JP5967161B2 - 細胞の上皮性維持に作用する物質のスクリーニング方法 - Google Patents
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Description
(1)細胞播種および観察
細胞培養容器NanoCulture(登録商標)ディッシュ(SCIVAX社製、35mmディッシュ、凹凸構造面の材質=ポリメチルペンテン(三井化学社製TPX)、凹凸構造の平面形状=正方形、単位構造間の幅(線幅)=700nm、単位構造の最小内径=3μm、深さ=1μm)に、細胞を2.5×105cellsで播種し、培養3日目に光学顕微鏡にて観察を行った。細胞としては、ヒト膵臓癌細胞株、BxPC−3,Capan−1,Capan−2,AsPC−1,PANC−1,MIAPaCa−2を用いた。培地は、BxPC−3、AsPC−1,PANC−1については10%FBS含有RPMI1640培地、Capan−1については10%FBS含有MEM培地、Capan−2については10%FBS含有McCoy’s 5A培地、MIAPaCa−2については10%FBS含有DMEM培地を用いた。
(1)と同様の細胞培養容器NanoCulture(登録商標)ディッシュ(SCIVAX社製、35mmディッシュ)に、(1)と同様の細胞を播種し、5日間培養した後、当該細胞をピペッティングにより回収した。回収した当該細胞をPBSで洗浄し、溶解バッファーにて溶解した細胞溶解液をサンプルとした。次に、各種細胞株のサンプル(タンパク質20μg分)をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法(SDS−PAGE)により分離し、その後、タンパク質をPVDF膜に転写した。タンパク質の検出は、一次抗体として抗E−cadherinマウスモノクローナル抗体(BD Biosciences: Cat#610182))、二次抗体としてHRPラベルされた抗マウス抗体(Santa Cruz: sc-2005)、検出試薬としてECL Plus Western Blotting Detection System(GEヘルスケア社製)を用いて行った。
(1)プレインキュベーション
細胞培養容器NanoCulture(登録商標)プレート(SCIVAX社製、384ウェルプレート、凹凸構造面の材質=ポリメチルペンテン(三井化学社製TPX)、凹凸構造の平面形状=正方形、単位構造間の幅(線幅)=700nm、単位構造の最小内径=3μm、深さ=1μm)に、5%FBS及び1.0%Matrigel(登録商標)含有DMEM培地を各ウェルに25μlずつ添加し、1000×gで5分間遠心した。
ヒト肺がん細胞由来株A549を5%FBS含有DMEM培地で13.5×104cells/mlに調整した細胞懸濁液を、25μlずつ前述したプレートの各ウェルに添加した(細胞数は3.4×103cells/well、培地添加物の最終濃度は5%FBS、0.5%Matrigel)。
培養3日目に、上皮−間葉転換誘導剤であるTGF−β2(R&Dsystems社製;302−B2−002)及びTNF−α(R&Dsystems社製;210−TA−010)を、それぞれ最終濃度が5ng/ml及び10ng/mlになるように各ウェルに添加した。それと同時に、TGF−β2の阻害剤であるSB431542(MiltenyiBiotec社製;130−095−561)を最終濃度が10μMになるように添加した。SB431542を添加しないすべてのウェルには最終濃度0.1%となるようにジメチルスルホキシドを添加した。
培養5日目に、低酸素領域検出用試薬LOX−1(SCIVAX社製)を最終濃度が2μMになるように各ウェルに添加した。LOX−1は、赤色燐光を発するイリジウム錯体を含有する試薬である。
培養6日目に、蛍光顕微鏡による観察を行った。
実施例2で確認されたスフェロイドの形態の変化が、上皮−間葉転換及び上皮−間葉転換阻害を反映しているのか否かを検証するために、上皮又は間葉系マーカーとして知られている遺伝子について、その発現レベルをqRT−PCRにより測定した結果を図6〜図9に示す。(1)プレインキュベーション〜(3)上皮−間葉転換の誘導剤及び阻害剤の添加までの工程は、実施例2に示したものと同様に行った。そして、培養6日目に、各サンプルからRNeasy Plus Mini Kit(QIAGEN社製)を用いて全RNAを抽出し、そのRNAをPrimeScript RT reagent Kit(タカラバイオ社製)を用いて逆転写したものを、qRT−PCRに用いた。PCRにはSYBER Premix Ex TaqII(タカラバイオ社製)を用いた。またその反応および検出にはThermal Cycler Dice(タカラバイオ社製)を用いた。PCRに用いたプライマーは下記表1に示す。なおデータは、内部標準遺伝子(TBP)の発現量で補正したうえで、コントロールの発現量を1とした場合の相対値として示した。
2 線
Claims (8)
- (a)スフェロイド形成可能な培養基材上で細胞を培養する工程と、(b)前記細胞と被験物質とを接触させる工程と、(c)スフェロイドの外観及び/又は内部構造の形態の変化を視覚的に観測し、当該観測した変化を上皮マーカー及び/又は間葉マーカーの発現量の指標として、被験物質が前記細胞の上皮性維持に及ぼす効果を評価する工程であり、上皮マーカーの発現量の増加及び/又は間葉マーカーの発現量の低下による形態の変化が観測された場合には、被験物質が前記細胞の上皮性を維持する効果があると評価する工程と、を含む細胞の上皮性維持に作用する物質のスクリーニング方法。
- 前記工程(c)は、前記観測した変化をE−cadherin発現量の指標として、E−cadherin発現量の増加による形態の変化が観測された場合には、上皮−間葉転換に対する被験物質の抑制・阻害作用効果があると評価することを特徴とする請求項1に記載のスクリーニング方法。
- 前記工程(c)は、前記観測した変化を、N−cadherin、Vimentin及びZEB1から選ばれる少なくとも何れか1以上の間葉系マーカーの発現量の指標として、N−cadherin、Vimentin及びZEB1から選ばれる少なくとも何れか1以上の間葉系マーカーの発現量の低下による形態の変化が観測された場合には、間葉−上皮転換に対する被験物質の促進・誘導作用効果があると評価することを特徴とする請求項1に記載のスクリーニング方法。
- 前記スフェロイドの形態は、スフェロイドの形、スフェロイドの大きさ、所定のサイズ以上のスフェロイドの数、スフェロイドを形成していない細胞の数、スフェロイド内の低酸素領域、及びスフェロイド内の酸素濃度から選ばれる少なくとも何れか1以上の形態であることを特徴とする請求項1に記載のスクリーニング方法。
- 前記上皮マーカーの発現量の増加及び/又は間葉マーカーの発現量の低下による形態の変化は、被験サンプル群においてネガティブコントロール群と比して、スフェロイドのサイズが大きくなること、所定のサイズ以上のスフェロイドの数が増加すること、スフェロイドの円形度がより1に近付くこと、スフェロイド内の低酸素領域が大きくなること、及びスフェロイド内の酸素濃度が低くなることから選ばれる少なくとも何れか1以上の変化であることを特徴とする請求項1に記載のスクリーニング方法。
- 前記スフェロイドの形態は、スフェロイドの形、スフェロイドの大きさ、所定のサイズ以上のスフェロイドの数、及びスフェロイドを形成していない細胞の数から選ばれる少なくとも何れか1以上の形態であることを特徴とする請求項1に記載のスクリーニング方法。
- 前記上皮マーカーの発現量の増加及び/又は間葉マーカーの発現量の低下による形態の変化は、被験サンプル群においてネガティブコントロール群と比して、スフェロイドのサイズが大きくなること、所定のサイズ以上のスフェロイドの数が増加すること、及びスフェロイドの円形度がより1に近付くことから選ばれる少なくとも何れか1以上の変化であることを特徴とする請求項1乃至3いずれかに記載のスクリーニング方法。
- 前記工程(c)の内部構造の形態の変化は、スフェロイド内の低酸素領域を検出可能な試薬を用いて観測することを特徴とする請求項1乃至3いずれかに記載のスクリーニング方法。
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