CN107847764A

CN107847764A - 用于治疗癌症的组合物和方法

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Publication number: CN107847764A
Application number: CN201680041275.7A
Authority: CN
Inventors: L.E.范弗勒肯-伊斯拉; E.M.赫特
Original assignee: MedImmune Vaccines Inc
Current assignee: MedImmune Vaccines Inc
Priority date: 2015-07-14
Filing date: 2016-07-13
Publication date: 2018-03-27
Anticipated expiration: 2036-07-13
Also published as: KR20180027568A; SG10201912086QA; RU2018105217A3; RU2729396C2; US20200102382A1; EP3322484B1; EP3322484A4; CN107847764B; IL256763A; JP6895946B2; ES2871252T3; US20210380673A1; EP3322484A1; WO2017011559A1; RU2018105217A; AU2019229394A1; CA2992091A1; JP2018520177A; WO2017011559A8; AU2016291803A1

Abstract

本披露通常提供可用于治疗癌症的组合物和方法。更确切地说，这些方法和组合物可用于检测、定量、抑制、杀死、分化或消除癌症干细胞(CSC)，并可用于治疗与CSC相关联的癌症，并且具体地为表达CCL20和/或CCR6的癌症和CSC。

Description

用于治疗癌症的组合物和方法

对电子提交序列表的引用

本申请通过引用结合以文本文件与本申请一起提交的计算机可读形式(CRF)的序列表，所述序列表名称为“CCL20-100P1_SeqList_ST25”，创建于2016年7月12日，并且大小为19.2KB。

背景技术

正如其名称所暗示的，癌症干细胞(CSC)是具有干细胞样多能性和不受限的自我更新特征的癌细胞亚群。因此，认为此细胞亚群对肿瘤形成和对其环境的适应负责。现在有几条证据表明，CSC可能对抗药性、转移和癌症复发负责，特别是在微小残留病的情况下。实际上，最近的临床证据显示，在标准护理疗法后存活的乳腺癌细胞部分在具有CSC标志的细胞中富集(Creighton等人，2009)。在类似的研究中，尽管已经进入了临床和细胞遗传学缓解，但具有5q缺失MDS的患者的骨髓中还发现有残留的恶性干细胞群(Tehranchi等人，2010)。在许多临床适应症中，现在认为尽管最初有治疗反应，抗性癌细胞的不同亚群的保留可导致复发和潜在的转移。

自从最初鉴定以来，已经在许多肿瘤类型中发现和验证了癌症干细胞。在AML的模型中最初鉴定CSC(Lapidot等人，1994)后，在许多血液学和实体瘤恶性肿瘤中发现和验证了CSC。实体瘤中CSC的第一个证据来自乳腺癌，其中发现CSC具有CD44⁺/CD24^-表面标记表型(Al-Hajj等人，2003)。在胰腺癌中的CSC也已被很好地表征。虽然各种报道将胰腺CSC鉴定为Epcam⁺/CD44⁺/CD24⁺(Li等人，2007)或CD133⁺(Hermann等人，2007)，但是在发明人的手中，三重阳性Epcam⁺/CD44⁺/CD24⁺标志追踪CSC的致瘤表型最好(van Vlerken等人，2013)。许多报道鉴定了结直肠癌中的CSC，并且研究已经鉴定了小鼠中肠道和结直肠肿瘤的干细胞来源(Barker等人，2009)。然而，本领域的当今技术水平尚未就人类结直肠癌CSC的表面标记表型达成共识。尽管已报道了很多表面标记，如CD66(Gemei等人，2013)、LGR5(Hirsch等人，2014)以及CD44和CD133(Wang等人，2012)，但该领域缺乏对以下的任何稳固的证实，即这些表面标记表型中的任何一种都可以代表人类结直肠CSC的共有表型，允许其他技术如非粘附球体生长(例如，结直肠CSC的结肠球体(colosphere))以在鉴定CSC的存在上找到共同用途。

靶向CSC的药物正在成为任何成功的癌症疗法的重要组成部分。当前的研究显示，即使在最初的成功治疗干预后，CSC也对癌症的化学抗性、转移和最终复发负责。尽管CSC是由驱动胚胎干细胞多能性的相同主要自我更新通路驱动的，但是对驱动CSC活性的其他细胞通路的了解仍然有限。

用于治疗癌症的另外的组合物和方法(包括用于减少癌症的致瘤性和抑制或杀死癌细胞如癌症干细胞(例如，诱导细胞凋亡或分化)的方法)的可获得性将允许更多的治疗选择并且保持更好的临床结果(如疾病缓解和/或患者生活质量的改善)的潜力。

发明内容

在一个方面，本披露涉及一种用于抑制癌症干细胞(CSC)增殖的方法，该方法包括以有效抑制CSC增殖和/或减少CSC存活的量使CSC与CCL20的抑制剂和/或CCR6的抑制剂接触。

在一个方面，本披露涉及一种用于在先前已经接受疗法并且需要治疗的受试者中对耐治疗性癌症进行治疗的方法，该方法包括以有效抑制或杀死存在于该耐治疗性癌症中癌症干细胞(CSC)的量向该受试者给予CCL20的抑制剂和/或CCR6的抑制剂。在一些实施例中，该方法可包括以有效诱导存在于该耐治疗性癌症中的癌症干细胞(CSC)的分化的量向受试者给予CCL20的抑制剂和/或CCR6的抑制剂。

在一个方面，本披露涉及一种用于在先前已经接受疗法并且需要治疗的受试者中对耐治疗性癌症进行治疗的方法，该方法包括以有效治疗该耐治疗性癌症的量向该受试者给予CCL20的抑制剂和/或CCR6的抑制剂。

在一个方面，本披露涉及一种用于治疗包括癌症干细胞(CSC)的癌症的方法，该方法包括以有效靶向并抑制或杀死该癌症中的CSC的量向需要治疗的受试者给予CCL20的抑制剂和/或CCR6的抑制剂。在一些实施例中，该方法可包括以有效诱导存在于该癌症中的癌症干细胞(CSC)的分化的量向受试者给予CCL20的抑制剂和/或CCR6的抑制剂。

在一个方面，本披露涉及一种用于治疗包括癌症干细胞(CSC)的癌症的方法，该方法包括以有效治疗该癌症的量向需要治疗的受试者给予CCL20的抑制剂和/或CCR6的抑制剂。

在一个方面，本披露涉及一种用于在患有重现或复发的癌症的受试者中治疗癌症的方法，该方法包括以有效抑制或杀死该癌症中的CSC的量向受试者给予CCL20的抑制剂和/或CCR6的抑制剂。在一些实施例中，该方法可包括以有效诱导存在于重现或复发的癌症中的癌症干细胞(CSC)的分化的量向受试者给予CCL20的抑制剂和/或CCR6的抑制剂。

在一个方面，本披露涉及一种用于在患有重现或复发的癌症的受试者中治疗癌症的方法，该方法包括以有效治疗该癌症的量向受试者给予CCL20的抑制剂和/或CCR6的抑制剂。

在一个方面，本披露涉及一种用于预防癌症重现或复发的方法，该方法包括以有效预防癌症重现或复发的量向需要预防癌症重现或复发的受试者给予CCL20的抑制剂和/或CCR6的抑制剂。

在另一个方面，本披露涉及一种用于降低患有癌症的受试者的癌症复发风险的方法，该方法包括以有效抑制或杀死该癌症中的CSC的量向该受试者给予CCL20的抑制剂和/或CCR6的抑制剂，从而降低该受试者中癌症复发的风险。在一些实施例中，该方法可包括以有效诱导存在于该癌症中的癌症干细胞(CSC)的分化并降低该癌症的复发或重现的风险的量向受试者给予CCL20的抑制剂和/或CCR6的抑制剂。

在另一个方面，本披露涉及一种消除癌症干细胞(CSC)的方法，该方法包括使该CSC与有效消除该CSC的量的CCL20的抑制剂和/或CCR6的抑制剂接触。

在一个方面，本披露涉及一种选择性地减少癌细胞群中的癌症干细胞(CSC)的数目的方法，该方法包括使该癌细胞群与有效抑制或杀死该癌细胞群中的CSC的量的CCL20的抑制剂和/或CCR6的抑制剂接触。在一些实施例中，该方法可以包括以有效诱导该癌细胞群中癌症干细胞(CSC)的分化并减少CSC的数目的量向受试者给予CCL20的抑制剂和/或CCR6的抑制剂。

在另一个方面，本披露提供了一种用于减少或抑制肿瘤生长的方法，该方法包括使该肿瘤与有效减少或抑制肿瘤生长的量的CCL20的抑制剂和/或CCR6的抑制剂接触。在相关方面，本披露提供了一种用于减少或抑制患者中的肿瘤生长的方法，该方法包括以有效减少或抑制肿瘤生长的量向该患者给予CCL20的抑制剂和/或CCR6的抑制剂。

在另一个方面，本披露提供了一种用于减小肿瘤大小的方法，该方法包括使该肿瘤与有效减小肿瘤大小的量的CCL20的抑制剂和/或CCR6的抑制剂接触。在相关方面，本披露涉及一种用于减少患者肿瘤大小的方法，该方法包括以有效减小肿瘤大小的量向患者给予CCL20的抑制剂和/或CCR6的抑制剂。

在另一个方面，本披露提供了一种用于抑制、减少或预防肿瘤侵袭或转移的方法，该方法包括使该肿瘤与有效抑制、降低或预防肿瘤侵袭或转移的量的CCL20的抑制剂和/或CCR6的抑制剂接触。在相关方面，本披露涉及一种用于抑制、减少或预防患者中的肿瘤侵袭或转移的方法，该方法包括以有效抑制、减少或预防肿瘤侵袭或转移的量向该患者给予CCL20的抑制剂和/或CCR6的抑制剂。

本披露还涉及CCL20的抑制剂和/或CCR6的抑制剂或其组合在组合物(包括治疗和药物组合物)中的一种或多种用途。在实施例中，这些用途和组合物包括有效提供在此披露的各种方法的量的一种或多种抑制剂。在实施例中，该一种或多种用途涉及用以制造用于治疗(例如，杀死、消除、抑制、减少细胞增殖的进展和/或细胞增殖的进展速率，减少疾病状态的进展和/或疾病状态的进展速率，减少自我更新和扩增(例如诱导分化)的能力)在此所述的肿瘤、癌症干细胞和/或癌症中的一种或多种的药物的用途。

在另一个方面，本披露提供了用于包括癌细胞的样品中癌症干细胞(CSC)的存在的诊断、预后、量化、鉴定、和/或检测的方法，其中该方法包括：

使该样品与结合至CCL20核酸序列或CCL20氨基酸序列的药剂接触；

检测在该药剂和该CCL20核酸序列或该CCL20氨基酸序列之间是否存在结合；并且

当检测在该药剂和该CCL20核酸序列或该CCL20氨基酸序列之间的结合时，鉴定该样品中该CSC的存在。

在此方面的实施例中，该方法可进一步包括以下项中的一个或多个：

量化该样品中的CCL20核酸序列或CCL20氨基酸序列的量；

将该CCL20核酸序列或该CCL20氨基酸序列的量与CCL20核酸或CCL20氨基酸的参考水平进行比较；和/或

当检测到的量大于该参考水平时，鉴定该样品中存在该CSC。

在又另外的实施例中，该方法可以包括含可检测部分的药剂。在一些实施例中，该药剂可以包括在严格杂交条件下与CCL20核酸序列的至少一部分杂交的核酸序列。在一些实施例中，该药剂可以包括特异性结合CCL20氨基酸序列的至少一部分的抗体。

在以上方面的各个实施例中，这些方法涉及表达CCL20的肿瘤和/或CSC或CSC细胞群。在以上方面的一些实施例中，这些方法涉及表达CCR6的肿瘤和/或CSC或CSC细胞群。在另外的实施例中，该肿瘤和/或CSC或CSC细胞群可以包括形成球体的CSC。

在以上方面的各个实施例中，这些方法涉及选自结直肠癌、胰腺癌、肺癌、头颈癌、胃癌、肝细胞癌和乳腺癌的肿瘤和/或癌症。

在此所述的方面和实施例涉及包括CCL20的抑制剂、CCR6的抑制剂或者CCL20和/或CCR6的抑制剂的组合的方法。在一些实施例中，该抑制剂包括结合CCL20的抗体、结合CCR6的抗体、CCL20的小分子抑制剂、CCR6的小分子抑制剂、与编码CCL20的核酸杂交的siRNA或与编码CCR6的核酸杂交的siRNA或其任何组合。

以上方面和实施例还涉及如下方法、用途和组合物，其进一步包括用于治疗与血管生成、肿瘤发生和癌症相关的疾病的另外疗法，并且可以包括治疗方案，如例如化学治疗、放射治疗、免疫疗法或本领域已知的任何其他活性剂或疗法。

通过阅读下面的说明和示例的描述，其他方面对于本领域技术人员将是显而易见的。

附图说明

出于说明本披露的目的，在附图中描绘了本披露的某些方面。然而，本披露不限于附图中所描绘的方面的精确安排和手段。

图1A-1E显示发现CSC比非CSC具有增加的CCL20表达。与标准单层培养相比，在测试的8个乳腺癌细胞系(A)中的4个、4个胰腺癌细胞系(B)中的2个以及7个结直肠癌细胞系(C)中的6个中，CSC富集球体培养促进CCL20的分泌。在培养4天后，以皮克/毫升(pg/mL)通过ELISA从细胞的条件培养基测量CCL20水平，并且与相同系的单层培养细胞相比，随后将pg/mL CCL20水平转化为倍数变化。来自2个乳腺细胞系(MDAMB468和HCC1937)的FACS分离的CD44^高/+CD24^低/-CSC与从相同系(D)中分离的CD44^低/-CD24^低/-非-CSC相比具有升高的CCL20mRNA水平。类似地，来自1个乳腺(BR_PDX_1)和2个胰腺(PA_PDX_1和PA_PDX_2)患者衍生异种移植物(PDX)模型的分离的CSC也显示与从相同系(E)中分离的非CSC相比CCL20mRNA水平升高。乳腺PDX模型的CSC被鉴定为Epcam⁺ CD44⁺ CD24^-，并且胰腺PDX模型的被鉴定为Epcam⁺ CD44⁺ CD24⁺，而PDX乳腺非CSC是Epcam⁺ CD44^- CD24^-，并且胰腺非CSC是Epcam^- CD44^-CD24^-。对于图A-C，n＝3个生物学重复/条件/细胞系；***、**和*分别表示球体培养和单层培养之间的p<0.001、p<0.01和p<0.05的统计学显著性，如通过t检验确定的。对于图D和E，n＝2个技术重复/条件/细胞系。RE＝Ct值的相对表达，其归一化为18S核糖体RNA并且以与非CSC水平相比来表示。

图2显示球体培养中的CCL20分泌。在第4天收获的球体培养细胞的条件培养基中测量的CCL20水平的平均值±SEM。相对于标准曲线，通过ELISA测量绝对CCL20水平。N＝3个生物学重复/细胞系。

图3A-3F显示CSC直接与CCL20+表型共定位。通过流式细胞术，来自Bxpc3胰腺模型的单层培养的CSC被鉴定为Epcam⁺CD44^高CD24^高(A)，而来自单层HCC1937模型的乳腺CSC被鉴定为CD44^高CD24^-(D)。在Bxpc3(B)和HCC1937(E)两者中，发现CSC比APC标签化的抗CCL20的通过中值荧光强度(中值：Comp-APC A)确定的总肿瘤细胞群(总肿瘤)剂量的平均值具有1.5倍高的CCL20表达。此外，在Bxpc3(C)和HCC1937(F)两者中，如黑色点所示的，CSC显现主要与CCL20⁺ CCR6⁺细胞群重叠，如通过多色流式细胞术确定的。为了比较，将总肿瘤细胞的散点图示为灰色点。

图4A-4F示出了CSC富集的球体培养导致CCL20⁺CCR6⁺细胞群的显著扩增。与单层培养(A，C)相比，当在球体形成条件下培养细胞(B，D)时，Bxpc3(A，B)和Panc1(C，D)胰腺癌模型中CCL20⁺CCR6⁺的频率显著增加，如由多色流式细胞术确定的。此外，从球体培养中鉴定为Epcam⁺CD44⁺CD24⁺(示为黑点)的胰腺CSC主要与Bxpc3(E)和Panc1(F)模型中的CCL20⁺CCR6⁺细胞群重叠。为了比较，将总肿瘤细胞的散点图示为灰色点。

图5A-5D显示向培养物中加入纯化的CCL20促进了富含CSC的球体的生长，但标准的单层培养的细胞并非如此。在球体或单层培养中用0、25、50、100和200pg/mL的重组人CCL20(rhCCL20)刺激Bxpc3胰腺癌(A)、Aspc1胰腺癌(B)和SUM159乳腺癌(C)模型4天，由此在铺板时给予CCL20。BT549细胞(D)示出对以50pg/mL给予的来自2个单独的商业来源即R&D系统公司(R&D systems)(CCL20 A)和生命技术公司(Life Technologies)(CCL20 B)的CCL20观察到CCL20对球体生长的增强作用。当加入15μg/mL的抗CCL20单克隆抗体使CCL20A和CCL20 B(D)的这种作用无效时，证实了CCL20介导此生长刺激的特异性。n＝5个生物学重复/处理/细胞系。***、**和*分别表示匹配浓度的CCL20的球体培养和单层培养之间的p<0.001、p<0.01和p<0.05的统计学显著性，如通过t检验确定的。##和#分别表示基底和CCL20刺激的球体之间的p<0.01和p<0.05的统计学显著性，并且^表示在加入和不加入抗CCL20的CCL20刺激细胞之间p<0.05的统计学显著性，如通过图基多重比较的单向ANOVA确定的。

图6A-6D显示用CCL20刺激癌细胞直接提高了CSC在培养物中的频率。在乳腺和胰腺癌模型中4天后，向球体培养的细胞中加入200pg/mL重组人CCL20直接增加CSC的百分比，看到这些CSC在(A)MDAMB468乳腺癌细胞中表征为CD44⁺ CD24^-，(B)在Bxpc3胰腺癌和(C)Aspc1胰腺癌细胞两者中表征为Epcam^高CD44^高CD24^高。用200pg/mL刺激4天的Bxpc3球体显示干性基因NANOG、SOX2、OCT3/4、BMI1和EZH2(D)的相应增加。图A-C，n＝3个生物学重复/处理/细胞系。*表示用或不用CCL20处理的细胞之间p<0.05的统计学显著性，如通过单侧t检验确定的。图D，n＝2个技术重复/处理；RE＝Ct值的相对表达，其归一化为18S核糖体RNA并且以与–CCL20水平相比来表示。

图7A-7C显示用CCL20刺激球体诱导干性基因的表达。在用100pg/mL重组人CCL20(+CCL20)处理4天的Hs578T(A)、Panc1(B)和SUM159(C)球体中的干性基因NANOG、SOX2、OCT3/4、EZH2和BMI1与未处理的球体(-CCL20)相比较的相对表达(RE)。RE＝Ct值的相对表达，其归一化为18S核糖体RNA并且以与–CCL20水平相比来表示。N＝2个技术重复/处理/细胞系。

图8A-8D显示CCL20通过由其受体CCR6传导信号来调节CSC。(A)在Lovo结直肠癌细胞中，用20nM siRNA敲低CCR6后，重组人CCL20(rhCCL20)在处理开始后4天失去刺激球体生长的能力，而用非靶标对照siRNA(20nM)转染的细胞保留了它们对CCL20的生长反应。(B)与从NCIH508结直肠癌模型中分离的CCR6^-细胞相比，CCR6⁺细胞在用CCL20(100pg/mL)刺激后48小时显示出干性基因的增加。(C-D)通过敲低CCL20或CCR6(20nM siRNA)抑制CCL20-CCR6轴导致与对照siRNA(20nM)处理相比，NCIH508结直肠癌细胞(C)和Hs578T乳腺癌细胞(D)的相似水平的球体生长抑制。图A，n＝5个生物学重复/条件。***、**和*分别表示在匹配浓度的CCL20下，对照siRNA和CCR6siRNA转染细胞之间p<0.001、p<0.01和p<0.05的统计学显著性，如通过t检验确定的。图B，RE＝Ct值的相对表达，其归一化为18S核糖体RNA并且以与CCR6^-水平相比来表示。图C，n＝5个生物学重复/处理。***表示来自对照siRNA的p<0.001的统计学显著性，如通过图基多重比较的单向ANOVA确定的。

图9A-9E显示用中和性单克隆CCL20抗体进行的处理显著降低CSC，如由球体生长和流式细胞术测量的。在(A)Hs578T乳腺癌细胞、(B)NCIH508结直肠癌细胞和(C)Panc 1胰腺癌细胞中，与10μg/mL同种型对照IgG处理相比，用10μg/mL CCL20 IgG处理4天后球体生长减少。与相同的10μg/mL剂量的同种型对照IgG处理相比，单剂量10μg/mL CCL20 IgG处理降低了Bxpc3(D)和Panc1(E)球体中Epcam⁺CD44⁺CD24⁺胰腺CSC的百分比。图A-C，n＝5个生物学重复/处理/细胞系。图D-E，n＝3个生物学重复/处理/细胞系。***、**和*分别表示对照IgG和CCL20 IgG处理的细胞之间的p<0.001、p<0.01和p<0.05的统计学显著性，如通过t检验确定的。

图10显示用中和性单克隆CCL20抗体的处理显著抑制CD4+T细胞向CCL20的趋化性迁移。从人健康供体血液中分离CD4+T细胞，并允许在具有聚碳酸酯过滤器和5μM孔的跨室(transwell)迁移板中用30nM同种型IgG或抗CCL20 IgG向10nM重组人CCL20迁移3小时。n＝3个生物学重复/处理/供体。**和***分别表示同种型IgG和CCL20 IgG之间的p<0.01和p<0.001的统计学显著性，如通过t检验确定的。

图11A-11I显示了TR1表型的多参数流式细胞术分析。细胞群中57％的活细胞对CCR6染色呈阳性(A)。在这些CCR6+细胞中，发现93％为CD3+/CD4+(B)。在CD3+/CD4+细胞中，发现94％为CD25+(C)，并且在这些CD25+细胞中，证实85％为FOXP3+(D)。阳性与阴性设门通过全减一(full-minus-one)(FMO-)染色来确定，由此样品含有组中的所有染色减CD3(E)、CD4(F)、CD25(G)、FoxP3(H)或CCR6(I)。

图12A-12C显示TR1细胞向由CSC分泌的CCL20迁移。与非特异性迁移(无CCL20)相比以及与通过加入中和性抗CCL20 IgG(667nM)(A)的迁移抑制相比，通过跨室迁移测定确定100nM CCL20对TR1细胞的趋化性吸引。通过ELISA确定CSC条件培养基(CSC CM)中由NCIH508细胞的球体培养产生的CCL20浓度。通过比较绘制未使用的SCM培养基中的CCL20水平，以确保CCL20产生自NCIH508CSC(B)。与非特异性迁移(无CCL20)相比以及与通过加入中和性抗CCL20 IgG(667nM)或同种型对照IgG(667nM)的迁移抑制相比，也通过跨室迁移测定确定CSC CM对TR1细胞的趋化性吸引。n＝4个重复/处理。

图13A-13E显示来自图3的Bxpc3和HCC1937流式细胞术数据的设门对照。在多色流式细胞术实验中，使用全减一(FMO)染色来定义每种蛋白质的阳性与阴性染色设门。使用针对Epcam、CD24、CD44、CCL20和CCR6的5色组对Bxpc3细胞(顶行，A-C)进行染色，而用除针对Epcam之外的所有以上项的4色组对HCC1937细胞(底行，D-E)进行染色。(A)全减Epcam(FMO-Epcam)(虚线，灰色阴影)，与完全染色的样品(实线，白色阴影)相比。(B，D)全减CD44(FMO-CD44)以灰色描绘，并且全减CD24(FMO-CD24)以绿色描绘。(C，E)全减CCL20(FMO-CCL20)以黑色描绘，并且全减CCR6(FMO-CCR6)以灰色描绘。

图14A-14B显示来自图4的Bxpc3和Panc1流式细胞术数据的设门对照。将单层培养和球体培养的Bxpc3和Panc1细胞用针对Epcam、CD24、CD44、CCL20和CCR6的5色组进行染色。对于每个实验，将设门对照在单层培养的细胞上运行。对于Bxpc3(A)和Panc1(B)单层培养的细胞两者，全减CCL20(FMO-CCL20)以灰色描绘，而全减CCR6(FMO-CCR6)以黑色描绘。

图15A-15D显示了来自图9D，E的Bxpc3和Panc1流式细胞术数据的设门对照。将球体培养的Bxpc3(A，B)和Panc1(C，D)细胞用针对Epcam、CD24、CD44、CCL20和CCR6的5色组进行染色。对于每个实验，将设门对照在单层培养的细胞上运行。(A，C)全减Epcam(FMO-Epcam)(虚线，灰色阴影)，与完全染色的样品(实线，白色阴影)相比。(B，D)全减CD24(FMO-CD24)以黑色描绘，而全减CD44(FMO-CD44)以灰色描绘。

图16A-16B描绘了CCL20 IgG如何中和CCL20刺激的CCR6通路活性，通过(A)cAMP和(B)β-抑制蛋白活性测量。使用以1nM CCL20和4mM福司可林刺激的过表达人CCR6的Ad293细胞进行cAMP测定，而使用以6nM CCL20刺激的过表达人CCR6的CHOKI细胞进行β-抑制蛋白测定。n＝2个技术重复/剂量/测定。

图17A-17B显示(A)当在肿瘤接种之前在体外用10ug/mL CCL20 IgG预处理Panc1球体4天时，与用10ug/mL同种型IgG预处理的Panc1球体相比Panc1肿瘤的获取率(％荷瘤动物)，由此从第一例可触知的肿瘤形成测量肿瘤获取。(B)在接种之前用10ug/mL CCL20 IgG预处理Panc1球体导致与同种型IgG预处理的Panc1球体(10ug/mL)相比显著减少的肿瘤生长。对于图A，通过Kaplan-Meier存活分析确定肿瘤获取的中位时间。对于图B，**和*分别表示同种型IgG和CCL20 IgG处理的肿瘤之间的p<0.01和p<0.05的统计学显著性，如通过双向ANOVA确定的。

图18显示抗小鼠CCL20 IgG(克隆114908)中和CCL20刺激的CCR6通路活性，通过β-抑制蛋白活性测量。使用以1.2nM小鼠CCL20刺激的过表达小鼠CCR6的CHOKI细胞进行该测定。

图19显示了描绘脾脏中的设门和免疫细胞分析的代表性流式细胞术图。首先在作为全白细胞标记的cd45上对细胞设门。接下来，将T细胞通过cd3染色鉴定，将树突细胞通过cd11c(针对总细胞)或通过cd11c/cd83进行鉴定以分离成熟和未成熟树突细胞，并且将中性粒细胞/粒细胞髓源抑制性细胞(gMDSC)通过cd11b/ly6g进行鉴定。将Cd3+T细胞进一步针对cd4和cd8染色而分为亚群，并且然后将cd4+细胞分离成foxp3+T_reg或rorgt+Th₁₇细胞。所有的设门都是通过FMO对照来确定的，并且在所有样品中保持不变。

图20显示了描绘肿瘤中的设门和免疫细胞分析的代表性流式细胞术图。首先在作为全白细胞标记的cd45上对细胞设门。接下来，将T细胞通过cd3染色鉴定，将树突细胞通过cd11c(针对总细胞)或通过cd11c/cd83进行鉴定以分离成熟和未成熟树突细胞，并且将中性粒细胞/粒细胞髓源抑制性细胞(gMDSC)通过cd11b/ly6g进行鉴定。将Cd3+T细胞进一步针对cd4和cd8染色而分为亚群，并且然后将cd4+细胞分离成foxp3+T_reg或rorgt+Th₁₇细胞。所有的设门都是通过FMO对照来确定的，并且在所有样品中保持不变。

图21A-21E显示了每周两次给予4剂10mg/kg抗小鼠CCL20 IgG或同种型对照IgG的4T1荷瘤小鼠脾脏中的免疫细胞群的频率。(A)cd3+cd4+foxp3+T_reg细胞，(B)cd3+cd4+rorγt+Th₁₇细胞，(C)cd11b+总树突细胞，(D)cd11b+cd83-未成熟树突细胞和(E)cd11b+cd83+成熟树突细胞。所有细胞频率描绘为总白细胞(cd45+细胞)的百分比。n＝5只动物/组。统计学显著性由双侧学生t检验确定。

图22A-22E显示了每周两次给予4剂10mg/kg抗小鼠CCL20 IgG或同种型对照IgG的4T1荷瘤小鼠肿瘤中的免疫细胞群的频率。(A)cd3+cd4+foxp3+T_reg细胞，(B)cd3+cd4+rorγt+Th₁₇细胞，(C)cd11b+总树突细胞，(D)cd11b+cd83-未成熟树突细胞和(E)cd11b+cd83+成熟树突细胞。所有细胞频率描绘为总白细胞(cd45+细胞)的百分比。n＝5只动物/组。统计学显著性由双侧学生t检验确定。

具体实施方式

如在此所述，诸位发明人提供了如下描述，其首次证明CCL20由CSC过表达并对于CSC是功能上相关的。虽然有报道指出在一些癌症中潜在的CCL20表达，但是没有报道已经鉴定并使CCL20表达和功能与任何CSC表型相关，这提供了用于治疗癌症和抑制CSC的新的且意想不到的方法。如在此披露的某些方面和非限制性实施例中所示，靶向和抑制CCL20活性的新方法对于包括和展现具有CSC表型的细胞的癌症是有用和有效的。在一些说明性的实施例中，在此披露的方法和药剂可用于靶向包括表达CCL20和/或CCR6的CSC的癌症，包括例如胰腺癌、结直肠癌、肝细胞癌、胃癌、肺癌、头颈癌和乳腺癌。因此，本披露提供了新颖的靶向策略，其包括抑制CSC的方法和药剂，并且可用于抑制和/或治疗患有癌症的患者中的各种癌症并改善生活质量。

本披露包括对乳腺CSC的全基因组mRNA分析的描述和综述，其出人意料地鉴定出基因CCL20表达的变化显现与CSC的富集或抑制直接相关(van Vlerken等人，2013)。趋化因子(C-C基序)配体20(CCL20)通常也被称为巨噬细胞炎性蛋白3-α(MIP-3α)或肝脏活化调节趋化因子(LARC)(Schutyser等人，2003)。CCL20通常作为趋化因子起作用以募集T-、B-和未成熟树突细胞，并且主要由肝、肺和胃肠道细胞产生(Schutyser等人，2003)。趋化因子受体6(CCR6)已经被鉴定为CCL20的受体(Baba等人，1997)，并且迄今为止仍然是对CCL20配体鉴定的唯一功能性受体。尽管它在免疫细胞募集中发挥作用，但几条证据已暗示了CCL20在癌症中的关联。一项报告将CCL20鉴定为导致胰腺癌发病的一个因素，据此作者推断CCL20在刺激胰腺癌生长方面有直接作用(Kleeff等人，1999)。虽然早期鉴定与胰腺癌相关联，但迄今为止最大量的证据将CCL20表达与结直肠癌相联系(Ghadjar等人，2009)。事实上，最近的工作提出将高血清水平的CCL20作为结直肠癌中预后不良的生物标记(Iwata等人，2013)。诸位发明人已经在乳腺癌模型中鉴定CCL20，这已经被显示CCL20可以直接影响乳腺癌细胞的迁移和增殖的外部证据证实(Marsigliante等人，2013)。尽管一些报道表明CCL20-CCR6轴对肿瘤细胞有直接的自分泌作用，但大多数报道提出肿瘤细胞过表达CCL20可促进免疫细胞募集。尽管本披露暗示了CCL20在CSC上的自分泌功能，但是本披露还提供了CSC分泌CCL20可辅助肿瘤免疫浸润物的募集。例如，有证据表明除了B细胞和树突细胞也可能向着CSC产生的CCL20移动之外，Treg(Chen等人2011，Liu等人2011，Zhang等人2014)和Th17细胞(Yu等人，2015)尤其倾向响应于CCL20产生进行肿瘤浸润。

如在此所披露的，诸位发明人揭示了趋化因子(C-C基序)配体20(CCL20)在CSC生长和活性中的作用，这一发现对于CSC生物学来说是完全新颖的。本披露提供以下说明性实施例，证明了代表性乳腺癌、胰腺癌和结直肠癌模型的CSC过表达CCL20，并且继而CCL20可通过也在CSC上表达的其受体CCR6传导信号来驱动CSC自我更新和增殖。用单克隆抗体中和CCL20对CSC抑制具有显著作用，支持了靶向这种趋化因子的疗法在肿瘤中减少CSC的巨大潜力。

在继续进一步详细描述本披露之前，应当理解的是，本披露并不局限于特定的组合物或方法步骤，因为这些组合物或方法步骤可以改变。必须注意的是，除非上下文中另外清楚地指出，如在本说明书及所附权利要求中所使用，单数形式“一种/一个(a/an)”和“该”包括复数指示物。

除非另外定义，否则在此使用的所有技术和科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。例如，Concise Dictionary of Biomedicine andMolecular Biology[生物医学和分子生物学简明词典]，Juo,Pei-Show,第2版，2002，CRCPress[CRC出版社]；Dictionary of Cell and Molecular Biology[细胞和分子生物学词典]，第3版，1999，Academic Press[学术出版社]；以及Oxford Dictionary OfBiochemistry And Molecular Biology[牛津生物化学和分子生物学词典]，修订版，2000，Oxford University Press[牛津大学出版社]为技术人员提供了本发明中所使用的许多术语的通用词典。

在本发明的上下文中术语“约”和“大约”表示本领域技术人员将理解的准确性区间，以仍然确保所讨论特征的技术效果。该术语典型地涵盖与指示的数值约+/-10％或约+/-5％的偏差。

两个序列之间的一致性百分比的确定优选使用Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA[美国国家科学院院刊]90:5873-5877完成。这种算法被例如并入在NCBI网站可得的Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-410的BLASTn和BLASTp程序中。一致性百分比的确定优选用BLASTn和BLASTp程序的标准参数进行。

氨基酸可以在此通过它们的通常己知的三字母符号或通过由IUPAC-IUB生物化学命名委员会(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推荐的单字母符号来提及。同样地，核苷酸可以通过它们的普遍公认的单字母代码而被提及。

如在此所用，术语“抗体(antibody和antibodies)”也被称为免疫球蛋白，涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、由至少两个不同表位结合片段形成的多特异抗体(例如，多特异抗体，如PCT公开WO 2009018386、PCT申请号PCT/US 2012/045229，将其通过引用以其全文结合在此)、双克隆抗体、人抗体、人源化抗体、骆驼化抗体、单链Fv(scFv)、单链抗体、单结构域抗体、结构域抗体、Fab片段、F(ab')2片段、展现出所希望的生物活性的抗体片段(例如，抗原结合部分)、二硫键连接的Fv(dsFv)，以及抗独特型(抗Id)抗体(包括，例如，针对本发明的抗体的抗Id抗体)、细胞内抗体，以及上述任一者的表位结合片段。具体地说，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即，含有至少一个抗原结合位点的分子。抗体还包括与抗体或其部分的肽融合物(例如与Fc结构域融合的蛋白质)。免疫球蛋白分子可以具有任何同种型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、亚同种型(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或同种异型(例如，Gm如G1m(f、z、a或x)、G2m(n)、G3m(g、b或c)、Am、Em、以及Km(1、2或3))。抗体可以源自任何哺乳动物，包括但不限于人、猴、猪、马、兔、狗、猫、小鼠等等，或其他动物，如鸟类(例如鸡)。

如在此所用，术语“趋化因子受体CCR6”或“CCR6受体”或“CCR6”和“趋化因子配体20”或“CCL20”是指本领域已知的生物分子(核酸分子和氨基酸分子)。本领域普通技术人员将能够从任何序列数据库(例如NCBI数据库)鉴定CCR6受体和CCL20的多核苷酸和氨基酸序列，以及CCR6和CCL20的任何直向同源和剪接变体同种型。

在一些实施例中，术语“CCR6受体”或“CCL20”是指哺乳动物CCR6受体和CCL20，并且在某些实施例中，是指人CCR6受体和人CCL20。如上所述，人CCR6受体的序列可从公共序列数据库如例如NCBI数据库(登录号NM_004367.5(转录物变体1；SEQ ID NO:1，编码SEQ IDNO:2)或NM_031409.3(转录物变体2；SEQ ID NO:3，编码SEQ ID NO:4))获得。类似地，人CCL20的序列是公众可获得的(NCBI登录号NM_004591.2(转录物变体1；SEQ ID NO:5，编码SEQ ID NO:6)或NM_001130046.1(转录物变体2；SEQ ID NO:7，编码SEQ ID NO:8))。其他直系同源物和变体将是本领域技术人员已知和/或可鉴定的。

CCR6有时也被称为CD196或CD196抗原。CCR6的许多其他术语已经以不同的频率用在本领域中，包括例如CC-CKR-6、C-C-CKR-6、趋化因子(C-C基序)受体6、趋化因子(C-C)受体6、C-C趋化因子受体6型、CKRL3、CKR-L3、趋化因子受体样3、STRL22、CMKBR6、G蛋白偶联受体29、GPR29、七-跨膜受体、淋巴细胞22、GPRCY4、GPR-CY4、DRY6、LARC受体和BN-1。

类似地，CCL20或C-C基序趋化因子20也被称为巨噬细胞炎性蛋白-3α(MIP3α、MIP3-α、MIP3A、MIP3a、MIP-3a)、肝和活化调节趋化因子(LARC)、CC趋化因子LARC、SCYA20、小诱导型细胞因子A20、小诱导型细胞因子亚家族A(Cys-Cys)、成员20、ST38、CKb4、β趋化因子Exodus-1、β-趋化因子Exodus-1或exodus-1。如上所述，CCL20是9kDa CC型趋化因子，其在不同组织(例如皮肤、肠粘膜、肝脏)中由角质化细胞以低水平组成性表达。虽然在人趋化因子网络中存在冗余，CCL20是其受体CCR6的独特趋化因子配体。已经在包括结直肠癌、肺癌、人胰腺和乳腺腺癌、恶性胶质瘤、白血病、淋巴瘤和黑色素瘤的多种人赘生物中描述了CCL20表达。然而，迄今为止并且在本披露之前，具体地在癌症和癌症疗法的背景下，尚未确定CCL20的体内作用。

A.方法

本披露提供了涉及并入CCL20的抑制剂或CCR6的抑制剂或其组合的方法的多个方面和实施例。如在此所讨论的，这些方面和实施例涵盖涉及疾病的各种方法，包括治疗方法、预防方法、抑制和/或减缓进展的方法、降低疾病复发和/或重现风险的方法；靶向和/或杀死特定细胞群的方法；诱导CSC分化和/或降低CSC自我更新和扩增能力的方法；检测、诊断和/或定量特定细胞群和/或疾病(包括确定疾病阶段)的方法以及疾病监测和/或预后的方法。

在实施例中，本披露提供了一种用于抑制癌症干细胞(CSC)增殖的方法，该方法包括以有效抑制CSC增殖和/或减少CSC存活的量使CSC与CCL20的抑制剂和/或CCR6的抑制剂接触。在实施例中，该方法包括给予有效量的对CCR6为选择性的CCR6抑制剂。在一些实施例中，该方法包括给予有效量的对CCL20为选择性的CCL20抑制剂。在一些实施例中，该抑制剂选择性抑制CCR6/CCL20生物化学级联或轴。当关于“抑制剂”或“抑制”使用时，术语“选择性”涉及相对于对其他生物分子的抑制活性而言对靶标(例如CCR6或CCL20)具有增加的抑制活性的化合物(例如，如在此所述的小分子或生物分子)。

在实施例中，本披露涉及一种用于在先前已经接受疗法并且需要治疗的受试者中对耐治疗性癌症进行治疗的方法，该方法包括以有效抑制或杀死存在于该耐治疗性癌症中癌症干细胞(CSC)和/或诱导CSC的分化的量向该受试者给予CCL20的抑制剂和/或CCR6的抑制剂。

在另外的实施例中，本披露涉及一种用于在先前已经接受疗法并且需要治疗的受试者中对耐治疗性癌症进行治疗的方法，该方法包括以有效治疗该耐治疗性癌症的量向该受试者给予CCL20的抑制剂和/或CCR6的抑制剂。

在其他实施例中，本披露涉及一种用于治疗包括癌症干细胞(CSC)的癌症的方法，该方法包括以有效靶向并抑制或杀死该癌症中的CSC和/或诱导CSC的分化的量向需要治疗的受试者给予CCL20的抑制剂和/或CCR6的抑制剂。

在其他实施例中，本披露涉及一种用于治疗包括癌症干细胞(CSC)的癌症的方法，该方法包括以有效治疗该癌症的量向需要治疗的受试者给予CCL20的抑制剂和/或CCR6的抑制剂。

在另外的实施例中，本披露涉及一种用于在患有重现或复发的癌症的受试者中治疗癌症的方法，该方法包括以有效抑制或杀死该癌症中的CSC和/或诱导CSC的分化的量向受试者给予CCL20的抑制剂和/或CCR6的抑制剂。

在另外的实施例中，本披露涉及一种用于在患有重现或复发的癌症的受试者中治疗癌症的方法，该方法包括以有效治疗该癌症的量向受试者给予CCL20的抑制剂和/或CCR6的抑制剂。

本披露的其他实施例涉及一种用于预防癌症重现或复发的方法，该方法包括以有效预防癌症重现或复发的量向需要预防癌症重现或复发的受试者给予CCL20的抑制剂和/或CCR6的抑制剂。

在另外的实施例中，本披露涉及一种用于降低患有癌症的受试者的癌症复发风险的方法，该方法包括以有效抑制或杀死该癌症中的CSC和/或诱导CSC的分化的量向该受试者给予CCL20的抑制剂和/或CCR6的抑制剂，从而降低该受试者中癌症复发的风险。

在实施例中，本披露涉及一种消除癌症干细胞(CSC)的方法，该方法包括使该CSC与有效消除该CSC的量的CCL20的抑制剂和/或CCR6的抑制剂接触。

在一些实施例中，本披露涉及一种选择性地减少癌细胞群中的癌症干细胞(CSC)的数目的方法，该方法包括使该癌细胞群与有效抑制或杀死该癌细胞群中的CSC和/或诱导CSC的分化的量的CCL20的抑制剂和/或CCR6的抑制剂接触。因此，可将这些抑制剂给予需要治疗的受试者和/或与许多CSC接触，以足以阻止该CSC的进一步增殖的量。在一些实施例中，这些抑制剂可以通过在CSC细胞群中诱导细胞死亡(凋亡)而有效减少CSC数目的量给予。在又其他实施例中，这些抑制剂可以通过在CSC细胞群中诱导细胞分化而有效减少CSC数目的量给予。相应地，在一些实施例中，提供这些抑制剂，以可能未必诱导CSC中细胞凋亡的量，但以通过诱导CSC分化而有效减少或解除控制CSC在受试者或致瘤组织中自我更新和扩增CSC细胞群的能力的量。这些抑制剂还可以以有效干扰CSC“小环境”的量提供，使得CSC小环境不再能够维持CSC和/或肿瘤组织再生。

在一些实施例中，本披露提供了一种用于减少或抑制肿瘤生长的方法，该方法包括使该肿瘤与有效减少或抑制肿瘤生长的量的CCL20的抑制剂和/或CCR6的抑制剂接触。在相关方面，本披露提供了一种用于减少或抑制患者中的肿瘤生长的方法，该方法包括以有效减少或抑制肿瘤生长的量向该患者给予CCL20的抑制剂和/或CCR6的抑制剂。

在另外的实施例中，本披露提供了一种用于减小肿瘤大小的方法，该方法包括使该肿瘤与有效减小肿瘤大小的量的CCL20的抑制剂和/或CCR6的抑制剂接触。在相关方面，本披露涉及一种用于减少患者肿瘤大小的方法，该方法包括以有效减小肿瘤大小的量向患者给予CCL20的抑制剂和/或CCR6的抑制剂。

在一些实施例中，本披露提供了一种用于抑制、减少或预防肿瘤侵袭或转移的方法，该方法包括使该肿瘤与有效预防、减少或抑制肿瘤侵袭或转移的量的CCL20的抑制剂和/或CCR6的抑制剂接触。在相关方面，本披露提供了一种用于抑制、减少或预防患者中的肿瘤侵袭或转移的方法，该方法包括以有效预防、减少或抑制肿瘤侵袭或转移的量向该患者给予CCL20的抑制剂和/或CCR6的抑制剂。

在本披露提供的实施例中，这些方法涉及表达CCL20的肿瘤和/或CSC或CSC细胞群。在一些实施例中，这些方法涉及表达CCR6的肿瘤和/或CSC或CSC细胞群。在一些实施例中，这些方法涉及肿瘤和/或CSC或者表达CCR6和CCL20的CSC细胞群。在另外的实施例中，该肿瘤和/或CSC或CSC细胞群可以包括形成球体的CSC。

在以上方面的不同实施例中，这些方法涉及治疗受试者的肿瘤疾病和/或癌症疾病。在一些实施例中，该癌症选自消化道或胃肠癌(例如，肛门癌；胆管癌；肝外胆道癌；阑尾癌；类癌瘤，胃肠癌；结肠癌；结直肠癌，包括儿童结直肠癌；食道癌，包括儿童食道癌；胆囊癌；胃癌，包括儿童胃癌；肝细胞癌(hepatocellular cancer)(例如，肝细胞癌(hepatocellular carcinoma))，包括成人(原发性)肝细胞癌和儿童肝细胞癌；胰腺癌，包括儿童胰腺癌；肉瘤，横纹肌肉瘤；胰岛细胞胰腺癌；直肠癌；和小肠癌)；肺癌(例如，非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC))；头颈癌(例如，唇及口腔癌；口腔癌，包括儿童口腔癌；下咽癌；喉癌，包括儿童喉癌；具隐匿性原发灶的转移性鳞状颈癌；口癌；鼻腔和鼻窦癌；鼻咽癌，包括儿童鼻咽癌；口咽癌；甲状旁腺癌；鼻咽癌；唾液腺癌，包括儿童唾液腺癌；咽喉癌；和甲状腺癌)；卵巢癌和乳腺癌。

如在此所用，术语“受试者”旨在包括人类和非人类动物，具体地哺乳动物。受试者的实例包括人类受试者，例如具有紊乱(例如，在此描述的紊乱，如癌症)的人类患者或者正常受试者。“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如非哺乳动物(如鸡、两栖动物、爬行动物)和哺乳动物(如非人类灵长动物)，驯化的和/或农业上有用的动物(如绵羊、狗、猫、母牛、猪等)，以及啮齿动物(如小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠等)。在具体实施例中，该受试者是人类患者。

“治疗(treatment或treat)”是指治疗性治疗和预防性(prophylactic或preventative)措施两者。对治疗有需要的那些受试者包括已经患有紊乱的那些连同易于患有紊乱的那些或者其中紊乱有待预防的那些。当关于疾病或需要治疗的受试者使用时，术语相应地包括但不限于与未治疗的受试者相比，疾病进展的停止或减缓、疾病的缓解、症状的预防、疾病和/或症状严重程度的减轻、或疾病长度的减少。在实施例中，治疗方法可以减轻正在治疗的特定疾病的一个或多个临床指征。涉及治疗与表达CCL20和/或CCR6的CSC以及具有活化的CCR6/CCL20级联或轴的CSC相关联的疾病或病症的方法的某些实施例包括给予治疗有效量的抑制CCR6、CCL20、或CCR6和CCL20两者的化合物连同其药物组合物。在实施例中，治疗方法可以涉及防止疾病和/或症状进一步进展，消除疾病，减缓或减少疾病和/或症状的进一步进展，或逆转与CSC相关联的疾病和/或临床症状和与表达CCR6和/或CCL20的CSC相关联的癌症。

在一些实施例中，这些方法可以包括治疗有效量的足以停止或减缓癌症进展的药剂。在另外的实施例中，治疗有效量是足以减少受试者中癌细胞(包括CSC)数目(例如杀死癌细胞和/或抑制癌细胞增殖和/或诱导CSC分化)的量。在此讨论了用于监测受试者中癌细胞增殖和癌症进展(例如，肿瘤大小、细胞计数、生化标记、次要适应症等)的方法，并且还可以包括本领域中通常已知的技术。

如在此所讨论的，一些实施例提供了一种治疗方法，该方法包括与放射治疗、手术、免疫疗法或其他化学治疗剂联合给予抑制剂。在一些实施例中，该方法包括与另外的抗癌剂组合给予治疗有效量的CCL20的抑制剂。在其他实施例中，该方法包括与另外的抗癌剂组合给予治疗有效量的CCR6的抑制剂。本领域已知各种各样的抗癌剂(即抗肿瘤剂)，包括例如烷化剂、抗代谢剂、天然抗肿瘤剂、激素抗肿瘤剂、血管生成抑制剂、分化剂、RNA抑制剂、抗体或免疫治疗剂、基因治疗剂、小分子酶抑制剂、生物反应修饰剂、微管抑制剂、DNA损伤反应抑制剂、抗转移剂和其他化学治疗剂。

如在此所用，“给予(administration或administering)”是指通过任何适当的途径提供、接触和/或递送一种或多种化合物以实现所希望的效果。给予可以包括但不限于口服、舌下、肠胃外(例如，静脉、皮下、皮内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内或颅内注射)、透皮、局部、颊、直肠、阴道、鼻、眼、通过吸入、以及植入物。

如在此所用，“共同给予”是指同时或顺序给予多种化合物或药剂。第一化合物或药剂可以在给予第二化合物或药剂之前、同时或之后给予。第一化合物或药剂和第二化合物或药剂可以在同一天同时或顺序给药，或者可以在彼此的1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周或一个月内顺序给予。适合地，化合物或药剂在每种化合物或药剂发挥至少某种生理作用和/或具有剩余功效的期间共同给予。

如在此如在“接触细胞”中所使用的“接触”是指在体外、离体或体内(即在受试者如哺乳动物中，包括人、小鼠、大鼠、兔、猫和狗中)直接或间接接触细胞。接触细胞(也可以包括使细胞与抑制剂化合物“反应”或将细胞“暴露”于抑制剂化合物)可以作为通常将化合物或药剂给予受试者的结果或者将该抑制剂加入或施加于含有细胞或组织或含细胞或组织的液体的器皿的结果而发生。因此，使细胞与抑制剂接触可以指将抑制剂给予受试者、受试者的组织或区域或包括细胞(例如受试者局部区域或系统(例如淋巴、循环等)中的CSC细胞)的组织，并且可能不会物理接触靶细胞。接触涵盖向细胞、组织、哺乳动物、受试者、患者或人给予。此外，接触细胞包括向细胞培养物中加入药剂。其他适合的方法可以包括使用在此讨论的或本领域中已知的另外的适当程序和给药途径向细胞、组织、哺乳动物、受试者或患者引入或给予药剂。

本披露还涉及CCL20的抑制剂和/或CCR6的抑制剂或其组合在组合物(包括治疗和药物组合物)中的一种或多种用途。在实施例中，这些用途和组合物包括有效提供在此披露的各种方法的量的一种或多种抑制剂。在实施例中，该一个或多个用途涉及用以制造用于治疗(例如，杀死、消除、抑制、减少细胞增殖的进展和/或细胞增殖的进展速率，减少细胞自我更新和/或扩增能力(CSC)，减少疾病状态的进展和/或疾病状态的进展速率)在此所述的肿瘤类型、癌症干细胞和/或癌症中的一种或多种的药物的用途。

检测方法

在一些方面和实施例中，在此披露的方法提供和/或包括用于检测、鉴定和/或定量癌症干细胞(CSC)的一种或多种方法。在一些实施例中，该方法包括检测、鉴定和/或定量包括CSC的生物样品中的CCL20和/或CCR6的量。在一些实施例中，该方法提供了在包括癌细胞的样品中对癌症干细胞(CSC)的存在的诊断、预后、定量、鉴定和/或检测，该方法可以包括以下中的一项或多项：

检测在该药剂和该CCL20核酸序列或该CCL20氨基酸序列之间是否存在结合；和/或

在一些实施例中，该方法提供了在包括癌细胞的样品中对癌症干细胞(CSC)的存在的诊断、预后、定量、鉴定和/或检测，该方法可以包括以下中的一项或多项：

使该样品与结合至CCR6核酸序列或CCR6氨基酸序列的药剂接触；

检测在该药剂和该CCR6核酸序列或该CCR6氨基酸序列之间是否存在结合；和/或

当检测在该药剂和该CCR6核酸序列或该CCR6氨基酸序列之间的结合时，鉴定该样品中该CSC的存在。

在这些方法中，这些步骤可以单独或以与彼此或本领域通常已知的其他技术的任何系列组合使用。在此方面的一些实施例中，该方法可进一步包括以下项中的一个或多个：

量化该样品中的CCL20和/或CCR6核酸序列或者CCL20和/或CCR6氨基酸序列的量；

将该CCL20和/或CCR6核酸序列或者该CCL20和/或CCR6氨基酸序列的量与CCL20和/或CCR6核酸或者CCL20和/或CCR6氨基酸的参考水平进行比较；和/或

当检测到的量大于该参考水平时，鉴定该样品中存在该CSC。

在又另外的实施例中，该方法可以包括含可检测部分的药剂。在一些实施例中，该药剂可以包括在严格杂交条件下与CCL20和/或CCR6核酸序列的至少一部分杂交的核酸序列。在一些实施例中，该药剂可以包括特异性结合CCL20和/或CCR6氨基酸序列的至少一部分的抗体。

除了在此描述的可用于检测、鉴定和/或量化样品中CSC的方法之外，这些方面和实施例还可以包括本领域普通技术人员可用的任何方法和技术。作为非限制性实例，可以使用包括流式细胞术在内的基于细胞表面标记的技术来鉴定、检测和分离CSC，这些细胞表面标记在特定的CSC中表达或者对于特定的CSC是特异的；通过染料排除(例如，Hoechst33342，如Moserle,L.等人，Cancer Res.[癌症研究](2008)68；5658-5668中披露的)检测侧群(SP)表型；作为漂浮球体在无血清培养基中生长/增殖的能力(例如，在此以及Ryback,A.P.等人，Biochim.Biophys.Acta[生物化学和生物物理学报](2011)1813；683-694中披露的)；和确定特定的酶活性(如例如醛脱氢酶活性)以及包括多梳异染色质标记的多梳标记的水平、H3K27me³水平和zeste 2(EZH2)的多梳组蛋白增强子的水平。

在一些实施例中，例如，在不同谱系(例如造血、乳房、内皮、间质、神经)的癌症前体细胞中已经报道了升高的醛脱氢酶(ALDH)表达和活性，并且可以结合在此的各个方面和实施例使用技术和商业上可获得的试剂盒(例如，ALDEFLUOR^TM，干细胞技术公司(StemcellTechnologies))。类似地，尽管目前还没有用于鉴定CSC的通用表达细胞表面标记，但是许多表面标记与CSC和相关的肿瘤类型相关，包括例如ALDH、CD13、CD15、CD24、CD44、CD90、CD117、CD133、CD166、CD326(参见例如，Xia,P.,Curr Stem Cell Res Ther.(2014)Mar[当前干细胞研究与治疗，2014年3月]；9(2):102-11；Shimamura,M.等人,Endocr.J.[内分泌杂志],(2014)61(5):481-90；Tirino,V.等人,FASEB J.,(2013)Jan[FASEB杂志，2013年1月]；27(1):13-24)。

在一些实施例中，由于缺乏用于检测或鉴定样品中CSC的一种或多种通用表面标记，所以检测、鉴定和/或定量的方法包括细胞培养技术，包括球体培养和生长测定，如在此披露的或另外本领域中已知的。

B.抑制剂

在此所述的方法、用途和组合物包括涉及能够抑制、下调或消除CCR6和/或CCL20的活性和/或表达，或者一种或多种这样的抑制剂药剂的任何组合的实施例。只要该药剂具有抑制功能(例如，抑制CCR6、CCL20或者CCR6和CCL20二者的表达和/或活性)，抑制剂可以选自任何类别的化合物。例如，抑制剂可选自下组，该组由以下各项组成：抑制CCR6和/或CCL20的多肽、抑制CCR6和/或CCL20的小分子、抑制CCR6和/或CCL20的多核苷酸、抑制CCR6和/或CCL20的适配体、抑制CCR6和/或CCL20的抗体或抑制CCR6和/或CCL20的反义分子或siRNA分子。因此，在此使用的抑制剂是指减少、抑制、下调或消除相关分子(例如CCR6和/或CCL20)的表达和/或功能的任何化合物，或适于中和、减少或抑制该分子的表达或功能的药剂。在此所述的抑制剂可通过任何机制发挥作用，包括例如与CCR6和/或CCL20结合。结合后，抑制剂可以例如抑制CCR6和/或CCL20与受体或配体的相互作用，使得CCR6或CCL20不能活化受体，或不能被配体活化。在其他实施例中，能够抑制CCR6和/或CCL20的活性的药剂可以抑制趋化活性，可以螯合蛋白质并降低生物利用度，或其任何组合。

在一些实施例中，抑制剂可以是能够结合CCR6或CCL20或两者的多肽或小分子，并且可以通过本领域任何技术常规(例如筛选小的化合物或多肽文库)来鉴定。如在此所用，“小分子”通常是指具有低分子量的小的有机化合物。小分子可以是在自然界未知是否发生的合成化合物或从自然来源分离或已知在天然来源中发生的天然存在的化合物，如例如细胞、植物、真菌、动物等。在一些实施例中，小分子可具有小于5000道尔顿、小于4000道尔顿、小于3000道尔顿、小于2000道尔顿、小于1000道尔顿或小于约800道尔顿的分子量。在这样的实施例中，小分子典型地具有大于约100道尔顿的分子量。

小分子或多肽是否能够结合CCR6或CCL20可以通过任何常规技术或测定以及在此描述的技术和测定来确定。例如，技术可以包括酵母双杂交测定法或生物化学测定，例如，拉下测定(pull-down assay)、共免疫沉淀测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、定量放射性配体结合测定、等离子体共振测定或本领域常规使用的任何其他方法。典型地，当使用拉下测定或等离子体共振测定时，将这些蛋白中至少一种与亲和标签如HIS标签、GST标签或本领域常用的其他可检测部分融合是有用的。可以通过测量膜结合多肽的活性来确定待测试的多肽或任何其他化合物是否能够抑制CCR6和/或CCL20的活性。适合地，多肽能够抑制CCR6和/或CCL20的活性。

在实施例中，抑制剂可以是“适配体”，是指对CCR6或对CCL20具有特异性的DNA、RNA或肽适配体。多核苷酸适配体包括长度为从约10个至约300个核苷酸的任何处。典型地，适配体的长度范围是从约30至约100个核苷酸，并且在一些实施例中，范围可以是从约10至60个核苷酸。适配体可以通过任何已知的方法制备，包括合成、重组和纯化方法，并且可以单独使用或与对CCR6或对CCL20具有特异性的其他适配体组合使用。

在一些实施例中，抑制剂可以是特异性结合CCR6或CCL20的抗体。在一些实施例中，该抗体可以是单克隆或多克隆抗体或多特异性抗血清。在这样的实施例中，该抗体还可以包括抗体变体或片段，如单链抗体、双抗体、迷你抗体、单链Fv片段(sc(Fv))、sc(Fv)₂抗体、Fab片段或F(ab')₂片段，只要该变体或片段保留与靶标(例如CCR6或CCL20)的特异性结合特性即可。

在其他实施例中，抑制剂可以是包括与CCR6mRNA或CCL20mRNA或两者的至少一部分互补的多核苷酸的反义分子。在一些实施例中，该反义分子适合用于抑制细胞中mRNA翻译的方法中。该反义分子可以包括DNA、RNA或者DNA和RNA两者，以及经化学修饰的核酸。此外，在一些实施例中，该反义分子可以是单链或双链的。该反义分子可以包括约10至约500个核苷酸，并且在一些实施例中可以具有任何数量的长度，例如范围是从约11至约200个核苷酸、约12至约100个核苷酸、约13至约75个核苷酸、约14至约50个核苷酸、约15至约40个核苷酸、约16至约30个核苷酸或约17至约25个核苷酸。本领域普通技术人员将会理解，这些范围表示说明性实施例。

在一些实施例中，抑制剂可以包括减少或抑制CCR6或CCL20或者CCR6和CCL20两者表达的siRNA分子。在一些实施例中，该siRNA分子可以是单链或双链siRNA分子，其包括能够与CCR6mRNA、CCL20mRNA或两者杂交的序列并诱导RNA干扰或减少或抑制蛋白质表达的另一个反义机制。siRNA分子可以具有允许该siRNA分子诱导RNA干扰从而减少或抑制CCR6蛋白或CCL20蛋白表达的任何序列。在一些实施例中，该siRNA分子的长度可以在10和100之间、在12和80之间、在14和60之间、在16和50之间、在17和40之间。适合地，该siRNA的长度范围是从18至30个核苷酸，并且在某些实施例中，在约18和约26个核苷酸之间。

在包括抑制性核酸分子的实施例中，这样的抑制剂可以在严格结合条件下与靶CCR6或CCL20核酸序列结合。术语“严格条件”、“严格结合条件”或“严格杂交条件”是指多核苷酸与靶序列杂交的程度将比它与其他序列杂交的程度可检测地更高(例如，超过背景至少2倍)的条件。严格条件的一个非限制性实例包括其中在37℃下在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中进行杂交和在60℃至65℃下在0.1x SSC中进行洗涤的那些。

考虑到CCR6或CCL20的多核苷酸序列，抑制性核酸分子可以使用基序来设计，并可使用本领域的标准技术靶向预测为对抑制性活性有效的区域。

可替代地或另外，可以使用适合于确定CCR6和/或CCL20的活性且本领域技术人员可用的任何其他方法。当与对照相比时，可用于在此所述的各个方面和实施例中的抑制剂可以将CCR6和/或CCL20的活性抑制至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％，更优选地至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在特定实施例中，抑制剂将CCR6和/或CCL20的活性有效抑制至少50％、至少60％或至少70％。在其他实施例中，所述抑制剂可以将CCR6和/或CCL20的活性抑制至少85％至约100％、至少90％至约100％、至少95％至约100％、或约100％。

在实施例中，抑制剂可以组合在包括一种或多种适合于治疗或预防肿瘤疾病和/或癌症的其他活性剂的组合物中。这样的活性化合物的一些非限制性实例包括本领域通常已知的化学治疗剂，如例如替莫唑胺、阿霉素、多柔比星、表柔比星、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷(“Ara-C”)、环磷酰胺、噻替派、白消安、细胞毒素、紫杉烷(例如，紫杉醇)、泰索帝(toxotere)、甲氨蝶呤、顺铂、美法仑、长春碱、博来霉素、依托泊苷、异环磷酰胺、丝裂霉素C、米托蒽醌、长春新碱、长春瑞滨、卡铂、替尼泊苷、道诺霉素、洋红霉素(caminomycin)、氨蝶呤、更生霉素、丝裂霉素、美法仑和其他相关的氮芥和激素药物(激素药物的作用是调节或抑制对肿瘤的激素作用，如他莫昔芬和奥那司酮)。

C.药物组合物和配制品

在一些方面，本披露提供药物组合物。这样的药物组合物可以是包括CCL20的抑制剂、CCR6的抑制剂、CCL20和CCR6的抑制剂的组合或其任何其他组合的组合物。这类药物组合物还可以是包括药学上可接受的赋形剂的组合物。在某些方面，本披露的药物组合物用作药剂。

在某些方面，在此披露的抑制剂可以与药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂一起配制成药物组合物。在某些方面，这类药物组合物适于使用本领域中已知的方法经由任何一个或多个给予途径来给予人或非人动物。如熟练的业内人士将理解，给予途经和/或方式将随所希望的结果而变化。术语“药学上可接受的载体”是指不干扰活性成分的生物活性的有效性的一种或多种无毒材料。此类制剂常规地可以含有盐、缓冲剂、防腐剂、相容的载体以及任选地其他治疗剂。这类药学上可接受的制剂还可以含有适合于给予人的相容的固体或液体填料、稀释剂或包封物质。可以用于在此所描述的配制品中的其他设想的载体、赋形剂、和/或添加剂包括：例如，调味剂、抗微生物剂、增甜剂、抗氧化剂、抗静电剂、脂质、蛋白质赋形剂(如血清白蛋白、明胶、酪蛋白)、成盐平衡离子(如钠)等等。适合用于在此所描述的配制品中的这些和另外已知的药物载体、赋形剂和/或添加剂是本领域中已知的，例如，如“Remington:The Science&Practice of Pharmacy”,21^st ed.,LippincottWilliams&Wilkins,(2005)[“雷明顿药物科学与实践”，第21版，利平科特威廉斯与威尔金斯出版公司(2005)]以及“Physician’s Desk Reference”,60^th ed.,Medical Economics,Montvale,N.J.(2005)[“医师案头参考”，第60版，医药经济出版社，蒙特维尔，新泽西(2005)]中所列出。可以选择对于所希望或所要求的给予方式、溶解度和/或稳定性来说适合的药学上可接受的载体。

在一方面，本披露的配制品是基本上不含内毒素和/或相关热原物质的无热原配制品。内毒素包括限制在微生物体内并且仅当微生物破坏或死亡时才释放出来的毒素。热原物质还包括来自细菌和其他微生物外膜的诱导发热的热稳定的物质(糖蛋白类)。如果向人类给予这两种物质，会引起发热、低血压和休克。由于潜在的有害影响，即使低量的内毒素也必须从静脉给予的药物溶液中去除。食品与药物管理局(“FDA”)已经针对静脉药物给予，设置了在单个一小时内每公斤体重每剂量的5个内毒素单位(EU)的上限(The UnitedStates Pharmacopeial Convention，Pharmacopeial Forum[美国药典委员会，药典论坛]26(1):223(2000))。在某些具体方面，组合物中的内毒性和热原水平是小于10EU/mg、或小于5EU/mg、或小于1EU/mg、或小于0.1EU/mg、或小于0.01EU/mg、或小于0.001EU/mg。

当用于体内给予时，本披露的配制品应是无菌的。本披露的配制品可以通过各种灭菌方法灭菌，包括无菌过滤、辐射等。在一个方面，将该配制品用预先灭菌的0.22微米过滤器过滤灭菌。用于注射的无菌组合物可以根据“Remington:The Science&Practice ofPharmacy”,21^st ed.,Lippincott Williams&Wilkins,(2005)[“雷明顿药物科学与实践”，第21版，利平科特威廉斯威尔金斯出版公司(2005)]中描述的常规药学实践来配制。

在此方面的实施例中，治疗组合物可以配制用于特定的给予途经，如口服、经鼻、经肺、局部(包括经颊和舌下)、经直肠、经阴道和/或肠胃外给予。如在此使用的措辞“肠胃外给予(parenteral administration)”和“肠胃外给予(administered parenterally)”是指除了肠道和局部给予以外的给予方式，通常通过注射，并且包括但不限于静脉、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬脑膜外以及胸骨内注射和输注。本披露的适合于局部或经皮给予的配制品包括粉剂、喷雾剂、软膏剂、糊剂、乳剂、洗剂、凝胶剂、溶液、贴剂以及吸入剂。这些抑制剂和其他活性物可以在无菌条件下与药学上可接受的载体混合、并且与可能要求的任何防腐剂、缓冲剂、或推进剂混合(参见，例如，美国专利号7,378,110；7,258,873；7,135,180；美国专利号2004-0042972；以及2004-0042971)。

这些配制品可以合宜地呈现为单位剂型，并且可以通过药学领域已知的任何方法来制备。本披露的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可以变化以便于获得有效实现对于具体的患者、组合物、以及给予方式来说希望的治疗应答而对患者无毒的量(例如，“治疗有效量的”)的活性成分。选择的剂量水平将取决于各种药代动力学因素，包括所采用的具体组合物的活性、给予途径、给予时间、所采用的具体化合物的排泄率、治疗持续时间，与所采用的具体组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料，所治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康和先前病史、以及在医学领域中熟知的类似因素。这些剂量可以每天、每周、每两周、每月或不频繁地给予，例如一年两次，这取决于剂量、给药方法、待治疗的紊乱或症状以及个体受试者特征。剂量还可以通过连续输注(例如通过泵)给予。给予的剂量还将取决于给予途径。例如，皮下给药可能需要比静脉给药更高的剂量。如上所述，任何常用的给药方案(例如，通过每天或每周两次注射或输注来给予1-10mg/kg)可以适配和适合于与治疗人类癌症患者有关的方法。

本披露类似地涵盖：还可以制备适于诊断和研究使用的配制品。这类配制品中的活性剂的浓度以及赋形剂和/或热原的存在或缺乏可以基于具体应用和预期用途来选择。

D.试剂盒

本披露的另一个方面涉及试剂盒。在一个方面，试剂盒包括如上所述的任何抑制剂、试剂、组合物或药物组合物，以及指导适当使用或给予的说明书或标签。任选地，试剂盒还可以包括一个或多个容器和/或注射器或其他装置以便于递送或使用。本披露考虑用于进行研究测定、诊断测定和/或用于给予治疗有效量的组分的全部或任何子集可以封装在试剂盒中。类似地，试剂盒可以包括通过例如在适合的条件下在本披露的抑制剂与治疗或诊断部分之间形成共价键以形成轭合物来制备轭合物的说明书。通过举出另外的实例，用于本披露的治疗性方法中的试剂盒可以包括含有CCL20或/和CCR6的一种或多种抑制剂的药物配制品溶液或一种或多种抑制剂的冻干制剂，以及用于将该组合物给予至对其有需要的患者和/或用于重构冻干产物的说明书。

本披露还涵盖完成包装的并且带标签的药物产品。这种制造物品包括在适当器皿或容器(例如，玻璃小瓶或其他密封容器)中的适当的单位剂型。在适于肠胃外给予的剂型的情况下，活性成分是无菌的，并且适于作为无颗粒溶液给予。在某些方面，该配制品适合于静脉给予，例如对人或动物的静脉输注。

在特定的方面，将本披露的配制品配制为在单剂量小瓶中的无菌液体。示例性的容器包括但不限于小瓶、瓶子、预填充注射器、IV包、泡罩包装(包括一个或多个药丸)。任选地，与这样一个或多个容器相关的可以是由管理药物或生物制品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的公告，所述公告反映针对人类诊断和/或给予的政府机构对制造、使用或销售的许可。

与任何药物产品一样，包装材料和容器被设计为在储存和装运期间保护产品的稳定性。此外，本披露的产品包括建议医师、技术员或患者关于如何适当预防或治疗所讨论的疾病或紊乱的使用说明书或其他信息材料。换句话说，制造物品包括指示或建议给药方案(包括但不限于实际剂量、监测程序等)，以及其他监测信息的说明书工具。

用于诊断测定的试剂盒可以包括含有在此披露的CCL20和/或CCR6的抑制剂的溶液，或者可替代地或另外还包括用于检测CCL20和/或CCR6的存在的试剂。不同试剂可以根据本领域已知的和在此描述的方法标记，包括但不限于例如小分子荧光标签、蛋白质例如生物素、GFP或其他荧光蛋白，或表位序列例如his或myc的标记物。类似地，试剂盒中可包括用于检测CCL20和/或CCR6的一级抗体。一级抗体可以针对CCL20和/或CCR6上的序列或针对可用以标记CCL20和/或CCR6的标记物、标签或表位。一级抗体可以进而被标记用于检测，或者如果需要进一步扩增信号，则一级抗体可以通过二级抗体检测，二级抗体也可以包括在试剂盒中。

也考虑用于研究用途的试剂盒。这样的试剂盒可以例如类似于旨在用于诊断或治疗用途的试剂盒，但还包括指定试剂盒及其使用仅限于研究目的的标签。

标记物、轭合物和部分

本披露涉及方法、组合物和试剂盒，其包括为了诊断和其他测定的目的可以与标记物轭合的试剂，其中一种或多种靶分子可以由这样的一种或多种经标记的试剂结合和检测。标记物包括但不限于发色团、荧光团、荧光蛋白、磷光性染料、叠层染料(tandem dye)、颗粒、半抗原、酶以及放射性同位素。

在某些方面，这些试剂轭合至荧光团。附接至这些试剂上的荧光团的选择将确定被轭合的分子的吸收和荧光发射特性。可以使用的荧光团标记的物理特性包括但不限于，光谱特征(吸收、发射和斯托克斯位移)、荧光强度、寿命、极化以及光致漂白率、或其组合。所有这些物理特性可以用于将一个荧光团与另一个荧光团区分开，并且从而允许多元分析。荧光标记的其他适合的特性可以包括细胞渗透性和低毒性，例如，如果将在细胞或生物体(例如，活体动物)中执行这些试剂的标记。

在某些方面，酶是标记物并且轭合至试剂。酶可以是适合的标记物，因为可以获得可检测信号的扩大，导致测定灵敏度增加。酶自身不产生可检测的响应，但是当它被适当的底物接触时，起到分解底物的作用，这样使得被转化的底物产生荧光、比色或发光信号。因为标记试剂上的一种酶可以导致多个底物被转化成可检测的信号，所以酶将可检测的信号放大。选择酶底物以产生优选的可测量的产物，例如，比色、荧光或化学发光。这种底物广泛用于本领域并且是本领域技术人员熟知的，包括例如氧化还原酶如辣根过氧化物酶和底物如3,3’-二氨基联苯胺(DAB)；磷酸酶，例如酸性磷酸酶、碱性磷酸酶以及底物例如5-溴-6-氯-3-吲哚基磷酸(BCIP)；糖苷酶，例如β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶或β-葡糖苷酶以及底物如5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(X-gal)；另外的酶包括水解酶如胆碱酯酶和肽酶、氧化酶如葡萄糖氧化酶和细胞色素氧化酶、以及还原酶，对于这些酶适合的底物是已知的。

酶以及其产生化学发光的适当底物适合于一些测定。这些包括但不限于天然和重组形式的荧光素酶和水母发光蛋白。磷酸酶、糖苷酶和氧化酶的产生化学发光的底物，如含有稳定的二氧杂环丁烷、鲁米诺、异氨基苯二酰肼以及吖啶酯的那些也是有用的。

在另一个方面，也利用如生物素的半抗原作为标记物。生物素是有用的，这是因为它可以在酶系统中起作用以进一步放大可检测的信号并且它可以充当一个有待在亲和色谱中使用用于分离目的标签。出于检测目的，使用对于生物素具有亲和力的酶轭合物，如抗生物素蛋白-HRP。随后添加一种过氧化物酶底物以产生可检测的信号。

半抗原还包括激素、天然存在和合成的药物、污染物、过敏原、影响分子、生长因子、趋化因子、细胞因子、淋巴因子、氨基酸、肽、化学中间体、核苷酸及相似物。

在某些方面，荧光蛋白可以轭合至这些试剂作为标记。荧光蛋白的实例包括绿色荧光蛋白(GFP)和藻胆蛋白以及其衍生物。荧光蛋白，特别是藻胆蛋白，对于产生叠层染料标记的标记试剂尤其有用。出于获得较大的斯托克斯位移的目的，这些叠层染料包括荧光蛋白和荧光团，其中发射光谱从荧光蛋白的吸收光谱的波长发生更远的位移。

在某些方面，标记物是放射性同位素。适合的放射性材料的实例包括但不限于：碘(¹²¹I、¹²³I、¹²⁵I、¹³¹I)、碳(¹⁴C)、硫(³⁵S)、氚(³H)、铟(¹¹¹In、¹¹²In、¹¹³mIn、¹¹⁵mIn)、锝(⁹⁹Tc、⁹⁹mTc)、铊(²⁰¹Ti)、镓(⁶⁸Ga、⁶⁷Ga)、钯(¹⁰³Pd)、钼(⁹⁹Mo)、氙(¹³⁵Xe)、氟(¹⁸F)、¹⁵³SM、¹⁷⁷Lu、¹⁵⁹Gd、¹⁴⁹Pm、¹⁴⁰La、¹⁷⁵Yb、¹⁶⁶Ho、⁹⁰Y、⁴⁷Sc、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁴²Pr、¹⁰⁵Rh以及⁹⁷Ru。

在一些方面，药物或毒素可以轭合至这些试剂。例如，试剂可以与细胞毒性药物轭合。在此实例中，该试剂可以结合细胞表面上的靶抗原，如例如CCR6或者CCR6与CCL20之间的复合物，并且然后将该细胞毒性药物递送至该细胞。在一些实施例中，该试剂-轭合物可以在细胞中内化，其将该细胞毒性药物释放到该细胞中。可以轭合本领域中已知的任何细胞毒性药物。一些抗体轭合物已经被FDA批准或正在进行临床试验。

呈现下面的实例以便提供上面披露的一些方面和实施例的附加说明。这些实例不应以任何方式被解释为限制本披露或所附权利要求的范围的宽度。

实例

材料与方法

单层培养和球体培养。对于细胞培养实验，将跨不同乳腺癌亚型的八个胰腺癌细胞系MDAMB468、HCC1937、SUM159PT、MCF7、BT549、BT474、T47D和Hs578T的组，四个胰腺癌细胞系Aspc1、Bxpc3、HPAC和Panc1的组，以及七个结直肠癌细胞系LS411N、SW1417、NCI-H508、Colo205、HT29、HCT116、Lovo的组在潮湿培养箱中在37℃，5％CO₂下维持在供应商推荐的培养基中。除了从Asterand(底特律，密歇根州)获得的SUM159PT以外，所有的细胞系最初都是从ATCC(马纳萨斯，弗吉尼亚州)获得的。

对于标准单层组织培养，用0.25％胰蛋白酶-EDTA(生命技术公司，格兰德岛，纽约)收获细胞，在汉克平衡盐溶液(Hank’s Balanced Salt Solution)(HBSS，生命技术公司)中洗涤三次，并且在全血清培养基中铺板至组织培养物处理的板。对于球体培养，将细胞用0.25％胰蛋白酶-EDTA收获，在汉克平衡盐溶液中洗涤三次，并在补充有表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素、牛血清白蛋白(BSA)和敲除血清(生命技术公司)的无血清限定培养基中铺板到超低附着组织培养板(康宁公司(Corning))上。

根据供应商推荐，通过CellTiter (CTG)发光细胞活力测定(普洛麦格公司(Promega)，麦迪逊，威斯康星州)在4天的孵育期后读取单层测定中的细胞生长。通过使用高内涵成像(High Content Imaging)(Arrayscan VTI，赛默科技公司(ThermoScientific)，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)直接计数球体集落以及通过CTG测定，在4天孵育期后读取球体生长测定。

基于CCR6的细胞分离。通过磁珠分离将CCR6-阳性(CCR6⁺)从细胞系中的CCR6-阴性(CCR6^-)细胞中分离出来。通过将小鼠抗人CCR6单克隆抗体(BD生物科学公司(BDBiosciences)，圣何塞，加利福尼亚州)与“自己动手(Do-It-Yourself)”EasySep选择试剂盒(干细胞技术公司(Stem Cell Technologies)，温哥华，加拿大)复合来开发四聚体抗体复合物(TAC)阳性选择系统。根据供应商推荐的方案，使用此阳性选择试剂盒通过磁珠分离捕获CCR6⁺细胞，而CCR6^-细胞保留在未结合的上清液中。然后将分离的CCR6⁺和CCR6^-细胞铺板长成单层培养物，并如其他部分所述用重组人CCL20(rhCCL20)刺激。

酶联免疫吸附测定(ELISA)。根据供应商方案，使用商业获得的夹心ELISA(R&D系统公司，明尼阿波利斯，明尼苏达州)在培养的第4天测量分泌到培养细胞的条件培养基中的CCL20水平。CCL20水平直接以皮克/毫升(pg/mL)测量，从标准曲线内插。分泌的CCL20水平被归一化为并报告为与来自相同系的单层培养细胞相比的X倍数变化。

CCL20刺激和抑制。将来源于R&D系统公司的商业获得的重组人CCL20(rhCCL20或CCL20)用于所有研究，除了图5D所描绘的数据外，其中也从生命技术公司获得重组人CCL20用于比较。同种型对照和抗CCL20单克隆抗体也是商业来源的(R&D系统公司)。所有材料都是根据制造商的建议进行重构和储存。

对于刺激和抑制研究，如上所述将细胞铺板用于单层或球体测定。在铺板时，将细胞用rhCCL20或抗体处理按实验和结果中所述的剂量进行处理。对于图8A，在添加rhCCL20之前，将细胞用20nM CCR6 siRNA或非靶标对照siRNA(池化的构建体，获自圣克鲁兹生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology)，圣克鲁兹，加利福尼亚州)转染48小时，而对于图8C、8D，将细胞在铺板时用20nM CCL20、CCR6或非靶标对照siRNA(池化的构建体，圣克鲁兹生物技术公司)转染，伴随着细胞的抗体处理。使用脂质(Lipofectamine RNAimax(生命技术公司))作为载剂进行siRNA转染，并以1:2.5siRNA:脂质的比率与siRNA复合。所有处理均不受打扰地运行4天，之后将细胞转移并准备用于单层/球体测定、流式细胞术分析或RNA提取，如前面或后面部分所述。

患者来源的异种移植物动物模型的护理和使用。将所有动物收容在12:12小时光照:黑暗循环下，随意取用水和食物，并在开始研究之前使其适应至少一周。全部的动物研究是经米迪缪尼研究机构动物护理和使用委员会批准的。

从杰克逊实验室(Jackson Laboratories)获得BR_PDX_1和PA_PDX_1模型作为P1代(PA_PDX_1)或P2代(BR_PDX_1)的携带皮下原发性人胰腺肿瘤异种移植物的雌性NSG小鼠。从Asterand获得PA_PDX_2模型作为原发性人胰腺癌切除。所有样品都是在患者知情同意的情况下根据其各自的IRB获得的，我们根据米迪缪尼的人体生物样品采集政策进行了审核和批准。

通过在无菌的情况下将肿瘤块皮下植入到6至8周龄雌性NSG小鼠(NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl/SzJ，杰克逊实验室)或雌性Beige Nude XID小鼠(Lyst^bgFoxnl^nuBtk^xid，Envigo)的后腹侧来繁殖所有肿瘤材料。通过该方法将肿瘤传代至第6代(P6)，由此认为0代(P0)是从患者活检建立的第一个异种移植物。

当肿瘤达到大约750mm³时，收获它们，在汉克平衡盐溶液(HBSS)中洗涤，用无菌剃刀刀片切碎，并在20U/mL胶原酶III(Worthington Biochemical)中解离成单细胞悬浮液。如下所述，将解离的肿瘤细胞用于荧光活化的细胞分选中。

对于体内致瘤性研究，在铺板时开始的10μg/mL CCL20 IgG或同种型IgG的处理(作为对照)下，将Panc1细胞培养至球体形成状况。培养4天后，将球体在StemPro Accutase中解离成单细胞悬浮液。将解离的球体细胞与Matrigel GFR(康宁公司)1:1混合，并以30,000个细胞/小鼠皮下注射到6-8周龄雌性nu/nu小鼠(Hsd:Athymic Nude-Foxn1^nu，Envigo)的后腹侧中。随着时间的推移监测和测量肿瘤体积，由此随着首次观察到可触及的肿瘤记录肿瘤获取的时间。

流式细胞术和荧光活化细胞分选(FACS)。通过将活细胞用Golgistop(BD生物科学公司)在37℃孵育1小时以阻止CCL20分泌来制备用于流式细胞术实验的样品。此后，用accutase细胞解离溶液(生命技术公司)收获细胞，洗涤并以约2.5x10⁶个细胞/mL重悬于汉克平衡盐溶液(HBSS)中。将细胞用由以下全部或几种抗体组成的多色组进行染色：抗人CCL20-APC(R&D系统公司)、抗人CCR6-BV605、抗人CD24-FITC、抗人CD44-PE-Cy7和抗人Epcam-PerCP-Cy5.5或Epcam-BV421(均来自BD生物科学公司)。将原代肿瘤异种移植物另外用抗小鼠H2Kd-PE抗体(BD生物科学公司)染色，以允许将所有肿瘤相关的小鼠内皮和基质细胞从随后的分析中排除。在含有CCL20染色的实验中，将细胞在固定并使它们透化以进行抗CCL20染色之前对所有表面受体进行染色。使用单染色对照来定义补偿矩阵，并使用全减一染色对照来定义设门。对于活细胞的细胞计数实验，将DAPI(英杰公司(Invitrogen))加入到30μM的每个样品中以选出死细胞。标准流式细胞术实验在具有4-激光器配置的LSRII上运行，而细胞分选实验在FACSAriaII(BD生物科学公司)上运行。如图13、图14和图15所示，通过荧光减一(FMO)染色来确定FACS设门。

定量RT-PCR。使用Ambion RNAaqueous试剂盒(应用生物系统公司(AppliedBiosystems))处理所有样品用于RNA提取。RNA产量和质量通过紫外分光光度法在260/280nm处测定。在随机引物寡脱氧核糖核苷酸(生命技术公司)和Superscript III逆转录酶(生命技术公司)的存在下，将每个样品的10-100纳克的mRNA在42℃经受逆转录PCR(RT-PCR)。在RT-PCR之后，使用池化的Taqman基因表达测定(生命技术公司)将20ng cDNA产物预扩增14个循环，每次为0.2x浓度，针对以下基因：

表1.

将每个样品的预扩增材料在去离子水(DI-H₂O)中稀释20倍，并在7900HT热循环仪(生命技术公司)上，根据供应商推荐的方案，使用上述在技术重复中列举的引物进行定量PCR(qPCR)分析。

使用SDS 2.4软件(生命技术公司)从qPCR运行获得Ct值，并通过比较性Ct方法使用公式RE＝2^-ΔΔCt转化为相对表达(RE)值，其中

ΔCt＝归一化的Ct＝基因Ct-18S Ct

ΔΔCt＝归一化的样品Ct-归一化的对照Ct

在技术重复中确定RE值的平均值±标准误差，并且随后绘制为最终数据表示。

TR1培养和流式细胞术分析。使用初试CD4T细胞分离试剂盒II根据供应商方案(美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotech))将人初试CD4+T细胞从健康人供体血液中新鲜分离，并根据Voo等人描述的方案在培养中向TR1细胞倾斜。所有人供体血液都是在知情同意的情况下获得的，并根据阿斯利康(Astrazeneca)的人体生物样品政策使用/处置。

在第8天，从培养中收集TR1细胞，在PBS中洗涤并染色进行流式细胞术分析以证实Treg标记表型。将细胞重悬于PBS+2％FBS(生命技术公司)中，至0.5x10⁶个细胞/0.1mL的浓度，并用由供应商推荐浓度的CD3-APC-Cy7、CD25-BV711(均得自生物传奇公司(Biolegend))、CD4-FITC、FOXP3-PE和CCR6-DL647(均来自BD生物科学公司)组成的多色抗体组进行染色。在细胞表面染色之前，根据供应商方案用Zombie-UV(生物传奇公司)处理细胞以从分析中选出死细胞。此后，针对所有细胞表面标记将活细胞在冰上染色15min。然后将染色的细胞用PBS+2％FBS洗涤两次，并使用BD cytofix/cytoperm试剂盒(BD生物科学公司)根据推荐的方案进行固定。在固定步骤之后，针对细胞内FOXP3将细胞在冰上染色15min，随后在PBS+2％FBS中另外洗涤2次。在BD Fortessa上进行流式细胞术分析，并通过FlowJo软件进行分析。使用补偿珠(e生物科学公司(eBiosciences))进行多色补偿，与细胞平行进行染色和分析，并且为每种颜色设置全减一(FMO)对照以确定阳性/阴性设门。

TR1趋化性(chemotaxis)测定。将NCIH508结肠癌细胞在如上所述的无血清限定培养基中铺板至超低附着板(康宁公司)上以促进CSC驱动的球体生长。在4天不受干扰的培养后，从条件培养基(CM)收集细胞，0.2μM过滤，并在4℃保存直到进一步使用。如上所述通过ELISA确定培养基中的CCL20浓度。将此CSC CM在收获一周内用于趋化性测定。

将在培养第8天收获的TR1细胞在PBS中洗涤并以0.4x10⁶个细胞/mL重悬于PBS+2％FBS或无血清限定培养基(SCM)中。在PBS+2％FBS中以100nM浓度制备分离的CCL20(R&D系统公司)。将抗CCL20单克隆抗体或同种型对照抗体(均来自R&D系统公司)以667nM终浓度加入分离的CCL20或CSC CM中并允许在室温下孵育30min。将制备好的处理物以n＝4个孔/处理转移到具有8μM孔的跨室迁移板(Neuroprobe)的接收孔中。根据供应商方案在匹配的培养基(PBS+2％FBS用于分离的CCL20处理，而SCM用于CSC CM处理)中将TR1细胞以50,000个细胞/孔铺板在滤板的顶部。允许将各板在37℃下孵育60min，之后将未迁移的细胞从滤板上吸干，并用PBS轻轻地洗涤过滤器。将各板以200rpm离心2min以在接收孔中收集迁移的细胞。根据供应商方案通过细胞滴度glo测定(普洛麦格公司)测定迁移的细胞的数目，由此使用细胞数目与相对发光(RLU)的标准曲线将RLU转化成迁移的TR1细胞的百分比。通过处理和对照之间的双尾学生T检验确定统计学显著性，其中n＝4个重复/处理。

β-抑制蛋白和cAMP通路测定。使用 eXpress CCR6 CHO-K1β-抑制蛋白GPCR测定(DiscoverX)按人和小鼠CCL20-CCR6通路活化的报告物测量β-抑制蛋白募集，由此对于小鼠通路测定，细胞稳定地表达小鼠CCR6，并且对于人类通路测定，细胞稳定地表达人CCR6。根据供应商方案进行测定，进行以下调节，将细胞用6nM重组人CCL20(R&D系统公司)或1.2nM重组小鼠CCL20(R&D系统公司)在37℃下刺激90min。使用LANCE cAMP测定试剂盒(珀金埃尔默公司(Perkin Elmer))，根据供应商方案，使用以人CCR6稳定转染的Ad293细胞，在单独的测定中作为人CCL20-CCR6通路活化的报告物另外测量cAMP水平的变化。在此测定中，将细胞用4μM福司可林(西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich))与1nM重组CCL20组合在室温下刺激60min。在两个测定中，在用CCL20 IgG或同种型对照IgG(均为R&D系统公司)处理后测量通路中和。

体内同基因小鼠模型。将4T1小鼠乳腺癌皮下异种移植到4-6周龄的雌性Balb/c小鼠(BALB/cAnNHsd，Envigo)的后腹侧中。当肿瘤达到大约50-100mm³时，小鼠开始接受以10mg/kg每周两次连续4个剂量i.p.给予的抗小鼠CCL20单克隆抗体(克隆114908)或同种型对照抗体(均为R&D系统公司)的处理。在最终剂量后24小时将小鼠人道安乐死，并收集脾脏和肿瘤用于分析。将脾脏和肿瘤组织都消化成单细胞悬浮液，并且在免疫细胞的流式细胞术分析之前，将所得细胞在Cryostor CS5(西格玛奥德里奇公司)中冷冻保存。

小鼠免疫细胞流式细胞术分析。将用同种型或抗小鼠CCL20单克隆抗体处理的小鼠的冷冻保存的脾脏和肿瘤细胞在37℃解冻，洗涤，并使用以下抗体组染色进行小鼠免疫细胞分析：抗cd45-BV21、抗cd4-BV711、抗cd11b-BV510(均得自BD生物科学公司)、抗cd3-FITC、抗cd8a-APC-Cy7、抗foxp3-PerCP-Cy5.5、抗-Rorγt-PE(均来自e生物科学公司)、抗cd11c-BV605、抗cd83-PE-Cy7、抗ly6g-BV785(均得自生物传奇公司)。首先用4％小鼠血清(杰克逊免疫研究公司(Jackson Immunoresearch))封闭活细胞，随后使用Zombie-UV(生物传奇公司)针对活细胞/死细胞进行染色，然后针对细胞外抗原(除foxp3和rorγt之外的所有靶标)进行染色。此后，洗涤细胞并在用抗细胞内抗原foxp3和rorγt的抗体对细胞染色之前使用Cytofix/Cytoperm试剂盒(BD生物科学公司)进行固定和透化。在配备有355nm、405nm、488nm、532nm和640nm激光器激发的BD Fortessa上运行流式细胞术，并使用flowjoV10软件进行分析。通过处理和对照之间的双尾学生T检验确定统计学显著性，其中n＝5只小鼠/处理/组织类型。超出均值的3x标准误差的数据点被鉴定为异常值，并从分析中去除。

人CD4+T细胞趋化性测定。使用Rosettesep CD4+T细胞富集试剂盒(干细胞技术公司)通过阴性选择从健康人供体血液中分离CD4+T细胞。将细胞在PBS中洗涤并重悬于PBS+2％FBS中。在PBS+2％FBS中以10nM浓度制备分离的CCL20(R&D系统公司)。将抗CCL20单克隆抗体或同种型对照抗体(均来自R&D系统公司)以30nM终浓度加入分离的CCL20中并允许在室温下孵育30min。将制备的处理物以n＝3孔/处理转移到具有5μM孔(康宁公司)的跨室迁移板的接收孔中，并在匹配的培养基(PBS+2％FBS)中，将CD4+T细胞以50,000个细胞/孔装载到聚碳酸酯过滤器上的插入物中，并且允许将各板在37℃孵育3小时。根据供应商方案通过细胞滴度glo测定(普洛麦格公司)测定迁移的细胞的数目，由此使用细胞数目与相对发光(RLU)的标准曲线将RLU转化成迁移的CD4+T细胞的百分比。通过处理和对照之间的双尾学生T检验确定统计学显著性，其中n＝3个重复/处理/供体。

实例1：在培养物中的癌症干细胞中CCL20的表达

如上所述，尽管CCL20被认为是募集免疫细胞的化学引诱剂，但是在此讨论的结果证明CCL20是癌细胞系中由CSC产生的因子，其中一些例示在此，包括乳腺癌、胰腺癌、和结直肠癌。在组织培养中，相对于单层培养条件，在CSC富集球体条件下培养时，发现大多数细胞系显著增加CCL20的分泌(图1A-1C)。如图1所示，在测试的乳腺癌细胞系(图1A)、胰腺癌细胞系(图1B)和结直肠癌细胞系(图1C)中的许多中，当与单层培养相比时，球体培养条件导致CCL20分泌的显著增加。在球体培养条件下由细胞分泌的CCL20的典型水平范围为从约1至约1000pg/mL，由此在球体培养中缺乏CCL20增加的细胞系通常具有低的或不可检测到的1pg/mL或更低的蛋白质水平(图2)。

为了证实CCL20水平上的球体相关增加归因于CSC，使用荧光活化细胞分选(FACS)从乳腺癌和胰腺癌细胞系中分离CSC和非CSC，以便测量每个细胞群中CCL20mRNA的水平。来自2个乳腺细胞系(MDAMB468和HCC1937)的分离的CD44^高/+CD24^低/-CSC与从相同系中分离的CD44^低/-CD24^低/-非-CSC相比具有显著升高的CCL20mRNA水平(图1D)。来自MDAMB468和HCC1937细胞的CSC分别产生比非CSC高23倍和10倍的CCL20转录物(CSC与非CSC的RE＝在MDAMB468中23.3±16与1.0±0.2，而在HCC1937中9.3±4.6与0.9±0.3)。为了确保此观察结果的临床相关性，还在来自患者衍生的原代肿瘤异种移植物(PDX)的FACS分离的CSC与非CSC中测量CCL20转录物水平。将来自两种胰腺癌(PA_PDX_1和PA_PDX_2)和一种乳腺癌(BR_PDX_1)PDX模型的肿瘤类似地进行FACS分选，以便针对胰腺癌分离Epcam⁺CD44⁺CD24⁺CSC连同Epcam^-CD44^-CD24^-非CSC，并且针对乳腺癌分离Epcam⁺CD44⁺CD24^-CSC连同Epcam⁺CD44^-CD24^-非CSC。如图1E中所示，所有三个患者异种移植物模型显示分离的CSC与非CSC相比CCL20mRNA水平的显著增加，CSC与非CSC的相对表达＝71.8±41.6与1.2±0.6(对于BR_PDX_1)，48.8±8.6与1.0±0.0(对于PA_PDX_1)，以及8.6±1.3与1.0±0.0(对于PA_PDX_2)。

接下来，我们通过流式细胞术证实，与其余的肿瘤细胞群相比，升高的CCL20水平的确标示CSC。虽然在胰腺癌中CSC通常被鉴定为Epcam⁺CD44⁺CD24⁺而在乳腺癌中被鉴定为CD44⁺CD24^-，但是我们发现，如通过致瘤性、球体形成和干性基因表达确定的，在单层细胞系模型中以CD44和/或CD24的高表达常常更好地追踪干细胞表型(因此有单层培养的胰腺癌中的Epcam⁺CD44^高CD24^高和单层培养的乳腺癌中的CD44^高CD24^-)。通过这种鉴定，我们发现来自Bxpc3胰腺模型(图3A)和来自HCC1937乳腺癌模型(图3D)的CSC都显示出CCL20中值荧光强度(MFI)水平相对于总肿瘤细胞群的1.5倍增加。Bxpc3CSC(图3B)显示189的MFI转变，而总肿瘤细胞群平均CCL20MFI为124。类似地，HCC1937CSC(图3E)也显示CCL20MFI从总肿瘤细胞中的243增加到确切地对于CD44^高CD24^-CSC的361。这一数据证实了图1所描绘的发现和结果，其表明CCL20水平升高主要与CSC富集的球体和分离的CSC相关联。如图13所描绘，CSC设门通过全减一染色来确定。

实例2：癌症干细胞中CCR6与CCL20的的关联和共定位

有趣的是，当我们CSC细胞群与针对肿瘤细胞的CCL20/CCR6染色叠加时，我们发现来自Bxpc3和HCC1937系的大部分CSC显现与配体和受体均为双阳性(即CCL20⁺CCR6⁺)的细胞共定位(图3C和3E)。引人注目的是，我们发现球体培养相比单层培养显著增加了这种双阳性CCL20⁺CCR6⁺细胞群。图4展示在Bxpc3和Panc1胰腺癌模型中的这种作用。当在标准单层中培养时，两种模型中的一小部分细胞被鉴定为CCL20⁺CCR6⁺(图4A与4C，以及针对设门对照的图13)。然而，当作为球体培养时，两种模型中的大部分细胞对CCL20和CCR6都呈染色阳性(图4B与4D)。在Bxpc3模型中，此CCL20⁺CCR6⁺细胞群从作为单层的3.76％(图4A)增加到球体中的71.2％(图4B)。类似地，作为单层培养的Panc1细胞具有5.87％CCL20⁺CCR6⁺细胞(图4C)，而在球体培养中该细胞群提高至83.5％(图4D)。有趣的是，当我们在这些球体中的Epcam⁺CD44⁺CD24⁺细胞上设门时，它们几乎又完全与Bxpc3(图4E)和Panc1(图4F)球体中的CCL20⁺CCR6⁺细胞群重叠。这些观察结果表明CSC可能对CCL20-CCR6轴具有自分泌依赖性。

实例3：CCL20水平与癌症干细胞活性的相关性

在证实CCL20的确由CSC细胞群过表达并且与其相关联之后，我们试图证实此分子与CSC活性的表型相关性。图5示出了外源加入纯化的CCL20如何促进球体生长，其充当CSC驱动的致瘤性的模型。在Aspc1(图5A)、Bxpc3(图5B)和SUM159(图5C)三种癌症模型中，向CSC培养物中加入重组人CCL20(rhCCL20)在第4天以剂量依赖性方式显著刺激球体生长。尽管加入CCL20引起球体生长的剂量依赖性增加，但在标准单层培养中配体对刺激细胞生长没有作用(图5A-5C)。这个观察结果往往表明CCL20的作用是专门针对CSC。此作用的特异性在图5D中得到证实，其展示出从两个独立商业来源获得的50pg/mL剂量的CCL20(CCL20 A和CCL20 B)以相同程度刺激BT549乳腺癌细胞的球体生长。例如，与基底细胞的100.0％±16.7％相比，CCL20 A刺激生长至333.3％±64.9％，而相比基底CCL20 B刺激生长至300.0％±54.6％(当与基底球体生长相比时，分别为p<0.01和p<0.05)。此外，当加入抗CCL20单克隆抗体(15μg/mL)时，该刺激作用可被中和或消除，由此尽管存在相同的50pg/mLCCL20 A或CCL20 B，最高球体生长对于CCL20 A+抗CCL20抗体为154％±16.9％而对于CCL20 B+抗CCL20抗体为125.0％±16.1％(参见图5D；与无抗CCL20抗体的CCL20处理的球体相比，p<0.05)。

总的来说，这种反应的特异性证实了CCL20的确介导表型CSC活性。然而，由于球体增长是衡量CSC活性的间接指标，因此我们试图证实CCL20(作为独立的因素)直接增加CSC。简言之，将用或未用200pg/mL CCL20处理4天的球体进行流式细胞术分析以直接测量CSC细胞群中CCL20驱动的增加。图6证明，在MDAMB468细胞中，CCL20处理将CD44⁺CD24^-乳腺CSC的百分比从0.9％±0.1％(无CCL20)显著增加至1.3％±0.1％(有CCL20)(p<0.05)(图6A)。类似地，在CCL20刺激之后，Bxpc3(图6B)和Aspc1(图6C)胰腺癌细胞显示其Epcam⁺CD44^高CD24^高CSC频率显著增加，Bxpc3中为从0.9％±0.1％增加至1.2％±0.1％，而Aspc1中为2.7％±0.1％增加至3.6％±0.4％(两个细胞类型中p<0.05)。除了球体生长和流式细胞术之外，我们和其他人还发现一组五个干性相关基因也可用CSC表型良好追踪。已知与多能性相关联的转录因子NANOG、SOX2和OCT3/4的表达随着CSC细胞群的相应增加和减少而增加和减少。相似地，多梳蛋白质EZH2和BMI1的转录物表达均与CSC细胞群的变化良好相关。图6D显示在处理4天后向Bxpc3球体中添加200pg/mL CCL20的确增加了所有5个干性相关基因的表达。在Hs578T、SUM159和Panc1细胞系中发现了类似的结果(图7)。与在球体生长中看到的作用以及在具有CSC表面标记的细胞的百分比中测量到的增加一起，这些数据的确表明，配体CCL20可以直接促进测试的细胞系中的CSC活性。

实例4：CCL20在癌症干细胞中的作用由其受体CCR6介导

虽然实例1-3中讨论的实验结果证实CCL20直接影响CSC活性，但仍有待确定CCL20是否的确通过其已知受体CCR6传导信号以发挥这种活性。图5中描绘的数据显示添加纯化的CCL20刺激球体生长。由此，设计实验来评估CCL20的作用是否是由通过其受体CCR6的信号传导介导的，推理如果CCL20通过CCR6信号传导发挥其功能，敲低CCR6将阻止CCL20刺激的球体生长。

在图8A中，我们显示在Lovo结直肠癌细胞中，用20nM siRNA敲低CCR6后，重组人CCL20(rhCCL20)失去刺激球体生长的能力，而用非靶标对照siRNA(20nM)转染的细胞保留了它们对CCL20的生长反应。为了证实CCR6是CSC上此CCL20轴的必要组分，我们将NCIH508细胞系中的CCR6⁺与CCR6^-细胞分开，并用100pg/mL CCL20刺激两个部分48小时，并且随后评估干性相关基因表达。图8B显示与CCR6^-细胞相比时，在用100pg/mL刺激48小时后，CCR6⁺细胞以NANOG、BMI1、OCT3/4和SOX2的约2倍增加的表达来响应。这些结果证明响应于CCL20刺激的CSC相关活性依赖于作为受体的CCR6的存在。为了进一步支持这一发现，我们观察到，通过CCL20的缺失或CCR6的缺失抑制肿瘤细胞上的这种CCL20-CCR6轴导致球体生长的类似结果(图8C和8D)。在NCIH508细胞中，与非靶标对照siRNA(100.0％±2.0％)相比，RNAi介导的CCL20或CCR6的敲低将球体生长减少(p<0.001)至相似的程度，即59.6％±2.9％或70.3％±2.2％(图8C)。在Hs578T细胞中进行了相同的观察，其中相比于用对照siRNA的情况下100.0％±7.0％的生长，RNAi介导的敲低使球体生长减少至：用CCL20siRNA的情况下55.4％±3.9％，和用CCR6siRNA的情况下21.8％±1.8％(p<0.001)(图8D)。总之，结果证实CCL20-CCR6轴负责促进CCL20对CSC的作用。

实例5：中和性CCL20抑制癌症干细胞活性

正如上面的实例所验证的，CCL20是CSC活性的明确介体。这个实例评估了此靶标的中和能否反过来抑制CSC。为了测试这一点，在一系列实验中使用了可商购的具有报导的中和潜力的针对CCL20的单克隆IgG抗体。在测试的所有三种适应症的模型中，与相同的10μg/mL剂量的同种型对照IgG相比，单剂量给予10μg/mL CCL20 IgG在处理后4天显著减少球体形成(图9)。与对照IgG的100.0％±27.2％球体生长相比，Hs578T乳腺癌球体的生长减少至仅11.1％±11.1％(p<0.05，图9A)。类似地，相比对照IgG的100.0％±4.8％，NCIH508结直肠癌球体的生长减少至62.8％±5.8％(p<0.001，图9B)，而Panc1胰腺癌球体的生长从用对照IgG处理情况下的100.0％±13.0％减少至18.1％±2.1％，(p<0.001，图9C)。在图15中展示出用于CSC鉴定的设门对照。

CCL20抑制对CSC减少的影响通过流式细胞术证实，其中单剂量给予10μg/mLCCL20 IgG进行的类似4天Bxpc3球体处理将Epcam⁺CD44⁺CD24⁺CSC的百分比从用10μg/mL对照IgG处理情况下的5.6％±0.1％降低至4.5％±0.4％(p<0.05，图9D)。在球体中Panc1胰腺CSC的频率从用对照IgG处理情况下的9.3％±0.9％降低至CCL20 IgG后的6.6％±0.7％(p<0.05，图9E)。总之，这些结果证实用单克隆抗体中和CCL20的确可以用作潜在治疗剂以减少CSC细胞群，揭示了CCL20作为抗CSC治疗剂靶标的有希望的机会。

实例6：T_reg运动由CSC产生的CCL20介导。

已知主要在B细胞、T细胞和树突细胞亚群中，CCL20引导CCR6+免疫细胞的趋化性迁移。作为阳性对照，我们证实了抗CCL20 IgG阻断已知细胞类型(即CD4+T细胞)的趋化性迁移的能力。图10证实了以30nM给予的抗CCL20 IgG可显著抑制从2名健康人供体的外周血分离的CD4+T细胞的趋化性迁移。

为了测试CSC产生的CCL20是否可以影响T_reg的迁移，我们在培养中使人初试CD4+T细胞向着1型调节性T细胞(TR1)倾斜，如上文在材料和方法中所述。细胞的流式细胞术分析证实TR1细胞按表面表型类似于T_reg，因为它们主要是CD3+/CD4+/CD25+/FOXP3+T细胞；并且这些TR1细胞表达CCR6(图11)。跨室迁移测定揭示这些TR1细胞可以选择性地向分离的CCL20迁移，其中14.7％±0.9％的细胞向CCL20迁移，相比而言非特异性迁移的细胞为10.2％±0.6％(p<0.01，图12A)。以6倍摩尔过量添加抗CCL20抗体能够阻断这种迁移，通过细胞迁移减少至7.9％±0.6％可见(与100nM CCL20处理相比，p<0.01，图12A)。

接下来，我们询问TR1细胞是否可以向CSC产生的CCL20迁移。我们从在CSC驱动的球体形成条件下培养4天的NCIH508结肠癌细胞产生CSC条件培养基，发现含有平均浓度为211pg/mL(＝26.4pM)的CCL20，如通过ELISA确定的(图12B)。TR1细胞(19.3％±0.9％)能够向CSC CM迁移，相比而言非特异性迁移的细胞为10.3％±0.6％(p<0.01，图12C)。由于添加中和性抗CCL20抗体显著将迁移减少到13.8％±0.7％(与CSC CM或CSC CM+同种型对照IgG相比，p<0.01，图12C)，所以迁移事实上是被引导朝向条件培养基中的CCL20。添加同种型对照IgG对减少TR1向CSC CM的迁移没有任何作用(用同种型对照IgG的情况下迁移率为17.9％±1.7％)。这些结果证实了1型调节性T细胞可以向由CSC产生的CCL20迁移的假设，并且由此表明针对CCL20的中和性抗体可以减少T_reg向肿瘤环境中的浸润。

实例7：CCL20中和性抗体减少体内肿瘤发生和免疫抑制

一旦CCL20被确立为CSC活性的明确介体，我们研究了此靶标的中和是否可以反过来抑制CSC。为了测试这一点，我们使用针对CCL20的可商购中和性人单克隆抗体(克隆67310；R&D系统公司)。在cAMP测定和β-抑制蛋白易位测定中(分别为图16A和16B)，此抗体抑制CCL20刺激的CCR6通路活性的能力证实了中和潜力。当用1nM CCL20刺激细胞时，在cAMP测定中测量IC₅₀为0.8nM，而当用6nM CCL20刺激细胞时，测量IC₅₀为2.7nM。

通过体外CCL20中和减少CSC含量转化为肿瘤获取率和肿瘤生长速率的延迟。当在肿瘤接种之前体外持续4天用10ug/mL CCL20 IgG预处理Panc1肿瘤时，与用10ug/mL同种型IgG预处理Panc1肿瘤相比，到Panc1肿瘤(％荷瘤动物)肿瘤获取的中位时间延迟了56.5天(图17A)。在这种情况下的肿瘤获取是从第一例可触知的肿瘤形成测量的。在研究过程中，CCL20 IgG处理的肿瘤的平均肿瘤体积也显著小于同种型IgG处理的肿瘤(图17B)。

为了评估CCL20中和在免疫感受态同基因小鼠模型中的作用，我们鉴定了具有充分阻断/中和潜力的可商购抗小鼠CCL20单克隆抗体(克隆114908；R&D系统公司)以充当抗人CCL20单克隆抗体的替代品。当用1.2nM小鼠CCL20刺激细胞时(图18)，抗小鼠CCL20 IgG抗体能够抑制小鼠CCL20-小鼠CCR6通路，如通过β-抑制蛋白易位测定(14.0nM的IC₅₀)测量的。然而，当比较人和小鼠之间的CCL20与抗体IC₅₀值的比率时，小鼠CCL20 IgG的效力与人CCL20 IgG(描述于0174)相比显著减少。

使用同基因肿瘤模型来评价体内CCL20中和对外周免疫细胞和肿瘤浸润免疫细胞的影响。已知4T1小鼠乳腺癌细胞系天然表达CCL20，并且因此被选择用于本研究。将免疫感受态小鼠以HLA匹配的4T1细胞皮下异种移植，并且一旦肿瘤达到大约50-100mm³，则每周两次连续4个剂量以10mg/kg给予抗小鼠CCL20 IgG或匹配的同种型对照IgG。对第4个剂量后24小时收获的脾脏和肿瘤组织进行死后免疫分型。

通过多色流式细胞术根据针对脾脏的图19和针对肿瘤组织的图20所示的设门图确定淋巴和骨髓免疫细胞亚群的频率。将全减一(FMO)对照用于设门以针对组中的任何特定标记鉴定细胞为阳性与阴性。

数据指示用抗CCL20 IgG进行的体内处理显著影响外周和肿瘤浸润免疫细胞的频率。在脾脏中，CCL20抑制导致foxp3+T_reg(图21A)和rorγt+Th₁₇细胞(图21B)显著减少，由此两个细胞群的频率与同种型对照处理的动物相比降低大约2倍(在同种型IgG与抗CCL20IgG处理的动物中为11.5％±0.4％与6.5％±1.2％T_reg和4.7％±0.4％与2.2％±0.5％Th₁₇)。在肿瘤中也捕获了这种相同的影响，即T_reg的频率从同种型IgG处理后的1.5％±0.05％减少到响应于抗CCL20 IgG处理的1.0％±0.1％(图22A)，并且Th₁₇细胞的频率也从同种型IgG处理的肿瘤中的0.4％±0.05％减少到CCL20 IgG处理后的0.3％±0.02％(图22B)。此结果表明体内阻断CCL20导致已知在肿瘤环境中促进免疫抑制的2个细胞类型(即T_reg和Th₁₇)的外周和肿瘤特异性减少，表明抑制CCL20的治疗剂可以帮助减轻免疫抑制，作为抗癌症治疗策略的部分。

除了CCL20对T_reg和Th₁₇细胞群发挥作用之外，CCL20中和也显著影响树突细胞。在肿瘤环境中，树突细胞频率从同种型IgG处理的小鼠中的18.2％±2.2％下降至CCL20 IgG处理后的11.9％±2.3％(图22C，非显著性)。这种下降主要归因于成熟cd83+树突细胞(图22E)而不是未成熟cd83-树突细胞(图22D)的显著减少。与此相反，在脾脏中，CCL20中和引起树突细胞的显著增加，从同种型IgG处理的小鼠中的6.9％±0.5％增加到CCL20 IgG处理的小鼠中的9.8％±0.6％(图21C)。树突细胞增加主要是cd83-未成熟树突细胞(图21D)而不是cd83+成熟树突细胞(图21E)的增加。这一结果指示，在体内中和CCL20抑制树突细胞的成熟，并因此将这种细胞类型浸润到肿瘤中。

相比同种型对照处理的小鼠(数据未显示)，在用抗CCL20处理的小鼠的脾脏或肿瘤中，没有发现概述的剩余免疫细胞群即cd8+T细胞和嗜中性粒细胞/粒细胞髓源抑制性细胞(gMDSC)的变化。

讨论

以上实例中的数据证明了CCL20-CCR6轴除了其在免疫细胞募集中的已知作用之外的以前未鉴定的和意料之外的功能。具体地，在此呈现的研究证明，就癌症而言，CCL20在CSC功能上具有特定的作用，代表了以前未报告的发现。在几个说明性实例中，结果显示，在乳腺癌、结直肠癌和胰腺癌模型中，在转录物和蛋白质水平，与非CSC肿瘤细胞相比，CCL20都被CSC特异性地过表达。这些实例还证实了CCL20蛋白质在CSC活性中的功能作用，因为如通过表面标记分析确定的，向细胞培养物给予外源CCL20提供了CSC百分比的直接增加。CCL20也增加CSC的自我更新和增殖功能，正如其分别直接增加干性基因活化和球体生长的作用所见。在体外，CCL20在生理学相关浓度下对CSC发挥活性，该生理学相关浓度不仅与我们的研究中的分泌到培养基中的水平相似，还与在预后不良的结直肠癌患者中检测到的循环水平相似(Iwata等人，2013)。

虽然CCL20对CSC的这种活性是意料之外的发现，但其他趋化因子/细胞因子也显示出对CSC活性有直接作用。白细胞介素-6(IL6)和白细胞介素-8(IL8)都显示出提供对乳腺CSC的直接作用(Ginestier等人，2010；Iliopoulos等人，2011)。类似地，已经显示CXC-基序配体12(CXCL12)的调节可调节成胶质细胞瘤CSC(Wurth等人，2014)，而CCL3的活性置于CML白血病起始细胞的背景下(Baba等人，2013)。因此，连同这一发现，越来越多的证据指出常规自我更新通路如Notch-、Wnt-和Hedgehog-信号传导之外的介体调节CSC功能的作用。鉴于CCL20与受体CCR6之间的独特关系，我们假设CCL20必须通过传导信号给其受体CCR6来发挥其对CSC的活性。通过敲除CCR6，我们证实了CCL20在促进功能性CSC活性方面的确需要受体。但是另外，当我们将癌细胞系分开为受体阳性或阴性的部分时，我们发现仅受体阳性细胞在CCL20刺激后显示出干性基因的活化。最后，观察到CSC显现大多与CCL20⁺/CCR6⁺细胞表面表型共定位，表明CCL20对CSC的活性可能是自分泌循环的结果，尽管需要进一步的研究来证实这一假设。总之，这个证据支持CCL20通过肿瘤细胞上其受体CCR6的信号传导发挥其对CSC活性的结论，并且因此作为整体，CCL20-CCR6轴可以在乳腺癌、胰腺癌和结直肠癌中的CSC活性上实施。

最近的出版物证明，当敲除CCR6时，APC^min小鼠显示肠道肿瘤发生减少(Nandi等人，2014)。这个结果暗示了在肠道中的肿瘤起始中的CCL20-CCR6轴，再次强化了这个轴在肿瘤发展和进展背后的事件中的作用。鉴于我们发现这个CCL20-CCR6轴与CSC表型相关，我们预期这个轴的治疗干预可以帮助根除CSC。实际上，我们发现用针对CCL20的中和性单克隆抗体进行的处理显著降低了测试的所有三个肿瘤类型的模型中的CSC频率和活性。虽然我们看到CCL20中和直接减少胰腺癌模型中表面表型阳性CSC的百分比，但我们还发现CCL20中和显著抑制乳腺癌、胰腺癌和结直肠癌模型中的球体生长。这些结果证实，我们不仅可以抑制CSC数目，更重要的是可以抑制CSC功能。

在体内，CSC功能可以通过其肿瘤发生潜力来测量。在小鼠模型中，我们发现用CCL20中和性单克隆抗体处理CSC富集的胰腺癌球体显著延迟了肿瘤形成的发作。此外，与同种型对照处理的肿瘤相比，由用抗CCL20IgG处理的CSC形成的肿瘤显示出肿瘤生长的显著减少。这一发现证实了CCL20在驱动CSC功能中的作用(在以上实例鉴定)意味着在体内对肿瘤发生和肿瘤生长速率的影响。

由于CCL20-CCR6轴在免疫细胞募集中提供基线功能，因此我们假设CSC分泌的CCL20除了其对肿瘤细胞的直接作用之外还可潜在地影响肿瘤浸润淋巴细胞募集。Chen等人显示了以下证据，CCL20水平与肝细胞癌患者肿瘤活检中的调节性T细胞水平直接相关，并且在此适应症中CCL20显著促进调节性T细胞迁移(Chen等人，2011)。鉴于调节性T细胞与许多肿瘤类型的不良预后相关联(Want等人，2012)，人们可以设想CCL20通过连环出击(one-two punch)，通过调节CSC部分和通过刺激免疫抑制调节性T细胞向肿瘤环境的募集来促进致瘤性的机制。

当使用免疫感中态荷瘤小鼠在体内测试时，我们的确证实CCL20中和抑制T_reg向肿瘤中的浸润。然而，CCL20中和也抑制了Th₁₇向肿瘤中的浸润，这是因Th₁₇细胞被表征为CCR6+而预期的发现。有趣的是，我们发现CCL20抑制不仅影响这两个免疫细胞类型在肿瘤中的频率，而且还减少了脾脏中T_reg和Th₁₇细胞的频率，表明了在单纯肿瘤浸润之外对于这两个细胞类型的抑制的外周响应。与此相反，我们还鉴定CCL20中和减少了肿瘤中成熟树突细胞的频率，然而这一发现对立于脾脏中增加的未成熟树突细胞的存在。这个结果表明CCL20也在树突细胞成熟和然后入侵到肿瘤环境中发挥作用。

鉴于许多肿瘤类型中T_reg和Th₁₇细胞与不良预后和免疫抑制的关联，以及CCL20显著降低这两个细胞类型在肿瘤和脾脏中的频率的发现，我们的总体发现提出CCL20在肿瘤环境中起着双重作用：1)通过驱动CSC的活性和致瘤能力，和2)通过促进免疫抑制表型。

大量的临床前和临床证据指出CSC在癌症治疗中具有关键功能，因此靶向这一肿瘤细胞群的治疗可具有很高的价值。在此所述的工作不仅指出了CCL20-CCR6轴在CSC维持中的新颖和重要作用，还指出了CCL20在支持免疫抑制表型中的关键作用。这一发现支持以下假设，CCL20在两个方面以肿瘤促进方式起作用：通过促进CSC功能和阻碍抗肿瘤免疫应答。我们的数据指出CCL20的中和可以是同时抑制CSC功能和减轻免疫抑制表型的有用策略。总之，我们假设，通过这种双重机制，通过阻断CCL20抑制CSC可以使得用以治疗癌症和改善患者生命的独特且有效的疗法成为可能。

通过引用的结合

在此提及的所有公开物和专利特此以其全文通过引用而结合，如同每个单独的出版物或专利被明确且单独地表明通过引用而结合。

虽然已经讨论了本披露的特定方面，但上述说明是说明性而非限制性的。通过回顾此说明书和以下权利要求，本披露的多种变体对于本领域的技术人员而言将变得清楚。应通过参考权利要求、连同它们的等效物的全部范围、以及说明书、连同这类变体，确定本披露的全部范围。

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序列表

<110> van Vlerken-Ysla, Lilian Emilia

Hurt, Elaine Marie

<120> 用于治疗癌症的组合物和方法

<130> CCL20-100-WO

<160> 8

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 3156

<212> DNA

<213> 智人

<400> 1

gaaggtcccc aggactctgt ggtcatcagt aagagagggc ccacgtgtat atgctggtga 60

acagaaatgt caaccttttc aaagtctgac atttaagaga aaaaactgtg gctgttggtt 120

tgtggaacag acagctcctt ctttattgag tcacctctac tttcctgcta ccgctgcctg 180

tgagctgaag gggctgaacc atacactcct ttttctacaa ccagcttgca ttttttctgc 240

ccacaatgag cggggaatca atgaatttca gcgatgtttt cgactccagt gaagattatt 300

ttgtgtcagt caatacttca tattactcag ttgattctga gatgttactg tgctccttgc 360

aggaggtcag gcagttctcc aggctatttg taccgattgc ctactccttg atctgtgtct 420

ttggcctcct ggggaatatt ctggtggtga tcacctttgc tttttataag aaggccaggt 480

ctatgacaga cgtctatctc ttgaacatgg ccattgcaga catcctcttt gttcttactc 540

tcccattctg ggcagtgagt catgccaccg gtgcgtgggt tttcagcaat gccacgtgca 600

agttgctaaa aggcatctat gccatcaact ttaactgcgg gatgctgctc ctgacttgca 660

ttagcatgga ccggtacatc gccattgtac aggcgactaa gtcattccgg ctccgatcca 720

gaacactacc gcgcagcaaa atcatctgcc ttgttgtgtg ggggctgtca gtcatcatct 780

ccagctcaac ttttgtcttc aaccaaaaat acaacaccca aggcagcgat gtctgtgaac 840

ccaagtacca gactgtctcg gagcccatca ggtggaagct gctgatgttg gggcttgagc 900

tactctttgg tttctttatc cctttgatgt tcatgatatt ttgttacacg ttcattgtca 960

aaaccttggt gcaagctcag aattctaaaa ggcacaaagc catccgtgta atcatagctg 1020

tggtgcttgt gtttctggct tgtcagattc ctcataacat ggtcctgctt gtgacggctg 1080

caaatttggg taaaatgaac cgatcctgcc agagcgaaaa gctaattggc tatacgaaaa 1140

ctgtcacaga agtcctggct ttcctgcact gctgcctgaa ccctgtgctc tacgctttta 1200

ttgggcagaa gttcagaaac tactttctga agatcttgaa ggacctgtgg tgtgtgagaa 1260

ggaagtacaa gtcctcaggc ttctcctgtg ccgggaggta ctcagaaaac atttctcggc 1320

agaccagtga gaccgcagat aacgacaatg cgtcgtcctt cactatgtga tagaaagctg 1380

agtctcccta aggcatgtgt gaaacatact catagatgtt atgcaaaaaa aagtctatgg 1440

ccaggtatgc atggaaaatg tgggaattaa gcaaaatcaa gcaagcctct ctcctgcggg 1500

acttaacgtg ctcatgggct gtgtgatctc ttcagggtgg ggtggtctct gataggtagc 1560

attttccagc actttgcaag gaatgttttg tagctctagg gtatatatcc gcctggcatt 1620

tcacaaaaca gcctttggga aatgctgaat taaagtgaat tgttgacaaa tgtaaacatt 1680

ttcagaaata ttcatgaagc ggtcacagat cacagtgtct tttggttaca gcacaaaatg 1740

atggcagtgg tttgaaaaac taaaacagaa aaaaaaatgg aagccaacac atcactcatt 1800

ttaggcaaat gtttaaacat ttttatctat cagaatgttt attgttgctg gttataagca 1860

gcaggattgg ccggctagtg tttcctctca tttccctttg atacagtcaa caagcctgac 1920

cctgtaaaat ggaggtggaa agacaagctc aagtgttcac aacctggaag tgcttcggga 1980

agaaggggac aatggcagaa caggtgttgg tgacaattgt caccaattgg ataaagcagc 2040

tcaggttgta gtgggccatt aggaaactgt cggtttgctt tgatttccct gggagctgtt 2100

ctctgtcgtg agtgtctctt gtctaaacgt ccattaagct gagagtgcta tgaagacagg 2160

atctagaata atcttgctca cagctgtgct ctgagtgcct agcggagttc cagcaaacaa 2220

aatggactca agagagattt gattaatgaa tcgtaatgaa gttggggttt attgtacagt 2280

ttaaaatgtt agatgttttt aattttttaa ataaatggaa tacttttttt ttttttttaa 2340

agaaagcaac tttactgaga caatgtagaa agaagttttg ttccgtttct ttaatgtggt 2400

tgaagagcaa tgtgtggctg aagacttttg ttatgaggag ctgcagatta gctaggggac 2460

agctggaatt atgctggctt ctgataatta ttttaaaggg gtctgaaatt tgtgatggaa 2520

tcagatttta acagctctct tcaatgacat agaaagttca tggaactcat gtttttaaag 2580

ggctatgtaa atatatgaac attagaaaaa tagcaacttg tgttacaaaa atacaaacac 2640

atgttaggaa ggtactgtca tgggctaggc atggtggctc acacctgtaa tcccagcatt 2700

ttgggaagct aagatgggtg gatcacttga ggtcaggagt ttgagaccag cctggccaac 2760

atggcgaaac ccctctctac taaaaataca aaaatttgcc aggcgtggtg gcgggtgcct 2820

gtaatcccag ctacttggga ggctgaggca agagaatcgc ttgaacccag gaggcagagg 2880

ttgcagtgag ccgagatcgt gccattgcac tccagcctgg gtgacaaagc gagactccat 2940

ctcaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaggaaag aactgtcatg taaacatacc aacatgttta 3000

aacctgacaa tggtgttatt tgaaacttta tattgttctt gtaagcttta actatatctc 3060

tctttaaaat gcaaaataat gtcttaagat tcaaagtctg tatttttaaa gcatggcttt 3120

ggctttgcaa aataaaaaat gtgttttgta catgaa 3156

<210> 2

<211> 374

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Met Ser Gly Glu Ser Met Asn Phe Ser Asp Val Phe Asp Ser Ser Glu

1 5 10 15

Asp Tyr Phe Val Ser Val Asn Thr Ser Tyr Tyr Ser Val Asp Ser Glu

20 25 30

Met Leu Leu Cys Ser Leu Gln Glu Val Arg Gln Phe Ser Arg Leu Phe

35 40 45

Val Pro Ile Ala Tyr Ser Leu Ile Cys Val Phe Gly Leu Leu Gly Asn

50 55 60

Ile Leu Val Val Ile Thr Phe Ala Phe Tyr Lys Lys Ala Arg Ser Met

65 70 75 80

Thr Asp Val Tyr Leu Leu Asn Met Ala Ile Ala Asp Ile Leu Phe Val

85 90 95

Leu Thr Leu Pro Phe Trp Ala Val Ser His Ala Thr Gly Ala Trp Val

100 105 110

Phe Ser Asn Ala Thr Cys Lys Leu Leu Lys Gly Ile Tyr Ala Ile Asn

115 120 125

Phe Asn Cys Gly Met Leu Leu Leu Thr Cys Ile Ser Met Asp Arg Tyr

130 135 140

Ile Ala Ile Val Gln Ala Thr Lys Ser Phe Arg Leu Arg Ser Arg Thr

145 150 155 160

Leu Pro Arg Ser Lys Ile Ile Cys Leu Val Val Trp Gly Leu Ser Val

165 170 175

Ile Ile Ser Ser Ser Thr Phe Val Phe Asn Gln Lys Tyr Asn Thr Gln

180 185 190

Gly Ser Asp Val Cys Glu Pro Lys Tyr Gln Thr Val Ser Glu Pro Ile

195 200 205

Arg Trp Lys Leu Leu Met Leu Gly Leu Glu Leu Leu Phe Gly Phe Phe

210 215 220

Ile Pro Leu Met Phe Met Ile Phe Cys Tyr Thr Phe Ile Val Lys Thr

225 230 235 240

Leu Val Gln Ala Gln Asn Ser Lys Arg His Lys Ala Ile Arg Val Ile

245 250 255

Ile Ala Val Val Leu Val Phe Leu Ala Cys Gln Ile Pro His Asn Met

260 265 270

Val Leu Leu Val Thr Ala Ala Asn Leu Gly Lys Met Asn Arg Ser Cys

275 280 285

Gln Ser Glu Lys Leu Ile Gly Tyr Thr Lys Thr Val Thr Glu Val Leu

290 295 300

Ala Phe Leu His Cys Cys Leu Asn Pro Val Leu Tyr Ala Phe Ile Gly

305 310 315 320

Gln Lys Phe Arg Asn Tyr Phe Leu Lys Ile Leu Lys Asp Leu Trp Cys

325 330 335

Val Arg Arg Lys Tyr Lys Ser Ser Gly Phe Ser Cys Ala Gly Arg Tyr

340 345 350

Ser Glu Asn Ile Ser Arg Gln Thr Ser Glu Thr Ala Asp Asn Asp Asn

355 360 365

Ala Ser Ser Phe Thr Met

370

<210> 3

<211> 3419

<212> DNA

<213> 智人

<400> 3

tgctcccagg agataaccag gtaaaggagt atgaaagttt gggtacaaac tcattgctgc 60

aaattgaaaa ccatgcaaag gctgtcttcc tctggggagt tcaatgcctc tctttttctt 120

atcactttac cattggttgg actttgattc cagggatcct acgattactc aataccctac 180

aggatataca tggttaacca tttgcatttg ggcaaatagg cgttactttt caataggaag 240

tggcaatcca gaacttgctt ttgggcaatt ctagtagctc accgcttttt tcttaatgac 300

tgctagaagc tgcatcttat tgacagatgg tcatcacatt ggtgagctgg agtcatcaga 360

ttgtggggcc cggagtgagg ctgaagggag tggatcagag cactgcctga gagtcacctc 420

tactttcctg ctaccgctgc ctgtgagctg aaggggctga accatacact cctttttcta 480

caaccagctt gcattttttc tgcccacaat gagcggggaa tcaatgaatt tcagcgatgt 540

tttcgactcc agtgaagatt attttgtgtc agtcaatact tcatattact cagttgattc 600

tgagatgtta ctgtgctcct tgcaggaggt caggcagttc tccaggctat ttgtaccgat 660

tgcctactcc ttgatctgtg tctttggcct cctggggaat attctggtgg tgatcacctt 720

tgctttttat aagaaggcca ggtctatgac agacgtctat ctcttgaaca tggccattgc 780

agacatcctc tttgttctta ctctcccatt ctgggcagtg agtcatgcca ccggtgcgtg 840

ggttttcagc aatgccacgt gcaagttgct aaaaggcatc tatgccatca actttaactg 900

cgggatgctg ctcctgactt gcattagcat ggaccggtac atcgccattg tacaggcgac 960

taagtcattc cggctccgat ccagaacact accgcgcagc aaaatcatct gccttgttgt 1020

gtgggggctg tcagtcatca tctccagctc aacttttgtc ttcaaccaaa aatacaacac 1080

ccaaggcagc gatgtctgtg aacccaagta ccagactgtc tcggagccca tcaggtggaa 1140

gctgctgatg ttggggcttg agctactctt tggtttcttt atccctttga tgttcatgat 1200

attttgttac acgttcattg tcaaaacctt ggtgcaagct cagaattcta aaaggcacaa 1260

agccatccgt gtaatcatag ctgtggtgct tgtgtttctg gcttgtcaga ttcctcataa 1320

catggtcctg cttgtgacgg ctgcaaattt gggtaaaatg aaccgatcct gccagagcga 1380

aaagctaatt ggctatacga aaactgtcac agaagtcctg gctttcctgc actgctgcct 1440

gaaccctgtg ctctacgctt ttattgggca gaagttcaga aactactttc tgaagatctt 1500

gaaggacctg tggtgtgtga gaaggaagta caagtcctca ggcttctcct gtgccgggag 1560

gtactcagaa aacatttctc ggcagaccag tgagaccgca gataacgaca atgcgtcgtc 1620

cttcactatg tgatagaaag ctgagtctcc ctaaggcatg tgtgaaacat actcatagat 1680

gttatgcaaa aaaaagtcta tggccaggta tgcatggaaa atgtgggaat taagcaaaat 1740

caagcaagcc tctctcctgc gggacttaac gtgctcatgg gctgtgtgat ctcttcaggg 1800

tggggtggtc tctgataggt agcattttcc agcactttgc aaggaatgtt ttgtagctct 1860

agggtatata tccgcctggc atttcacaaa acagcctttg ggaaatgctg aattaaagtg 1920

aattgttgac aaatgtaaac attttcagaa atattcatga agcggtcaca gatcacagtg 1980

tcttttggtt acagcacaaa atgatggcag tggtttgaaa aactaaaaca gaaaaaaaaa 2040

tggaagccaa cacatcactc attttaggca aatgtttaaa catttttatc tatcagaatg 2100

tttattgttg ctggttataa gcagcaggat tggccggcta gtgtttcctc tcatttccct 2160

ttgatacagt caacaagcct gaccctgtaa aatggaggtg gaaagacaag ctcaagtgtt 2220

cacaacctgg aagtgcttcg ggaagaaggg gacaatggca gaacaggtgt tggtgacaat 2280

tgtcaccaat tggataaagc agctcaggtt gtagtgggcc attaggaaac tgtcggtttg 2340

ctttgatttc cctgggagct gttctctgtc gtgagtgtct cttgtctaaa cgtccattaa 2400

gctgagagtg ctatgaagac aggatctaga ataatcttgc tcacagctgt gctctgagtg 2460

cctagcggag ttccagcaaa caaaatggac tcaagagaga tttgattaat gaatcgtaat 2520

gaagttgggg tttattgtac agtttaaaat gttagatgtt tttaattttt taaataaatg 2580

gaatactttt tttttttttt taaagaaagc aactttactg agacaatgta gaaagaagtt 2640

ttgttccgtt tctttaatgt ggttgaagag caatgtgtgg ctgaagactt ttgttatgag 2700

gagctgcaga ttagctaggg gacagctgga attatgctgg cttctgataa ttattttaaa 2760

ggggtctgaa atttgtgatg gaatcagatt ttaacagctc tcttcaatga catagaaagt 2820

tcatggaact catgttttta aagggctatg taaatatatg aacattagaa aaatagcaac 2880

ttgtgttaca aaaatacaaa cacatgttag gaaggtactg tcatgggcta ggcatggtgg 2940

ctcacacctg taatcccagc attttgggaa gctaagatgg gtggatcact tgaggtcagg 3000

agtttgagac cagcctggcc aacatggcga aacccctctc tactaaaaat acaaaaattt 3060

gccaggcgtg gtggcgggtg cctgtaatcc cagctacttg ggaggctgag gcaagagaat 3120

cgcttgaacc caggaggcag aggttgcagt gagccgagat cgtgccattg cactccagcc 3180

tgggtgacaa agcgagactc catctcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaagga aagaactgtc 3240

atgtaaacat accaacatgt ttaaacctga caatggtgtt atttgaaact ttatattgtt 3300

cttgtaagct ttaactatat ctctctttaa aatgcaaaat aatgtcttaa gattcaaagt 3360

ctgtattttt aaagcatggc tttggctttg caaaataaaa aatgtgtttt gtacatgaa 3419

<210> 4

<211> 374

<212> PRT

<213> 智人

<400> 4

Met Ser Gly Glu Ser Met Asn Phe Ser Asp Val Phe Asp Ser Ser Glu

1 5 10 15

Asp Tyr Phe Val Ser Val Asn Thr Ser Tyr Tyr Ser Val Asp Ser Glu

20 25 30

Met Leu Leu Cys Ser Leu Gln Glu Val Arg Gln Phe Ser Arg Leu Phe

35 40 45

Val Pro Ile Ala Tyr Ser Leu Ile Cys Val Phe Gly Leu Leu Gly Asn

50 55 60

Ile Leu Val Val Ile Thr Phe Ala Phe Tyr Lys Lys Ala Arg Ser Met

65 70 75 80

Thr Asp Val Tyr Leu Leu Asn Met Ala Ile Ala Asp Ile Leu Phe Val

85 90 95

Leu Thr Leu Pro Phe Trp Ala Val Ser His Ala Thr Gly Ala Trp Val

100 105 110

Phe Ser Asn Ala Thr Cys Lys Leu Leu Lys Gly Ile Tyr Ala Ile Asn

115 120 125

Phe Asn Cys Gly Met Leu Leu Leu Thr Cys Ile Ser Met Asp Arg Tyr

130 135 140

Ile Ala Ile Val Gln Ala Thr Lys Ser Phe Arg Leu Arg Ser Arg Thr

145 150 155 160

Leu Pro Arg Ser Lys Ile Ile Cys Leu Val Val Trp Gly Leu Ser Val

165 170 175

Ile Ile Ser Ser Ser Thr Phe Val Phe Asn Gln Lys Tyr Asn Thr Gln

180 185 190

Gly Ser Asp Val Cys Glu Pro Lys Tyr Gln Thr Val Ser Glu Pro Ile

195 200 205

Arg Trp Lys Leu Leu Met Leu Gly Leu Glu Leu Leu Phe Gly Phe Phe

210 215 220

Ile Pro Leu Met Phe Met Ile Phe Cys Tyr Thr Phe Ile Val Lys Thr

225 230 235 240

Leu Val Gln Ala Gln Asn Ser Lys Arg His Lys Ala Ile Arg Val Ile

245 250 255

Ile Ala Val Val Leu Val Phe Leu Ala Cys Gln Ile Pro His Asn Met

260 265 270

Val Leu Leu Val Thr Ala Ala Asn Leu Gly Lys Met Asn Arg Ser Cys

275 280 285

Gln Ser Glu Lys Leu Ile Gly Tyr Thr Lys Thr Val Thr Glu Val Leu

290 295 300

Ala Phe Leu His Cys Cys Leu Asn Pro Val Leu Tyr Ala Phe Ile Gly

305 310 315 320

Gln Lys Phe Arg Asn Tyr Phe Leu Lys Ile Leu Lys Asp Leu Trp Cys

325 330 335

Val Arg Arg Lys Tyr Lys Ser Ser Gly Phe Ser Cys Ala Gly Arg Tyr

340 345 350

Ser Glu Asn Ile Ser Arg Gln Thr Ser Glu Thr Ala Asp Asn Asp Asn

355 360 365

Ala Ser Ser Phe Thr Met

370

<210> 5

<211> 851

<212> DNA

<213> 智人

<400> 5

agaatataac agcactccca aagaactggg tactcaacac tgagcagatc tgttctttga 60

gctaaaaacc atgtgctgta ccaagagttt gctcctggct gctttgatgt cagtgctgct 120

actccacctc tgcggcgaat cagaagcagc aagcaacttt gactgctgtc ttggatacac 180

agaccgtatt cttcatccta aatttattgt gggcttcaca cggcagctgg ccaatgaagg 240

ctgtgacatc aatgctatca tctttcacac aaagaaaaag ttgtctgtgt gcgcaaatcc 300

aaaacagact tgggtgaaat atattgtgcg tctcctcagt aaaaaagtca agaacatgta 360

aaaactgtgg cttttctgga atggaattgg acatagccca agaacagaaa gaaccttgct 420

ggggttggag gtttcacttg cacatcatgg agggtttagt gcttatctaa tttgtgcctc 480

actggacttg tccaattaat gaagttgatt catattgcat catagtttgc tttgtttaag 540

catcacatta aagttaaact gtattttatg ttatttatag ctgtaggttt tctgtgttta 600

gctatttaat actaattttc cataagctat tttggtttag tgcaaagtat aaaattatat 660

ttggggggga ataagattat atggactttc ttgcaagcaa caagctattt tttaaaaaaa 720

actatttaac attcttttgt ttatattgtt ttgtctccta aattgttgta attgcattat 780

aaaataagaa aaatattaat aagacaaata ttgaaaataa agaaacaaaa agttcttctg 840

ttaaaaaaaa a 851

<210> 6

<211> 96

<212> PRT

<213> 智人

<400> 6

Met Cys Cys Thr Lys Ser Leu Leu Leu Ala Ala Leu Met Ser Val Leu

1 5 10 15

Leu Leu His Leu Cys Gly Glu Ser Glu Ala Ala Ser Asn Phe Asp Cys

20 25 30

Cys Leu Gly Tyr Thr Asp Arg Ile Leu His Pro Lys Phe Ile Val Gly

35 40 45

Phe Thr Arg Gln Leu Ala Asn Glu Gly Cys Asp Ile Asn Ala Ile Ile

50 55 60

Phe His Thr Lys Lys Lys Leu Ser Val Cys Ala Asn Pro Lys Gln Thr

65 70 75 80

Trp Val Lys Tyr Ile Val Arg Leu Leu Ser Lys Lys Val Lys Asn Met

85 90 95

<210> 7

<211> 848

<212> DNA

<213> 智人

<400> 7

agaatataac agcactccca aagaactggg tactcaacac tgagcagatc tgttctttga 60

gctaaaaacc atgtgctgta ccaagagttt gctcctggct gctttgatgt cagtgctgct 120

actccacctc tgcggcgaat cagaagcaag caactttgac tgctgtcttg gatacacaga 180

ccgtattctt catcctaaat ttattgtggg cttcacacgg cagctggcca atgaaggctg 240

tgacatcaat gctatcatct ttcacacaaa gaaaaagttg tctgtgtgcg caaatccaaa 300

acagacttgg gtgaaatata ttgtgcgtct cctcagtaaa aaagtcaaga acatgtaaaa 360

actgtggctt ttctggaatg gaattggaca tagcccaaga acagaaagaa ccttgctggg 420

gttggaggtt tcacttgcac atcatggagg gtttagtgct tatctaattt gtgcctcact 480

ggacttgtcc aattaatgaa gttgattcat attgcatcat agtttgcttt gtttaagcat 540

cacattaaag ttaaactgta ttttatgtta tttatagctg taggttttct gtgtttagct 600

atttaatact aattttccat aagctatttt ggtttagtgc aaagtataaa attatatttg 660

ggggggaata agattatatg gactttcttg caagcaacaa gctatttttt aaaaaaaact 720

atttaacatt cttttgttta tattgttttg tctcctaaat tgttgtaatt gcattataaa 780

ataagaaaaa tattaataag acaaatattg aaaataaaga aacaaaaagt tcttctgtta 840

aaaaaaaa 848

<210> 8

<211> 95

<212> PRT

<213> 智人

<400> 8

Met Cys Cys Thr Lys Ser Leu Leu Leu Ala Ala Leu Met Ser Val Leu

1 5 10 15

Leu Leu His Leu Cys Gly Glu Ser Glu Ala Ser Asn Phe Asp Cys Cys

20 25 30

Leu Gly Tyr Thr Asp Arg Ile Leu His Pro Lys Phe Ile Val Gly Phe

35 40 45

Thr Arg Gln Leu Ala Asn Glu Gly Cys Asp Ile Asn Ala Ile Ile Phe

50 55 60

His Thr Lys Lys Lys Leu Ser Val Cys Ala Asn Pro Lys Gln Thr Trp

65 70 75 80

Val Lys Tyr Ile Val Arg Leu Leu Ser Lys Lys Val Lys Asn Met

85 90 95

Claims

1.一种用于抑制癌症干细胞(CSC)增殖的方法，该方法包括以有效抑制该CSC增殖和/或减少该CSC存活的量使该CSC与CCL20的抑制剂、CCR6的抑制剂或其组合接触。

2.如权利要求1所述的方法，其中该CSC表达CCL20。

3.如权利要求1所述的方法，其中该CSC表达CCR6。

4.如权利要求1所述的方法，其中该CSC是形成球体的CSC。

5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该CSC来自选自下组的癌症，该组由以下各项组成：结直肠癌、胰腺癌、肺癌、头颈癌、胃癌、肝细胞癌和乳腺癌。

6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该抑制剂选自下组，该组由以下各项组成：结合CCL20的抗体、结合CCR6的抗体、CCL20的小分子抑制剂、CCR6的小分子抑制剂、与编码CCL20的核酸杂交的siRNA以及与编码CCR6的核酸杂交的siRNA。

7.一种用于在先前已经接受疗法并且需要治疗的受试者中对耐治疗性癌症进行治疗的方法，该方法包括以有效抑制或杀死存在于该耐治疗性癌症中的癌症干细胞(CSC)和/或诱导CSC的分化的量向该受试者给予CCL20的抑制剂、CCR6的抑制剂或其组合。

8.一种用于在先前已经接受疗法并且需要治疗的受试者中对耐治疗性癌症进行治疗的方法，该方法包括以有效治疗该耐治疗性癌症的量向该受试者给予CCL20的抑制剂、CCR6的抑制剂或其组合。

9.如权利要求7或8所述的方法，其中该CSC表达CCL20。

10.如权利要求7或8所述的方法，其中该CSC表达CCR6。

11.如权利要求7或8所述的方法，其中该CSC包括形成球体的CSC。

12.如权利要求7至11中任一项所述的方法，其中该CSC来自选自下组的癌症，该组由以下各项组成：结直肠癌、胰腺癌、肺癌、头颈癌、胃癌、肝细胞癌和乳腺癌。

13.如权利要求7至12中任一项所述的方法，其中该抑制剂选自下组，该组由以下各项组成：结合CCL20的抗体、结合CCR6的抗体、CCL20的小分子抑制剂、CCR6的小分子抑制剂、与编码CCL20的核酸杂交的siRNA以及与编码CCR6的核酸杂交的siRNA。

14.一种用于治疗包括癌症干细胞(CSC)的癌症的方法，该方法包括以有效抑制或杀死该癌症中的CSC和/或诱导CSC的分化的量向需要治疗的受试者给予CCL20的抑制剂、CCR6的抑制剂或其组合。

15.一种用于治疗包括癌症干细胞(CSC)的癌症的方法，该方法包括以有效治疗该癌症的量向需要治疗的受试者给予CCL20的抑制剂、CCR6的抑制剂或其组合。

16.如权利要求14或15所述的方法，其中该CSC表达CCL20。

17.如权利要求14或15所述的方法，其中该CSC表达CCR6。

18.如权利要求14或15所述的方法，其中该CSC包括形成球体的CSC。

19.如权利要求14至18中任一项所述的方法，其中该CSC来自选自下组的癌症，该组由以下各项组成：结直肠癌、胰腺癌、肺癌、头颈癌、胃癌、肝细胞癌和乳腺癌。

20.如权利要求14至19中任一项所述的方法，其中该抑制剂选自下组，该组由以下各项组成：结合CCL20的抗体、结合CCR6的抗体、CCL20的小分子抑制剂、CCR6的小分子抑制剂、与编码CCL20的核酸杂交的siRNA以及与编码CCR6的核酸杂交的siRNA。

21.一种用于在患有重现或复发的癌症的受试者中治疗癌症的方法，该方法包括以有效抑制或杀死该癌症中的CSC和/或诱导CSC的分化的量向受试者给予CCL20的抑制剂、CCR6的抑制剂或其组合。

22.一种用于在患有重现或复发的癌症的受试者中治疗癌症的方法，该方法包括以有效治疗该癌症的量向受试者给予CCL20的抑制剂、CCR6的抑制剂或其组合。

23.如权利要求21或22所述的方法，其中该CSC表达CCL20。

24.如权利要求21或22所述的方法，其中该CSC表达CCR6。

25.如权利要求21或22所述的方法，其中该CSC包括形成球体的CSC。

26.如权利要求21至25中任一项所述的方法，其中该CSC来自选自下组的癌症，该组由以下各项组成：结直肠癌、胰腺癌、肺癌、头颈癌、胃癌、肝细胞癌和乳腺癌。

27.如权利要求21至25中任一项所述的方法，其中该抑制剂选自下组，该组由以下各项组成：结合CCL20的抗体、结合CCR6的抗体、CCL20的小分子抑制剂、CCR6的小分子抑制剂、与编码CCL20的核酸杂交的siRNA以及与编码CCR6的核酸杂交的siRNA。

28.一种用于预防癌症重现或复发的方法，该方法包括以有效预防癌症重现或复发的量向需要预防癌症重现或复发的受试者给予CCL20的抑制剂、CCR6的抑制剂或其组合。

29.如权利要求28所述的方法，其中该癌症包括癌症干细胞(CSC)。

30.如权利要求29所述的方法，其中该CSC表达CCL20。

31.如权利要求29所述的方法，其中该CSC表达CCR6。

32.如权利要求29所述的方法，其中该CSC包括形成球体的CSC。

33.如权利要求29至32中任一项所述的方法，其中该CSC来自选自下组的癌症，该组由以下各项组成：结直肠癌、胰腺癌、肺癌、头颈癌、胃癌、肝细胞癌和乳腺癌。

34.如权利要求28至33中任一项所述的方法，其中该抑制剂选自下组，该组由以下各项组成：结合CCL20的抗体、结合CCR6的抗体、CCL20的小分子抑制剂、CCR6的小分子抑制剂、与编码CCL20的核酸杂交的siRNA以及与编码CCR6的核酸杂交的siRNA。

35.一种用于降低患有癌症的受试者的癌症复发风险的方法，该方法包括以有效抑制或杀死该癌症中的CSC和/或诱导CSC的分化的量向该受试者给予CCL20的抑制剂、CCR6的抑制剂或其组合，从而降低该受试者中癌症复发的风险。

36.如权利要求35所述的方法，其中该CSC表达CCL20。

37.如权利要求35所述的方法，其中该CSC表达CCR6。

38.如权利要求35所述的方法，其中该CSC包括形成球体的CSC。

39.如权利要求35至38中任一项所述的方法，其中该CSC来自选自下组的癌症，该组由以下各项组成：结直肠癌、胰腺癌、肺癌、头颈癌、胃癌、肝细胞癌和乳腺癌。

40.如权利要求35至39中任一项所述的方法，其中该抑制剂选自下组，该组由以下各项组成：结合CCL20的抗体、结合CCR6的抗体、CCL20的小分子抑制剂、CCR6的小分子抑制剂、与编码CCL20的核酸杂交的siRNA以及与编码CCR6的核酸杂交的siRNA。

41.一种消除癌症干细胞(CSC)的方法，该方法包括使该CSC与CCL20的抑制剂、CCR6的抑制剂或其组合接触。

42.如权利要求41所述的方法，其中该CSC表达CCL20。

43.如权利要求41所述的方法，其中该CSC表达CCR6。

44.如权利要求41所述的方法，其中该CSC是形成球体的CSC。

45.如权利要求41至44中任一项所述的方法，其中该CSC来自选自下组的癌症，该组由以下各项组成：结直肠癌、胰腺癌、肺癌、头颈癌、胃癌、肝细胞癌和乳腺癌。

46.如权利要求41至45中任一项所述的方法，其中该抑制剂选自下组，该组由以下各项组成：结合CCL20的抗体、结合CCR6的抗体、CCL20的小分子抑制剂、CCR6的小分子抑制剂、与编码CCL20的核酸杂交的siRNA以及与编码CCR6的核酸杂交的siRNA。

47.CCL20的抑制剂、CCR6的抑制剂或其组合以有效抑制或杀死癌症中的癌症干细胞(CSC)和/或降低CSC自我更新和扩增能力的量在组合物中的用途。

48.如权利要求47所述的用途，其中该CSC表达CCL20。

49.如权利要求47所述的用途，其中该CSC表达CCR6。

50.如权利要求47所述的用途，其中该CSC包括形成球体的CSC。

51.如权利要求47至50中任一项所述的用途，其中该CSC来自选自下组的癌症，该组由以下各项组成：结直肠癌、胰腺癌、肺癌、头颈癌、胃癌、肝细胞癌和乳腺癌。

52.如权利要求47至51中任一项所述的用途，其中该抑制剂选自下组，该组由以下各项组成：结合CCL20的抗体、结合CCR6的抗体、CCL20的小分子抑制剂、CCR6的小分子抑制剂、与编码CCL20的核酸杂交的siRNA以及与编码CCR6的核酸杂交的siRNA。

53.一种在包括癌细胞的样品中确定癌症干细胞(CSC)的存在的方法，该方法包括：

54.如权利要求53所述的方法，该方法进一步包括量化该样品中的该CCL20核酸序列或该CCL20氨基酸序列的量，将该CCL20核酸序列或该CCL20氨基酸序列的量与CCL20核酸或CCL20氨基酸的参考水平进行比较，并且当检测到的量大于该参考水平时，鉴定该样品中存在该CSC。

55.如权利要求53或54所述的方法，其中该药剂进一步包括可检测部分。

56.如权利要求53或54所述的方法，其中该药剂包括在严格杂交条件下与CCL20核酸序列杂交的核酸序列。

57.如权利要求53或54所述的方法，其中该药剂包括特异性地结合该CCL20氨基酸序列的抗体。

58.一种选择性地减少癌细胞群中的癌症干细胞(CSC)的数目的方法，该方法包括使该癌细胞群与处于有效抑制或杀死该癌细胞群中的该CSC和/或诱导CSC的分化的量的CCL20的抑制剂、CCR6的抑制剂或其组合接触。

59.如权利要求58所述的方法，其中该CSC表达CCL20。

60.如权利要求58所述的方法，其中该CSC表达CCR6。

61.如权利要求58所述的方法，其中该CSC包括形成球体的CSC。

62.如权利要求58至61中任一项所述的方法，其中该CSC来自选自下组的癌症，该组由以下各项组成：结直肠癌、胰腺癌、肺癌、头颈癌、胃癌、肝细胞癌和乳腺癌。

63.如权利要求58至62中任一项所述的方法，其中该抑制剂选自下组，该组由以下各项组成：结合CCL20的抗体、结合CCR6的抗体、CCL20的小分子抑制剂、CCR6的小分子抑制剂、与编码CCL20的核酸杂交的siRNA以及与编码CCR6的核酸杂交的siRNA。

64.一种用于减少或抑制肿瘤生长的方法，该方法包括使该肿瘤与有效减少或抑制肿瘤生长的量的CCL20的抑制剂、CCR6的抑制剂或其组合接触。

65.如权利要求64所述的方法，其中该肿瘤表达CCL20。

66.如权利要求64所述的方法，其中该肿瘤表达CCR6。

67.如权利要求64所述的方法，其中该肿瘤包括形成球体的CSC。

68.如权利要求64至67中任一项所述的方法，其中该肿瘤来自选自下组的癌症，该组由以下各项组成：结直肠癌、胰腺癌、肺癌、头颈癌、胃癌、肝细胞癌和乳腺癌。

69.如权利要求64至68中任一项所述的方法，其中该抑制剂选自下组，该组由以下各项组成：结合CCL20的抗体、结合CCR6的抗体、CCL20的小分子抑制剂、CCR6的小分子抑制剂、与编码CCL20的核酸杂交的siRNA以及与编码CCR6的核酸杂交的siRNA。

70.一种用于减小肿瘤大小的方法，该方法包括使该肿瘤与有效减小肿瘤大小的量的CCL20的抑制剂、CCR6的抑制剂或其组合接触。

71.如权利要求70所述的方法，其中该肿瘤表达CCL20。

72.如权利要求70所述的方法，其中该肿瘤表达CCR6。

73.如权利要求70所述的方法，其中该肿瘤包括形成球体的CSC。

74.如权利要求70至73中任一项所述的方法，其中该肿瘤来自选自下组的癌症，该组由以下各项组成：结直肠癌、胰腺癌、肺癌、头颈癌、胃癌、肝细胞癌和乳腺癌。

75.如权利要求70至74中任一项所述的方法，其中该抑制剂选自下组，该组由以下各项组成：结合CCL20的抗体、结合CCR6的抗体、CCL20的小分子抑制剂、CCR6的小分子抑制剂、与编码CCL20的核酸杂交的siRNA以及与编码CCR6的核酸杂交的siRNA。

76.一种用于减少或抑制患者中的肿瘤生长的方法，该方法包括以有效减少或抑制肿瘤生长的量向该患者给予CCL20的抑制剂、CCR6的抑制剂或其组合。

77.如权利要求76所述的方法，其中该肿瘤表达CCL20。

78.如权利要求76所述的方法，其中该肿瘤表达CCR6。

79.如权利要求76所述的方法，其中该肿瘤包括形成球体的CSC。

80.如权利要求76至79中任一项所述的方法，其中该肿瘤来自选自下组的癌症，该组由以下各项组成：结直肠癌、胰腺癌、肺癌、头颈癌、胃癌、肝细胞癌和乳腺癌。

81.如权利要求76至80中任一项所述的方法，其中该抑制剂选自下组，该组由以下各项组成：结合CCL20的抗体、结合CCR6的抗体、CCL20的小分子抑制剂、CCR6的小分子抑制剂、与编码CCL20的核酸杂交的siRNA以及与编码CCR6的核酸杂交的siRNA。

82.一种用于减小患者肿瘤大小的方法，该方法包括以有效减小肿瘤大小的量向该患者给予CCL20的抑制剂、CCR6的抑制剂或其组合。

83.如权利要求82所述的方法，其中该肿瘤表达CCL20。

84.如权利要求82所述的方法，其中该肿瘤表达CCR6。

85.如权利要求82所述的方法，其中该肿瘤包括形成球体的CSC。

86.如权利要求82至85中任一项所述的方法，其中该肿瘤来自选自下组的癌症，该组由以下各项组成：结直肠癌、胰腺癌、肺癌、头颈癌、胃癌、肝细胞癌和乳腺癌。

87.如权利要求82至86中任一项所述的方法，其中该抑制剂选自下组，该组由以下各项组成：结合CCL20的抗体、结合CCR6的抗体、CCL20的小分子抑制剂、CCR6的小分子抑制剂、与编码CCL20的核酸杂交的siRNA以及与编码CCR6的核酸杂交的siRNA。

88.一种用于抑制、减少或预防患者中的肿瘤侵袭或转移的方法，该方法包括以有效抑制、减少或预防肿瘤侵袭或转移的量向该患者给予CCL20的抑制剂、CCR6的抑制剂或其组合。

89.如权利要求88所述的方法，其中该肿瘤表达CCL20。

90.如权利要求88所述的方法，其中该肿瘤表达CCR6。

91.如权利要求88所述的方法，其中该肿瘤包括形成球体的CSC。

92.如权利要求88至91中任一项所述的方法，其中该肿瘤来自选自下组的癌症，该组由以下各项组成：结直肠癌、胰腺癌、肺癌、头颈癌、胃癌、肝细胞癌和乳腺癌。

93.如权利要求84至92中任一项所述的方法，其中该抑制剂选自下组，该组由以下各项组成：结合CCL20的抗体、结合CCR6的抗体、CCL20的小分子抑制剂、CCR6的小分子抑制剂、与编码CCL20的核酸杂交的siRNA以及与编码CCR6的核酸杂交的siRNA。