和肺癌患者的外周血CD8+ T细胞具有更高的PD-1表达 (图7A)。此外，在乳腺癌和结肠癌患者的肿瘤浸润的CD8+ T细胞中发现非常高的PD-1表达(图7A)。与这些结果一致地，这些癌症患者血浆和肿瘤组织中的Kyn水平显著升高(图7B)。值得注意的是，Kyn水平与乳腺癌和结肠癌患者中的PD-1表达强烈相关，但不在健康人群中(图7C)。为了阐明Kyn产生的细胞来源，分析了从患者的乳腺(n＝10)和结肠(n＝14)肿瘤组织分离的CD45+免疫细胞和CD45-肿瘤细胞。IDO1表达以及Kyn水平在CD45-细胞而非CD45+细胞中占主导地位。然后，我们在存在或不存在1-MT的情况下用IFN-γ在体外处理CD45-肿瘤细胞24小时。上清液用于处理患者的外周血T细胞24小时。流式细胞术分析显示PD-1表达在CD8+ T细胞中上调，而该过程通过加入 1-MT而阻断，表明Kyn在人肿瘤组织中主要由肿瘤细胞产生，其促进PD-1 在CD8+ T细胞中的表达。考虑到Kyn水平受Trp转运蛋白调控，我们另外发现 SLC1A5在患者的乳腺和结肠肿瘤组织中表达高水平。
我们使用Kyn在体外在用或不用抗CD3/CD28微珠刺激下处理上述来自人样品的CD8+T细胞。Kyn上调了来自健康供体以及乳腺癌和肺癌患者(图7D)的静息和活化的CD8+T细胞中的PD-1表达。此外，Kyn处理促进了在来自乳腺癌和肺癌患者的静息和活化的外周CD8+T细胞中AhR从胞质溶胶转位至细胞核。一致的是，在乳腺癌和结肠癌患者的肿瘤浸润的T细胞中也发现了AhR核转位。我们使用DMF或CH-223191来阻断AhR活性。我们发现 DMF或CH-223191的添加抑制了人CD8+T细胞中Kyn诱导的PD-1上调(图 7D)。更重要的是，单独加入DMF可以直接下调患者CD8+T细胞中的PD-1表达(图7E)，表明AhR可能是驱动癌症患者的CD8+T细胞中PD-1表达的关键信号分子。
我们比较了癌症患者的PD-1高和PD-1低CD8+T细胞之间的AhR活性。我们发现从肺癌和乳腺癌患者中分选出的但不是从健康对照分选出的PD-1高 CD8+T细胞，表达了比相应设置的PD-1低CD8+T细胞高得多的AhR mRNA水平(图7F)。进一步的免疫染色分析证实，如核转位所证明的，来自患者的PD-1 高T细胞确实具有更多的AhR活性(图7G)，并且与健康的对照相比，此类核 AhR强烈结合至来自乳腺癌患者的CD8+T细胞中的PD-1的启动子(图7H)。SLC7A8和PAT4通过转运外源性Kyn参与PD-1的表达，并且在鼠CD8+T细胞中受AhR调控(图4D和4E)。
加入Kyn时SLC7A8和PAT4在人CD8+T细胞中上调(图7I)。免疫组织化学染色显示在乳腺癌和结肠癌患者中肿瘤浸润的T细胞高度表达PAT4。然而，这种上调可能被AhR抑制剂DMF或CH-223191阻断(图7I)。一致的是，从癌症患者中分选的仅PD-1高但不是PD-1低CD8+T细胞具有SLC7A5和PAT4的高表达(图7J)。此外，在人CD8+T细胞中证实了AhR与SLC7A8和PAT4的启动子的结合以及它们表达的调节(图7K)。总之，这些数据表明癌症患者的CD8+T细胞中PD-1表达升高可能主要由Kyn-AhR通路驱动。
实施例8：GPNA(L-γ-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺)能显著抑制肿瘤细胞对色氨酸 的摄取，降低特异性OT-1CD8+T细胞的PD-1表达
1、检测GPNA对肿瘤细胞摄取色氨酸的影响实验
1)实验步骤
小鼠OVA-B16细胞体外RPMI-1640培养基培养，按以下分组处理：
对照组1(PBS)：培养基加PBS；
对照组2(GPNA)：培养基加GPNA 10μM；
实验组3(IFN-γ)：培养基加IFN-γ50ng/mL；
实验组4(IFN-γ+GPNA)：培养基加IFN-γ50ng/mL和GPNA 10μM；
24h收取每组细胞超声破碎，裂解物ELISA检测色氨酸浓度，同时做BCA 蛋白定量。
2)实验结果
图8A可以看出，IFN-γ能显著增加肿瘤细胞对色氨酸的摄取，使用GPNA 抑制色氨酸转运子SLC1A5后，肿瘤细胞对色氨酸的摄取明显减少。
2、检测GPNA对特异性CD8+T细胞PD-1表达的影响实验
1)实验步骤
3D培养的OVA-B16细胞按以下分组加药处理：
对照组1(PBS)：培养基加PBS；
实验组2(GPNA)：培养基加GPNA 10μM；
处理12h后与已激活48h的OT-1CD8+T细胞以1:10共培养，4h后流式检测 CD8+T细胞的PD-1表达。
2)实验结果
图8B可以看出，GPNA抑制了肿瘤细胞对色氨酸的摄取，可显著抑制与肿瘤细胞共培养的特异性OT-1CD8+T细胞的PD-1表达。
实施例9：SAR(肌苷酸)和BCH(2-氨基-2-去甲菠烷羧酸)能显著抑制CD8+T细胞的 PD-1表达
1、检测Kyn对CD8+T细胞PAT4和SLC7A8表达的影响实验
1)实验步骤
磁珠分选获得OT-1小鼠脾脏CD8+T细胞，种于24孔板(100万/孔)，同时加入抗CD3/CD28磁珠激活T细胞，培养基为RPMI-1640加10ng/mL小鼠IL-2 和50nMβ巯基乙醇。按以下分组加药：
对照组1(PBS)：培养基加PBS；
实验组2(Kyn)：培养基加Kyn 200μM；
48h收取每组细胞RNA，荧光定量PCR检测PAT4和SLC7A8的表达。
2)实验结果
图9A可以看出，Kyn能显著上调小鼠CD8+T细胞PAT4和SLC7A8，说明转运子PAT4和SLC7A8在Kyn转运过程中起重要作用。
2、检测SAR(肌氨酸)和BCH对CD8+T细胞PD-1表达的影响实验
1)实验步骤
磁珠分选获得小鼠脾脏CD8+T细胞，种于U型底96孔板(10万/孔)，同时加入抗CD3/CD28磁珠激活T细胞，培养基为RPMI-1640加10ng/mL小鼠 IL-2和50nMβ巯基乙醇。按以下分组加药：
对照组1(PBS)：培养基加PBS；
实验组2(Kyn)：培养基加Kyn 200μM；
实验组3(Kyn+SAR)：培养基加Kyn 200μM和SAR 10mM；
实验组4(Kyn+BCH)：培养基加Kyn 200μM和BCH 100μM；
48h流式检测每组CD8+T细胞的PD-1表达水平。
2)实验结果
图9B可以看出，在Kyn显著升高CD8+T细胞PD-1表达的基础上，使用 SAR和BCH分别抑制Kyn转运子PAT4和SLC7A8能明显降低CD8+T细胞PD-1 的表达。
3、检测SAR和BCH对特异性CD8+T细胞功能的影响实验
1)实验步骤
磁珠分选获得OT-1小鼠脾脏CD8+T细胞，种于U型底96孔板(10万/孔)，按以下分组加药处理：
对照组1(PBS)：培养基加PBS；
实验组2(SAR)：培养基加SAR 10mM；
实验组3(BCH)：培养基加BCH 100μM；
预处理T细胞24小时后，将3D培养的OVA-B16与OT-1CD8+T细胞以1比 10的比例共培养，4小时后流式检测OVA-B16细胞的凋亡情况。
2)实验结果
图9C可以看出，与SAR和BCH预处理T细胞共培养的OVA-B16肿瘤细胞凋亡比例明显增加，说明SAR和BCH能显著抑制T细胞对Kyn的摄取，下调 PD-1表达，增强CD8+T细胞的杀伤功能。
实施例10：SAR和BCH能显著抑制人外周血CD8+T细胞的PD-1表达
1、检测Kyn对人外周血CD8+T细胞PAT4和SLC7A8表达的影响实验
1)实验步骤
使用Ficoll分离乳腺癌病人外周全血获得单个核细胞，磁珠分选CD8+T 细胞，种于U型底96孔板(10万/孔)，同时加入抗CD3/CD28磁珠激活T细胞，培养基为RPMI-1640加10ng/mL人IL-2。按以下分组加药：
对照组1(PBS)：培养基加PBS；
实验组2(Kyn)：培养基加Kyn 200μM；
48h收取每组细胞RNA，荧光定量PCR检测PAT4和SLC7A8的表达。
2)实验结果
图10A可以看出，Kyn能显著上调乳腺癌病人外周血CD8+T细胞PAT4和 SLC7A8，说明转运子PAT4和SLC7A8在Kyn转运过程中起重要作用。
2、检测SAR和BCH对人外周血CD8+T细胞PD-1表达的影响实验
1)实验步骤
使用Ficoll分离乳腺癌病人外周全血获得单个核细胞，磁珠分选CD8+T 细胞，种于U型底96孔板(10万/孔)，同时加入抗CD3/CD28磁珠激活T细胞，培养基为RPMI-1640加10ng/mL人IL-2。按以下分组加药：
对照组1(PBS)：培养基加PBS；
实验组2(Kyn)：培养基加Kyn 200μM；
实验组3(Kyn+SAR)：培养基加Kyn 200μM和SAR 10mM；
实验组4(Kyn+BCH)：培养基加Kyn 200μM和BCH 100μM；
48h流式检测每组CD8+T细胞的PD-1表达水平。
2)实验结果
图10B可以看出，在Kyn显著升高乳腺癌病人外周血CD8+T细胞PD-1表达的基础上，使用SAR和BCH分别抑制Kyn转运子PAT4和SLC7A8能明显降低CD8+T细胞PD-1的表达。
根据本公开实施例8-10的结果显示，使用抑制剂GPNA抑制肿瘤细胞色氨酸转运子，或使用抑制剂SAR和BCH分别抑制CD8+T细胞kyn转运子PAT4 和SLC7A8，都可以有效降低特异性CD8+T细胞PD-1的表达，增强特异性 CD8+T细胞对肿瘤细胞的杀伤。
本公开的上述实施例仅是为清楚地说明本公开所作的举例，而并非是对本公开的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本公开的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本公开权利要求的保护范围之内。

Claims (13)

1.转运蛋白抑制剂在制备预防或治疗伴随PD-1表达上升的疾病的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述疾病选自伴随PD-1表达上升而产生肿瘤所导致的疾病；优选的，所述伴随PD-1表达上升而产生肿瘤所导致的疾病选自伴随PD-1表达上升的黑色素瘤、伴随PD-1表达上升的肝癌、伴随PD-1表达上升的乳腺癌、伴随PD-1表达上升的肺癌、伴随PD-1表达上升的结肠直肠癌、伴随PD-1表达上升的卵巢癌或伴随PD-1表达上升的白血病中的一种或多种。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述转运蛋白选自色氨酸转运子或Kyn转运子中的一种或其组合；优选的，所述色氨酸转运子选自SLC1A5，所述Kyn转运子选自SLC7A8或PAT4。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述转运蛋白抑制剂选自GPNA，SAR、BCH及其药理学上可以接受的盐中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物还包含其它治疗伴随PD-1表达上升的疾病的试剂；优选的，所述其它治疗伴随PD-1表达上升的疾病的试剂选自免疫调节剂、IDO抑制剂，AhR抑制剂、放疗剂或化疗剂中的一种或多种；可选的，所述免疫调节剂选自免疫检查点调节剂或促进或介导促进细胞介导的免疫应答的抗原呈递的试剂。
6.转运蛋白抑制剂在制备用于和其它可以治疗伴随PD-1表达上升的疾病的药物联合预防或治疗伴随PD-1表达上升的疾病的药物的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其中，所述治疗伴随PD-1表达上升的疾病的药物选自如权利要求5所述的其它治疗伴随PD-1表达上升的疾病的试剂。
8.一种药物，其用于预防或治疗伴随PD-1表达上升的疾病，其中，所述药物包含转运蛋白抑制剂。
9.根据权利要求8所述的药物，其特征在于，所述转运蛋白选自色氨酸转运子或Kyn转运子中的一种或其组合；优选的，所述色氨酸转运子选自SLC1A5，所述Kyn转运子选自SLC7A8或PAT4；可选的，所述转运蛋白抑制剂选自GPNA，SAR、BCH及其药理学上可以接受的盐中的一种或多种。
10.根据权利要求8或9所述的药物，其特征在于，所述药物还包含如权利要求5所述的其它治疗伴随PD-1表达上升的疾病的试剂。
11.一种伴随PD-1表达上升的疾病的预防或治疗方法，其特征在于，所述方法包括施用预防或治疗有效量的如权利要求8-10任一项所述的药物的步骤。
12.如权利要求11所述方法，其特征在于，所述方法还包括施用治疗有效量的如权利要求5所述的其它治疗伴随PD-1表达上升的疾病的试剂；可选的，所述方法进一步包括手术治疗的步骤。
13.根据权利要求1-7任一项所述的应用，权利要求8-10任一项所述的药物或权利要求11-12所述的治疗方法，其特征在于，所述药物进一步包含药用辅料。
CN201810176164.8A 2018-03-02 2018-03-02 一种含有转运蛋白抑制剂的药物、药物组合物及用途 Active CN110215448B (zh)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810176164.8A CN110215448B (zh) 2018-03-02 2018-03-02 一种含有转运蛋白抑制剂的药物、药物组合物及用途
PCT/CN2019/074548 WO2019165884A1 (zh) 2018-03-02 2019-02-02 一种含有转运蛋白抑制剂的药物、药物组合物及用途
JP2020568583A JP7150885B2 (ja) 2018-03-02 2019-02-02 トランスポーター阻害剤を含有する医薬品、医薬組成物及びその使用
US16/977,217 US20210154162A1 (en) 2018-03-02 2019-02-02 Drug and pharmaceutical composition containing transport protein inhibitor, and use
EP19761332.6A EP3760197B1 (en) 2018-03-02 2019-02-02 Transport protein inhibitor for reducing expression of pd-1

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810176164.8A CN110215448B (zh) 2018-03-02 2018-03-02 一种含有转运蛋白抑制剂的药物、药物组合物及用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110215448A true CN110215448A (zh) 2019-09-10
CN110215448B CN110215448B (zh) 2022-09-20

Family

ID=67805127

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810176164.8A Active CN110215448B (zh) 2018-03-02 2018-03-02 一种含有转运蛋白抑制剂的药物、药物组合物及用途

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20210154162A1 (zh)
EP (1) EP3760197B1 (zh)
JP (1) JP7150885B2 (zh)
CN (1) CN110215448B (zh)
WO (1) WO2019165884A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022061962A1 (zh) * 2020-09-28 2022-03-31 中国科学院上海营养与健康研究所 一种l型氨基酸转运蛋白抑制剂或拮抗剂有效干预糖尿病的方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114796234B (zh) * 2022-01-14 2024-03-12 山东大学 胆固醇转运抑制剂u18666a作为增敏剂在制备抗肿瘤产品中的应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH693558A5 (de) * 1998-08-06 2003-10-15 Ptc Pharma Ag Pharmazeutische Zusammensetzung.
WO2009115807A1 (en) * 2008-03-20 2009-09-24 Medical Research Council Inhibitors of the aryl hydrocarbon receptor for modulating the immune response
US20170067903A1 (en) * 2014-05-05 2017-03-09 Baylor College Of Medicine Metabolic biomarker for diagnosis and treatment of metastatic prostate cancer
US20170209387A1 (en) * 2014-07-09 2017-07-27 The Johns Hopkins University Glutaminase inhibitor discovery and nanoparticle-enhanced delivery for cancer therapy

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012141285A1 (ja) * 2011-04-15 2012-10-18 ジェイファーマ株式会社 乳癌のバイオマーカー
WO2015077414A1 (en) * 2013-11-20 2015-05-28 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Kynurenine pathway biomarkers predictive of anti-immune checkpoint inhibitor response

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH693558A5 (de) * 1998-08-06 2003-10-15 Ptc Pharma Ag Pharmazeutische Zusammensetzung.
WO2009115807A1 (en) * 2008-03-20 2009-09-24 Medical Research Council Inhibitors of the aryl hydrocarbon receptor for modulating the immune response
US20170067903A1 (en) * 2014-05-05 2017-03-09 Baylor College Of Medicine Metabolic biomarker for diagnosis and treatment of metastatic prostate cancer
US20170209387A1 (en) * 2014-07-09 2017-07-27 The Johns Hopkins University Glutaminase inhibitor discovery and nanoparticle-enhanced delivery for cancer therapy

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DARREN: "Characterisation of Amino Acid Transport Processes in Chinese Hamster Ovary (CHO) Cells", 《HTTPS://ETHESES.WHITEROSE.AC.UK/12970/》 *
LIU YUYING等: "PD-1 upregulation by transferring tumor-repopulating cell-released kynurenine into tumor-specific CD8+ T cells via AhR activation", 《ABSTRACTS OF NATURE CONFERENCE ON INFLAMMATORY DISEASES》 *
LIU YUYING等: "PD-1 upregulation by transferring tumor-repopulating cell-released kynurenine into tumor-specific CD8+ T cells via AhR activation", 《第十二届全国免疫学学术大会分会场交流报告集》 *
YUYING LIU等: "Tumor-Repopulating Cells Induce PD-1 Expression in CD8+ T Cells by Transferring Kynurenine and AhR Activation", 《CANCER CELL》 *
孔令雷等: "IDO抑制剂的研究进展", 《中国药物化学杂志》 *
杨剑等: "氨基酸感应对mTORC1的调节作用及其与肿瘤的关系", 《肿瘤代谢与营养电子杂志》 *
赵姗等: "L型氨基酸转运蛋白抑制剂BCH联合顺铂对卵巢癌SKOV3细胞增殖的抑制作用", 《现代妇产科进展》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022061962A1 (zh) * 2020-09-28 2022-03-31 中国科学院上海营养与健康研究所 一种l型氨基酸转运蛋白抑制剂或拮抗剂有效干预糖尿病的方法

Also Published As

Publication number Publication date
JP2021517908A (ja) 2021-07-29
EP3760197A1 (en) 2021-01-06
CN110215448B (zh) 2022-09-20
EP3760197B1 (en) 2022-04-27
US20210154162A1 (en) 2021-05-27
WO2019165884A1 (zh) 2019-09-06
EP3760197A4 (en) 2021-03-24
JP7150885B2 (ja) 2022-10-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhao et al. Engineered IL‐7 receptor enhances the therapeutic effect of AXL‐CAR‐T cells on triple‐negative breast cancer
Tsuchihashi et al. The EGF receptor promotes the malignant potential of glioma by regulating amino acid transport system xc (—)
US20220127638A1 (en) Non-hla matched humanized nsg mouse model with patient-derived xenograft
US20190077856A1 (en) Method of treating diseases using kinase modulators
Zhong et al. DDR1 promotes breast tumor growth by suppressing antitumor immunity
Kim et al. Saccharide analog, 2‐deoxy‐d‐glucose enhances 4‐1BB‐mediated antitumor immunity via PD‐L1 deglycosylation
Guo et al. B7-H3 as a therapeutic target in advanced prostate cancer
Tuomela et al. Radiotherapy transiently reduces the sensitivity of cancer cells to lymphocyte cytotoxicity
Zhi et al. Inhibition of BRAF sensitizes thyroid carcinoma to immunotherapy by enhancing tsMHCII-mediated immune recognition
CN110215448A (zh) 一种含有转运蛋白抑制剂的药物、药物组合物及用途
Kozlova et al. Implication of integrin α2β1 in senescence of SK-Mel-147 human melanoma cells
Paudyal et al. Inhibiting G protein βγ signaling blocks prostate cancer progression and enhances the efficacy of paclitaxel
CN107249636A (zh) 以ckap4作为靶分子的抗肿瘤剂
CN108472320A (zh) 抗癌疫苗组合
CN110221068A (zh) 检测Kyn含量的试剂的应用
KR101794111B1 (ko) 방사선 저항성 진단용 조성물 및 이의 용도
CN107683142A (zh) 基于多孔硅微粒的癌症疫苗和增强抗肿瘤免疫性的方法
Le et al. NF-κB-regulated VentX expression mediates tumoricidal effects of chemotherapeutics at noncytotoxic concentrations
Frazzi et al. Increase in clusterin forms part of the stress response in Hodgkin's lymphoma
US20240293462A1 (en) Immune Cell Fusion (ICF) and Uses Thereof
Filippatos Liposomal-based delivery of Phosphoantigens as sensitizers for γδ T Cell Immunotherapy in Breast Cancer
Sorrentino A screening for novel immune modulators identifies SIK3 kinase as a regulator of tumor resistance to T cell attack
Markowitz et al. Deficiency of metabolic regulator PKM2 activates the pentose phosphate pathway and generates TCF1+ progenitor CD8+ T cells to improve immunotherapy
CN107847764A (zh) 用于治疗癌症的组合物和方法
Chen et al. TNFAIP3 Suppresses Lung Cancer Progression via Regulating Cell Proliferation and Apoptosis

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant