ES2871252T3 - Método para detectar células madre cancerosas - Google Patents

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Abstract

Un método para determinar la presencia de una célula madre cancerosa (CSC) en una muestra que comprende células cancerosas, comprendiendo el método: - poner en contacto la muestra con un agente que se una a una secuencia de ácido nucleico de CCL20 o a una secuencia de aminoácidos de CCL20; - detectar la presencia o la ausencia de la unión entre el agente y la secuencia de ácido nucleico de CCL20 o la secuencia de aminoácidos de CCL20; e - identificar la presencia de la CSC en la muestra tras la detección de la unión entre el agente y la secuencia de ácido nucleico de CCL20 o la secuencia de aminoácidos de CCL20.

Description

DESCRIPCIÓN
Método para detectar células madre cancerosas
ANTECEDENTES
Las células madre cancerosas (CSC, por sus siglas en inglés), tal como implica su nombre, son un subconjunto de células cancerosas con características de tipo células madre de pluripotencia y autorrenovación ilimitada. Como tal, se cree que esta subpoblación de células es responsable de la formación de tumores y de la adaptación a su ambiente. Actualmente, varias líneas de evidencias indican que las CSC probablemente sean responsables de la resistencia a los fármacos, de la metástasis y de la recaída del cáncer, en particular, en casos con la enfermedad residual mínima. De hecho, las recientes evidencias clínicas demostraron que la fracción de células de cáncer de mama que sobrevivió tras la terapia habitual estaba enriquecida en células que llevaban las características distintivas de las CSC (Creighton et al., 2009). En un estudio similar, se descubrió que los pacientes con una deleción 5q MDS tenían poblaciones residuales de células madre malignas en su médula ósea, a pesar de haber entrado en remisión clínica y citogenética (Tehranchi et al., 2010). En muchas indicaciones clínicas, actualmente se cree que a pesar de la respuesta terapéutica inicial, la retención de un subconjunto distinto de células cancerosas resistentes puede llevar a la recaída y a una posible metástasis.
Desde su identificación inicial, las células madre cancerosas se han descubierto y validado en muchos tipos tumorales. Tras la identificación original de una CSC en un modelo de LMA (Lapidot et al., 1994), las CSC se descubrieron y se validaron en una serie de neoplasias hematológicas y de tumores sólidos. La primera evidencia de CSC en tumores sólidos provino del cáncer de mama, en donde se descubrió que las CSC portaban un fenotipo de marcador de superficie CD44+/CD24-(Al-Hajj et al., 2003). Las CSC en el cáncer de páncreas también se han caracterizado bien. Si bien varios informes identifican las CSC pancreáticas como Epcam+/CD44+/CD24+ (Li et al., 2007) o CD133+ (Hermann et al., 2007), en manos de los inventores, los rastros característicos de Epcam+/CD44+/CD24+ triple positivas son mejores con el fenotipo tumorigénico de una CSC (van Vlerken et al., 2013). Una serie de informes identifican las CSC en cáncer colorrectal, y la investigación ha identificado un origen de células madre en el ratón para tumores intestinales y colorrectales (Barker et al., 2009). En cualquier caso, el estado de la técnica en este campo no ha alcanzado un consenso en relación con el fenotipo del marcador de superficie para las CSC colorrectales humanas. Aunque se han documentado muchos marcadores de superficie, tales como CD66 (Gemei et al., 2013), LGR5 (Hirsch et al., 2014) y CD44 y CD133 (Wang et al., 2012), el campo carece de cualquier confirmación firme de que cualquiera de estos fenotipos de marcadores de superficie puede representar un consenso para las CSC colorrectales humanas, lo que permite que otras técnicas tales como crecimiento en esferas no adherentes (por ejemplo, coloesferas para las CSC colorrectales) encuentren su uso común en la identificación de la presencia de CSC.
Los fármacos que se dirigen hacia las CSC están apareciendo como un componente importante de cualquier terapia exitosa contra el cáncer. La investigación actual está demostrando que las CSC son responsables de la quimiorresistencia, la metástasis, y en última instancia, la recaída del cáncer, incluso después de una intervención terapéutica inicial exitosa. Aunque las c Sc se rigen por las mismas vías principales de autorrenovación que rigen la pluripotencia de las células madre embrionarias, el conocimiento de otras vías celulares que rigen la actividad de las CSC es aún limitado.
El documento US 2007/0099209 describe perfiles de expresión génica asociados con células madre de tumores sólidos.
La disponibilidad de composiciones y métodos adicionales para el tratamiento de los cánceres, incluyendo los métodos para reducir la tumorigenicidad del cáncer e inhibir o matar células cancerosas, tales como células madre cancerosas (por ejemplo, inducir apoptosis o diferenciación), permitiría más opciones terapéuticas y conservaría la posibilidad de mejores resultados clínicos tales como la remisión de la enfermedad y/o la mejora de la calidad de vida del paciente.
SUMARIO DE LA DIVULGACIÓN
La divulgación proporciona métodos para el diagnóstico, el pronóstico, la cuantificación, la identificación y/o la detección de la presencia de una célula madre cancerosa (CSC) en una muestra que comprende células cancerosas, en donde el método comprende:
poner en contacto la muestra con un agente que se una a una secuencia de ácido nucleico de CCL20 o a una secuencia de aminoácidos de CCL20;
detectar la presencia o la ausencia de la unión entre el agente y la secuencia de ácido nucleico de CCL20 o la secuencia de aminoácidos de CCL20; e
identificar la presencia de la CSC en la muestra tras la detección de la unión entre el agente y la secuencia de ácido nucleico de CCL20 o la secuencia de aminoácidos de CCL20.
En realizaciones de este aspecto, el método puede comprender además uno o más de:
cuantificar la cantidad de la secuencia de ácido nucleico de CCL20 o de la secuencia de aminoácidos de CCL20 en la muestra;
comparar la cantidad de la secuencia de ácido nucleico de CCL20 o de la secuencia de aminoácidos de CCL20 con un nivel de referencia de ácido nucleico de CCL20 o de aminoácidos de CCL20; y/o
identificar la presencia de la CSC en la muestra cuando la cantidad detectada es mayor que la del nivel de referencia.
En otras realizaciones adicionales más, el método puede comprender un agente que comprende un resto detectable. En algunas realizaciones, el agente puede comprender una secuencia de ácido nucleico que hibrida con al menos una porción de la secuencia de ácido nucleico de CCL20 en condiciones rigurosas de hibridación. En algunas realizaciones, el agente puede comprender un anticuerpo que se une específicamente al menos a una porción de la secuencia de aminoácidos de CCL20.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Para el fin de ilustrar la divulgación, se representan en los dibujos ciertos aspectos de la divulgación.
La Figura 1A-1E muestra que se ha descubierto que las CSC tienen una elevada expresión de CCL20 sobre las no CSC. El cultivo de esferas enriquecido en c Sc promueve la secreción de CCL20 en comparación con el cultivo en monocapa convencional en 4 de 8 líneas de cáncer de mama (A), 2 de 4 líneas de cáncer de páncreas (B) y 6 de 7 líneas de cáncer colorrectal (C) probadas. Los niveles de CCL20 se midieron en picogramos/mililitros (pg/ml) a partir de medio acondicionado de células después de 4 días en cultivo por ELISA y los niveles de CCL20 en pg/ml se convirtieron posteriormente en múltiplo de variación en comparación con las células cultivadas en monocapa de la misma línea. Las CSC CD44high/+ CD24low/- aisladas de 2 líneas de cáncer de mama (MDAMB468 y HCC1937) tienen niveles de ARNm de CCL20 elevados en comparación con las no CSC CD44low/- CD24low/- aisladas de las mismas líneas (D). De manera similar, las CSC aisladas de 1 modelo de xenoinjerto derivado de pacientes (PDX) de mama (b R_PDX_1) y de 2 de páncreas (PA_PDX_1 y PA_PDX_2) también revelan elevados niveles de ARNm de CCl20 en comparación con las no CSC aisladas de la misma línea (E). Las CSC para los modelos PDX de mama se identificaron como Epcam+ CD44+ CD24-, y para los modelos PDX de páncreas como Epcam+ CD44+ CD24+, mientras que las no CSC de PDX de mama fueron Epcam+ CD44- c D24-, y las no CSC de páncreas fueron Epcam- CD44- CD24-. Para los paneles A-C, n = 3 réplicas biológicas/afección/línea celular; ***, ** y * indican significación estadística de p<0,001, p<0,01 y p<0,05 respectivamente, entre cultivo en esferas y en monocapa tal como se determina mediante la prueba de la t. Para los paneles D y E, n = 2 réplicas técnicas/afección/línea celular. ER = expresión relativa de valores Ct normalizados al ARN ribosómico 18S y expresados en comparación con los niveles de no CSC.
La Figura 2 muestra la secreción de CCL20 en cultivo en esferas. La media ± EEM para los niveles de CCL20 medidos en medio acondicionado de células cultivadas en esferas recogidas el día 4. Los niveles absolutos de CCL20 se midieron mediante ELISA en relación con una curva estándar. N = 3 réplicas biológicas/línea celular.
La Figura 3A-3F muestra que las CSC se colocalizar directamente con un fenotipo CCL20+. Las CSC del cultivo en monocapa para el modelo de páncreas Bxpc3 se identifican como Epcam+ CD44high CD24high por citometría de flujo (A), mientras que las CSC de mama del modelo HHC1937 en monocapa se identifican como CD44high CD24-(D). Tanto en Bxpec3 (B) como en HCC1937 (E), se descubrió que las CSC tenían una expresión de CCL20 1,5 veces mayor que el promedio de la población de células tumorales totales (tumor total) tal como se determina mediante la intensidad de fluorescencia media (Mediana: Comp-APC A) de anti-CCL20 marcado con APC. Además, tanto en Bxpc3 (C) como en HCC1937 (F) las CSC, representadas como puntos negros, parecen solaparse predominantemente con una población de células CCL20+ CCR6+ tal como se determina mediante citometría de flujo multicolor. La dispersión de las células tumorales totales se representa como puntos grises para la comparación.
La Figura 4A-4F ilustra que el cultivo en esferas enriquecido en CSC provoca una expansión espectacular de la población CCL20+CCR6+. La frecuencia de CCL20+CCR6+ aumenta drásticamente en los modelos de cáncer de páncreas Bxpc3 (A, B) y Panc1 (C, D) cuando las células se cultivan en condiciones de formación de esferas (B, D) en comparación con el cultivo en monocapa (A, C) tal como se determina mediante citometría de flujo multicolor. Además, las CSC de páncreas identificadas del cultivo en esferas como Epcam+CD44+CD24+, representadas como puntos negros, se superponen predominantemente con la población de CCL20+CCR6+ en los modelos Bxpc3 (E) y Panc1 (F). La dispersión de las células tumorales totales se representa como puntos grises para la comparación.
La Figura 5A-5D muestra que la adición de CCL20 purificado al cultivo refuerza el crecimiento de esferas enriquecidas en CSC, pero no de células cultivadas en monocapa estándar. Los modelos de cáncer de páncreas Bxpc3 (A), cáncer de páncreas Aspc1 (B) y cáncer de mama SUM159 (C) se estimularon con CCL20 humano recombinante (rhCCL20) a 0, 25, 50, 100 y 200 pg/ml durante 4 días en cultivo en esfera o en monocapa, por lo que CCL20 se dosificó en el momento de la colocación en placa. Las células BT549 (D) representan que la potenciación de CCL20 en el crecimiento en esferas se ve con CCL20 de 2 fuentes comerciales separadas, R&D systems (CCL20 A) y Life Technologies (CCL20 B), ambos dosificados a 50 pg/ml. La especificidad de CCL20 en la mediación de esta estimulación del crecimiento se confirmó cuando la adición de un anticuerpo monoclonal anti-CCL20 a 15 |jg/ml anuló este efecto tanto para CCL20 A como para CCL20 B (D). n = 5 réplicas biológicas/tratamiento/línea celular. ***, ** y * indican significación estadística de p<0,001, p<0,01 y p<0,05 respectivamente, entre cultivo en esferas y en monocapa a concentraciones coincidentes de CCL20 tal como se determina mediante la prueba de la t. ## y # indican significación estadística de p<0,01 y p<0,05 respectivamente, entre esferas basales y estimuladas con CCL20, y A indica significación estadística de p<0,05 entre células estimuladas con CCL20 con y sin adición de anti-CCL20, tal como se determina mediante ANOVA de 1 vía con las comparaciones múltiples de Tukey.
La Figura 6A-6D muestra que la estimulación de células de cáncer con CCL20 refuerza directamente la frecuencia de las CSC en cultivo. La adición de 200 pg/ml de CCL20 humano recombinante en cultivo en esferas aumenta directamente el porcentaje de CSC después de 4 días en modelos de cáncer de mama y de páncreas, visto en (A) células de cáncer de mama MDAMB468, caracterizadas como CD44+ CD24-, (B) cáncer de páncreas Bxpc3 y (C) en células de cáncer de páncreas Aspcl, ambos caracterizados como Epcamhigh CD44high CD24high. Las esferas de Bxpc3 estimuladas durante 4 días con 200 pg/ml muestran un correspondiente aumento en los genes de características de células madre, NANOG, SOX2, OCT3/4, BMI1 y EZH2 (D). Paneles A-C, n = 3 réplicas biológicas/tratamiento/línea celular. * indica significación estadística de p<0,05 entre células tratadas con o sin CCL20 tal como se determina mediante la prueba de la t unilateral. Panel D, n = 2 réplicas técnicas/tratamiento; ER = expresión relativa de valores Ct normalizados al ARN ribosómico 18S y expresados en comparación con los niveles de -CCL20.
La Figura 7A-7C muestra que la estimulación de esferas con CCL20 induce la expresión de los genes de las características de células madre. La expresión relativa (ER) de los genes de las características de células madre NANOG, SOX2, OCT3/4, EZH2 y BMI1 en esferas de Hs578T (A), Pancl (B) y SUM159 (C) tratadas durante 4 días con 100 pg/ml de CCL20 humano recombinante (+ CCL20) en comparación con las esferas no tratadas (-CCL20). ER = expresión relativa de valores Ct normalizados al ARN ribosómico 18S y expresados en comparación con los niveles de -CCL20. N = 2 réplicas técnicas/tratamiento/línea celular.
La Figura 8A-8D muestra que CCL20 regula las CSC mediante señalización a través de su receptor CCR6. (A) el CCL20 humano recombinante (rhCCL20) pierde la capacidad para estimular el crecimiento en esferas mediante 4 días después de la iniciación del tratamiento en células de cáncer colorrectal Lovo tras la inactivación génica de CCR6 con ARNip 20 nM, mientras que las células transfectadas con ARNip de control sin diana (20 nM) conservaron su respuesta de crecimiento para CCL20. (B) las células CCR6+ muestran un aumento en los genes de las características de células madre 48 horas después de la estimulación con CCL20 (100 pg/ml) en comparación con las células CCR6- aisladas del modelo de cáncer colorrectal NCIH508. (C-D) La inhibición del eje CCL20-CCR6, bien por inactivación génica de CCL20 o CCR6 (ARNip 20 nM) dio como resultado un nivel similar de inhibición de crecimiento en esferas de células de cáncer colorrectal NCIH508 (C) y células de cáncer de mama Hs578T (D) en comparación con el tratamiento con ARNip de control (20 nM). Panel A, n = 5 réplicas biológicas/afección. ***, ** y * indican significación estadística de p<0,001, p<0,01 y p<0,05 respectivamente, entre células transfectadas con ARNip de control y ARNip de CCR6 a concentraciones coincidentes de CCL20 tal como se determina mediante la prueba de la t. Panel B, ER = expresión relativa de valores Ct normalizados al ARN ribosómico 18S y expresados en comparación con los niveles de CCR6\ Panel C, n = 5 réplicas biológicas/tratamiento. *** indica significación estadística de p<0,001 de ARNip de control, tal como se determina mediante ANOVA de 1 vía con comparaciones múltiples de Tukey.
La Figura 9A-9E muestra que el tratamiento con un anticuerpo monoclonal neutralizante de CCL20 reduce significativamente las CSC medidas por crecimiento en esferas y citometría de flujo. El crecimiento en esferas se reduce tras un tratamiento de 4 días con 10 jg/m l de IgG de CCL20, en comparación con el tratamiento de 10 jg/m l de IgG de control de isotipo en (A) células de cáncer de mama Hs578T, (B) células de cáncer colorrectal NCIH508, y (C) células de cáncer de páncreas Panc 1. Un tratamiento de dosis única de IgG de CCL20 de 10 jg/m l reduce el porcentaje de CSC Epcam+CD44+CD24+ de páncreas en esferas de Bxpc3 (D) y Panc1 (E) en comparación con el tratamiento de IgG de control de isotipo en la misma dosis de 10 jg/ml. Paneles A-C, n = 5 réplicas biológicas/tratamiento/línea celular. Paneles D-E, n = 3 réplicas biológicas/tratamiento/línea celular. ***, ** y * indican significación estadística de p<0,001, p<0,01 y p<0,05 entre células tratadas con IgG de control e IgG de CCL20, respectivamente, tal como se determina mediante la prueba de la t.
La Figura 10 muestra que el tratamiento con un anticuerpo monoclonal neutralizante de CCL20 inhibe significativamente la migración quimiotáctica de los linfocitos T CD4+ hacia CCL20. Los linfocitos T CD4+ se aislaron de sangre de donantes sanos y se permitió que migrasen hacia CCL20 humano recombinante 10 nM con isotipo IgG 30 nM o IgG anti-CCL20 en placas de migración de transpocillo con un filtro de policarbonato y poros de 5 jM durante 3 horas. n=3 réplicas biológicas/tratamiento/donante. ** y *** indican significación estadística de p<0,01 y p<0,001 entre isotipo IgG e IgG de CCL20, respectivamente, tal como se determina mediante la prueba de la t.
La Figura 11A-11I muestra un análisis de citometría de flujo multiparamétrico del fenotipo TR1. El 57 % de las células vivas en la población se tiñeron positivamente para CCR6 (A). De estas células CCR6+, se descubrió que el 93 % eran CD3+/CD4+ (B). De las células CD3+/CD4+, se descubrió que el 94 % eran CD25+ (C) y de estas células CD25+, se confirmó que el 85 % eran FOXP3+ (D). La selección positiva frente a negativa se determinó mediante tinción completa menos uno (FMO - ) mediante lo cual, las muestras contenían todas las tinciones en el panel menos CD3 (E), CD4 (F), CD25 (G), FoxP3 (H) o CCR6 (I).
La Figura 12A-12C muestra que los linfocitos TR1 migran hacia CCL20 secretado por las CSC. La atracción quimiotáctica de los linfocitos TR1 hacia CCL20 100 nM se determinó mediante un ensayo de migración transpocillo comparado con la migración no específica (sin CCL20) y comparado con la inhibición de la migración a través de la adición de IgG neutralizante anti-CCL20 (667 nM) (A). La concentración de CCL20 en medio acondicionado de CSC (CM de CSC) generado del cultivo de esferas de células NCIH508, se determinó mediante ELISA. Los niveles de CCL20 en medio SCM no usado se representan gráficamente mediante comparación para asegurar que el CCL20 fue producido por las CSC NCIH508 (B). La atracción quimiotáctica de linfocitos TR1 hacia CM de CSC también se determinó mediante un ensayo de migración transpocillo comparado con la migración no específica (sin CCL20) y comparado con la inhibición de la migración a través de la adición de IgG neutralizante anti-CCL20 (667 nM) o IgG de control de isotipo (667 nM). n=4 réplicas/tratamiento.
La Figura 13A-13E muestra controles de selección para los datos de citometría de flujo de Bxpc3 y HCC1937 de la FIG. 3. Se usaron tinciones completas menos uno (FMO) para definir selecciones de tinción positiva frente a negativa para cada proteína en experimentos de citometría de flujo multicolor. Las células Bxpc3 (fila superior, A-C) se tiñeron con un panel de 5 colores para Epcam, CD24, CD44, CCL20 y CCR6, mientras que las células HCC1937 (fila inferior, D-E) se tiñeron con un panel de 4 colores para todos los anteriores salvo Epcam. (A) Completa menos Epcam (FMO - Epcam) (línea discontinua, sombreado gris) en comparación con la muestra teñida por completo (línea continua, sombreado blanco). (B, D) Completa menos CD44 (FMO-CD44) se representa en gris y completa menos CD24 (FMO -CD24) se representa en verde. (C, E) Completa menos CCL20 (FMO-CCL20) se representa en negro y completo menos CCR6 (FMO-CCR6) se representa en gris.
La Figura 14A-14B muestra controles de selección para los datos de citometría de flujo de Bxpc3 y Panc1 de la FIG. 4. Las células Bxpc3 y Panc1 cultivadas en monocapa y en esfera se tiñeron con un panel de 5 colores para Epcam, CD24, CD44, CCL20 y CCR6. Para cada experimento, los controles de selección se ejecutaron en células cultivadas en monocapa. Completa menos CCL20 (FMO -CCL20) se representan en gris mientras que completa menos CCR6 (FMO -CCR6) se representa en negro, tanto para células Bxpc3 (A) como para Panc1 (B) cultivadas en monocapa.
La Figura 15A-15D muestra controles de selección para los datos de citometría de Bxpc3 y PancIflow de las FIG. 9 D, E. Las células cultivadas en esferas Bxpc3 (A, B) y Panc1 (C, D) se tiñeron con un panel de 5 colores para Epcam, CD24, CD44, CCL20 y CCR6. Para cada experimento, los controles de selección se ejecutaron en células cultivadas en monocapa. (A, C) Completa menos Epcam (FMO - Epcam) (línea discontinua, sombreado gris) en comparación con la muestra teñida por completo (línea continua, sombreado blanco). (B, D) Completa menos CD24 (FMO -CD24) se representa en negro mientras que completa menos CD44 (FMO -CD44) se representa en gris.
La Figura 16A-16B representa cómo los IgG de CCL20 neutralizan la actividad de la vía de CCR6 estimulada por CCL20 medida a través de (A) AMPc y (B) actividad de beta-arrestina. El ensayo de AMPc se realizó usando células Ad293 que sobreexpresan CCR6 humano, estimuladas con CCL201 nM y forskolina 4 mm, mientras que el ensayo de beta-arrestina se realizó usando células CHOKI que sobreexpresan CCR6 humano, estimuladas con CCL206 nM. n=2 réplicas técnicas/dosis/ensayo.
La Figura 17A-17B muestra (A) la tasa de absorción de tumores del panel (% de animales con tumores) se reduce cuando las esferas de Panc1 se pretratan con 10 ug/ml de IgG de CCL20 en comparación con las esferas de Panc1 que se pretrataron con 10 ug/ml de isotipo IgG durante 4 días in vitro antes de la inoculación del tumor, por lo que la absorción del tumor se mide desde el primer caso de formación de tumor palpable. (B) El pretratamiento de esferas Panc1 con 10 ug/ml de IgG de CCL20 antes de la inoculación lleva a un crecimiento del tumor significativamente reducido en comparación con las esferas de Panc1 pretratadas con isotipo IgG (10 ug/ml). Para el panel A, el tiempo medio hasta la absorción del tumor se determinó mediante el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier. Para el panel B, **, y * indican significación estadística de p<0,01 y p<0,05 entre tumores tratados con isotipo IgG e IgG de CCL20, respectivamente, tal como se determina mediante ANOVA de 2 vías.
La Figura 18 muestra que el IgG anti-CCL20 de ratón (clon 114908) neutraliza la actividad de la vía de CCR6 estimulada por CCL20 a través de la actividad de la beta-arrestina. Este ensayo se realizó usando células CHOKI que sobreexpresan CCR6 de ratón, estimuladas con CCL20 de ratón 1,2 nM.
La Figura 19 muestra un diagrama de citometría de flujo representativo que representa la selección y el análisis de células inmunitarias en el bazo. Las células se seleccionaron en primer lugar en cd45 como un marcador de pan-leucocito. A continuación, se identificaron los linfocitos T mediante tinción de cd3, las células dendríticas por cdllc para las células totales o cd11c/cd83 para separar las células dendríticas maduras e inmaduras, y células supresoras que provienen de los neutrófilos/granulocitos mieloides (gMDSC) mediante cd11b/ly6g. Los linfocitos T Cd3+ se subdividieron para la tinción con cd4 y cd8, y las células cd4+ se separaron después en linfocitos Treg foxp3+ o Th17 rorgt+. Todas las selecciones se determinaron por controles de FMO y se mantuvieron constantes para todas las muestras.
La Figura 20 muestra un diagrama de citometría de flujo representativo que representa la selección y el análisis de células inmunitarias en el tumor. Las células se seleccionaron en primer lugar en cd45 como un marcador de pan-leucocito. A continuación, se identificaron los linfocitos T mediante tinción de cd3, las células dendríticas por cdllc para las células totales o cd11c/cd83 para separar las células dendríticas maduras e inmaduras, y células supresoras que provienen de los neutrófilos/granulocitos mieloides (gMDSC) mediante cd11b/ly6g. Los linfocitos T Cd3+ se subdividieron para la tinción con cd4 y cd8, y las células cd4+ se separaron después en linfocitos Treg foxp3+ o Th17 rorgt+. Todas las selecciones se determinaron por controles de FMO y se mantuvieron constantes para todas las muestras.
La Figura 21A-21E muestra la frecuencia de las poblaciones de células inmunitarias en los bazos de los ratones portadores del tumor 4T1 dosificados con 10 mg por kg de IgG anti-CCL20 de ratón o IgG de control de isotipo, dos veces a la semana para 4 dosis. (A) linfocitos Treg cd3+ cd4+ foxp3+ (B) linfocitos Th17 cd3+ cd4+ rorYt+ (C) células dendríticas totales cd11b+ (D) células dendríticas inmaduras cd11b+ cd83- y (E) células dendríticas maduras cd11b+ cd83+. Todas las frecuencias celulares se representan como % de leucocitos totales (células cd45+). n=5 animales/grupo. La significación estadística se determinó mediante la prueba de la t de student bilateral.
La Figura 22A-22E muestra la frecuencia de las poblaciones de células inmunitarias en los tumores de los ratones portadores del tumor 4T1 dosificados con 10 mg por kg de IgG anti-CCL20 de ratón o IgG de control de isotipo, dos veces a la semana para 4 dosis. (A) linfocitos Treg cd3+ cd4+ foxp3+ (B) linfocitos Th17 cd3+ cd4+ rorYt+ (C) células dendríticas totales cd11b+ (D) células dendríticas inmaduras cd11b+ cd83- y (E) células dendríticas maduras cd11b+ cd83+. Todas las frecuencias celulares se representan como % de leucocitos totales (células cd45+). n=5 animales/grupo. La significación estadística se determinó mediante la prueba de la t de student bilateral.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Tal como se describe en el presente documento, los inventores proporcionan la descripción que demuestra, por primera vez, que la CCL20 se sobreexpresa por, y es funcionalmente relevante para, las CSC. Aunque algunos informes han citado una posible expresión de CCL20 en algunos cánceres, no hay informes que hayan identificado y relacionado la expresión y la función de CCL20 con ningún fenotipo de las CSC.
La divulgación incluye una descripción y una visión global del análisis de ARNm del genoma completo en CSC de mama que identificó sorprendentemente que los cambios en la expresión del gen CCL20 parecían correlacionarse directamente con el enriquecimiento o la inhibición de las CSC (van Vlerken et al., 2013). El ligando 20 de la quimiocina (motivo C-C) (CCL20) también se cita comúnmente como proteína inflamatoria del macrófago 3-alfa (MIP-3a) o quimiocina regulada por activación hepática (LARC) (Schutyser et al., 2003). CCL20 funciona normalmente como un factor quimiotáctico para el reclutamiento de linfocitos T, linfocitos B y células dendríticas inmaduras, y se produce predominantemente por células del hígado, pulmón y tracto gastrointestinal (Schutyser et al., 2003). El receptor de quimiocina 6 (CCR6) se ha identificado como el receptor para la CCL20 (Baba et al., 1997) y, hasta la fecha, aún es el único receptor funcional identificado para el ligando CCL20. A pesar de su papel en el reclutamiento de células inmunitarias, varias líneas de evidencias han sugerido una asociación para CCL20 en el cáncer. Un informe identificó CCL20 como un factor que contribuye a la patogénesis de cáncer de páncreas, mediante lo cual, los autores concluyeron un efecto directo para CCL20 en la estimulación del crecimiento del cáncer de páncreas (Kleeff et al., 1999). Aunque la identificación temprana se asoció con el cáncer de páncreas, el mayor cuerpo de evidencias hasta la fecha conecta la expresión de CCL20 con el cáncer colorrectal (Ghadjar et al., 2009). De hecho, el trabajo reciente propuso altos niveles séricos de CCL20 como un biomarcador para el mal pronóstico del cáncer colorrectal (Iwata et al., 2013). Los inventores han identificado CCL20 en modelos de cáncer de mama que se han corroborado con la evidencia externa que muestra que CCL20 puede afectar directamente a la migración y proliferación de células de cáncer de mama (Marsigliante et al., 2013). Aunque algunos informes sugieren un efecto autocrino directo del eje CCL20-CCR6 sobre las células tumorales, la mayoría de los informes proponen que la sobreexpresión de CCL20 por células tumorales sirve para promover el reclutamiento de células inmunitarias. Aunque la divulgación actual implica una función autocrina para CCL20 en las CSC, la divulgación también proporciona que la secreción de CCL20 por las CSC puede ayudar en el reclutamiento del infiltrado inmunitario en el tumor. Por ejemplo, la evidencia sugiere que los linfocitos Treg (Chen et al. 2011, Liu et al. 2011, Zhang et al. 2014) y los Th17 (Yi et al.2015) en particular serían propensos a la infiltración tumoral en respuesta a la producción de CCL20, además de linfocitos B y células dendríticas que también posiblemente se movilizan hacia CCL20 producido por las CSC.
Tal como se desvela en el presente documento, los inventores descubren un papel para el ligando 20 de la quimiocina (motivo C-C) (CCL20) en el crecimiento y la actividad de las CSC, un hallazgo que es totalmente novedoso para la biología de las CSC. La divulgación proporciona realizaciones ilustrativas que demuestran que las CSC de los modelos representativos de cáncer de mama, de páncreas y colorrectal sobreexpresan CCL20 y que, a su vez, CCL20 puede dirigir la autorrenovación de las CSC y la proliferación mediante la señalización a través de su receptor CCR6, también expresado en las CSC. La neutralización de CCL20 con un anticuerpo monoclonal tiene un efecto significativo sobre la inhibición de las CSC, que respalda el gran potencial para las terapias dirigidas a esta quimiocina para reducir las CSC en el tumor.
Debe tenerse en cuenta que, tal como se usa en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, la forma singular "un", "una" y "el/la" incluye referentes plurales salvo que el contexto claramente dicte lo contrario.
A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende un experto en la técnica con la que se relaciona esta invención. Por ejemplo, el Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2.a ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3.a ed., 1999, Academic Press; y el Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revisado, 2000, Oxford University Press, proporcionan a un experto un diccionario general de muchos de los términos utilizados en esta invención.
Los términos "sobre" y "aproximadamente" en el contexto de la presente invención, indican un intervalo de precisión que un experto en la materia entenderá que sigue garantizando el efecto técnico de la característica en cuestión. El término normalmente abarca una desviación del valor numérico indicado de aproximadamente /- el 10 % o de aproximadamente /- el 5 %.
La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias preferentemente se realiza usando el algoritmo matemático de Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci EE.UU. 90: 5873-5877. Dicho algoritmo se incorpora, por ejemplo, en los programas BLASTn y BLASTp de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 disponibles en la página web del NCBI. La determinación del porcentaje de identidad se realiza preferentemente con los parámetros estándar de los programas BLASTn y BLASTp.
Se puede hacer referencia a los aminoácidos en el presente documento por sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos o por los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB. Los nucleótidos, del mismo modo, pueden ser referidos por sus códigos de una sola letra comúnmente aceptados.
Tal como se usa en el presente documento, los términos "anticuerpo" y "anticuerpos", también conocidos como inmunoglobulinas, abarcan anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos formados a partir de al menos dos fragmentos de unión a epítopo (por ejemplo, anticuerpos multiespecíficos, por ejemplo, la publicación de PCT WO2009018386, la solicitud de p Ct N.° Pc T/Us 2012/045229 (la Publicación de Pc T WO2013006544)), biMabs, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos camelizados, FVs de cadena simple (scFv), anticuerpos de cadena simple, anticuerpos de dominio único, anticuerpos de dominio, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, fragmentos de anticuerpo que presentan la actividad biológica deseada (por ejemplo, la porción de unión a antígeno), Fv unido a disulfuro (dsFv), y anticuerpos anti-idiotípicos (anti-Id) (incluyendo, por ejemplo, anticuerpos anti-Id para anticuerpos de la divulgación), intracuerpos, y fragmentos de unión a epítopo de cualquiera de los anteriores. En particular, los anticuerpos incluyen moléculas de inmunoglobulina y fragmentos inmunológicamente activos de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen al menos un sitio de unión a antígeno. Los anticuerpos también incluyen fusiones de péptidos con anticuerpos o porciones de los mismos tal como una proteína fusionada a un dominio Fc. Las moléculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier isotipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), subisotipo (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o alotipo (por ejemplo, Gm, por ejemplo, G1m(f, z, a o x), G2m(n), G3m(g, b, o c), Am, Em, y Km(1, 2 o 3)). Los anticuerpos se pueden obtener de cualquier mamífero, incluyendo, pero sin limitación, humanos, monos, cerdos, caballos, conejos, perros, gatos, ratones, etc., u otros animales tales como aves (por ejemplo, pollos).
Las expresiones "receptor de quimiocinas CCR6" o "receptor CCR6" o "CCR6" y "ligando 20 de quimiocinas" o "CCL20" tal como se usa en el presente documento se refiere a moléculas biológicas (moléculas de ácido nucleico y moléculas de aminoácidos) que se conocen en la técnica. Un experto en la materia será capaz de identificar las secuencias de polinucleótidos y aminoácidos del receptor CCR6 y CCL20, así como cualquier isoforma variante ortóloga y de corte y empalme de CCR6 y CCL20 de cualquier base de datos de secuencias (por ejemplo, la base de datos del NCBI).
En algunas realizaciones, las expresiones "receptor CCR6" o "CCL20" se refieren a un receptor CCR6 y CCL20, y en ciertas realizaciones, se refieren al receptor humano CCR6 y CCL20 humano. Tal como se indica anteriormente, las secuencias del receptor CCR6 humano están disponibles de las bases de datos de secuencias públicas tales como, por ejemplo, la base de datos del NCBI (número de registro nM_004367.5 (variante del transcrito 1; s Eq ID NO:1, que codifica la s Eq ID NO:2) o nM_031409.3 (variante del transcrito 2; SEQ ID NO: 3, que codifica la SEQ ID NO:4). De manera similar, las secuencias del CCL20 humano están públicamente disponibles (número de registro del NCBI nM_004591.2 (variante del transcrito 1; SEQ ID NO:5, que codifica la SEQ ID NO:6) o nM_001130046.1 (variante del transcrito 2; SEQ ID NO:7, que codifica la SEQ ID NO:8). Otros ortólogos y variantes serán conocidos y/o identificables por un experto en la materia.
CCR6 a veces también se denomina CD196 o antígeno CD196. Con frecuencia variables, se han utilizado en la técnica una serie de otros términos para CCR6 que incluyen, por ejemplo, CC-CKR-6, C-C- CKR-6, receptor 6 de la quimiocina (motivo C-C), receptor 6 de la quimiocina (C-C), receptor de la quimiocina C-C de tipo 6, CKRL3, CKR-L3, receptor de quimiocina de tipo 3, STRL22, CMKBR6, receptor 29 acoplado a proteína G, GPR29, receptor transmembrana siete, linfocito 22, GRPCY4, GPR-CY4, DRY6, receptor LARC y BN-1.
De manera similar, CCL20, o quimiocina de motivo C-C 20 también se conoce como proteína inflamatoria de macrófagos 3a (MIP3 a, MIP3-alfa, MIP3A, MIP3a, MIP-3a) quimiocina hepática y regulada por la activación (LARC), LARC de quimiocina CC, SCYA20, citocina inducible pequeña A20, subfamilia A de citocina inducible pequeña (Cys-Cys), miembro 20, ST38, CKb4, éxodo-1 de quimiocina beta, exodo-1 de quimiocina-beta o exodo-1. Tal como se indica anteriormente, CCL20 es una quimiocina de tipo CC de 9 kDa que se expresa de manera constitutiva a bajos niveles por los queratinocitos en diversos tejidos (por ejemplo, piel, mucosa intestinal, hígado). Aunque hay redundancia en la red de quimiocinas humanas, CCL20 es el único ligando de quimiocina de su receptor, CCR6. La expresión de CCL20 se ha descrito en una variedad de neoplasias humanas, incluyendo los adenocarcinomas humanos colorrectal, de pulmón, de páncreas y de mama, glioma maligno, leucemia, linfoma y melanoma. Hasta la fecha, y antes de la presente divulgación, sin embargo, no se ha establecido el papel in vivo de CCL20, en particular, en el contexto de cáncer y terapia del cáncer.
A. Métodos
Tal como se usa en el presente documento, el término "sujeto" pretende incluir animales humanos y no humanos, en particular, mamíferos. Los ejemplos de sujetos incluyen sujetos humanos, por ejemplo, un paciente humano que tiene un trastorno, por ejemplo, un trastorno descrito en el presente documento, tal como un cáncer, o un sujeto normal. Un "animal no humano" incluye todos los vertebrados, por ejemplo, no mamíferos (tal como aves, anfibios, reptiles) y mamíferos, tales como primates no humanos, domesticados y/o animales útiles en la agricultura (tales como ovejas, perros, gatos, vacas, cerdos, etc.) y roedores (tales como ratones, ratas, hámsteres, cobayas, etc.). En realizaciones particulares, el sujeto es un paciente humano.
"Tratamiento" o "tratar" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas. Aquellos sujetos que necesiten tratamiento incluyen los que ya tienen el trastorno, así como aquellos propensos a tener el trastorno o aquellos en los que se va a prevenir el trastorno. Cuando se usa con referencia a una enfermedad o un sujeto que necesita tratamiento, los términos en consecuencia incluyen, pero sin limitación, detener o ralentizar la progresión de la enfermedad, la remisión de la enfermedad, la profilaxis de los síntomas, reducción de la gravedad de la enfermedad y/o de los síntomas, o reducción en la duración de la enfermedad en comparación con un sujeto no tratado. En realizaciones, los métodos de tratamiento pueden reducir una o más indicaciones clínicas de la enfermedad en particular que se está tratando.
"Administración" o "administrar", tal como se usa en el presente documento, se refiere a proporcionar, poner en contacto y/o administrar un compuesto o compuestos por cualquier vía apropiada para lograr el efecto deseado. La administración puede incluir, pero sin limitación, oral, sublingual, parenteral (por ejemplo, inyección intravenosa, subcutánea, intracutánea, intramuscular, intraarticular, intraarterial, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intralesional o intracraneal), transdérmica, tópica, bucal, rectal, vaginal, nasal, oftálmica, por inhalación e implantes.
"Coadministrado", tal como se usa en el presente documento, se refiere a la administración simultánea o secuencial de múltiples compuestos o agentes. Un primer compuesto o agente se puede administrar antes, de manera concurrente con o después de la administración de un segundo compuesto o agente. El primer compuesto o agente y el segundo compuesto o agente se puede administrar de manera simultánea o secuencial el mismo día, o se puede administrar de manera secuencial en 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas o un mes entre cada uno. De manera adecuada, los compuestos o agentes se coadministran durante el período en el que cada uno de los compuestos o agentes ejercen al menos un efecto fisiológico y/o tiene eficacia restante.
"Poner en contacto", tal como se usa en el presente documento como "poner en contacto una célula", se refiere a poner en contacto una célula directamente o indirectamente in vitro, ex vivo o in vivo (es decir, dentro de un sujeto, tal como un mamífero, incluyendo seres humanos, ratones, ratas, conejos, gatos y perros). Poner en contacto una célula, que también puede incluir "hacer reaccionar" una célula con o "exponer" una célula a un compuesto inhibidor, puede tener lugar como resultado de la administración general de un compuesto o agente a un sujeto o la adición o aplicación del inhibidor a un recipiente que contiene una célula o un tejido o a un fluido que contiene una célula o tejido. Por lo tanto, poner en contacto la célula con un inhibidor se puede referir a la administración de un inhibidor a un sujeto, tejido o región de un sujeto o tejido que comprende una célula (por ejemplo, una célula CSC en una región localizada o un sistema en un sujeto (por ejemplo, linfático, circulatorio, etc.)) y no puede ponerse físicamente en contacto con una célula diana. Poner en contacto abarca la administración a una célula, tejido, mamífero, sujeto, paciente o ser humano. Además, poner en contacto una célula incluye añadir un agente a un cultivo celular. Otros métodos adecuados pueden incluir introducir o administrar un agente a una célula, tejido, mamífero, sujeto o paciente usando procedimientos y vías de administración apropiadas tal como se trata en el presente documento o se conoce de otro modo en la materia.
Métodos de detección
En algunos aspectos y realizaciones, los métodos desvelados en el presente documento proporcionan y/o comprenden uno o más métodos útiles en la detección, la identificación y/o la cuantificación de una célula madre cancerosa (CSC). En algunas realizaciones, el método comprende detectar, identificar y/o cuantificar la cantidad de CCL20 en una muestra biológica que comprende las CSC. En algunas realizaciones, los métodos proporcionan el diagnóstico, el pronóstico, la cuantificación, la identificación y/o la detección de la presencia de una célula madre cancerosa (CSC) en una muestra que comprende células cancerosas, el método puede comprender una o más de:
poner en contacto la muestra con un agente que se una a una secuencia de ácido nucleico de CCL20 o a una secuencia de aminoácidos de CCL20;
detectar la presencia o la ausencia de la unión entre el agente y la secuencia de ácido nucleico de CCL20 o la secuencia de aminoácidos de CCL20; y/o
identificar la presencia de la CSC en la muestra tras la detección de la unión entre el agente y la secuencia de ácido nucleico de CCL20 o la secuencia de aminoácidos de CCL20.
En otras realizaciones adicionales más, el método puede comprender un agente que comprende un resto detectable. En algunas realizaciones, el agente puede comprender una secuencia de ácido nucleico que hibrida con al menos una porción de la secuencia de ácido nucleico de CCL20 en condiciones rigurosas de hibridación. En algunas realizaciones, el agente puede comprender un anticuerpo que se une específicamente al menos a una porción de la secuencia de aminoácidos de CCL20.
Además de los métodos descritos en el presente documento que son útiles para detectar, identificar y/o cuantificar una CSC en una muestra, estos aspectos y realizaciones también pueden incluir cualquier método y técnica que está disponible para un experto en la materia. Como ejemplos no limitantes, las CSC se pueden identificar, detectar y aislar usando técnicas que incluyen la citometría de flujo basadas en los marcadores de superficie celular que se expresan dentro, o son específicas para CSC particulares; la detección de fenotipos de población lateral (SP por sus siglas en inglés) mediante exclusión con colorante (por ejemplo, Hoechst 33342, tal como se desvela en Moserle, L., et al., Cancer Res. (2008) 68; 5658-5668); capacidad para crecer/proliferar como esferas flotantes en medio sin suero (por ejemplo, desvelados en el presente documento, así como en Ryback, A.P., et al., Biochim. Biophys. Acta (2011) 1813; 683-694); y la determinación de actividad enzimática particular tal como, por ejemplo, actividad aldehído deshidrogenasa, y niveles de marcadores polycomb que incluyen el marcador de heterocromatina polycomb, niveles de H3K27me3, y potenciador de zeste 2 de la proteína del grupo polycomb (EZH2).
En algunas realizaciones, por ejemplo, la elevada expresión y actividad de la aldehído deshidrogenasa (ALDH) se ha documentado en células precursoras del cáncer de diversos linajes (por ejemplo, hematopoyético, mamario, endotelial, mesenquimático, neural) y se pueden usar técnicas y kits comercialmente disponibles (por ejemplo, ALDEFLUOR™, Stemcell Technologies) en relación con los diversos aspectos y realizaciones del presente documento. De manera similar, aunque actualmente no hay marcadores de superficie celular expresados universalmente para identificar las CSC, se han asociado una serie de marcadores de superficie con las CSC y los tipos tumorales asociados, que incluyen, por ejemplo, ALDH, CD13, CD15, CD24, CD44, CD90, CD117, CD133, CD166, CD326, (véase, por ejemplo, Xia, P., Curr Stem Cell Res Ther. (2014) Mar; 9(2): 102-11; Shimamura, M., et al., Endocr. J., (2014) 61(5):481-90; Tirino, V., et al., FASEB J., (2013) Ene; 27(1):13-24).
En algunas realizaciones, debido a la ausencia de uno o más marcadores de superficie universal para la detección o la identificación de una CSC en una muestra, los métodos de detección, identificación y/o cuantificación comprenden técnicas de cultivo celular que comprenden cultivos de esferas y ensayos de crecimiento tal como se desvela en el presente documento o se conocen de otro modo en la técnica.
B. Inhibidores
En realizaciones, el inhibidor puede ser un "aptámero" que se refiere a un aptámero de ADN, ARN o de péptido que tiene especificidad por CCL20. Un aptámero de polinucleótido comprende entre aproximadamente 10 y aproximadamente 300 nucleótidos de longitud. Normalmente, un aptámero varía de aproximadamente 30 a aproximadamente 100 nucleótidos de longitud, y en algunas realizaciones, puede variar de aproximadamente 10 a 60 nucleótidos de longitud. Los aptámeros se pueden preparar mediante cualquier método conocido, incluyendo métodos sintéticos, recombinantes y de purificación, y se pueden usar solos o en combinación con otros aptámeros específicos para CCL20.
En algunas realizaciones, el inhibidor puede ser un anticuerpo que se une específicamente a CCL20. En algunas realizaciones, el anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal o policlonal, o un antisuero poliespecífico. En tales realizaciones, el anticuerpo también puede incluir variantes o fragmentos de anticuerpos tales como, por ejemplo, anticuerpos de cadena simple, diacuerpos, minicuerpo, fragmentos de Fv de cadena simple (sc(Fv)), anticuerpos sc(Fv)2 , fragmentos Fab o fragmentos F(ab')2 siempre que la variante o el fragmento conserve las propiedades específicas de unión a la diana (por ejemplo, CCL20).
En otras realizaciones, el inhibidor puede ser una molécula antisentido que comprende un polinucleótido que es complementario con al menos una porción de ARNm de CCL20. En algunas realizaciones, la molécula antisentido es adecuada para su uso en los métodos que inhiben la traducción del ARNm en una célula. La molécula antisentido puede comprender ADN, ARN o tanto ADN como ARN, así como ácidos nucleicos modificados químicamente. Además, en algunas realizaciones, la molécula antisentido puede ser monocatenaria o bicatenaria. Una molécula antisentido puede comprender de aproximadamente 10 a aproximadamente 500 nucleótidos y, en algunas realizaciones, puede tener cualquier número de longitudes, por ejemplo, que varían de aproximadamente 11 a aproximadamente 200 nucleótidos, de aproximadamente 12 a aproximadamente 100, de aproximadamente 13 a aproximadamente 75 nucleótidos, de aproximadamente 14 a aproximadamente 50 nucleótidos, de aproximadamente 15 a aproximadamente 40 nucleótidos, de aproximadamente 16 a aproximadamente 30 nucleótidos, o de aproximadamente 17 a aproximadamente 25 nucleótidos. Un experto en la materia apreciará que estos intervalos representan realizaciones ilustrativas.
En algunas realizaciones, el inhibidor puede comprender una molécula de ARNip que reduce o inhibe la expresión de CCL20. La molécula de ARNip puede, en algunas realizaciones, ser una molécula de ARNip monocatenaria o bicatenaria que comprende una secuencia capaz de hibridar con el ARNm de CCL20, e inducir una interferencia del ARN u otro mecanismo antisentido que reduce o inhibe la expresión de la proteína. Las moléculas de ARNip pueden ser de cualquier secuencia que permita que la molécula de ARNip induzca interferencia de ARN que da como resultado la reducción o la inhibición de la expresión de la proteína CCL20. La molécula de ARNip puede, en algunas realizaciones, tener una longitud de entre 10 y 100, entre 12 y 80, entre 14 y 60, entre 16 y 50, entre 17 y 40. De manera adecuada, el ARNip tiene una longitud que varía de 18 a 30 nucleótidos y, en ciertas realizaciones, entre aproximadamente 18 y aproximadamente 26 nucleótidos.
En realizaciones que comprenden una molécula de ácido nucleico inhibidor, tales inhibidores pueden unirse a una secuencia diana de ácido nucleico de CCL20 en condiciones de unión rigurosas. Las expresiones "condiciones rigurosas" o "condiciones de unión rigurosas" o "condiciones de hibridación rigurosas" se refiere a condiciones en las que un polinucleótido hibridará con una secuencia diana, en un grado de detección mayor que en otras secuencias (por ejemplo, al menos 2 veces sobre el fondo). Un ejemplo no limitante de condiciones rigurosas incluye aquellas en las que se realiza la hibridación en formamida al 50 %, NaCl 1 M, SDS al 1 % a 37 °C y un lavado en SSC a 0,1x a de 60 °C a 65 °C.
Dada la secuencia de polinucleótidos de CCLL20, se puede diseñar una molécula de ácido nucleico inhibidor usando motivos y dirigida a una región que se puede predecir que sea eficaz para la actividad inhibidora, usando técnicas convencionales en la materia.
C. Kits
Otro aspecto de la divulgación se refiere a un kit. En un aspecto, un kit comprende cualquiera de los inhibidores, reactivos, composiciones o composiciones farmacéuticas tal como se describe anteriormente, e instrucciones o una etiqueta que dirige el uso o la administración apropiada. Opcionalmente, un kit también puede incluir uno o más recipientes y/o una jeringa u otro dispositivo para facilitar la administración o el uso. La divulgación contempla que todos o cualquier subconjunto de los componentes para llevar a cabo los ensayos de investigación, los ensayos de diagnóstico y/o para administrar cantidades terapéuticamente eficaces se pueden incluir en el kit. De manera similar, el kit puede incluir instrucciones para hacer un conjugado, por ejemplo formando un enlace covalente entre un inhibidor de la divulgación y un resto terapéutico o de diagnóstico en condiciones adecuadas para formar un conjugado. A modo de ejemplo adicional, un kit para su uso en un método terapéutico de la divulgación puede comprender una solución que contiene una formulación farmacéutica del(los) inhibidor(es) de CCL20 y/o CCR6, o una preparación liofilizada de uno o más inhibidores, e instrucciones para administrar la composición a un paciente que lo necesite y/o para reconstituir el producto liofilizado.
La presente divulgación también abarca un producto farmacéutico terminado, empaquetado y etiquetado. El artículo de fabricación incluye la forma de dosificación unitaria apropiada en un recipiente o envase apropiado, tal como un vial de vidrio u otro recipiente que esté sellado herméticamente. En el caso de formas de dosificación adecuadas para la administración parenteral, el ingrediente activo es estéril y adecuado para la administración como una solución libre de partículas. En ciertos aspectos, la formulación es adecuada para la administración intravenosa, tal como para la infusión intravenosa a un ser humano o animal.
En un aspecto específico, las formulaciones de la divulgación se formulan en viales de dosis unitaria como un líquido estéril. Los recipientes ilustrativos incluyen, pero sin limitación, viales, botellas, jeringas precargadas, bolsas IV, packs de blíster (que comprenden una o más píldoras). Opcionalmente asociado con dicho(s) recipiente(s) puede haber un aviso en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, cuyo aviso refleja la aprobación de la agencia de fabricación, uso o venta para diagnóstico y/o administración a humanos.
Como con cualquier producto farmacéutico, el material de empaquetamiento y el recipiente se diseñan para proteger la estabilidad del producto durante el almacenamiento y el envío. Además, los productos de la divulgación incluyen instrucciones para su uso u otro material informativo que advierta al médico, al técnico o al paciente sobre cómo prevenir o tratar la enfermedad o el trastorno de manera apropiada en cuestión. En otras palabras, el artículo de fabricación incluye medios de instrucción que indican o sugieren un régimen de dosificación que incluye, pero sin limitación, dosis reales, procedimientos de control, etc., y otra información de control.
Un kit para ensayos de diagnóstico puede comprender una solución que contiene un inhibidor de CCL20 o, como alternativa o adicionalmente, reactivos para detectar la presencia de CCL20. Los diversos reactivos se pueden etiquetar de acuerdo con los métodos conocidos en la materia y descritos en el presente documento, incluyendo pero sin limitación, etiquetas tales como etiquetas fluorescentes de molécula pequeña, proteínas tales como una biotina, GFP u otras proteínas fluorescentes, o secuencias de epítopo tales como his o myc. De manera similar, los anticuerpos primarios usados para detectar CCL20 se pueden incluir en el kit. Los anticuerpos primarios se pueden dirigir a secuencias en CCL20 o a marcadores, etiquetas o epítopos con los que se puede etiquetar CCL20. Los anticuerpos primarios pueden, a su vez, estar marcados para la detección o, si se desea una amplificación adicional de la señal, los anticuerpos primarios se pueden detectar por anticuerpos secundarios, que también se pueden incluir en el kit.
También se contemplan kits para el uso en investigación. Tales kits se pueden parecer, por ejemplo, a kits pensados para usos de diagnóstico o terapéuticos, pero incluyen además un marcador que especifica que el kit y su uso se restringe solo a fines de investigación.
Etiquetas, conjugados y restos
La divulgación se refiere a métodos, composiciones y kits que comprenden reactivos que se pueden conjugar con etiquetas para los fines de diagnóstico y otros ensayos en los que uno o más moléculas diana se pueden unir y detectar por tales reactivos marcados. Los marcadores incluyen, sin limitación, un cromóforo, un fluoróforo, una proteína fluorescente, un colorante fluorescente, un colorante en tándem, una partícula, un hapteno, una enzima y un radioisótopo.
En ciertos aspectos, los reactivos se conjugan con un fluoróforo. La elección del fluoróforo unido al(los) reactivo(s) determinará las propiedades de absorción y emisión de fluorescencia de la molécula conjugada. Las propiedades físicas de un marcador de fluoróforo que se pueden usar incluyen, pero sin limitación, características espectrales (absorción, emisión, y desplazamiento de Stokes), intensidad de fluorescencia, durabilidad, polarización y tasa de fotoblanqueo o combinación de los mismos. Todas estas propiedades físicas se pueden usar para distinguir un fluoróforo de otro y permitir de este modo el análisis multiplexado. Otras propiedades adecuadas del marcador fluorescente pueden incluir la permeabilidad celular y la baja toxicidad, por ejemplo, si el marcaje de la(s) diana(s) se va a realizar en una célula o un organismo (por ejemplo, un animal vivo).
En ciertos aspectos, una enzima es un marcador y está conjugada con un reactivo. Las enzimas pueden ser marcadores adecuados porque la amplificación de la señal detectable se puede obtener dando como resultado un aumento de la sensibilidad del ensayo. La propia enzima no produce una respuesta detectable, sino que sirve para descomponer un sustrato cuando se pone en contacto con un sustrato apropiado de tal manera que el sustrato convertido produce una señal fluorescente colorimétrica o luminiscente. Las enzimas amplifican la señal detectable debido a que una enzima sobre un reactivo de marcaje puede dar como resultado múltiples sustratos que se convierten en una señal detectable. El sustrato enzimático se selecciona para producir el producto medible preferido, por ejemplo, colorimétrico, fluorescente o de quimioluminiscencia. Tales sustratos se usan de manera extensiva en la técnica y son bien conocidos por el experto en la materia e incluyen, por ejemplo, oxidorreductasas tales como peroxidasa de rábano picante y un sustrato tal como 3,3'-diaminobenzidina (DAB); enzimas de fosfatasas tales como una fosfatasa ácida, alcalina y un sustrato tal como 5-bromo-6-cloro-3-indolil fosfato (BCIP); glucosidasas, tales como beta-galactosidasa, beta-glucuronidasa o betaglucosidasa y un sustrato tal como 5-bromo-4-cloro-3-indolil beta-D-galactopiranósido (X-gal); las enzimas adicionales incluyen hidrolasas tales como colinesterasas y peptidasas, oxidasas tales como glucosa oxidasa y citocromo oxidasas, y reductasas para las que se conocen los sustratos adecuados.
Las enzimas y sus sustratos adecuados que producen quimioluminiscencia son adecuados para algunos ensayos. Estos incluyen, pero sin limitación, formas naturales y recombinantes de luciferasas y ecuorinas. Los sustratos productores de quimioluminiscencia para fosfatasas, glucosidasas y oxidasas tales como los que contienen diotexanos estables, luminol, isoluminol y ésteres de acridinio son adicionalmente útiles.
En otro aspecto, los haptenos tales como biotina, también se utilizan como marcadores. La biotina es útil porque puede servir en un sistema enzimático para amplificar adicionalmente la señal detectable, y puede servir como una etiqueta que se va a utilizar en cromatografía de afinidad para fines de aislamiento. Para fines de detección, se usa un conjugado enzimático que tiene afinidad por la biotina, tal como avidina-HRP. Posteriormente se añade un sustrato de peroxidasa para producir una señal detectable.
Los haptenos también incluyen hormonas, fármacos de origen natural y sintético, contaminantes, alérgenos, moléculas afectoras, factores de crecimiento, quimiocinas, citocinas, linfocinas, aminoácidos, péptidos, intermediarios químicos, nucleótidos y similares.
En ciertos aspectos, las proteínas fluorescentes se pueden conjugar con el(los) reactivo(s) tal como un marcador. Los ejemplos de proteínas fluorescentes incluyen proteína verde fluorescente (GFP, por sus siglas en inglés) y las ficobiliproteínas y los derivados de la misma. Las proteínas fluorescentes, especialmente la ficobiliproteína, son particularmente útiles para crear reactivos de mareaje marcados con colorante en tándem. Estos colorantes en tándem comprenden una proteína fluorescente y un fluoróforo para los fines de obtener desplazamientos de Stokes mayores en el que los espectros de emisión se desplazan más lejos de la longitud de onda de los espectros de absorción de la proteína fluorescente.
En ciertos aspectos, el marcador es un isótopo radiactivo. Los ejemplos de materiales radiactivos adecuados incluyen, pero sin limitación, yodo (121I, 123I, 125I, 131I), carbono (14C), azufre (35S), tritio (3H), indio (111In 112In, 113mIn, 115mIn), tecnecio (99Tc, 99mTc) talio (201Ti), galio (68Ga, 67Ga), paladio (103Pd), molibdeno (99Mo), xenón (135Xe), flúor (18F), 153Sm , 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90y, 47Sc, 186Re, 188Re,142Pr, 105 Rh y 97Ru.
EJEMPLOS
MATERIALES Y MÉTODOS
Cultivo en monocapa y en esferas. Para experimentos de cultivo celular, un panel de ocho líneas celulares de cáncer de mama que abarca diversos subtipos de cáncer de mama, MDAMB468, HCC1937, SUM159PT, MCF7, BT549, BT474, T47D, y Hs578T, un panel de cuatro líneas celulares de cáncer de páncreas, Aspc1, Bxpc3, HPAC, y Panc1, y un panel de siete líneas celulares de cáncer colorrectal, LS411N, SW1417, NCI-H508, Colo205, HT29, HCT116, Lovo, se mantuvieron en incubadoras humidificadas a 37 °C, con CO2 al 5 %, en medios recomendados por los proveedores. Todas las líneas celulares se obtuvieron originariamente de ATCC (Manassas, VA) con la excepción de SUM159PT, que se obtuvo de Asterand (Detroit, MI).
Para el cultivo tisular en monocapa convencional, las células se recogieron con tripsina-EDTA al 0,25 % (Life Technologies, Grand Island, NY), se lavaron tres veces en solución salina equilibrada de Hank (HBSS, Life Technologies) y se sembraron en medio de suero completo para placas tratadas con cultivo tisular. Para el cultivo con esferas, las células se recogieron con Tripsina-EDTA al 0,25 %, se lavaron tres veces en solución salina equilibrada de Hank, y se colocaron en placas con medio definido sin suero, suplementado con factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), insulina, albúmina de suero bovino (BSA), y suero de inactivación (Life Technologies) para placas de cultivo tisular con unión ultra baja (Corning).
El crecimiento celular en ensayos de monocapa se leyó después de un período de incubación de 4 días por el ensayo de viabilidad de células luminiscentes CellTiter glo® (c Tg ) (Promega, Madison, WI) de acuerdo con la recomendación del proveedor. Los ensayos de cultivo de esferas se leyeron después de un período de incubación de 4 días mediante recuento directo de colonias de esferas usando High Content Imaging (Arrayscan VTI, Thermo Scientific, Waltham, MA), así como mediante ensayo CTG.
Aislamiento de células basado en CCR6. Las células CCR6 positivas (CCR6+) se separaron de las CCR6 negativas (CCR6-) en líneas celulares mediante separación con perlas magnéticas. Se desarrolló un sistema de selección positiva de complejo de anticuerpos tetraméricos (TAC) mediante la combinación de un anticuerpo monoclonal anti-CCR6 humano de ratón (BD Biosciences, San José, CA) con el kit de selección EasySep "Do-It-Yourself" (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC, Canadá). El uso de este kit de selección positiva de acuerdo con el protocolo recomendado por los proveedores capturó las células CCR6+ mediante aislamiento con perlas magnéticas, mientras que las células CCR6-quedaron conservadas en el sobrenadante sin unión. Las células CCR6+ aisladas y las CCR6- se colocaron en la placa para el cultivo en monocapa y se estimularon con CCL20 humano recombinante (rhCCL20) tal como se describe en otras secciones.
Ensayo inmunoadsorbente ligado a enzimas (ELISA). Los niveles de CCL20 secretado en medio acondicionado de células cultivadas se midieron el día 4 del cultivo usando un ELISA de tipo sándwich obtenido comercialmente (R&D systems, Minneapolis, MN), de acuerdo con el protocolo del proveedor. Los niveles de CCL20 se midieron directamente en picogramos/mililitros (pg/ml), interpolados de una curva estándar. Los niveles de CCL20 secretado se normalizaron y se documentaron como múltiplo de variación X en comparación con las células cultivadas en monocapa de la misma línea.
Estimulación e inhibición de CCL20. El CCL20 humano recombinante obtenido comercialmente (rhCCL20 o CCL20) que proviene de R&D systems se usó para todos los estudios, con la excepción de los datos representados en la FIG. 5D, en donde el CCL20 humano recombinante también se obtuvo de Life Technologies para la comparación. Los anticuerpos monoclonales de control de isotipo y anti-CCL20 también se obtuvieron comercialmente (R&D systems). Todos los materiales se reconstituyeron y se conservaron de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
Para estudios de estimulación e inhibición, las células se colocaron en placas para el ensayo de monocapa o con esferas tal como se describe anteriormente. En el momento de la colocación en placas, las células se trataron con rhCCL20 o tratamientos de anticuerpos a dosis descritas en los experimentos y resultados. Para la FIG. 8A, las células se transfectaron con ARNip de CCR620 nM o ARNip de control sin diana (construcciones agrupadas, obtenidas de Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) durante 48 horas antes de la adición de rhCCL20, mientras que para las FIG. 8C, 8D, las células se transfectaron con ARNip de CCL20, CCR6 o de control sin diana 20 nM (construcciones agrupadas, Santa Cruz Biotechnology) en el momento de la colocación en placa, concomitante con el tratamiento con anticuerpos de las células. La transfección de ARNip se realizó usando lípido (Lipofectamina RNAimax (Life Technologies)) como vehículo y se formó un complejo con ARNip a una proporción de ARNip:lípido de 1:2,5. Todos los tratamientos se ejecutaron durante 4 días sin interrupción, después de los cuales, las células se transfectaron y se prepararon para ensayos de monocapa/esfera, análisis por citometría de flujo, o extracción de ARN tal como se describe en secciones anteriores o posteriores.
Cuidado y uso de modelos animales de xenoinjerto que provienen de pacientes. Todos los animales se alojaron bajo un ciclo de luz:oscuridad de 12:12 horas, con acceso a voluntad a agua y alimento, y se permitió que se aclimatasen durante al menos una semana antes del comienzo del estudio. Todos los estudios en animales se aprobaron por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales de MedImmune.
Los modelos BR_PDX_1 y PA_PDX_1 se obtuvieron de Jackson Laboratories como ratones NSG hembra que llevan xenoinjertos de tumor de páncreas humano primario subcutáneo en el pase P1 (PA_PDX_1) o el pase P2 (BR_PDX_1). El modelo PA_PDX_2 se obtuvo de Asterand como extracciones de adenocarcinoma de páncreas humano primario. Todas las muestras se obtuvieron bajo el consentimiento informado del paciente, de acuerdo con sus respectivas IRB (Juntas de Revisión Institucional) que revisaron y aprobaron los presentes inventores de acuerdo con la política de adquisición de muestras biológicas humanas de MedImmune.
Todo el material tumoral se propagó por implantación subcutánea de trozos de tumor en el flanco trasero de ratones NSG hembra de seis a ocho semanas de vida (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ, Jackson Laboratories) o ratones hembra Beige desnudos XID (LystbgFoxn1nuBtkxid, Envigo) en condiciones estériles. Los tumores se pasaron mediante esta metodología hasta el pase 6 (P6), por lo que el pase 0 (P0) se considera el primer xenoinjerto establecido a partir de la biopsia del paciente.
Cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 750 mm3, se recolectaron, se lavaron en solución salina equilibrada de Hank (HBSS), se trituraron con una cuchilla de afeitar estéril, y se disociaron a una suspensión de células únicas en 20 U/ml de colagenasa III (Worthington Biochemical). Las células tumorales disociadas se usaron en selección de células activadas por fluorescencia tal como se describe a continuación.
Para el estudio de tumorigenicidad in vivo, las células Panc1 se cultivaron en condiciones de formación de esferas, bajo el tratamiento con 10 |jg/ml de IgG de CCL20 o isotipo IgG como control iniciado en el momento de la colocación en placa. Después de un cultivo de 4 días, las esferas se disociaron en StemPro Accutase a una suspensión de células simples. Las células de esfera disociadas se mezclaron a 1:1 con Matrigel GFR (Corning) y se inyectaron por vía subcutánea en el flanco posterior de ratones hembra nu/nu de 6-8 semanas de vida (Hsd:AthymicNude-Foxn1nu, Envigo) a 30.000 células por ratón. El volumen tumoral se controló y se midió a lo largo del tiempo, por lo que se registró el tiempo hasta la toma del tumor como la primera observación de un tumor palpable.
Citometría de flujo y clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Las muestras se prepararon para los experimentos por citometría de flujo incubando las células vivas con Golgistop (BD Biosciences) durante 1 hora a 37 °C para detener la secreción de CCL20. Después de esto, las células se recogieron con una solución de desprendimiento celular Accutasa (Life Technologies), se lavaron y se resuspendieron a aproximadamente 2,5x106 células por ml en la solución salina equilibrada de Hank (HBSS). Las células se tiñeron con un panel multicolor que consiste en todos o varios de los siguientes anticuerpos: anti-CCL20-APC humano (R&D systems), anti-CCR6-BV605 humano, anti-CD24-FITC humano, anti-CD44-PE-Cy7 humano y anti-Epcam-PerCP-Cy5.5 o Epcam-BV421 humano (todos de BD Biosciences). Los xenoinjertos de tumor primario se tiñeron adicionalmente con anticuerpo anti-H2Kd-PE de ratón (BD Biosciences) para permitir que todas las células endoteliales y estromáticas de ratón asociadas al tumor se excluyan de los análisis posteriores. En experimentos que contienen células de tinción de CCL20 se tiñeron todos los receptores de superficie antes de fijar e impermeabilizarlas para la tinción de anti-CCL20. Se utilizaron controles de tinción única para definir matrices de compensación, y se utilizaron controles de tinción completos menos uno para definir la selección. Para experimentos de citometría en células vivas, se añadió DAPI (Invitrogen) a cada muestra a 30 jM para deseleccionar células muertas. Los experimentos de citometría de flujo convencionales se ejecutaron en un LSRII con configuración de 4 láseres, mientras que los experimentos de selección de células se ejecutaron en un FACSAriall (BD Biosciences). La selección por FACS se determinó por tinción por fluorescencia menos uno (FMO) tal como se muestra en las FIG. 13, FIG. 14, y FIG. 15.
RT-PCR cuantitativa. Todas las muestras se procesaron para la extracción de ARN usando el kit Ambion RNAaqueous (Applied Biosystems). El rendimiento y la calidad del ARN se determinó mediante espectrofotometría de UV a 260/280 nM. De 10-100 nanogramos de ARNm de cada muestra se sometieron a PCR con transcripción inversa (RT-PCR) a 42 °C en presencia de oligodesoxirribonucleótidos de cebador aleatorio (Life Technologies) y transcriptasa inversa Superscript III (Life Technologies). Tras la RT-PCR, el producto de ADNc de 20 ng se preamplificó durante 14 ciclos usando ensayos de expresión génica de Taqman agrupados (Life Technologies), cada uno a una concentración de 0,2x, para los siguientes genes:
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El material preamplificado para cada muestra se diluyó 20 veces en agua desionizada (DI-H2O) y se sometió a análisis de PCR cuantitativa (qPCR) usando los cebadores enumerados anteriormente en réplicas técnicas en un termociclador 7900HT Thermocycler (Life Technologies) de acuerdo con el protocolo recomendado por el proveedor.
Los valores Ct se obtuvieron de la ejecución de la qPCR usando el programa informático SDS 2.4 (Life Technologies) y se convirtieron a valores de expresión relativa (ER) mediante el método comparativo de Ct, usando la fórmula ER= 2-ññC t, en donde
ACt = Ct normalizado = Ct de gen - Ct de 13 S
AACt = Ct de la muestra normalizado - Ct de control normalizado
Un promedio ± el error estándar de la media se determinó para valores de ER entre las réplicas técnicas, y posteriormente se representó gráficamente como la representación de datos final.
Cultivo de TR1 y análisis por citometría de flujo. Los linfocitos T CD4+ humanos sin exposición previa se aislaron de sangre de donantes humanos sanos usando el kit de aislado de linfocitos T CD4 II (Miltenyo Biotech) y se sesgaron en cultivo hacia linfocitos TR1 de acuerdo con el protocolo descrito en Voo, et al. Toda la sangre de donantes humanos se obtuvo bajo el consentimiento informado, y se usó/dispuso de acuerdo con la política de muestras biológicas humanas de Astrazeneca.
El día 8, los linfocitos TR1 se recogieron del cultivo, se lavaron en PBS y se tiñeron para el análisis de citometría de flujo para confirmar el fenotipo del marcador de Treg. Las células se resuspendieron en PBS FBS al 2 % (Life Technologies) a una concentración de 0,5x106 células/0,1 ml y se tiñeron con un panel de anticuerpos multicolor que consistió en CD3-APC-Cy7, CD25-BV711 (ambos obtenidos de Biolegend), CD4-FITC, FOXP3-PE y CCR6-DL647 (todos obtenidos de BD Biosciences) en concentraciones recomendadas por los proveedores. Antes de la tinción superficial de las células, las células se trataron con Zombie-UV (Biolegend) de acuerdo con el protocolo del proveedor para deseleccionar células muertas del análisis. Después de esto, las células vivas se tiñeron para todos los marcadores de superficie celular durante 15 min en hielo. Las células teñidas se lavaron después dos veces con PBS FBS al 2 % y se fijaron usando el kit cytofix/cytoperm (BD Biosciences) de acuerdo con el protocolo recomendado. Tras la etapa de fijación, las células se tiñeron para FOXP3 intracelular durante 15 min en hielo, seguido por 2 lavados adicionales en PBS FBS al 2 %. El análisis por citometría de flujo se realizó en un BD Fortessa y se analizó mediante el programa informático FlowJo. La compensación multicolor se realizó usando perlas de compensación (eBiosciences), se tiñó y se analizó en paralelo a las células y se establecieron controles de completo menos uno (FMO) para cada color para determinar la selección positiva/negativa.
Ensayo de quimiotaxis de TR1. Las células de cáncer de colon NCIH508 se colocaron en placas de unión ultra-baja (Corning) en medio definido sin suero tal como se describe anteriormente para promover el cultivo de esferas dirigido por CSC. Después de 4 días de cultivo inalterado, se recogió medio acondicionado (CM, por sus siglas en inglés) de las células, se filtró a 0,2 |jM y se conservó a 4 °C hasta su uso posterior. La concentración de CCL20 en el medio se determinó mediante ELISA tal como se describe anteriormente. Este CM de las CSC se usó en una semana de recolección para los ensayos de quimiotaxis.
Los linfocitos TR1 recogidos el día 8 del cultivo se lavaron en PBS y se resuspendieron frente a PBS FBS al 2 % o medio definido sin suero (SCM) a 0,4x106 células/ml. El CCL20 aislado (R&D systems) se preparó de a una concentración de 100 nM en PBS FBS al 2 %. El anticuerpo monoclonal anti-CCL20 o el anticuerpo de control de isotipo (ambos de R&D systems) se añadió al CM de CCL20 aislado o de CSC a una concentración final de 667 nM y se permitió que se incubase durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los tratamientos preparados se transfirieron a los pocillos receptores de una placa de migración transpocillo con poros de 8 j M (Neuroprobe) a n=4 pocillos/tratamiento. Los linfocitos TR1 se colocaron en placas en la parte superior de la placa de filtro de acuerdo con el protocolo de los proveedores a 50.000 células/pocillo en medio emparejado (PBS FBS al 2 %, para tratamientos de CCL20 aislado y SCM para tratamientos de CM de CSC). Se dejó incubar las placas durante 60 min. a 37 °C, después de lo cual las células no migradas se eliminaron de la placa de filtro y el filtro se lavó suavemente con PBS. Las placas se centrifugaron a 200 rpm durante 2 minutos para recolectar las células migradas en los pocillos receptores. El número de células migradas se determinó mediante el ensayo cell titer glo (Promega) de acuerdo con el protocolo del proveedor, mediante lo cual se usó una curva estándar de número de células frente a luminiscencia relativa (URL) para convertir las URL a % de linfocitos TR1 migrados. La significación estadística se determinó mediante la prueba de la T de student de 2 colas entre el tratamiento y el control, por lo que n=4 réplicas/tratamiento.
Ensayos de la vía de beta-arrestina y AMPc. El reclutamiento de la beta-arrestina se midió como un reportero para la activación de la vía de CCL20-CCR6 de humano y de ratón usando el ensayo GPCR de p-arrestina PathHunter® eXpress CCR6 CHO-K1 (DiscoverX), por lo que las células expresaron de manera estable CCR6 de ratón para el ensayo de la vía del ratón y CCR6 humano para el ensayo de la vía de humano. Los ensayos se ejecutaron de acuerdo con el protocolo del proveedor con el ajuste de que las células se estimularon con CCL20 humano recombinante 6 nM (R&D Systems) o CCL20 de ratón recombinante 1,2 nM (R&D systems) durante 90 minutos a 37 °C. Los cambios en los niveles de AMPc se midieron adicionalmente en un ensayo separado tal como un reportero para la activación de la vía CCL20-CCR6 de humano usando el kit de ensayo de AMPc LANCE (Perkin Elmer) de acuerdo con el protocolo del proveedor, usando células Ad293 transfectadas de manera estable con CCR6 humano. En este ensayo, las células se estimularon con forskolina 4 |jM (Sigma Aldrich) en combinación con CCL20 recombinante 1 nM durante 60 minutos a temperatura ambiente. En ambos ensayos, la vía de neutralización se midió tras el tratamiento con IgG de CCL20 o IgG de control de isotipo (ambos de R&D systems).
Modelos de ratón singénico in vivo. Se hizo un xenoinjerto de carcinoma de mama de ratón 4T1 en el flanco posterior de ratones Balb/c hembras de 4-6 semanas de vida (BALB/cAnNHsd, Envigo). Cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 50-100 mm3, los ratones comenzaron a recibir tratamiento con un anticuerpo monoclonal anti-CCL20 (clon 114908) o un anticuerpo de control de isotipo (ambos de R&D systems), dosificados a 10 mg por kg i.p. dos veces a la semana durante 4 dosis consecutivas. Los ratones se sacrificaron compasivamente a las 24 horas tras la dosis final y los bazos y los tumores se extrajeron para su análisis. Tanto el bazo como el tejido tumoral se digirieron hasta una suspensión de células simples y las células resultantes se criopreservaron en Cryostor CS5 (Sigma-Aldrich) antes del análisis de citometría de flujo de las células inmunitarias.
Análisis de citometría de flujo de células inmunitarias de ratón. Las células del bazo y tumorales criopreservadas de ratones tratados con isotipo o anticuerpo monoclonal anti-CCL20 de ratón se descongelaron a 37 °C, se lavaron y se tiñeron para el análisis de células inmunitarias de ratón usando el siguiente panel de anticuerpos: anti cd45-BV21, anti cd4-Bv711, anti cd11b-BV510 (todos obtenidos de BD Biosciences), anti cd3-FITC, anti cd8a-APC-Cy7, anti foxp3-PerCP-Cy5.5, anti roryt-PE (todos obtenidos de eBiosciences), anti cd11c-BV605, anti-cd83-PE-Cy7, anti ly6g-Bv785 (todos obtenidos de Biolegend). Las células vivas se bloquearon primero con suero de ratón al 4 % (Jackson immunoresearch), posteriormente se tiñeron para células vivas/muertas usando Zombie-UV (Biolegend), luego se tiñeron para antígenos extracelulares (todas las dianas excepto para foxp3 y roryt). Después de esto, las células se lavaron y se fijaron y permeabilizaron usando un kit Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences) antes de teñir las células con anticuerpos contra los antígenos intracelulares foxp3 y roryt. La citometría de flujo se ejecutó en un BD Fortessa equipado con excitación láser de 355 nM, 405 nM, 488 nM, 532 nM y 640 nM, y se analizó usando el programa informático flowjo V10. La significación estadística se determinó mediante la prueba de la T de student de 2 colas entre el tratamiento y el control, por lo que n=5 ratones/tratamiento/tipo de tejido. Los puntos de datos que estaban más allá de 3 veces el error estándar de la media se identificaron como valores atípicos y se eliminaron del análisis.
Ensayo de quimiotaxis de linfocitos T CD4+ humanos. Los linfocitos T CD4+ se aislaron de la sangre de donantes humanos sanos mediante selección negativa usando el kit de enriquecimiento de linfocitos T CD4+ Rosettesep (Stemcell Technologies). Las células se lavaron en PBS y se resuspendieron a PBS FBS al 2 %. El CCL20 aislado (R&D systems) se preparó de a una concentración de 10 nM en PBS FBS al 2 %. El anticuerpo monoclonal anti-CCL20 o el anticuerpo de control de isotipo (ambos de R&D Systems) se añadió al CCL20 aislado a una concentración final de 30 nM y se permitió que se incubase durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los tratamientos preparados se transfirieron a los pocillos receptores de una placa de migración transpocillo con poros de 5 j M (Corning) en n=3 pocillos/tratamiento, y se cargaron linfocitos T CD4+ en el inserto sobre un filtro de policarbonato a 50.000 células/pocillo en medio emparejado PBS FBS al 2 %), y las placas se dejaron incubar durante 3 horas a 37 °C. El número de células migradas se determinó mediante el ensayo cell titer glo (Promega) de acuerdo con el protocolo del proveedor, mediante el cual se utilizó una curva estándar de número de células frente a luminiscencia relativa (URL) para convertir la URL en% de linfocitos T CD4+ migrados. La significación estadística se determinó mediante la prueba de la T de student de 2 colas entre el tratamiento y el control, por lo que n=3 réplicas/tratamiento/donante.
EJEMPLO 1: Expresión de CCL20 en células madre cancerosas en cultivo
Tal como se trató anteriormente, aunque CCL20 se conoce como un quimioatrayente para el reclutamiento de células inmunitarias, los resultados tratados en el presente documento demuestran que CCL20 es un factor producido por las CSC en líneas de células cancerosas, algunas de las cuales se ejemplifican en el presente documento, incluyendo cánceres de mama, de páncreas y colorrectal. En cultivo tisular, se ha descubierto que la mayoría de las líneas celulares aumentan profundamente la secreción de CCL20 cuando se cultivan en condiciones de esferas de enriquecimiento de CSC en relación con las condiciones de cultivo de monocapa (FIG. 1A-1C). Tal como muestra la Figura 1, las condiciones de cultivo en esferas dieron como resultado un aumento significativo en la secreción de CCL20 cuando se comparó con el cultivo en monocapa en muchas de las líneas de cáncer de mama (FIG. 1A), líneas de cáncer de páncreas (FIG. 1B) y líneas de cáncer colorrectal (FIG. 1C) que se probaron. Los niveles típicos de CCL20 que se secretaron por las células en condiciones de cultivo en esferas variaron de aproximadamente 1 a aproximadamente 1000 pg/ml, por lo que las líneas celulares que carecen de un aumento de CCL20 en cultivo en esferas generalmente tuvieron niveles de proteína bajos o indetectables de o por debajo de 1 pg/ml (FIG. 2).
Para confirmar que el aumento en los niveles de CCL20 asociado a las esferas son atribuibles a las CSC, se usó la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) para aislar las CSC y las no CSC de líneas de cáncer de mama y de páncreas, con el fin de medir los niveles de ARNm de CCL20 en cada población celular. Las CSC CD44high/+ CD24low/- aisladas de dos líneas de cáncer de mama (MDAMB468 y HCC1937) tienen niveles de ARNm de CCL20 drásticamente elevados en comparación con las no CSC CD44low/- CD24low/- aisladas de las mismas líneas (FIG. 1D). Las CSC de las células MDAMB468 y HCC1937 producen un transcrito de CCL2023 veces y 10 veces mayor que las no CSC, respectivamente (ER para CSC frente a no Cs C = 23,3±16 frente a 1,0±0,2 en MDAMB468 y 9,3±4,6 frente a 0,9±0,3 en HCC1937). Para asegurar la importancia clínica de esta observación, los niveles del transcrito CCL20 también se midieron en células CSC aisladas por FACS frente a las no CSC de xenoinjertos de tumor que provienen de paciente primario (PDX). Los tumores de dos cánceres de páncreas (PA_PDX_1 y PA_PDX_2) y un modelo de cáncer de mama (BR_PDX_1) PDX se seleccionaron de forma similar por FACS para aislar las CSC Epcam+ CD44+ CD24+ junto con las no CSC Epcam- CD44- CD24- para el cáncer de páncreas, y las CSC Epcam+ CD44+ CD24- junto con las no CSC Epcam+ CD44- CD24- para el cáncer de mama. Tal como se muestra en la FIG. 1E, los tres modelos de xenoinjerto del paciente presentaron un aumento significativo en los niveles de ARNm de CCL20 en las CSC aisladas sobre las no CSC, con una expresión relativa para las CSC frente a las no CSC = 71,8±41,6 frente a 1,2±0,6 (para BR_PDX_1), 48,8±8,6 frente a 1,0±0,0 (para PA_PDX_1), y 8,6±1,3 frente a 1,0±0,0 (para PA_PDX_2).
A continuación, los presentes inventores confirmaron por citometría de flujo que las CSC de hecho están marcadas por elevados niveles de CCL20 en comparación con el resto de la población de células tumorales. Mientras que las CSC se identifican comúnmente como Epcam+CD44+CD24+ en cáncer de páncreas y CD44+CD24- en cáncer de mama, los presentes inventores descubrieron que el fenotipo de células madre, tal como se determina por la tumorigenicidad, la formación en esferas y la expresión del gen de las características de las células madre (autorrenovación y pluripotencia) a menudo se rastrea mejor en modelos de la línea celular en monocapa con alta expresión de CD44 y/o CD24 (por lo tanto, Epcam+CD44highCD24high en cáncer de páncreas cultivado en monocapa y CD44highCD24- en cáncer de mama cultivado en monocapa). Mediante esta identificación, los presentes inventores descubrieron que las CSC del modelo de páncreas Bxpc3 (FIG. 3A) y del modelo de cáncer de mama HCC1937 (FIG. 3D) mostraron ambos un nivel 1,5 veces superior de intensidad de fluorescencia media (MFI, por sus siglas en inglés) de CCL20 sobre la población de células tumorales totales. Las CSC Bxpc3 (FIG. 3B) presentaron un desplazamiento en la MFI de 189, aunque la población de células tumorales totales promedió una MFI de CCL20 de 124. De manera similar, las CSC HCC1937 (FIG. 3E) también presentaron un desplazamiento aumentado en la MFI de CCL20 de 243 en las células tumorales totales a 361, específicamente para las CSC CD44highCD24-. Estos datos corroboran los descubrimientos y los resultados representados en la FIG. 1, que muestra que los niveles elevados de CCL20 se asocian predominantemente con esferas enriquecidas en CSC y CSC aisladas. La selección de CSC se determinó mediante una tinción completa menos uno tal como se representa en la FIG. 13.
EJEMPLO 2: Asociación de CCR6 y colocalización con CCL20 en células madre cancerosas
De manera interesante, cuando los presentes inventores superpusieron las poblaciones de CSC con la tinción de CCL20/CCR6 para las células tumorales, descubrieron que la mayoría de las CSC de las líneas Bxpc3 y HCC1937 parecen colocalizarse con células que son doblemente positivas tanto para el ligando como para el receptor, es decir, CCL20+CCR6+ (FIG. 3C y 3E). Sorprendentemente, los presentes inventores descubrieron que el cultivo de esferas aumenta drásticamente esta población doblemente positiva CCL20+CCR6+ sobre el cultivo en monocapa. La Figura 4 ilustra este efecto en los modelos de cáncer de páncreas Bxpc3 y Panc1. Cuando se cultivó en monocapa estándar, una pequeña fracción de células en ambos modelos se identifica como CCL20+CCR6+ (FIG. 4A y 4C, y la FIG 13 para controles de selección). Sin embargo, cuando se cultivan como esferas, la mayoría de las células en ambos modelos tiñen positivamente para CCL20 y para CCR6 (FIG. 4B y 4D). En el modelo Bxpc3, esta población CCL20+CCR6+ aumenta del 3,76 % (FIG. 4A) como monocapa al 71,2 % (FIG. 4B) en esferas. De manera similar, las células Panc1 cultivadas como monocapa tienen el 5,87 % de células CCL20+CCR6+ (FIG. 4C), una población que está reforzada al 83,5 % en cultivo en esferas (FIG. 4D). De manera interesante, cuando los presentes inventores seleccionan las células Epcam+CD44+CD24+ en estas esferas, de nuevo se superponen casi por completo con la población CCL20+CCR6+ en las esferas de Bxpc3 (FIG. 4E) y Panc1 (FIG. 4F). Estas observaciones sugieren que las c Sc pueden tener una dependencia autocrina sobre el eje CCL20-CCR6.
EJEMPLO 3: Correlación de niveles de CCL20 y actividad de células madre cancerosas
Tras la confirmación de que CCL20 se sobreexpresa por y se asocia con la población de las CSC, los presentes inventores buscaron confirmar la relevancia fenotípica de esta molécula con la actividad de las CSC. La FIG. 5 ilustra cómo la adición exógena de CCL20 purificado refuerza el crecimiento en esferas, lo que sirve como un modelo para la tumorigenicidad dirigida por las CSC. La adición de CCL20 humana recombinante (rhCCL20) al cultivo de CSC estimuló de manera significativa el crecimiento en esferas el día 4 de una forma dependiente de la dosis en tres modelos de cáncer, Aspc1 (FIG. 5A), Bxpc3 (FIG. 5B), y SUM159 (FIG. 5C). Mientras que la adición de CCL20 provoca un aumento dependiente de la dosis en el crecimiento en esferas, el ligando no muestra efectos sobre la estimulación del crecimiento de células en cultivo en monocapa convencional (FIG. 5A-5C). Esta observación tiende a sugerir que el efecto de CCL20 se dirige específicamente hacia las CSC. La especificidad de este efecto se confirmó en la FIG. 5D, que ilustra que una dosis de 50 pg/ml de CCL20 obtenida de dos fuentes comerciales separadas (CCL20 A y CCL20 B) estimula el crecimiento en esferas de células de cáncer de mama BT549 en el mismo grado. Por ejemplo, CCL20 A estimuló el crecimiento a 333,3 ± 64,9 % en comparación con 100,0 ± 16,7% para células basales, mientras que CCL20 B estimuló el crecimiento a 300,0 ± 54,6 % sobre las basales (p<0,01 y p<0,05, respectivamente, cuando se comparó con el crecimiento en esferas de las basales). Además, este efecto estimulador se puede neutralizar o anular tras la adición de anticuerpo monoclonal anti-CCL20 (15 |jg/ml), por lo que a pesar de la presencia de los mismos 50 pg/ml de CCL20 A o CCL20 B, el crecimiento en esferas fue, como máximo, 154 ± 16,9 % para CCL20 A anticuerpo anti-CCL20 y 125,0 ± 16,1 % para CCL20 B anticuerpo anti-CCL20 (véase, la FIG. 5D; p<0,05 en comparación con las esferas tratadas con CCL20 sin anticuerpo anti-CCL20).
En general, la especificidad de esta respuesta confirma que CCL20, de hecho, media la actividad fenotípica de las CSC. Sin embargo, dado que el crecimiento en esferas es una medida indirecta de la actividad de las CSC, los presentes inventores buscaron confirmar que CCL20, como un factor aislado, aumenta las CSC directamente. En resumen, las esferas tratadas con o sin 200 pg/ml de CCL20 durante 4 días se sometieron a análisis por citometría de flujo para medir directamente los aumentos dirigidos por CCL20 en la población de las CSC. La FIG. 6 demuestra que el tratamiento con CCL20 aumenta significativamente el porcentaje de las CSC de mama CD44+CD24- del 0,9 ± 0,1 % (sin CCL20) al 1,3± 0,1 % (con CCL20) en células MDAMB468 (p<0,05) (FIG. 6A). De manera similar, las células de cáncer de páncreas Bxpc3 (FIG.6B) y Aspc1 (FIG. 6C) muestran aumentos significativos en sus frecuencias de CSC Epcam+CD44highCD24high tras la estimulación con CCL20, del 0,9 ± 0,1 % al 1,2 ± 0,1 % en Bxpc3 y del 2,7 ± 0,1 % al 3,6 ± 0,4 % en Aspc1 (p<0,05 en ambos tipos celulares). Además del crecimiento en esferas y de la citometría de flujo, los presentes inventores y otros han descubierto que un panel de cinco genes relacionados con las características de las células madre también rastrea bien el fenotipo de las CSC. La expresión de los factores de transcripción NANOG, SOX2 y OCT3/4, que se sabe que están asociados con la pluripotencia, aumenta y reduce con los correspondientes aumentos y reducciones en la población de CSC. La expresión del transcrito de las proteínas polycomb EZH2 y BMI1 se relacionan ambas igual de bien con los cambios en la población de CSC. La FIG. 6 muestra que la adición de 200 pg/ml de CCL20 a esferas con Bxpc3 aumenta de hecho la expresión de los 5 genes relacionados con las características de las células madre después de 4 días de tratamiento. Se descubrieron resultados similares en las líneas celulares Hs578T, SUM159 y Panc1 (FIG.7). Junto con los efectos vistos en el crecimiento de las esferas y los aumentos medidos en el porcentaje de células que llevan marcadores de superficie de CSC, los datos sugieren de hecho que el ligando CCL20 puede promover directamente la actividad de las CSC en las líneas celulares probadas.
EJEMPLO 4: El efecto de CCL20 en células madre cancerosas está mediado por su receptor, CCR6
Aunque los resultados de los experimentos tratados en los Ejemplos 1-3 confirmaron que CCL20 afecta directamente a la actividad de las CSC, quedaba por determinar si CCL20 señalizaba de hecho a través de su receptor conocido, CCR6, para ejercer su actividad. Los datos representados en la FIG. 5 mostraron que la adición de CCL20 purificado estimuló el crecimiento en las esferas. A partir de esto, se diseñó un experimento para evaluar si el efecto de CCL20 estaba mediado a través de la señalización a través de su receptor CCR6, razonando que si CCL20 ejercía su función a través de la señalización de CCR6, la inactivación génica de CCR6 evitaría el crecimiento en esferas estimulado por CCL20.
En la FIG. 8A, los presentes inventores muestran que el CCL20 humano recombinante (rhCCL20) pierde la capacidad para estimular el crecimiento en esferas en células de cáncer colorrectal Lovo tras la inactivación génica de CCR6 con ARNip 20 nM, mientras que las células transfectadas con ARNip de control sin diana (20 nM) conservaron su respuesta de crecimiento para CCL20. Para confirmar que CCR6 era un componente necesario para este eje de CCL20 en las CSC, los presentes inventores separaron las células CCR6+ de las CCR6- en la línea celular NCIH508, y estimularon ambas fracciones con 100 pg/ml de CCL20 durante 48 horas y posteriormente evaluaron la expresión de los genes relacionados con las características de las células madre. La FIG. 8B muestra que las células CCR6+ respondieron con un aumento de aproximadamente 2 veces en la expresión de NANOG, BMI1, OCT3/4 y SOX2 después de 48 horas de estimulación con 100 pg/ml, cuando se comparó con las células CCR6-. Estos resultados demuestran que la actividad asociada a CSC en respuesta a la estimulación con CCL20 depende de la presencia de CCR6 como el receptor. Para apoyar más este descubrimiento, los presentes inventores observaron que la inhibición de este eje CCL20-CCR6 en las células tumorales, bien por pérdida de CCL20 o por pérdida de CCR6, dio como resultado, un resultado similar del crecimiento en esferas (FIG. 8C y 8D). La inactivación génica mediada por ARNi para CCL20 o CCR6 redujo el crecimiento en esferas en un grado similar den células NCIH508, principalmente el 59,6 ± 2,9 % o el 70,3 ± 2,2 % en comparación con el ARNip de control sin diana (100,0 ± 2,0 %, p<0,001) (FIG. 8C). La misma observación se hizo en células Hs578T en donde la inactivación génica mediada por ARNi redujo el crecimiento en esferas al 55,4 ± 3,9 % con ARNip de CCL20 y el 21,8 ± 1,8 % con ARNip de CCR6, en comparación con el crecimiento del 100,0 ± 7,0 % con ARNip de control (p<0,001) (FIG.
8D). En conjunto, los resultados confirman que el eje CCL20-CCR6 es responsable de promover los efectos de CCL20 sobre las CSC.
EJEMPLO 5: La neutralización de CCL20 inhibe la actividad de células madre cancerosas
Como validan los ejemplos anteriores, CCL20 es un claro mediador de la actividad de CSC. Este ejemplo evaluó si la neutralización de esta diana podría inhibir a su vez las CSC. Para probar esto, se utilizó en una serie de experimentos un anticuerpo IgG monoclonal disponible comercialmente contra CCL20 del que se había documentado un potencial neutralizante. Una administración de dosis única de 10 |jg/ml de IgG CCL20 redujo de manera significativa la formación de esferas 4 días después del tratamiento en modelos de las tres indicaciones probadas, en comparación con la misma dosis de 10 jg/m l de IgG de control de isotipo (FIG. 9). El crecimiento de esferas de cáncer de mama Hs578T se redujo a un mero 11,1 ± 11,1 % en comparación con el crecimiento en esferas del 100,0 ± 27,2 % con IgG de control (p<0,05, FIG. 9A). De manera similar, el crecimiento de esferas de cáncer colorrectal NCIH508 se redujo al 62,8 ± 5,8 % frente al 100,0 ± 4,8 % con IgG de control (p<0,001, FIG. 9B), mientras que el crecimiento de esferas de cáncer de páncreas Panc1 se redujo al 18,1 ± 2,1 % debajo del 100,0 ± 13,0 % con tratamiento con IgG de control (p<0,001, FIG. 9C). Los controles de selección para la identificación de CSC se ilustran en la FIG 15.
El efecto de la inhibición de CCL20 sobre la reducción de las CSC se confirmó mediante citometría de flujo, en donde un tratamiento similar de 4 días de esferas de Bxpc3 con una administración de dosis única de 10 jg/m l de IgG de CCL20 redujo el porcentaje de CSC Epcam+CD44+CD24+ al 4,5 ± 0,4 %, debajo del 5,6 ± 0,1 % con 10 jg/m l de tratamiento de IgG de control (p<0,05, FIG. 9D). La frecuencia de CSC de páncreas del panel se redujo en esferas del 9,3 ± 0,9 con tratamiento con IgG de control al 6,6 ± 0,7 % después de la IgG de CCL20 (p<0,05, FIG. 9E). En conjunto, estos resultados confirman que la neutralización de CCL20 con un anticuerpo monoclonal se pueden usar de hecho como un posible agente terapéutico para reducir la población de CSC, lo que revela una oportunidad prometedora para CCL20 como diana para terapias anti-CSC.
EJEMPLO 6: La movilidad de los T reg está mediada por CCL20 producido por las CSC.
Se sabe que el CCL20 dirige la migración quimiotáctica de las células inmunitarias CCR6+, predominantemente en los subconjuntos de linfocitos B, linfocitos T y células dendríticas. Como control positivo, los presentes inventores confirmaron que la capacidad de una IgG anti-CCL20 para bloquear la migración quimiotáctica de un tipo celular conocido, principalmente linfocitos T CD4+. La FIG. 10 confirma que la IgG anti-CCL20 dosificada a 30 nM, puede inhibir de manera significativa la migración quimiotáctica de los linfocitos T CD4+ aislados de la sangre periférica de 2 donantes humanos sanos.
Para probar si el CCL20 producido por las CSC puede influir en la migración de los Treg, los presentes inventores sesgaron los linfocitos T CD4+ humanos sin exposición previa hacia los linfocitos T reguladores de tipo 1 (TR1) en cultivo tal como se describe anteriormente en los materiales y métodos. El análisis de citometría de flujo de las células confirmó que los linfocitos TR1 se parecen a los T reg por el fenotipo de superficie, ya que son predominantemente linfocitos T CD3+/CD4+/CD25+/FOXP3+ y que estos linfocitos Tr 1 expresaban CCR6 (FiG. 11). Un ensayo de migración transpocillo reveló que estos linfocitos TR1 podrían migrar selectivamente hacia CCL20 aislado, por lo que el 14,7 ± 0,9 % de las células migraron hacia CCL20, en comparación con el 10,2 ± 0,6 % de las células que no migraron específicamente (p<0,01, FIG. 12A). La adición del anticuerpo anti-CCL20 en un exceso molar de 6 veces fue capaz de bloquear esta migración vista por una reducción de la migración celular al 7,9 ± 0,6 % (p<0,01 en comparación con el tratamiento con CCL20 100 nM, FIG. 12A).
A continuación, los presentes inventores se preguntaron si los linfocitos TR1 podrían migrar hacia CCL20 producido por las CSC. Los presentes inventores generaron medio acondicionado por CSC de células de cáncer de colon NCIH508 cultivadas en condiciones de formación de esferas dirigidas por CSC durante 4 días, que se descubrió que contenía CCL20 en una concentración promedio de 211 pg/ml (= 26,4 pM) tal como se determinó mediante ELISA (FIG. 12B). Los linfocitos TR1 (19,3 ± 0,9 %) fueron capaces de migrar hacia el CM de las CSC en comparación con el 10,3 ± 0,6 % de las células que no migraron de manera específica (p<0,01, FIG. 12C). La migración se dirigió de hecho hacia CCL20 en el medio acondicionado dado que la adición de anticuerpo anti-CCL20 neutralizante redujo significativamente la migración hacia el 13,8 ± 0,7 % (p<0,01 en comparación con el Cm de CSC o CM de CSC IgG de control de isotipo, FIG. 12C). La adición de una IgG de control de isotipo no tuvo ningún efecto en la reducción de la migración de TR1 hacia el CM de las CSC (17,9 ± 1,7 % de migración con IgG de control de isotipo). Estos resultados confirman la hipótesis de que los linfocitos T reguladores de tipo 1 pueden migrar hacia el CCL20 producido por las CSC, y por lo tanto, sugiere que los anticuerpos neutralizantes contra CCL20 pueden reducir la infiltración de los Treg en el ambiente tumoral.
EJEMPLO 7: Los anticuerpos neutralizantes de CCL20 reducen la tumorigénesis y la inmunosupresión in vivo
Una vez que se estableció CCL20 como un mediador claro de la actividad de CSC, los presentes inventores investigaron si la neutralización de esta diana podría entonces inhibir a su vez las CSC. Para probar esto, los presentes inventores usaron un anticuerpo monoclonal humano neutralizante comercialmente disponible contra CCL20 (clon 67310; R&D Systems). La capacidad de este anticuerpo para inhibir la actividad de la vía de CCR6 estimulada por CCL20 tanto en un ensayo de AMPc como en un ensayo de translocación de beta-arrestina (FIG. 16A y 16B, respectivamente) confirmaron el potencial de neutralización. La CI50 se midió a 0,8 nM en un ensayo de AMPc cuando las células se estimularon con CCL20 1 nM, mientras que la CI50 se midió a 2,7 nM cuando las células se estimularon con CCL206 nM.
La reducción del contenido de las CSC a través de la neutralización in vitro de CCL20 se tradujo en un retraso en la tasa de absorción tumoral y la tasa de crecimiento tumoral. El tiempo medio para la absorción tumoral en tumores Pancl (% de animales que llevan el tumor) se retrasó en 56,5 días cuando los tumores Panc1 se pretrataron con 10 ug/ml de IgG de CCL20 en comparación con los tumores de Panc1 que se pretrataron con 10 ug/ml de isotipo IgG durante 4 días in vitro antes de la inoculación del tumor (FIG. 17A). La absorción tumoral en este caso se midió a partir del primer caso de formación de tumor palpable. El volumen tumoral promedio para tumores tratados con IgG CCL20 también fue significativamente más pequeño que los tumores tratados con isotipo IgG durante el trascurso del estudio (FIG. 17B).
Para evaluar el papel de la neutralización de CCL20 en modelos de ratón singénico inmunocompetente, los presentes inventores identificaron un anticuerpo monoclonal anti-CCL20 de ratón comercialmente disponible (clon 114908; R&D Systems) con suficiente potencial de bloqueo/neutralización para actuar como un sustituto para el anticuerpo monoclonal anti-CCL20 humano. El anticuerpo IgG anti-CCL20 de ratón fue capaz de inhibir la vía de CCL20-CCR6 de ratón tal como se mide mediante un ensayo de translocación de beta-arrestina con una CI50 de 14,0 nM, cuando las células se estimularon con 1,2 nM de CCL20 de ratón (FIG. 18). Sin embargo, la potencia de la IgG de CCL20 de ratón se reduce notablemente en comparación con la IgG de CCL20 humano (descrito en 0174) cuando la proporción de CCL20 frente al valor de CI50 del anticuerpo se compara entre humano y ratón.
Se usaron modelos de tumores singénicos para evaluar el efecto de la neutralización de CCL20 in vivo en células inmunitarias periféricas e infiltrantes de tumor. La línea celular de carcinoma de mama de ratón 4T1 es conocida por expresar CCL20 de forma natural y, por lo tanto, se eligió para este estudio. A los ratones inmunocompetentes se les realizó un xenoinjerto por vía subcutánea con células 4T1 coincidentes con HLA y se les dio una dosis de IgG anti-CCL20 de ratón o IgG de control de isotipo coincidente a 10 mg por kg dos veces por semana para 4 dosis consecutivas una vez que los tumores habían alcanzado aproximadamente 50-100 mm3. El inmunofenotipado cadavérico se realizó en el bazo y en el tejido tumoral extraído 24 horas después de la 4a dosis.
La frecuencia de los subconjuntos de células inmunitarias mieloides se determinó mediante citometría de flujo multicolor de acuerdo con el esquema de selección representado en la FIG. 19 para el bazo y en la FIG. 20 para el tejido tumoral. Los controles de completo menos uno (FMO) se usaron para la selección, para identificar células que eran positivas frente a negativas para cualquier marcador particular en el panel.
Los datos indican que el tratamiento in vivo con una IgG anti-CCL20 afecta significativamente a la frecuencia de células periféricas e infiltrantes en el tumor. En el bazo, la inhibición de CCL20 provocó una reducción significativa para los linfocitos Treg foxp3+ (FIG. 21A) y los Th17 rorYt+ (FIG. 21B), por lo que la frecuencia de ambas poblaciones se redujo aproximadamente 2 veces en comparación con los animales tratados con el control de isotipo (Treg del 11,5 ± 0,4 % frente a 6,5 ± 1,2 % y Th17 de 4,7 ± 0,4 % frente a 2,2 ± 0,5 % en animales tratados con isotipo IgG frente a IgG anti-CCL20, respectivamente). Este mismo efecto también se capturó en el tumor, en donde la frecuencia de los T reg se redujo del 1,5 ± 0,05 % tras el tratamiento con el isotipo IgG al 1,0 ± 0,1 % en respuesta al tratamiento de IgG anti-CCL20 (FiG. 22A), y la frecuencia de las células Th17 también se redujo del 0,4 ± 0,05 % en tumores tratados con el isotipo IgG al 0,3 ± 0,02 % después del tratamiento de IgG de CCL20 (FIG. 22B). Este resultado sugiere que el bloqueo de CCL20 in vivo lleva tanto a la reducción periférica como específica de tumor de 2 tipos celulares conocidos por promover la inmunosupresión en el ambiente tumoral, principalmente Treg y Th17, lo que sugiere que las terapias que inhiben CCL20 pueden ayudar a aliviar la inmunosupresión como parte de una estrategia terapéutica contra el cáncer.
Además del efecto que ejerce el CCL20 sobre las poblaciones de T reg y Th17, la neutralización de CCL20 también afectó de manera significativa a las células dendríticas. En el ambiente tumoral, la frecuencia de células dendríticas se redujo del 18,2 ± 2,2 % en ratones tratados con el isotipo IgG al 11,9 ± 2,3 % tras el tratamiento con el IgG de CCL20 (FIG. 22C, no significativo). Esta disminución se atribuyó principalmente a la reducción significativa en células dendríticas maduras cd83+ (FIG. 22E), pero no en células dendríticas inmaduras cd83- (FIG. 22D). Al contrario de esto, en el bazo, la neutralización de CCL20 provocó un aumento significativo en las células dendríticas, del 6,9 ± 0,5 % en ratones tratados con isotipo IgG al 9,8 ± 0,6 % en ratones tratados con IgG de CCL20 (FIG. 21C). El aumento en células dendríticas fue predominantemente para un aumento en células dendríticas inmaduras cd83- (FIG. 21D), no para células dendríticas maduras cd83+ (FIG. 21E). Este resultado indica que la neutralización de CCL20 in vivo inhibe la maduración de células dendríticas y posteriormente la infiltración de este tipo celular en el tumor.
No se encontraron cambios en los perfiles de las poblaciones de células inmunitarias restantes, principalmente en linfocitos T cd8+ y células supresoras que provienen de neutrófilos/granulocitos mieloides (gMDSC) en el bazo o en los tumores de ratones tratados con anti-CCL20 en comparación con los ratones tratados con control de isotipo (datos no mostrados).
DISCUSIÓN
Los datos en los ejemplos anteriores demuestran una función no identificada anteriormente e inesperada para el eje CCL20-CCR6 además de su papel conocido en el reclutamiento de células inmunitarias. En particular, los estudios presentados en el presente documento demuestran que en relación con el cáncer, CCL20 tiene un papel específico en la función de las CSC, lo que representa un hallazgo no documentado anteriormente. En varios de los ejemplos ilustrativos, los resultados muestran que en modelos de cáncer de mama, colorrectal y de páncreas, CCL20 se sobreexpresa de manera específica por las CSC cuando se compara con células tumorales no CSC, tanto en el transcrito como a nivel proteico. Los ejemplos también confirman un papel funcional de la proteína CCL20 en la actividad de las CSC, ya que la administración exógena de CCL20 a cultivos celulares proporciona un aumento directo en el porcentaje de CSC según se determina mediante análisis de marcadores de superficie. CCL20 también aumenta la función de autorrenovación y proliferación de las CSC tal como se ve por su efecto en el aumento de manera directa de la activación de genes de características de células madre y el crecimiento en esferas, respectivamente. In vitro, CCL20 ejerce actividad sobre las CSC a concentraciones fisiológicamente relevantes que no solo son similares a los niveles secretados en el medio de cultivo en los estudios de los presentes inventores, sino también similares a los niveles en circulación detectados en pacientes con cáncer colorrectal con mal pronóstico (Iwata et al., 2013).
Aunque esta actividad de CCL20 sobre las CSC fue un descubrimiento inesperado, también se ha demostrado que otras quimiocinas/citocinas tienen un efecto directo sobre la actividad de las CSC. Tanto la interleucina-6 (IL6) como la interleucina-8 (IL8) han demostrado que proporcionan efectos directos sobre las CSC de mama (Ginestier et al., 2010; Iliopoulos et al., 2011). De manera similar, la modulación del ligando del motivo CXC 12 (CXC12) ha demostrado que modula las CSC de glioblastoma (Wurth et al., 2014), mientras que la actividad de CCL3 se colocó en el contexto de células de iniciación de la leucemia LMC (Baba et al., 2013). Por lo tanto, junto con este hallazgo, un creciente cuerpo de evidencia apunta hacia un papel para los mediadores fuera de las vías de autorrenovación convencionales como la señalización Notch, Wnt y Hedgehog para regular la función de las CSC. Dada la relación única entre CCL20 y el receptor CCR6, los presentes inventores plantean la hipótesis de que CCL20 debe ejercer su actividad sobre las CSC mediante la señalización a su receptor CCR6. Mediante inactivación génica de CCR6, los presentes inventores confirman que el receptor era realmente necesario para la actividad de CCL20 en la promoción de la actividad de CSC funcional. Pero además, cuando separaron las líneas de células cancerosas en fracciones que eran positivas o negativas para el receptor, los presentes inventores descubrieron que solo las células positivas para el receptor mostraban activación de genes de características de células madre después de la estimulación con CCL20. Por último, la observación de que las CSC parecen localizarse en su mayoría con un fenotipo de superficie celular CCL20+/CCR6+ sugiere que la actividad de CCL20 en las CSC podría ser el resultado de un bucle autocrino, aunque se necesitarían más estudios para confirmar esta hipótesis. En conjunto, esta evidencia apoya la conclusión de que CCL20 ejerce su actividad en las CSC mediante la señalización a través de su receptor CCR6 en las células tumorales y que, por lo tanto, el eje CCL20-CCR6 en su conjunto puede implementarse en la actividad de las CSC en cáncer de mama, páncreas y colorrectal.
Una reciente publicación demostró que los ratones APCmin mostraron una tumorigénesis intestinal reducida cuando se inactivó el gen de CCR6 (Nandi et al., 2014). Este resultado implicó al eje CCL20-CCR6 en la iniciación del tumor en el intestino, fortaleciendo nuevamente el papel de este eje en los eventos subyacentes al desarrollo y progresión del tumor. Dado el hallazgo de los presentes inventores de que este eje CCL20-CCR6 es relevante para el fenotipo de CSC, anticipan que la intervención terapéutica de este eje podría ayudar a erradicar las CSC. De hecho, descubrieron que el tratamiento con un anticuerpo monoclonal neutralizante contra CCL20 disminuye significativamente la frecuencia y actividad de las CSC en modelos de los tres tipos de tumores probados. Si bien los presentes inventores ven que la neutralización de CCL20 reduce directamente el porcentaje de las CSC de fenotipo de superficie positivo en modelos de cáncer de páncreas, también encuentran que la neutralización de CCL20 inhibe significativamente el crecimiento de esferas en modelos de cáncer de mama, páncreas y colorrectal. Estos resultados confirman que pueden inhibir no solo los números de CSC sino, lo que es más importante, la función de las CSC.
In vivo, la función de las CSC se puede medir por su potencial de tumorigénesis. Los presentes inventores descubrieron que el tratamiento de esferas de cáncer de páncreas enriquecidas con CSC con un anticuerpo monoclonal neutralizante de CCL20 retrasa drásticamente el inicio de la formación de tumores en modelos de ratón. Además, los tumores que se forman a partir de CSC tratadas con IgG anti-CCL20 muestran una reducción significativa en el crecimiento tumoral en comparación con los tumores tratados con control de isotipo. Este hallazgo confirma que el papel de CCL20 en la dirección de la función de CSC, identificado en los ejemplos anteriores, se traduce en un impacto in vivo sobre la tumorigénesis y la tasa de crecimiento tumoral.
Dado que el eje CCL20-CCR6 proporciona una función de referencia en el reclutamiento de células inmunitarias, los presentes inventores plantean la hipótesis de que el CCL20 secretado por CSC podría influir potencialmente en el reclutamiento de linfocitos infiltrantes de tumores además de su efecto directo sobre las células tumorales. Chen et al. mostró evidencia de que los niveles de CCL20 se correlacionaban directamente con los niveles de linfocitos T reguladores en biopsias tumorales de pacientes con carcinoma hepatocelular, y que CCL20 promovía significativamente la migración de linfocitos T reguladores en esta indicación (Chen et al., 2011). Dada la asociación de los linfocitos T reguladores con un mal pronóstico en muchos tipos de tumores (Want et al. 2012), uno podría imaginar un mecanismo por el cual CCL20 promueve la tumorigenicidad a través de un golpe uno-dos, tanto regulando la fracción de CSC como estimulando el reclutamiento. de linfocitos T reguladores inmunosupresores al entorno tumoral.
Cuando se probó in vivo utilizando ratones portadores de tumores inmunocompetentes, los presentes inventores confirmaron de hecho que la neutralización de CCL20 inhibe la infiltración de Treg en el tumor. Sin embargo, la neutralización de CCL20 también inhibió la infiltración de Th17 en el tumor, un hallazgo que se esperaba ya que los linfocitos Th17 se caracterizan como CCR6+. Curiosamente, descubrieron que la inhibición de CCL20 no solo afecta la frecuencia de estos dos tipos de células inmunitarias en el tumor, sino que también reduce la frecuencia de linfocitos Treg y Th17 en el bazo, lo que sugiere una respuesta periférica al inhibir estos dos tipos de células más allá de la mera infiltración tumoral. Contrariamente a esto, también identificaron que la neutralización de CCL20 redujo la frecuencia de células dendríticas maduras en el tumor, sin embargo, este hallazgo fue contrarrestado por la presencia de un aumento de células dendríticas inmaduras en el bazo. Este resultado sugiere que CCL20 también juega un papel en la maduración y luego la invasión de células dendríticas en el entorno del tumor.
Dada la asociación de linfocitos Treg y Th17 con mal pronóstico e inmunosupresión en muchos tipos de tumores, y el hallazgo de que CCL20 reduce significativamente la frecuencia de estos dos tipos de células en el tumor y el bazo, los hallazgos generales de los presentes inventores proponen que CCL20 desempeña un papel doble en el entorno tumoral: 1) impulsando la actividad y la capacidad tumorigénica de las CSC, y 2) promoviendo un fenotipo inmunosupresor.
Una gran cantidad de evidencia preclínica y clínica apunta a una función crítica de las CSC en el tratamiento del cáncer, por lo que los tratamientos dirigidos a esta población de células tumorales pueden ser de gran valor. El trabajo descrito en este documento apunta no solo a un papel nuevo e importante para el eje CCL20-CCR6 en el mantenimiento de CSC, sino también a un papel crítico para CCL20 en el apoyo de un fenotipo inmunosupresor. Este hallazgo apoya la hipótesis de que CCL20 actúa promoviendo tumores en dos frentes, promoviendo la función de las CSC y obstaculizando la respuesta inmune antitumoral. Los datos de los presentes inventores indican que la neutralización de CCL20 puede ser una estrategia útil para inhibir simultáneamente la función de las CSC y aliviar el fenotipo inmunosupresor. En general, los presentes inventores plantean la hipótesis de que, mediante este mecanismo dual, la inhibición de las CSC mediante el bloqueo de CCL20 podría permitir terapias únicas y eficaces para tratar el cáncer y mejorar la vida de los pacientes.
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Claims (4)

REIVINDICACIONES
1. Un método para determinar la presencia de una célula madre cancerosa (CSC) en una muestra que comprende células cancerosas, comprendiendo el método:
- poner en contacto la muestra con un agente que se una a una secuencia de ácido nucleico de CCL20 o a una secuencia de aminoácidos de CCL20;
- detectar la presencia o la ausencia de la unión entre el agente y la secuencia de ácido nucleico de CCL20 o la secuencia de aminoácidos de CCL20; e
- identificar la presencia de la CSC en la muestra tras la detección de la unión entre el agente y la secuencia de ácido nucleico de CCL20 o la secuencia de aminoácidos de CCL20.
2. El método de la reivindicación 1 en donde el agente comprende además un resto detectable.
3. El método de la reivindicación 1 o 2, que además comprende cuantificar la cantidad de la secuencia de ácido nucleico de CCL20 o de la secuencia de aminoácidos de CCL20 en la muestra, comparar la cantidad de la secuencia de ácido nucleico de CCL20 o de la secuencia de aminoácidos de CCL20 con un nivel de referencia de la secuencia de ácido nucleico de CCL20 o de la secuencia de aminoácidos de CCL20, e identificar la presencia de la CSC en la muestra cuando la cantidad detectada es mayor que la del nivel de referencia.
4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el agente comprende (i) una secuencia de ácido nucleico que hibrida con la secuencia de ácido nucleico de CCL20 en condiciones rigurosas de hibridación, o (ii) un anticuerpo que se une específicamente a la secuencia de aminoácidos de CCL20.
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