CN102792160A - 用于治疗癌症的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了用于检测癌细胞是否有可能对mTOR抑制剂治疗具有抗性的方法。所述方法可包括检测细胞中或细胞的PPP2R2B (GenBank登录号：NM_181678)。可选地或此外，所述方法可包括检测所述细胞中或所述细胞的PDK1(GenBank登录号：NM_002613)。所述方法可包括检测所述细胞中或所述细胞的PPP2R2B启动子的甲基化。所述方法可包括检测所述细胞中或所述细胞的PPP2R2B表达和/或活性。所述方法可包括检测PDK1介导的Myc磷酸化活性。本发明还提供了用于为患有或疑似患有癌症的个体选择治疗的方法、用于确定患有癌症或疑似患有癌症的个体是否会对mTOR抑制剂治疗作出响应的方法，用于提高癌细胞对mTOR抑制剂治疗的敏感性的方法，用于治疗或预防患有癌症或疑似患有癌症的个体的癌症。本发明进一步提供了PDK1表达和/或活性的抑制剂和mTOR抑制剂的组合，其用在治疗或预防癌症的方法中。

Description

用于治疗癌症的方法和组合物
技术领域
本发明涉及医药、细胞生物学、分子生物学和遗传学领域。本发明涉及医药领域。具体地，本发明涉及诸如癌症的疾病的治疗和诊断，以及用于此应用的组合物。
背景技术
蛋白质磷酸酶2A(PP2A)作为包含催化亚基C、结构亚基A和大量调节亚基B中的一种的多聚体酶而发挥作用。真核细胞包含200多种在生化上各不相同的PP2A复合体，其源自A、B、C以及其他亚基的不同组合。调节亚基以组织特异性的方式表达，导致不同的哺乳动物组织中存在不同的PP2A复合体(Virshupand Shenolikar,2009)。此外，提供底物特异性并催化不同的去磷酸化事件以产生不同的功能结果的是这些调节亚基而不是催化亚基。
尽管已经在多种永生化人细胞类型中证明了PP2A的肿瘤抑制作用(Chen etal.,2004;Eichhorn et al.,2009;Janssens and Goris,2001;Rangarajan et al.,2004;Sablina et al.,2007;Zhao et al.,2003)，但尚没有针对PP2A在人恶性病中普遍失活的遗传学和/或表观遗传学证据。可导致丧失B亚基结合的PP2A复合体的A亚基的体细胞突变(Ruediger et al.,2001)仅见于占15%的某些人癌症中(Calin etal.,2000;Ruediger et al.,2001;Takagi et al.,2000;Tamaki et al.,2004;Wang et al.,1998;Westermarck and Hahn,2008)，且仅在某些癌细胞系中报道了PP2A亚基B56γ3的表达下降(Chen et al.,2004;Zhao et al.,2003)。总而言之，如同其对癌症信号转导或靶向治疗的治疗响应的影响，PP2A复合体在人癌症中的遗传学或表观遗传学变化仍有待阐释。
PP2A调控的癌症信号转导途径之一是mTOR途径，mTOR是很多癌症细胞所依赖以获得生长优势的PI3K途径的关键组分(Guertin and Sabatini,2007;Sabatini,2006)。尽管小分子mTORC1抑制剂，例如雷帕霉素(rapamycin)及其类似物已经显示了其在癌症治疗应用中的合理前景并且已经批准用于临床应用(Guertin and Sabatini,2007;Hudes et al.,2007)，但这些抑制剂仅取得了有限的成功，且临床结果无法预测。由于已知的雷帕霉素抗性机理将其与其通过PI3K和mTORC2的AKT磷酸化的反馈激活相联(O'Reilly et al.,2006;Sarbassov et al.,2006)，因此，关于抗性机理的进一步理解和鉴定有助于预测治疗响应的生物标记成为了重要话题(Mao et al.,2008;Scott et al.,2009;Thomas et al.,2006)。
发明内容
本发明描述了在人结肠直肠癌(CRC)中，启动子DNA的高甲基使PP2A全酶的B亚基PPP2R2B(其编码B55β)在表观遗传学上失活。
本发明人证明了PP2A-PPP2R2B复合体通过减轻PDK1指导的Myc磷酸化而发挥肿瘤抑制剂的作用。CRC中导致雷帕霉素抗性的这种特异性PP2A复合体的丧失产生了响应mTORC1抑制剂雷帕霉素的强的Myc磷酸化。
令人感兴趣的是，不同于雷帕霉素诱导的AKT磷酸化，雷帕霉素诱导的Myc磷酸化不需要P13KCA，但依赖PDK1。
因此，本发明人发现了控制PDK1-Myc信号转导的新肿瘤抑制机理，并且证明了此调控中的缺陷产生对基于mTOR的癌症疗法的抗性。
根据本发明的第一方面，本发明人提供了用于测定癌细胞是否可能对mTOR抑制剂治疗具有抗性的方法，所述方法包括检测所述细胞中或所述细胞的：(i)PPP2R2B(GenBank登录号：NM_181678)，或(ii)PDK1(GenBank登录号：NM_002613)，或以上二者。
所述方法可包括检测所述细胞中或所述细胞的PPP2R2B启动子的甲基化。所述方法可包括检测PPP2R2B启动子的高甲基。所述甲基化或高甲基可与没有mTOR抑制剂抗性的癌细胞进行比较。检测到高甲基可表明所述癌细胞可能对mTOR抑制剂的治疗具有抗性。
所述方法可包括检测所述细胞中PPP2R2B或PDK1或以上二者的表达或活性。所述PDK1活性可包括PDK1介导的Myc磷酸化活性。
所述方法可以是：与没有mTOR抑制剂抗性的癌细胞相比之下PPP2R2B表达和/或活性的下降表明，所述癌细胞可能对mTOR抑制剂的治疗具有抗性。所述方法可以是：与没有mTOR抑制剂抗性的癌细胞相比之下PDK1表达和/或活性的升高表明，所述癌细胞可能对mTOR抑制剂的治疗具有抗性。
根据本发明的第二方面，本文提供了为患有癌症或疑似患有癌症的个体选择治疗的方法，所述方法包括(a)提供所述患者的细胞；(b)通过上文所述的方法检测所述细胞的mTOR抑制剂抗性；和(c)在所述细胞被确定为没有mTOR抑制剂抗性的情况下，选择mTOR抑制剂对所述个体进行治疗，在所述细胞被确定为具有mTOR抑制剂抗性的情况下，则为所述个体选择不同的治疗。
根据本发明的第三方面，本发明人提供了用于测定患有癌症或疑似患有癌症的个体是否会对mTOR抑制剂治疗作出响应的方法。所述方法可包括对所述个体的细胞实施如上文所述的方法。所述方法可包括，在所述细胞被确定为没有mTOR抑制剂抗性的情况下，确定所述个体可能对mTOR抑制剂治疗作出响应。
在本发明的第四方面，提供了提高癌细胞对mTOR抑制剂治疗的敏感性的方法，所述方法包括提高所述细胞中或所述细胞的PPP2R2B表达和/或活性，或降低PDK1表达和/或活性，或上述二者。
根据本发明的第五方面，本发明人提供了用于治疗或预防患有癌症或疑似患有癌症的个体的癌症的方法，所述方法包括提高所述个体中或所述个体的PPP2R2B表达和/或活性，或降低PDK1表达和/或活性，或上述二者。
所述方法可以是：通过减少PPP2R2B启动子的甲基化而提高PPP2R2B的表达。可通过使所述细胞暴露于，或向患者施用去甲基化试剂，例如5-aza-dC或阿扎胞苷(Azacitidine)而实现所述PPP2R2B启动子的甲基化。
所述方法可包括使所述细胞暴露于，或向患者施用PDK1抑制剂，例如BX912(CAS登录号：702674-56-4)或BX795(CAS登录号：702675-74-9)。
在第六方面，本发明提供了用于治疗或预防患有癌症或疑似患有癌症的个体的癌症的方法，所述方法包括施用PDK1表达和/或活性的抑制剂和mTOR抑制剂。
在本发明的第七方面，提供了PDK1表达和/或活性的抑制剂和mTOR抑制剂的组合，其用在治疗或预防癌症的方法中。
根据本发明的第八方面，本发明人提供了PDK1表达和/或活性的抑制剂和mTOR抑制剂的组合在制备用于治疗或预防癌症的药物中的应用。
根据本发明的第九方面，本发明人提供了PPP2R2B或PDK1或以上二者的应用，其作为用于癌细胞对mTOR抑制剂的敏感性的生物标记，或作为用于结肠直肠癌(CRC)，例如雷帕霉素抗性结肠直肠癌的生物标记。
所述mTOR抑制剂可包括雷帕霉素或其衍生物。所述PDK1抑制剂可包括shRNA、BX912或BX795(或其任意组合)。
根据本发明的第十方面，提供了PDK1或其拮抗剂，其用在治疗结肠直肠癌(CRC)的方法中。
所述癌症可以选自结肠直肠癌(CRC)、膀胱癌、脑癌和食道癌组成的组，优选结肠直肠癌(CRC)。
除非另有指明，可采用本领域普通技术人员能力范围之内的化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术实施本发明。此类技术阐述于文献中。参见，例如J.Sambrook，E.F.Fritsch,and T.Maniatis,1989,MolecularCloning:A Laboratory Manual,Second Edition,Books 1-3,Cold Spring HarborLaboratory Press；Ausubel,F.M.et al.(1995and periodic supplements；CurrentProtocols in Molecular Biology,ch.9,13,and 16,John Wiley&Sons,New York,N.Y.)；B.Roe,J.Crabtree,and A.Kahn,1996,DNA Isolation and Sequencing:Essential Techniques,John Wiley&Sons；J.M.Polak and James O’D.McGee,1990,In Situ Hybridization:Principles and Practice；Oxford University Press；M.J.Gait(Editor),1984,Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,Irl Press；D.M.J.Lilley and J.E.Dahlberg,1992,Methods of Enzymology:DNA Structure Part A:Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology,Academic Press；Using Antibodies:A Laboratory Manual:Portable Protocol NO.I by Edward Harlow,David Lane,Ed Harlow(1999,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ISBN0-87969-544-7)；Antibodies:A Laboratory Manual by Ed Harlow(Editor),DavidLane(Editor)(1988,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ISBN 0-87969-314-2),1855.Handbook of Drug Screening,edited by Ramakrishna Seethala,Prabhavathi B.Fernandes(2001,New York,NY,Marcel Dekker,ISBN 0-8247-0562-9)；and LabRef：A Handbook of Recipes,Reagents,and Other Reference Tools for Use at theBench,Edited Jane Roskams and Linda Rodgers,2002,Cold Spring HarborLaboratory,ISBN 0-87969-630-3。这些通用内容分别通过引用并入本文。
附图说明
图1：CRC中启动子DNA的高甲基使丧失PPP2R2B表达。
图1A：通过Illumina阵列分析测定的，在24对源自患者的CRC和配对的正常结肠粘膜中的PPP2R2B差异表达。PPP2R2B-mRNA的表达以相对于log2表示。**p<0.001。
图1B：24对结肠直肠肿瘤(T)和配对的正常粘膜(N)中PP2A亚基表达的层次聚类。
图1C：随机选择的8对人CRC(T)和配对粘膜(N)的PPP2R2B表达的RT-PCR分析。使用β-肌动蛋白作为PCR对照。
图1D：与正常结肠组织相比，一系列CRC细胞系中的PPP2R2B、PPP2R2A和PPP2R5C的RT-PCR分析。
图1E：CRC细胞系中的PPP2R2B启动子的甲基化特异性PCR(MSP)分析。
图1F：8种肿瘤和正常对照中PPP2R2B启动子的MSP分析。
图1G：HCT116和DKO，或使用或没有使用5-AzaC(5μM)处理3天的DLD1细胞中PPP2R2B的RT-PCR分析。
图1H：HCT116和DKO细胞中PPP2R2B启动子的MSP分析。
图1I：通过亚硫酸氢盐-测序分析(BGS)对PPP2R2B启动子的甲基化分析。所分析的区域如所图所示。箭头指出了转录起始位点。空心圆代表没有甲基化的CpG；实心圆表示甲基化的CpG。
图2：PPP2R2B作为肿瘤抑制剂的功能取得或损失的分析。
图2A：使用抗-Myc标签抗体或抗-B55亚基抗体，对DLD1-PPP2R2B细胞的内源B55α和异位B55β-Myc的免疫印迹分析。使用或不使用1.0μg/ml强力霉素(Doxycycline，Dox)处理细胞3天。
图2B：使用或没有使用Dox处理96小时的DLD1-PPP2R2B或载体对照细胞的SA-β-gal分析。比例尺=100μm。
图2C：使用或没有使用Dox处理96小时的DLD1-PPP2R2B或载体对照细胞的BrdU掺入。所显示的是三个独立试验的平均值+S.D.。**p<0.001。
图2D：通过软琼脂试验评估使用或没有使用Dox处理12天的DLD1-PPP2R2B或HCT116-PPP2R2B细胞的锚定独立性生长(Anchorageindependent growth)。
图2E：按照试验方法中的描述，每天使用100mg/kg Dox处理的裸鼠中DLD1-PPP2R2B或对照细胞的移植瘤生长。误差线代表S.D.。
图2F和图2G：使用PPP2R2B Smart Pool siRNA(SP)或独立的PPP2R2BsiRNA转染HEK-TERV细胞，通过Taqman试验(图2F)评估PPP2R2B mRNA，并通过软琼脂试验评估集落形成能力(图2G)。左侧显示的是三个独立试验的代表图。使用表达SV40小抗原(ST)的HEK-TERV细胞作为阳性对照。
图3：PPP2R2B-PP2A复合体的恢复导致p70S6K和Myc磷酸化的抑制。
图3A：在存在或缺失Dox 48小时的情况下，HCT116-PPP2R2B或载体对照细胞的所示蛋白的免疫印迹分析。
图3B和图3C：使用或没有使用Dox处理所示时间长度时，DLD1-PPP2R2B或载体对照细胞的免疫印迹分析。
图3D：PP2A结构亚基A和催化亚基C与PPP2R2B的免疫共沉淀。使用Dox处理DLD1-PPP2R2B或载体对照细胞，且使用抗Myc-标签的抗体对PPP2R2B进行免疫沉淀。WCL，全细胞裂解物。
图3E：DLD1-PPP2R2B或载体对照细胞的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性。测量来自三个独立试验的PPP2R2B-Myc免疫沉淀物的蛋白磷酸酶活性，一式三份。
图3F：在有或没有Dox处理的情况下，经PPP2R1A siRNA或阴性对照siRNA处理的DLD1-PPP2R2B细胞的Myc和p70S6K的免疫印迹分析。
图3G：使用Myc或p70S6K siRNA或阴性对照siRNA处理所示天数的HCT116和DLD1细胞的生长曲线。
图4：PPP2R2B在CRC中的重表达导致体外和体内的雷帕霉素敏感性，且抑制了(override)雷帕霉素诱导的Myc磷酸化。
图4A：使用10ng/ml Dox(Dox)或10nM雷帕霉素或以上二者(R+D)处理所示天数的DLD1-PPP2R2B细胞的增殖。
图4B：在有或没有10ng/ml Dox处理的情况下，经10nM雷帕霉素处理的DLD1-PPP2R2B或DLD1载体对照细胞的单层上14天的密集集落形成。
图4C：使用Dox或雷帕霉素或以上二者处理48小时的DLD1-PPP2R2B或载体对照细胞的G2/M细胞周期停滞。
图4D：按照试验方法中的描述，每隔一天使用100mg/kg Dox或4mg/kg雷帕霉素或以上二者处理的裸鼠中DLD1-PPP2R2B细胞的移植瘤生长。误差线代表SEM。***p<0.01。
图4E：在存在或缺失Dox的情况下，使用10nM雷帕霉素处理DLD1-PPP2R2B或DLD1载体对照细胞48小时。免疫印迹分析显示，雷帕霉素诱导了Myc磷酸化，其在PPP2R2B表达后消失。
图4F：使用10nM雷帕霉素处理所示时间的DLD1细胞中所示蛋白的免疫印迹分析。
图4G：使用靶向mTOR、raptor或rictor的shRNA处理的DLD1细胞中Myc的免疫印迹分析。
图5：雷帕霉素诱导的Myc磷酸化需要DK1，但不需要PIK3CA-AKT。
图5A：DLD1细胞中AKT和Myc的免疫印迹分析。使DLD1细胞血清饥饿48小时，随后使用10nM雷帕霉素处理所示时间。
图5B：响应双重mTORC1和P110α抑制剂PI-103(0.5μM)处理所示时间的DLD1细胞中AKT和Myc的免疫印迹分析。
图5C：DLD1细胞中Myc、AKT、PI3K或PDK1的免疫印迹分析。使用靶向所示基因的siRNA或阴性对照siRNA转染细胞48小时，随后使用10nM雷帕霉素处理24小时。
图5D：使用两种不同的PDK1siRNA或阴性对照siRNA转染，随后使用10nM雷帕霉素处理24小时的DLD1细胞中PDK1、Myc和AKT的免疫印迹分析。
图5E：使用逆转录PDK1shRNA感染的SW480细胞中PDK1、Myc和AKT的免疫印迹分析。
图5F：使用PDK1抑制剂BX912(2.5μM)，或PIK3CA抑制剂PIK90(5μM)、雷帕霉素(10nM)或所示组合处理48小时的DLD1细胞中Myc、AKT和S6K的免疫印迹分析。
图6：PPP2R2B与PDK1结合并抑制其在CRC中被上调的活性。
图6A：使用PPP2R2B-Myc、PDK1-HA或以上二者转染的293T细胞的免疫共沉淀试验。
图6B：DLD1-PPP2R2B细胞的免疫共沉淀试验。使用或没有使用Dox处理细胞24小时，捕获(pull down)PPP2R2B-Myc或PDK1并进行免疫印迹分析。
图6C：从使用或没有使用Dox处理48小时的DLD-PPP2R2B细胞制备的膜片段的PDK1的免疫印迹分析。
图6D：有或没有血清和Dox处理的DLD1-PPP2R2B中PDK1-HA的免疫荧光。
图6E：人结肠和正常阑尾组织中磷酸化PDK1的免疫组化(IHC)分析。深棕色代表S241处的磷-PDK1阳性信号，蓝色代表细胞核染色。扫描IHC的放大率为40X。
图7：对PDK1-Myc信号转导的抑制克服了雷帕霉素抗性。
图7A：使用靶向Myc、PDK1、AKT1或PIK3CA的siRNA转染HCT116细胞48小时，随后使用100nM雷帕霉素处理5天。柱图显示了相对于未处理细胞时雷帕霉素诱导的生长抑制。
图7B：表达PDK1shRNA或阴性对照shRNA的SW480细胞中雷帕霉素诱导的生长抑制。
图7C：通过PI染色和FACS分析评估雷帕霉素(10nM)、BX912(2.5μM)、PIK90(5μM)单独或组合诱导的SW480和DLD1细胞的G2/M期停滞。数据表示停滞在G2/M的细胞百分比的平均值±SD。
图7D：使用BX912(2.5μM)、雷帕霉素(10nM)或以上二者处理所示天数的DLD1和SW480细胞的细胞存活率。
图7E：如图7D处理的DLD1和SW480细胞的单层上14天的密集集落形成。
图7F：表明PPP2R2B调节的PDK1-Myc途径在调节雷帕霉素响应中的作用的模型。CRC中PPP2R2B表达的丧失导致雷帕霉素诱导的PDK1-依赖性Myc磷酸化，从而产生雷帕霉素抗性。
图8：PPP2R2B在多种人癌症中受到显著抑制。ONCOMINE数据分析显示了PPP2R2B在膀胱(Dyrskjot et al.,2004;Sanchez-Carbayo et al.,2006)、脑(Rickman et al.,2001;Shai et al.,2003;Sun et al.,2006)、食道(Wang et al.,2006)和结肠(Ki et al.,2007)的恶性组织和相应的正常组织中的标准化表达。所显示的代表性数据包括来自ONCOMINE网站的多个独立公开的微阵列研究。
图9：PPP2R2B重新表达对结肠癌细胞生长的影响。使用pMN-GFP (对照载体)或pMN-GFP-PPP2R2B逆转录病毒感染DLD1、HT29和SW480细胞，并使用GFP筛选将细胞分类。图8A中显示了通过PPP2R2B重新表达诱导的DLD1和SW480细胞的形态；图8B显示了SW480和HT29的锚定独立性生长。比例尺=100μm。
图10：PPP2R2B的异位表达抑制了转化有Ras的NIH/3T3细胞的生长。
图10A：显示了NIH/3T3-Ras细胞中逆转录病毒包装pMN-PPP2R2B后的锚定独立性生长。测量了软琼脂中的集落形成。
图10B：感染PPP2R2B或对照载体的NIH/3T3-Ras细胞中Myc和S6K蛋白的免疫印迹研究。
图11：S6K与PPP2R2B结合的PP2A复合体的相互作用。
图11A：使用1.0μg/ml Dox处理DLD1-PPP2R2B tet-on细胞8小时，使用S6K抗体对细胞提取物进行免疫沉淀，并通过免疫沉淀物(IP)的免疫印迹研究S6K与PPP2R2B和PP2AC亚基的相互作用。
图11B：按照图11A所述处理DLD1-PPP2R2B tet-on细胞，使用Myc标记抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀，并通过免疫沉淀物的Western杂交研究PPP2R2B与S6K和PP2AA亚基的相互作用。
图12：PPP2R2B和雷帕霉素协同诱导G2/M细胞周期停滞。经Dox或雷帕霉素或以上二者处理48小时的DLD1-PPP2R2B或载体对照细胞的FACS分析。停滞在G2/M的细胞的百分比如图所示。
图13：在结肠癌细胞中，雷帕霉素诱导的Myc磷酸化与PPP2R2B表达和雷帕霉素敏感性相关。
图13A：使用10nM雷帕霉素处理所示时间的HCT116和DKO细胞中Myc、AKT和p70S6K的免疫印迹分析。
图13B：雷帕霉素诱导的HCT116和DKO细胞的生长抑制。
图13C：使用雷帕霉素处理48小时的一系列CRC细胞系中Myc、AKT或p70S6K的免疫印迹分析。
图13D：雷帕霉素诱导的CRC细胞系的生长抑制。在使用10nM雷帕霉素处理5天后测量的细胞存活率。柱图代表与未处理细胞相比时雷帕霉素诱导的生长抑制(%)。
图14：在表达PPP2R2B的癌细胞中，雷帕霉素没有诱导Myc磷酸化，且更加敏感。
图14A：显示肾癌(Boer et al.,2001)、肝癌(Chen et al.,2002)、淋巴癌(Alizadehet al.,2000)和卵巢癌(Hendrix et al.,2006)中PPP2R2B表达的ONCOMINE数据。
图14B：所示癌细胞系和正常结肠粘膜中PPP2R2B mRNA的Tagman试验。显示了
Figure BDA00002111634800101
值。
图14C：一系列表达PPP2R2B的癌细胞系中Myc和AKT磷酸化的免疫印迹分析。
图14D：表达PPP2R2B的癌细胞系中雷帕霉素诱导的生长抑制。在使用10nM雷帕霉素处理5天后测量的细胞存活率。柱图代表与未处理细胞相比雷帕霉素诱导的生长抑制(%)。
图15：PPP2R2B、PDK1和Myc在DLD1细胞中的亚细胞定位。
图15A：使用Dox处理DLD1-PPP2R2B细胞48小时以诱导PPP2R2B表达，使用anti-Myc(9E10)和DAPI对细胞进行染色以检测PPP2R2B-Myc在DLD1细胞中的定位。比例尺=10ìm。
图15B：使用anti-p-PDK1(S241)染色以检测所述定位的DLD1细胞。比例尺=10ìm。
图15C：使用雷帕霉素处理48小时并使用anti-p-Myc(T58/S62)染色的DLD1细胞。
图16：PDK1抑制剂BX912和shPDK1在结肠癌细胞中的药理学作用。
图16A：所示处理下SW480细胞的形态。
图16B：在有或没有雷帕霉素的条件下，使用2.5μM BX912或2.5μM PIKCA抑制剂PIK90处理的DLD1和SW480细胞的48小时的FACS分析。使用PI染色细胞，并通过FACS分析测定细胞周期。停滞在G2/M的细胞的百分比如图所示。
图17：与对照或PTEN稳定敲减诱导的转化相比，PDK1抑制剂BI2536和GW843682X更有选择性地降低了转化有PDK1或Myc的细胞的存活率。在PLK1抑制剂存在4天的情况下，进行细胞存活率试验。
图18：在HEK-TERV和RWPE1两个系统中，PLK1抑制剂BI2536优选抑制转化有PDK1的细胞的增殖，但对对照细胞(PMN)和转化有PI3K的细胞(E545)的影响较小。
图19：使用10nM PLK1抑制剂BI2536处理24小时的HEK-TERV细胞的凋亡试验。
图20：PDK1在多种上皮细胞中均诱导PLK1和Myc磷酸化(图20A)。转化有PDK1、Myc或shPTEN的HEK-TERV细胞中Myc和PLK1的免疫印迹分析(图20B)。人乳腺上皮细胞(HMEC)和前列腺上皮细胞(RWPE)中Myc和PLK1的免疫印迹分析。
图21：PLK1过表达在293T细胞中诱导Myc磷酸化并积累Myc蛋白。
图22：通过siRNA敲减PLK1抑制了HEK-PDK1细胞中的Myc磷酸化。
图23：BEZ 235诱导的Myc磷酸化需要PLK1。使用PLK1抑制剂BI2536(10nM)、mTOR抑制剂BEZ 235(100nM)或所示组合处理48小时的DLD1细胞中Myc和AKT磷酸化的免疫印迹分析。
图24：使用BI 2536(10nM)、BEZ 235(10nM)或以上二者处理所示天数的SW480和DLD1细胞的细胞存活率。
图25：使用BI 2536(10nM)、BEZ 235(10nM)或以上二者处理48小时的SW480和DLD1细胞的凋亡试验。
图26：使用BEZ 235或BI2436或组合处理12天的DLD1细胞的单层集落形成试验。
图27：与pMN对照细胞、PIK3CA-E545K或shPTEN转化细胞相比，转化有PDK1的细胞产生了大量肿瘤球(tumor sphere)。
图28：PLK1抑制剂BI2536阻断了HEK-PDK1细胞中的肿瘤球形成。使用或没有使用5nM BI2536处理所述细胞7天。
图29：通过siRNA敲减PLK1抑制了HEK-PDK1细胞中的肿瘤球形成。
图30：对HEK-TERV细胞中的干细胞相关基因进行qRT-PCR分析。
图31：与1x103或1x104HEK-Myc细胞相比，在注射1000HEK-PDK1细胞后3周的裸鼠中的肿瘤生长曲线(平均值±SD)。
具体实施方式
mTOR抑制剂抗性癌症的检测
如实施例17所示，结肠直肠癌(CRC)细胞显示在表观遗传学上丧失PPP2R2B(GenBank登录号：NM_181678)的活性和表达。因此，PPP2R2B可用作结肠直肠癌的标记。实施例13和图8也显示了诸如膀胱癌、食道癌和脑癌的其他癌症中PPP2R2B的类似丧失。
因此，本发明人提供了检测癌细胞，或患有或可能患有此类癌，例如结肠直肠癌、膀胱癌、食道癌或脑癌的患者的方法，所述方法包括检测细胞中或细胞的，或患者细胞中或患者细胞的PPP2R2B表达和/或活性的下降。
本发明人证实了此类丧失导致对mTOR抑制剂治疗，例如使用雷帕霉素(或雷帕霉素衍生物)的治疗的抗性。因此，本发明人提供了PPP2R2B作为肿瘤抑制剂的应用。本发明人进一步提供了用于检测具有mTOR抑制剂治疗抗性的癌症的方法，所述癌症包括具有mTOR抑制剂抗性的结肠直肠癌、具有mTOR抑制剂抗性的膀胱癌、具有mTOR抑制剂抗性的食道癌和具有mTOR抑制剂抗性的脑癌，所述方法包括按照上文所述检测PPP2R2B表达和/或活性的降低。所述mTOR抑制剂可包括，特别是雷帕霉素或其衍生物。
此类细胞中PPP2R2B活性表达的上调与雷帕霉素治疗一起抑制了所述细胞的生长。因此，可通过上调PPP2R2B活性和/或表达，任选地与使用mTOR抑制剂例如雷帕霉素或其衍生物的治疗一起来治疗癌症，例如包括mTOR抑制剂抗性形式在内的结肠直肠癌、膀胱癌、食道癌和脑癌；因此，在本文中，本发明人提供了所述方法。通过例如使用诸如胞苷类似物，包括5-aza-dC和阿扎胞苷的去甲基化试剂，可获得PPP2R2B的表达和/或活性(Issa JP,Kantarjian H.Azacitidine.Nat Rev Drug Discov 2005;May Suppl:S6–7)。
因此，本发明人提供了去甲基化试剂和mTOR抑制剂的组合(或包含去甲基化试剂和mTOR抑制剂的组合物)，其例如用于包括结肠直肠癌、膀胱癌、食道癌和脑癌的癌症(以及此类癌症的mTOR抑制剂抗性形式，包括雷帕霉素抗性或雷帕霉素衍生物抗性形式)的治疗。所述mTOR抑制剂可包括雷帕霉素或其衍生物，所述去甲基化试剂可包括5-aza-dC或阿扎胞苷。
在实施例19中，本发明人显示了雷帕霉素诱导的Myc磷酸化(导致mTOR抑制剂抗性)是由PDK1激酶介导的。因此，PDK1的检测可代替PPP2R2B的检测(如上所述)，以检测诸如结肠直肠癌、膀胱癌、食道癌和脑癌的癌症，及其mTOR抑制剂抗性形式(例如，此类癌症的雷帕霉素抗性或雷帕霉素衍生物抗性形式)。因此，本发明人提供了通过检测PDK1活性和/或表达，任选地与检测PPP2R2B活性和/或表达一起，来检测此类癌症的方法。
本发明人进一步提供了PDK1作为包括结肠直肠癌、膀胱癌、食道癌和脑癌在内的癌症的治疗靶标的应用。因此，本发明人提供了通过下调PDK1活性和/或表达治疗诸如结肠直肠癌、膀胱癌、食道癌和脑癌的癌症及其mTOR抑制剂抗性形式(例如，此类癌症的雷帕霉素抗性或雷帕霉素衍生物抗性形式)。可通过使用PDK1活性和/或表达的调节剂，例如PDK1拮抗剂或PDK1抑制剂，来下调PDK1活性和表达。PDK1抑制剂和拮抗剂可按照下文更详细的描述来鉴定，且可包括PDK1抑制剂，例如BX912(CAS登录号：702674-56-4)和BX795(CAS登录号：702675-74-9)。其他PDK1抑制剂是本领域已知的，且描述于，例如R IFeldman el al.Novel Small Molecule Inhibitors of 3-Phosphoinositide-dependentKinase-1.J.Biol.Chem.,2005,280,20,19867-19874和C Peifer,D R.Alessi,Small-Molecule Inhibitors of PDK1.ChemMedChem.2008,3(10)。
因此，本发明人提供了PDK1抑制剂或拮抗剂在诸如结肠直肠癌、膀胱癌、食道癌和脑癌的癌症及其mTOR抑制剂抗性形式(例如，此类癌症的雷帕霉素抗性或雷帕霉素衍生物抗性形式)的治疗中的应用。所述治疗可进一步包括PDK1抑制剂或拮抗剂与诸如雷帕霉素或其衍生物的mTOR抑制剂的联合给药。
因此，本发明人提供了PDK1抑制剂或拮抗剂和mTOR抑制剂的组合(或包含PDK1抑制剂或拮抗剂和mTOR抑制剂的组合物)，其用于例如包括结肠直肠癌、膀胱癌、食道癌和脑癌在内的癌症(及此类癌症的mTOR抑制剂抗性形式，包括雷帕霉素抗性或雷帕霉素衍生物抗性形式)的治疗。所述mTOR抑制剂可包括雷帕霉素或其衍生物，且所述PDK1抑制剂或拮抗剂可包括BX912(CAS登录号：702674-56-4)或BX795(CAS登录号：702675-74-9)。
本发明人还提供了PDK1和PLK1用于癌症，例如癌症干细胞或Myc-驱动的肿瘤的应用。
癌症的治疗
适合地，与没有接受治疗的个体相比，本文所述的方法和组合物能够改进接受治疗个体的可测量指标(criterion)。
出于此目的，标明了多个指标，其反应了癌症的进展或患者的健康状态。可用的指标可包括肿瘤大小、肿瘤规模(tumor dimension)、肿瘤的最大规模、肿瘤数量、肿瘤标记(例如甲胎蛋白)的存在、转移的程度或数量等。
因此，例如，根据适当试验或测试的测量，经治疗的个体可显示肿瘤大小或数量减少。与未经治疗的个体相比，经治疗的个体可显示，例如特定肿瘤的肿瘤体积下降或肿瘤数量或以上二者减少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或更多。
在一些实施方式中，适合地，使用标准测试量化治疗的效果，例如实体瘤的疗效评价标准(RECIST)委员会提出的国际标准，其详细描述于Therasse,P.,S.G.Arbuck,et al.(2000).“New guidelines to evaluate the response to treatment insolid tumors.European Organization for Research and Treatment of Cancer,NationalCancer Institute of the United States,National Cancer Institute of Canada.”J.Natl. Cancer Inst. 92(3):205-16。
在其他实施方式中，可按照临床试验(实施例E1至E8)中描述的给药和测试方案来量化治疗效果。因此，可使用实施例E8“效果测定”中所述的一种或多种方法，优选所有方法进行治疗效果的评估。在这种情况下，所述治疗可产生部分响应(Partial Response，PR)或完全缓解(Complete Response，CR)。
尽管上文将所述对照描述为没有接受治疗的个体，但在一些情况下，更适合的对照可以是接受治疗前的患者本身。
处于本文的目的，术语“癌(症)”可包括以下的任一种或多种：急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、肾上腺皮质癌、肛门癌、膀胱癌、血癌、骨癌、脑瘤、乳腺癌、女性生殖系统癌、男性生殖系统癌、中枢神经系统淋巴瘤、宫颈癌、儿童横纹肌肉瘤、儿童肉瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、结肠和直肠癌、结肠癌、子宫内膜癌、子宫内膜肉瘤、食道癌、眼癌、胆囊癌、胃癌、胃肠道癌、毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞癌、霍奇金病、下咽癌、卡波西肉瘤、肾癌、喉癌、白血病、白血病、肝癌、肺癌、恶性纤维组织细胞瘤、恶性胸腺瘤、黑素瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、骨髓瘤、鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌、神经系统癌、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、垂体肿瘤、浆细胞瘤、原发性CNS淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、呼吸系统、成视网膜细胞瘤、唾腺癌、皮肤癌、小肠癌、软组织肉瘤、胃癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、泌尿系统癌、子宫肉瘤、阴道癌、血管系统、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和维尔姆斯瘤。
mTOR
本发明中使用术语mTOR时，其是指具有登录号NM_004958.2、P42345或NP_004949，更具体为NM_004958.2的多肽序列。
优选地，mTOR是指人序列。因此，此术语涵盖的具体同源物包括人同源物，例如登录号NM_004958.2、NP_004949、Hs.509145。然而，该术语还涵盖与mTOR同源的可选肽，例如源自其他物种，包括其他哺乳动物物种的多肽。例如，包括登录号NM_020009.1、NP_064393、Mm.21158、Q9JLN9、AAF73196和AF152838的mTOR的小鼠同源物。mTOR的牛和大鼠同源物也是已知的(登录号分别为NM_174319和NM_019906)。
mTOR也被称作FKBP12-雷帕霉素复合体-结合蛋白1、FRAP1、FK506-结合蛋白12-雷帕霉素复合体-结合蛋白1、FRAP、FRAP2、雷帕霉素的哺乳动物靶标和RAFT1。
优选地，mTOR包括此核苷酸序列的片段、同源物、变体和衍生物。本文使用的术语“变体”、“同源物”、“衍生物”或“片段”包含从或向mTOR核苷酸序列的序列任意地取代、改变、修饰、置换、删除或添加一个(或多个)核酸。除非文中另有许可，有关“mTOR”的内容包括mTOR的这些变体、同源物、衍生物和片段的内容。详见下文。
优选地，所得核苷酸序列编码具有mTOR活性的多肽的核苷酸序列，优选至少具有上文所述人mTOR的相同活性。优选地，术语“同源物”旨在包括结构和/或功能上的同一性，从而使所得的核苷酸序列编码具有mTOR活性的多肽。关于序列同一性(即类似性)，优选具有至少70%，更优选至少75%，更优选至少85%，更优选至少90%序列同一性。更优选至少95%，更优选至少98%的序列同一性。这些术语还包括所述序列的等位基因变体。
关于mTOR(也称作FRAP)的以下描述由在线人类孟德尔遗传数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=601231)(Online MendelianInheritance in Man website)提供。
FKBP12-雷帕霉素相关蛋白(FRAP)是参与细胞周期进程、DNA重组和DNA损伤检测的蛋白质家族中的一员。在大鼠中，其为与酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)蛋白TOR1具有显著同源性的245-kD蛋白(表示为RAFT1)，并且显示以雷帕霉素依赖的方式与亲免素FKBP12(186945)结合(Sabatini et al.,1994)。Brown等人(1994)指出，已知在多种细胞类型以及酵母中FKBP12-雷帕霉素复合体通过干扰参与G1进程的有丝分裂信号转导途径，而抑制进程通过细胞周期G1期。该作者认为，FRAP与FKBP12-雷帕霉素的结合与这些配体抑制细胞周期进程的能力相关。
雷帕霉素是对抗实体瘤的有效抗癌剂。在缺氧环境中，实体瘤质量的增加依赖于有丝分裂原和营养物的募集。营养物，特别是那些必需氨基酸的浓度变化时，雷帕霉素的哺乳动物靶标(mTOR/FRAP)在控制核糖体生物合成和细胞生长的调控途径中发挥功能。在细菌中，核糖体生物合成由氨基酸和ATP独立调控。Dennis等人(2001)证明，人mTOR途径受到细胞内ATP浓度的影响，与氨基酸的丰度无关，并且mTOR/FRAP本身是ATP传感器。
Castedo等人(2001)描述了由人免疫缺陷病毒(HIV)-1包膜糖蛋白(Env)-诱导的体外和体内合胞体形成而导致的凋亡途径。免疫组化分析证明，来自HIV-1-阳性供体的淋巴结尖端明区(T细胞区)和外周血单核细胞中的合胞体中存在p53的磷酸化ser15(191170)和凋亡前标记物组织转谷酰胺酶(TGM2;190196)，但在HIV-1-阴性供体中则不存在。这些标记物的存在与病毒载量(HIV-1RNA水平)相关。定量免疫印迹分析显示，响应HIV-1Env的p53ser15的磷酸化由FRAP介导，而不是由其他磷脂酰肌醇激酶相关的激酶介导，并且伴随着蛋白磷酸酶2A的下调(参见176915)。所述磷酸化受到雷帕霉素的显著抑制。免疫荧光显微镜检测表明，合胞细胞核中富含FRAP，且核积累在p53ser15的磷酸化之前。Castedo等人(2001)的结论认为，HIV-1Env-诱导的合胞体形成通过包括FRAP对p53ser15的磷酸化以及随后的BAX活化(600040)、线粒体膜透化、细胞色素C释放和半胱天冬酶(caspase)活化的途径而导致凋亡。
Fang等人(2001)将磷脂酸鉴定为是mTOR信号转导的关键组分。在其研究中，哺乳动物细胞的有丝分裂刺激导致了mTOR下游效应子活化所需的细胞磷脂酸的磷脂酶D依赖性积累。磷脂酸与雷帕霉素所靶向的mTOR中的结构域直接相互作用，这种相互作用与mTOR活化下游效应子的能力正相关。磷脂酸参与mTOR信号转导表明了这种脂质在信号转导和蛋白质合成中的重要功能并作为mTOR和有丝分裂原的直接关联。Fang等人(2001)的结论认为，其研究提示了免疫抑制剂雷帕霉素的体内作用的潜在机理。
Kim等人(2002)和Hara等人(2002)报道了mTOR结合RAPTOR(607130)，RAPTOR是在mTOR途径中具有至少2种功能的进化保守蛋白。Kim等人(2002)表明，RAPTOR在向下游效应子S6K1(601684)的营养物刺激性信号转导、细胞大小维持和mTOR蛋白表达中具有积极作用。RAPTOR与mTOR的结合还下调了mTOR激酶的活性。抑制所述途径的条件(例如营养缺乏和线粒体解偶联)稳定mTOR-RAPTOR结合并抑制mTOR激酶活性。Kim等人(2002)提出，RAPTOR是mTOR途径的组分，其通过其与mTOR的结合调控细胞大小以响应营养物的水平。
Hara等人(2002)表明，RAPTOR与mTOR的结合是mTOR催化的4EBP1(602223)体外磷酸化所必需的，由此，其强烈地增强了针对p70-ɑ(S6K1)的mTOR激酶活性。雷帕霉素或氨基酸的撤回提高了4EBP1和RAPTOR在7-甲基-GTP琼脂糖上的回收，而胰岛素则强烈抑制了这种回收。RNA干扰对RAPTOR表达的部分抑制降低了mTOR催化的4EBP1体外磷酸化。对秀丽隐杆线虫(C.elegans)Raptor的RNA干扰产生的一系列表型与CE-Tor失活所产生的表型非常近似。因此，该作者得出结论，RAPTOR是mTOR-催化4EBP1磷酸化的必要结构，并且在体内介导TOR作用。
Vellai等人(2003)证实了秀丽隐杆线虫中的TOR缺陷使其正常寿命延长了一倍多。Let363/TOR活性的缺失导致发育停滞在L3幼虫阶段。在25.5℃，Let363突变体的平均寿命为25天，与此相比，野生线虫的寿命为10天。
亨廷顿病(HD;143100)是由多谷氨酰胺片段扩增导致的遗传性神经退行性疾病，其中扩增的多谷氨酰胺蛋白在细胞内聚集体中异常积累。Ravikumar等人(2004)表明，雷帕霉素的哺乳动物靶标(mTOR)被隔离在细胞模型、转基因鼠和人脑的多谷氨酰胺聚集体中。mTOR的隔离削弱了其激酶活性并诱导了自吞噬，这是突变亨廷顿蛋白(huntingtin)片段的主要清除途径。这保护免受多谷氨酰胺细胞毒性，这是因为特异性mTOR抑制剂雷帕霉素削减了HD细胞模型中亨廷顿蛋白的积累和细胞死亡，而对自吞噬的抑制具有相反的作用。此外，雷帕霉素还在HD的蝇模型中保护免受神经退行性病变，且雷帕霉素类似物CCI-779改善了4种不同行为任务的表现，并且减少了HD鼠模型中聚集体的形成。这些数据提供了诱导自吞噬以治疗HD的前景的原理性证据。
Moore等人(1996)通过荧光原位杂交(FISH)将FRAP基因定位于1p36。Lench等人(1997)通过FISH以及随后对该整体区域进行的放射杂交制图，将FRAP基因绘图至1p36.2。染色体1p36.2是神经母细胞瘤中最常被删除的区域。考虑到PIK相关激酶蛋白在DNA修复、重组和细胞周期检查点中的作用，该作者提出，应对FRAP在1p36有缺失的实体瘤中的潜在作用进行研究。Onyango等人(1998)确定了1p36区域中的基因顺序，从端粒到着丝点方向为CDC2L1(176873)--PTPRZ2(604008)--ENO1(172430)--PGD(172200)--XBX1(604007)--FRAP2(FRAP1)--CD30(153243)。
mTOR详述于Beugnet,et al.J.Biol.Chem.278(42),40717-40722(2003)；Kristof，et al.,J.Biol.Chem.278(36),33637-33644(2003)；Chen,Y.,et al.,Oncogene 22(25),3937-3942(2003)；Garami,et al.,Mol.Cell 11(6),1457-1466(2003)；Nojima,et al.,J.Biol.Chem.278(18),15461-15464(2003)；Kimura,et al.,Genes Cells 8(1),65-79(2003)；McMahon,et al.,Mol.Cell.Biol.22(21),7428-7438(2002)；Tee,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99(21),13571-13576(2002)；Hudson,et al.,Mol.Cell.Biol.22(20),7004-7014(2002)；Choi,et al.,EMBO Rep.3(10),988-994(2002)；Inoki,et al.,Nat.Cell Biol.4(9),648-657(2002)；Zhang,et al.,J.Biol.Chem.277(31),28127-28134(2002)；Castedo,et al.,EMBO J.21(15),4070-4080(2002)；Hara,et al.,Cell 110(2),177-189(2002)；Kim,et al.,Cell 110(2),163-175(2002)；Fingar,et al.,Genes Dev.16(12),1472-1487(2002)；Reynolds,et al.,J.Biol.Chem.277(20),17657-17662(2002)；Fang,et al.,Science 294(5548),1942-1945(2001)；Dennis,et al.,Science 294(5544),1102-1105(2001)；Onyango,et al.,Genomics 50(2),187-198(1998)；Lench,et al.,Hum.Genet.99(4),547-549(1997)；Choi,et al.,Science 273(5272),239-242(1996)；Moore,etal.,Genomics 33(2),331-332(1996)；Chen,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92(11),4947-4951(1995)；Chiu et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91(26),12574-12578(1994)；Brown,et al.,Nature 369(6483),756-758(1994).
mTOR活性的抑制剂
在一些实施方式中，本文所述的方法和组合物依赖于阻断、减少或降低mTOR蛋白的活性。根据本文所述的方法和组合物，可结合使用所述对mTOR活性的抑制以治疗癌症或预防细胞或组织生长或增殖。
尽管通常可使用实现上述目的的任何方式，但本文所述的方法和组合物采用mTOR活性或表达的调节剂。将能够降低mTOR蛋白活性的试剂称作该活性的抑制剂或拮抗剂。出于本文的目的，在内容需要时，术语“抑制剂”和“拮抗剂”可视为同义词。
在优选的实施方式中，mTOR活性的拮抗剂能够将mTOR相关活性，例如激酶活性降低10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更多。优选地，按照下文“mTOR活性检测”一节中的描述检测mTOR活性。
本领域中使用的术语“拮抗剂”通常是指与酶结合并抑制所述酶活性的化合物。然而，本文使用的该术语泛指抑制分子活性而不必须通过与其结合的任何试剂。因此，所述术语包括影响mTOR蛋白的表达，或影响调控分子的生物合成，或影响mTOR活性调控剂的表达的试剂。所抑制的特异活性可以是酶或分子表现的，或特征性的任何活性，例如，视情况，mTOR的任何活性可以是例如激酶活性。所述激酶活性可包括使S6K1和/或4E-BP1之一或任一磷酸化的能力。
所述拮抗剂可结合并竞争相关分子上的一个或多个位点，优选所述酶的催化位点。优选地，所述结合阻断了所述分子和另一实体之间的相互作用(例如，酶与其底物之间的相互作用)。然而，所述拮抗剂不一定需要直接结合到催化位点，而可结合，例如相邻位点，另一蛋白(例如，与所述酶复合的蛋白)，或所述细胞上或细胞内的其他实体，只要这种结合降低了所述酶或分子的活性。
在涉及诸如mTOR的酶的拮抗剂的情况下，拮抗剂可包括酶的底物，或其能够与酶结合的片段。此外，可使用天然产生的或通过肽合成的完整底物或片段与所述底物竞争所述酶上的结合位点。可选地，或此外，可使用能够结合所述酶的免疫球蛋白(例如，单克隆或多克隆抗体)。所述拮抗剂还可包括能够干扰结合相互作用的肽或其他小分子。下文更详细地描述了拮抗剂的其他实例，且这对本领域技术人员也是显而易见的。
还测试了mTOR的无功能同源物对mTOR活性的抑制作用，这是因为其可以与野生型蛋白竞争结合细胞系统的其他组分，但不能发挥所述蛋白的正常功能。或者，其可阻断与蛋白系统结合的蛋白质的功能。此类无功能同源物可包括天然存在的突变体及其修饰序列或片段。
或者，不是直接阻止与所述组分的结合，所述物质可抑制生物学可用量的mTOR。这可以是通过抑制所述组分的表达，例如在转录，转录本稳定性、翻译或翻译后稳定性的水平上。此类物质的实例可以是抑制生物合成量的mRNA的反义RNA或双链干扰RNA序列。
因此，还可通过降低细胞中所述蛋白或抑制剂的表达水平来阻断mTOR蛋白的抑制剂的活性。例如，可使用反义化合物，例如具有特异于mTOR mRNA的序列的寡核苷酸处理所述细胞。还可以以这种方式调控致病形式的粘附蛋白的表达水平。
通常，mTOR的激动剂、拮抗剂可包括诸如原子或分子的试剂，其中所述分子可以是无机或有机的、生物效应分子和/或编码诸如生物效应分子的试剂的核酸，蛋白质、多肽、肽、核酸、肽核酸(PNA)、病毒、病毒样颗粒、核苷酸、核糖核酸、核苷酸的合成类似物、核糖核酸的合成类似物、修饰的核苷酸、修饰的核糖核酸、氨基酸、氨基酸类似物、修饰的氨基酸、修饰的氨基酸类似物、类固醇、蛋白多糖、脂质、脂肪酸和碳水化合物。试剂可以是溶剂或悬浮剂(例如，结晶、胶体或其他具体形式)。所述试剂可以是单体、二体、寡聚体等的形式，或为复合体。
所述术语“调节剂”、“拮抗剂”和“试剂”还包括：蛋白质、多肽或肽，包括但不限于，结构蛋白、酶、细胞因子(例如，干扰素和/或白介素)、抗生素、多克隆或单克隆抗体或其有效部分例如Fv片段（其中所述抗体或其部分可以是天然、合成或人源化的）、肽激素、受体、信号转导分子或其他蛋白；如下文定义的核酸，包括但不限于寡核苷酸或修饰的寡核苷酸、反义寡核苷酸或修饰的反义寡核苷酸、cDNA、基因组DNA、人工或天然的染色体(例如，酵母人工染色体)或其部分、RNA(包括mRNA、tRNA、rRNA或核酶)或肽核酸(PNA)；病毒或病毒样颗粒；核酸或核糖核酸或其合成类似物，其可以是修饰或未修饰的；氨基酸或其类似物，其可以是修饰或未修饰的；非肽类(例如类固醇)激素；蛋白多糖；脂质；或碳水化合物。还包括小分子，包括无机和有机化学品，其结合并占据所述多肽的活性位点，从而使所述催化位点无法接近底物，进而阻碍正常的生物活性。小分子的实例包括，但不限于小肽或肽样分子。
在具体的实施方式中，可使用RNA干扰(RNAi)技术消除或敲除或降低基因活性，例如mTOR活性。所述整体策略是制备特异于每个目标基因的双链RNA(dsRNA)，并将其转染至目标细胞以抑制特定基因的表达。
可使用以下方法：通过水平凝胶电泳分析PCR产物的样品，并使用QiagenQiaQuick PCR纯化试剂盒纯化DNA。在使用Ambion T7 Megascript试剂盒的基因特异性单链RNA制备中，使用1μg DNA作为模板。从模板的两条链产生单链RNA，纯化并立即通过加热至90°C 15分钟随后逐步冷却至室温过夜而退火。通过水平凝胶电泳分析dsRNA样品，并通过常规方式引入到相关细胞中。
MTOR活性的拮抗剂
如上文所述，可使用能够降低mTOR活性或表达的任何试剂作为mTOR拮抗剂以用于降低其活性的目的。
丁醇
根据Kam and Exton,FASEB J.2004Feb;18(2):311-9和Fang et al.,Science294:1942-1945中的描述，1-丁醇是mTOR活性的抑制剂。因此，丁醇可用于本文所述的方法和组合物中作为能够降低mTOR活性的试剂。
抗肽MTOR抗体
可产生针对mTOR肽序列的抗肽抗体。所选择的序列可基于来自以下mTOR参照序列的如下小鼠序列：
  1 mlgtgpavat asaatssnvs vlqqfasglk srneetraka akelqhyvtm elremsqees
 61 trfydqlnhh ifelvsssda nerkggilai asligveggn strigrfany lrnllpssdp
121 vvmemaskai grlamagdtf taeyvefevk ralewlgadr negrrhaavl vlrelaisvp
181 tfffqqvqpf fdnifvavwd pkqairegav aalraclilt tqrepkemqk pqwyrhtfee
241 aekgfdetla kekgmnrddr ihgallilne lvrissmege rlreemeeit qqqlvhdkyc
301 kdlmgfgtkp rhitpftsfq avqpqqpnal vgllgysspq glmgfgtsps pakstlvesr
361 ccrdlmeekf dqvcqwvlkc rssknsliqm tilnllprla afrpsaftdt qylqdtmnhv
421 lscvkkeker taafqalgll svavrsefkv ylprvldiir aalppkdfah krqktvqvda
481 tvftcismla ramgpgiqqd ikellepmla vglspaltav lydlsrqipq lkkdiqdgll
541 kmlslvlmhk plrhpgmpkg lahqlaspgl ttlpeasdva sitlalrtlg sfefeghslt
601 qfvrhcadhf lnsehkeirm eaartcscll tpsihlisgh ahvvsqtavq vvadvlskll
661 vvgitdpdpd irycvlasld erfdahlaqa enlqalfval ndqvfeirel aictvgrlss
721 mnpafvmpfl rkmliqilte lehsgigrik eqsarmlghl vsnaprlirp ymepilkali
 781 lklkdpdpdp npgvinnvla tigelaqvsg lemrkwvdel fiiimdmlqd ssllakrqva
 841 lwtlgqlvas tgyvvepyrk yptllevlln flkteqnqgt rreairvlgl lgaldpykhk
 901 vnigmidqsr dasavslses kssqdssdys tsemlvnmgn lpldefypav smvalmrifr
 961 dqslshhhtm vvqaitfifk slglkcvqfl pqvmptflnv irvcdgaire flfqqlgmlv
1021 sfvkshirpy mdeivtlmre fwvmntsiqs tiillieqiv valggefkly lpqliphmlr
1081 vfmhdnsqgr ivsikllaai qlfganlddy lhlllppivk lfdapevplp srkaaletvd
1141 rltesldftd yasriihpiv rtldqspelr stamdtlssl vfqlgkkyqi fipmvnkvlv
1201 rhrinhqryd vlicrivkgy tladeeedpl iyqhrmlrss qgdalasgpv etgpmkklhv
1261 stinlqkawg aarrvskddw lewlrrlsle llkdssspsl rscwalaqay npmardlfna
1321 afvscwseln edqqdelirs ielaltsqdi aevtqtllnl aefmehsdkg plplrddngi
1381 vllgeraakc rayakalhyk elefqkgptp aileslisin nklqqpeaas gvleyamkhf
1441 geleiqatwy eklhewedal vaydkkmdtn kedpelmlgr mrclealgew gqlhqqccek
1501 wtlvndetqa kmarmaaaaa wglgqwdsme eytcmiprdt hdgafyravl alhqdlfsla
1561 qqcidkardl ldaeltamag esysraygam vschmlsele eviqyklvpe rreiirqiww
1621 erlqgcqriv edwqkilmvr slvvsphedm rtwlkyaslc gksgrlalah ktlvlllgvd
1681 psrqldhplp tahpqvtyay mknmwksark idafqhmqhf vqtmqqqaqh aiatedqqhk
1741 qelhklmarc flklgewqln lqginestip kvlqyysaat ehdrswykaw hawavmnfea
1801 vlhykhqnqa rdekkklrha sganitnatt aattaasaaa atstegsnse seaesnensp
1861 tpsplqkkvt edlsktllly tvpavqgffr sislsrgnnl qdtlrvltlw fdyghwpdvn
1921 ealvegvkai qidtwlqvip qliaridtpr plvgrlihql ltdigryhpq aliypltvas
1981 kstttarhna ankilknmce hsntlvqqam mvseelirva ilwhemwheg leeasrlyfg
2041 ernvkgmfev leplhammer gpqtlketsf nqaygrdlme aqewcrkymk sgnvkdltqa
2101 wdlyyhvfrr iskqlpqlts lelqyvspkl lmcrdlelav pgtydpnqpi iriqsiapsl
2161 qvitskqrpr kltlmgsngh efvfllkghe dlrqdervmq lfglvntlla ndptslrknl
2221 siqryavipl stnsgligwv phcdtlhali rdyrekkkil lniehrimlr mapdydhltl
2281 mqkvevfeha vnntagddla kllwlkspss evwfdrrtny trslavmsmv gyilglgdrh
2341 psnlmldrls gkilhidfgd cfevamtrek fpekipfrlt rmltnamevt gldgnyrttc
2401 htvmevlreh kdsvmavlea fvydpllnwr lmdtntkgnk rsrtrtdsys agqsveildg
2461 velgepahkk agttvpesih sfigdglvkp ealnkkaiqi inrvrdkltg rdfshddtld
2521 vptqvellik qatshenlcq cyigwcpfw
因此，可由以下序列中的任一种或多种产生优选的抗肽抗体：氨基酸22-139；氨基酸647-907；氨基酸937-1140；氨基酸1382-1982；氨基酸2019-2112；或氨基酸2181-2549。
可选择来自人mTOR的相应序列用于从接种动物得到抗肽抗体。抗体可通过注射至家兔，和例如Harlow and Lane(如上)中描述的其他常规方式产生。
通过ELISA试验和通过Western杂交检测抗体，并将其用于实施例中所述的免疫染色中。
雷帕霉素
在一些实施方式中，能够降低mTOR活性的试剂包括雷帕霉素。本文使用的术语“雷帕霉素”包括具体化合物雷帕霉素(如下文所述，也称作西罗莫司(Sirolimus)，C51H79NO13)及其任意衍生物。此类衍生物有详细的描述，且包括雷帕霉素前药、雷帕霉素二醛、雷帕霉素的结构类似物(rapalogs)等。
因此，本发明提供了包括其衍生物等的雷帕霉素，作为mTOR活性的特异性拮抗剂。
可采用浓度高于1nM，例如10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、100nM、500nM、1μm、10μm、100μm或更高浓度的雷帕霉素及其衍生物。在一些实施方式中，使用约50nM的雷帕霉素及其衍生物。雷帕霉素及其衍生物可施用至人个体，剂量在例如约1mg/天至10mg/天之间。
雷帕霉素(西罗莫司)
雷帕霉素(C51H79NO13，分子质量914.172g/mol.)是抗真菌抗生素，其可由链霉菌，例如吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)提取。
雷帕霉素的IUPAC名称为：(3S,6R,7E,9R,10R,12R,14S,15E,17E,19E,21S,23S,26R,27R,34aS)-9,10,12,13,14,21,22,23,24,25,26,27,32,33,34,34a-十六氢-9,27-二羟基-3-[(1R)-2-[(1S,3R,4R)-4-羟基-3-甲氧基环己基]-1-甲基乙基]-10,21-二甲氧基-6,8,12,14,20,26-六甲基-23,27-环氧-3H-吡哆并[2,1-c][1,4]-氧杂氮杂环三十一烷-1,5,11,28,29(4H,6H,31H)-异戊烯炔。
通过其CAS编号53123-88-9、ATC编码L04AA10、PubChem 6436030、DrugBank APRD00178识别雷帕霉素。雷帕霉素的结构式如下：
Figure BDA00002111634800241
雷帕霉素也称作西罗莫司。
雷帕霉素的制备方法公开在Sehgal等人的美国专利第3,929,992和3,993,749号。此外，雷帕霉素的单酰基和二酰基衍生物及其制备方法公开在Rakhit的美国专利第4,316,885号。此外，Stella等人的的美国专利第4,650,803号还公开了雷帕霉素的水溶性前药，即包括以下雷帕霉素前药的雷帕霉素衍生物：甘氨酸前药、丙酸前药和吡咯烷基丁酸前药。
本文所述的方法和组合物包括天然和合成雷帕霉素、基因工程化雷帕霉素和雷帕霉素的所有衍生物和前药的应用，例如上述美国专利第3,929,992、3,993,749、4,316,885和4,650,803号中的描述，这些专利的内容并入本文作为参考。
雷帕霉素是31元的大环内酯C51H79NO13，分子量为913.6Da。由于哌啶甲酸(pipecolic acid)酰胺键周围的旋转受阻，西罗莫司在溶液中形成比例为4:1(氯仿)的反向和正向两种构象异构体。雷帕霉素微溶于水、脂肪族烃和二乙醚，而可溶于醇类、卤代烃和二甲基亚砜。雷帕霉素在溶液中不稳定，并且在37℃的血浆以及低-和中性-pH缓冲剂中降解，半衰期小于10h。降解产物的结构在最近得到表征。雷帕霉素是由吸水链霉菌产生的大环三烯抗生素，发现其具有体外和体内的抗真菌活性，特别是对白色念珠菌(Candida albicans)的活性[C.Vezina et al.,J.Antibiot.28,721(1975)；S.N.Sehgal et al.,J.Antibiot.28,727(1975)；H.A.Baker et al.,J.Antibiot.31,539(1978)；美国专利第3,929,992和3,993,749号]。
现已发现单独的雷帕霉素(美国专利第4,885,171号)或与毕西巴尼(picibanil)的组合(美国专利第4,401,653号)具有抗肿瘤活性。R.Martel等人[Can.J.Physiol.Pharmacol.55,48(1977)]发现雷帕霉素在试验性变态反应性脑脊髓炎模型(多发性硬化模型)、佐剂性关节炎模型(类风湿性关节炎模型)中有效；且有效地抑制了IgE样抗体的形成。
雷帕霉素的免疫抑制作用已经公开在FASEB 3,3411(1989)中。还已发现环孢菌素A和FK-506(其他大环分子)也是有效的免疫抑制剂，因此可用于预防移植排斥[FASEB 3,3411(1989)；FASEB 3,5256(1989)；和R.Y.Calne et al.,Lancet1183(1978)]。尽管其与免疫抑制剂他克莫司(tacrolimus)具有结构同源性并且结合到淋巴细胞中的相同细胞内结合蛋白，但雷帕霉素抑制S6p70-激酶，并因此具有不同于他克莫司的免疫抑制作用机理。发现单独的雷帕霉素或与其他免疫抑制剂的组合延长了不同移植在多个物种中的移植物存活。在动物模型中，其毒性作用谱不同于环孢菌素(cyclosporin)或FK-506，包括损伤葡萄糖体内平衡、胃、溃疡、体重减轻和血小板减少症，而尚未检测到肾毒性。
雷帕霉素衍生物
雷帕霉素衍生物包括雷帕霉素前药、雷帕霉素二醛、雷帕霉素的结构类似物(rapalogs)等，并且将在下文详细描述。
可用于本文所述方法和组合物的雷帕霉素的具体衍生物包括RAD001(依维莫司(Everolimus))和CCI-779(Wyeth)。
RAD001(依维莫司)
RAD001(C53H83NO14，分子量958.224g/mol)是雷帕霉素的衍生物。RAD00通过其CAS编号159351-69-6、ATC编码L04AA18和PubChem6442177识别。RAD00的结构式如下所示：
Figure BDA00002111634800261
RAD001也被称作依维莫司，并且由Novartis AG制造。目前，将其用作免疫抑制剂以预防器官移植物的排斥。
RAD001详述于O’Reilly TM,Wood JM,Littlewood-Evans A等人的Differentialanti-vascular effects of mTOR or VEGFR pathway inhibition:a rational basis forcombining RAD001 and PTK787/ZK222584，Presented at:96th Annual Meeting ofthe American Association for Cancer Research.Anaheim,Calif；April 16-20,2005，Abstract 3038。
RAD001还详述于105.Van Oosterom AT,Dumez H,DesaiJ等人的Combination signal transduction inhibition:a phase I/II trial of the oralmTOR-inhibitor everolimus(E,RAD001)and imatinib mesylate(IM)in patients(pts)with gastrointestinal stromal tumor(GIST)refractory to IM[abstract].Proc Am SocClin Oncol.2004;23:195.Abstract 3002。
CCI 779(坦西莫司(Temsirolimus))
CCI 779(细胞周期抑制剂-779，C56H87NO16，分子量1030.3)是雷帕霉素的酯类似物。
CCI 779也称作雷帕霉素-28-N,N-二甲基甘氨酸甲磺酸盐、雷帕霉素,42-[3-羟基-2-(羟甲基)-2-甲基丙酸盐]、3S,6R,7E,9R,10R,12R,14S，15E,17E,19E,21S,23S,26R,27R,34aS)-9,10,12,13,14,21,22,23,24,25,26,27,32,33,34,34a-十六氢-9,27-二羟基-3-[(1R)-2-[(1S,3R,4R)-4-羟基-3-甲氧基环己基]-1-甲基乙基]-10,21-二甲氧基-6,8,12,14,20,26-六甲基-23,27-环氧-3H-吡哆并[2,1-c][1,4]-氧杂氮杂环三十一烷-1,5,11,28,29(4H，6H,31H)-异戊烯炔4′-[2,2-双(羟甲基)丙酸盐]，和雷帕霉素42-[2,2-双(羟甲基)丙酸盐]。
CCI 779通过其CAS编号162635-04-3识别。CCI 779的结构式如下所示：
Figure BDA00002111634800271
CCI 779也被称作坦西莫司，由Wyeth制造。坦西莫司结合胞浆蛋白FKBP，随后抑制mTOR(雷帕霉素的哺乳动物靶标)。
在人癌症的动物模型中，发现坦西莫司即便在使用间歇给药方案时也抑制多种类型癌症的生长。该化合物还似乎具有通过抑制T细胞增殖而阻断与自体免疫疾病和风湿性疾病相关的炎性反应的潜力。
CCI 779是雷帕霉素的水溶性酯(前药)，其在体内释放雷帕霉素。认为CCI779在临床上使用的耐受性比雷帕霉素更好，且目前正在II期和III期临床试验中研究其在肿瘤患者中的应用(包括脑瘤)。
CCI 779详述于Nat Genet.2004;36:585-95和J Clin Oncol.2004;22:2336-47。还可参考K Yu,L Toral-Barza,C Discafani,WG Zhang,J Skotnicki,P Frost,and JJGibbons(2001).mTOR,a novel target in breast cancer:the effect of CCI-779,anmTOR inhibitor,in preclinical models ofbreast cancer.Endocrine-Related cancer 8(3)249-258和Josep Maria Peralba,Linda deGraffenried,William Friedrichs,LetitiaFulcher,Viktor Grünwald,Geoffrey Weiss and Manuel Hidalgo (2003.Pharmacodynamic Evaluation of CCI-779,an Inhibitor of mTOR,in cancer Patients.Clinical cancer Research Vol.9,2887-2892。
雷帕霉素(前药)
所述mTOR抑制剂，特别是雷帕霉素，可以前药的形式提供。如上所述，雷帕霉素前药的具体实例是CCI 779。
本申请中使用的术语“前药”是指药物活性物质的前体或衍生物形式，其对癌细胞的细胞毒性低于母体药物，且能够通过酶活化或转化成活性更高的母体形式。参见，例如Wilman,“Prodrugs in Cancer Chemotherapy”Biochemical SocietyTransactions,14,pp.375382,615th Meeting Belfast(1986)和Stella et al.,“Prodrugs:A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery,”Directed Drug Delivery,Borchardt et al.,(ed.),pp.247267,Humana Press(1985)。本文所述的前药包括，但不限于可转化成活性细胞毒性更高的游离药物的含磷酸盐的前药、含硫代磷酸盐的前药、含硫酸盐的前药、含肽前药、D-氨基酸修饰的前药、糖基化的前药、含β-内酰胺的前药、含任选取代的苯氧基乙酰胺的前药或含任选取代的苯乙酰胺的前药、5-氟胞嘧啶和其他5-氟尿嘧啶前药。可衍生化成前药形式而用于本文所述方法和组合物的药物的实例包括，但不限于上文所述的那些化疗试剂。
雷帕霉素二醛
雷帕霉素前药，例如描述于美国专利6,680,330(Zhu等人)的雷帕霉素二醛可用于本文所述的方法和组合物中。
现已发现雷帕霉素的单酰化和二酰化衍生物(在28和43位被酯化)可用作抗真菌剂(美国专利第4,316,885号)和用于制备雷帕霉素的水溶性前药(美国专利第4,650,803号)。最近，更改了雷帕霉素的编号规定，因此，根据化学文摘的命名法，上述酯将在31和42位。现已描述了羧酸酯(PCT申请第WO92/05179号)、氨基甲酸盐(美国专利第5,118,678号)、酰胺酯(美国专利第5,118,678号)、(美国专利第5,118,678号)、氟化酯(美国专利第5,100,883号)、缩醛(美国专利第5,151413号)、甲硅烷基酯(美国专利第5,120,842号)、二环衍生物(美国专利第5,120,725号)、雷帕霉素二聚体(美国专利第5,120,727号)和O-芳基、O-烷基、O-烷烯基和O-炔基衍生物(美国专利第5,258,389号)。
雷帕霉素通过细胞色素P-4503A代谢成至少6种代谢物。在与人肝和小肠微粒体温育期间，西罗莫司被羟基化和去甲基化，并鉴定到39-O-去甲基西罗莫司的结构。在西罗莫司处理的大鼠胆汁中，检测到>16种的羟基化和去甲基化的代谢物。
在雷帕霉素中，由于所释放的C-7羟基与相邻吡喃环系统(所述系统与其开放形式相平衡)的相互作用，甲氧基在C-7碳的去甲基化将导致雷帕霉素的构象改变。C-7羟基还可以与三烯系统相互作用，并可改变雷帕霉素的免疫抑制活性。这导致雷帕霉素分子的降解及其活性改变。
雷帕霉素的结构类似物(Rapalogs)
现已报道了大量的雷帕霉素结构变体，其通常作为可选的发酵产物，或来自改进化合物作为免疫抑制剂的治疗指数的合成工作。这些中的每一种均可用于本文所述的方法和组合物中。
例如，结构上与雷帕霉素相关的类似物、同源物、衍生物和其他化合物(“rapalogs”)的大量文献除了其他雷帕霉素变体外还包括相对于雷帕霉素具有一种或多种以下修饰：在C7、C42和/或C29甲氧基的去甲基化、除去或置换；C13、C43和/或C28羟基的除去、衍生化或置换；C14、C24和/或C30酮的还原、除去或衍生化；6-元甲基哌啶环(pipecolate ring)置换成5-元脯氨酰环(prolylring)；和环己基环上的可选取代，或环己基环置换成取代的环戊基环。在几乎所有的情况下均报道强免疫抑制活性伴随有rapalogs抗真菌活性。其他历史信息描述于美国专利第5,525,610、5,310,903和5,362,718号的背景部分。
Rapalogs
本文使用的术语“Rapalogs”是指一类化合物，其包括雷帕霉素的各种类似物、同源物和衍生物，以及结构上与雷帕霉素相关的其他化合物。“Rapalogs”包括雷帕霉素(或与雷帕霉素相比，其修饰仅涉及1、2、3、4或5、6位碳-碳双键的一个或多个的饱和的那些雷帕霉素衍生物)之外的化合物，其包括式I中所示的亚结构，携带任意数量的多种取代基，并且除非本文中有相反的说明，任选地在一个或多个碳-碳键是不饱和的。
除其他外，Rapalogs还包括相对于雷帕霉素具有一个或多个以下修饰的雷帕霉素变体：在C7、C42和/或C29甲氧基的去甲基化、除去或置换；C13、C43和/或C28羟基的除去、衍生化或置换；C14、C24和/或C30酮的还原、除去或衍生化；6-元甲基哌啶环置换成5-元脯氨酰环；和环己基环上一个或多个取代基的除去、衍生化或置换，或环己基环置换成取代或未取代的环戊基环等。本文使用的术语Rapalogs不包含雷帕霉素本身，且优选不包含C1和C30之间的氧桥。Rapalogs的说明性实例公开在表I中列出的文献中。C7修饰的Rapalogs的实例显示在表II中。
表I
WO9710502  WO9418207  WO9304680  US5527907  US5225403
WO9641807  WO9410843  WO9214737  US5484799  US5221625
WO9635423  WO9409010  WO9205179  US5457194  US5210030
WO9603430  WO9404540  US5604234  US5457182  US5208241
WO9600282  WO9402485  US5597715  US5362735  US5200411
WO9516691  WO9402137  US5583139  US5324644  US5198421
WO9515328  WO9402136  US5563172  US5318895  US5147877
WO9507468  WO9325533  US5561228  US5310903  US5140018
WO9504738  WO9318043  US5561137  US5310901  US5116756
WO9504060  WO9313663  US5541193  US5258389  US5109112
WO9425022  WO9311130  US5541189  US5252732  US5093338
WO9421644  WO9310122  US5534632  US5247076  US5091389
抗肽mTOR抗体
可产生针对mTOR肽序列的抗肽抗体。所选择的序列可基于来自以下mTOR参照序列的如下小鼠序列：
  1 mlgtgpavat asaatssnvs vlqqfasglk srneetraka akelqhyvtm elremsqees
 61 trfydqlnhh ifelvsssda nerkggilai asligveggn strigrfany lrnllpssdp
121 vvmemaskai grlamagdtf taeyvefevk ralewlgadr negrrhaavl vlrelaisvp
181 tfffqqvqpf fdnifvavwd pkqairegav aalraclilt tqrepkemqk pqwyrhtfee
241 aekgfdetla kekgmnrddr ihgallilne lvrissmege rlreemeeit qqglvhdkyc
 301 kdlmgfgtkp rhitpftsfq avqpqqpnal vgllgysspq glmgfgtsps pakstlvesr
 361 ccrdlmeekf dqvcqwvlkc rssknsliqm tilnllprla afrpsaftdt qylqdtmnhv
 421 lscvkkeker taafqalgll svavrsefkv ylprvldiir aalppkdfah krqktvqvda
 481 tvftcismla ramgpgiqqd ikellepmla vglspaltav lydlsrqipq lkkdiqdgll
 541 kmlslvlmhk plrhpgmpkg lahqlaspgl ttlpeasdva sitlalrtlg sfefeghslt
 601 qfvrhcadhf lnsehkeirm eaartcscll tpsihlisgh ahvvsqtavq vvadvlskll
 661 vvgitdpdpd irycvlasld erfdahlaqa enlqalfval ndqvfeirel aictvgrlss
 721 mnpafvmpfl rkmliqilte lehsgigrik eqsarmlghl vsnaprlirp ymepilkali
 781 lklkdpdpdp npgvinnvla tigelaqvsg lemrkwvdel fiiimdmlqd ssllakrqva
 841 lwtlgqlvas tgyvvepyrk yptllevlln flkteqnqgt rreairvlgl lgaldpykhk
 901 vnigmidqsr dasavslses kssqdssdys tsemlvnmgn lpldefypav smvalmrifr
 961 dqslshhhtm vvqaitfifk slglkcvqfl pqvmptflnv irvcdgaire flfqqlgmlv
1021 sfvkshirpy mdeivtlmre fwvmntsiqs tiillieqiv valggefkly lpqliphmlr
1081 vfmhdnsqgr ivsikllaai qlfganlddy lhlllppivk lfdapevplp srkaaletvd
1141 rltesldftd yasriihpiv rtldqspelr stamdtlssl vfqlgkkyqi fipmvnkvlv
1201 rhrinhqryd vlicrivkgy tladeeedpl iyqhrmlrss qgdalasgpv etgpmkklhv
1261 stinlqkawg aarrvskddw lewlrrlsle llkdssspsl rscwalaqay npmardlfna
1321 afvscwseln edqqdelirs ielaltsqdi aevtqtllnl aefmehsdkg plplrddngi
1381 vllgeraakc rayakalhyk elefqkgptp aileslisin nklqqpeaas gvleyamkhf
1441 geleiqatwy eklhewedal vaydkkmdtn kedpelmlgr mrclealgew gqlhqqccek
1501 wtlvndetqa kmarmaaaaa wglgqwdsme eytcmiprdt hdgafyravl alhqdlfsla
1561 qqcidkardl ldaeltamag esysraygam vschmlsele eviqyklvpe rreiirqiww
1621 erlqgcqriv edwqkilmvr slvvsphedm rtwlkyaslc gksgrlalah ktlvlllgvd
1681 psrqldhplp tahpqvtyay mknmwksark idafqhmqhf vqtmqqqaqh aiatedqqhk
1741 qelhklmarc flklgewqln lqginestip kvlqyysaat ehdrswykaw hawavmnfea
1801 vlhykhqnqa rdekkklrha sganitnatt aattaasaaa atstegsnse seaesnensp
1861 tpsplqkkvt edlsktllly tvpavqgffr sislsrgnnl qdtlrvltlw fdyghwpdvn
1921 ealvegvkai qidtwlqvip qliaridtpr plvgrlihql ltdigryhpq aliypltvas
1981 kstttarhna ankilknmce hsntlvqqam mvseelirva ilwhemwheg leeasrlyfg
2041 ernvkgmfev leplhammer gpqtlketsf nqaygrdlme aqewcrkymk sgnvkdltqa
2101 wdlyyhvfrr iskqlpqlts lelqyvspkl lmcrdlelav pgtydpnqpi iriqsiapsl
2161 qvitskqrpr kltlmgsngh efvfllkghe dlrqdervmq lfglvntlla ndptslrknl
2221 siqryavipl stnsgligwv phcdtlhali rdyrekkkil lniehrimlr mapdydhltl
2281 mqkvevfeha vnntagddla kllwlkspss evwfdrrtny trslavmsmv gyilglgdrh
2341 psnlmldrls gkilhidfgd cfevamtrek fpekipfrlt rmltnamevt gldgnyrttc
2401 htvmevlreh kdsvmavlea fvydpllnwr lmdtntkgnk rsrtrtdsys agqsveildg
2461 velgepahkk agttvpesih sfigdglvkp ealnkkaiqi inrvrdkltg rdfshddtld
2521 vptqvellik qatshenlcq cyigwcpfw
因此，可由以下序列中的任一种或多种产生优选的抗肽抗体：氨基酸22-139；氨基酸647-907；氨基酸937-1140；氨基酸1382-1982；氨基酸2019-2112；或氨基酸2181-2549。
可选择来自人mTOR的相应序列用于从接种动物得到抗肽抗体。抗体可通过注射至家兔，和例如Harlow and Lane(如上)中描述的其他常规方式产生。
通过ELISA试验或通过Western印迹检测抗体，并将其用于实施例中所述的免疫染色中。
PDK1的下调
本文所述的方法和组合物涉及PDK1活性和/或表达的部分下调。
概括地，本发明的方法涉及通过调节(例如下调)癌细胞中PDK1的表达、量或活性而操纵所述细胞。可在所述操纵步骤之前或之后进行检测细胞中受调控PDK1的表达、量或活性的步骤。所述检测步骤可检测PDK1的表达、量或活性的上调或下调。可使用如本文他处详述的调节或下调PDK1的任何方法。
例如，可通过使用PDK1抑制剂，包括PDK1的小分子抑制剂下调PDK1活性和/或表达。PDK1抑制剂的实例为BX795(CAS No.:702675-74-9)。
Figure BDA00002111634800331
可适合用于下调PDK1活性和/或表达的其他PDK1抑制剂描述于R IFeldman等人的Novel Small Molecule Inhibitors of 3-Phosphoinositide-dependentKinase-1.J.Biol.Chem.,2005,280,20,19867-19874和C Peifer,D R.Alessi,Small-Molecule Inhibitors of PDK1.ChemMedChem.2008,3(10)。
所述方法可包括使所述细胞暴露于siRNA或shRNA或能够特异结合PDK1的抗PDK1抗体。可通过靶向PDK1靶位点来调节PDK1，其中所述PDK1靶位点选自PDK1序列中的任何适合位点。
根据本发明的方法，由于所述操纵，所述癌细胞变成非癌性或对mTOR抑制剂敏感。具体地，所述癌症可包括例如结肠直肠癌、膀胱癌、食道癌和脑癌的癌症及其mTOR抑制剂抗性形式(例如，此类癌症的雷帕霉素抗性或雷帕霉素衍生物抗性形式)。
可检测患有癌症的个体的细胞内(癌或非癌细胞内)的PDK1水平，并评估所述个体对诸如mTOR抑制剂的治疗的敏感性。与正常细胞相比高水平的PDK1量、表达或活性表明为例如结肠直肠癌、膀胱癌、食道癌和脑癌的癌症的mTOR抑制剂抗性形式(例如，雷帕霉素抗性或雷帕霉素衍生物抗性形式)。因此，可选择可选的疗法，包括使用PDK1抑制剂和拮抗剂。
如果相对于对照所述疾病的相关症状得到显著抑制(即，抑制50%或更多)，则将所述癌症定义为得到了“治疗”。所述抑制可以是相对于对照至少75%，例如相对于对照90%，95%或100%。所述症状可包括细胞增殖，或可包括细胞周期时间、细胞数量、细胞迁移、细胞侵袭等。所述术语“治疗”还包括癌症的预防或缓解。
特别是在癌细胞和其他增殖性细胞中，PDK1多肽代表了抑制其功能以用于治疗的靶标。
本文使用的术语增殖性疾病广义上包括需要控制细胞周期的任何疾病。具体地，增殖性疾病包括恶性和癌前病变。本文所述的方法和组合物对于腺癌的治疗或诊断特别有用，例如小细胞肺癌，以及肾、子宫、前列腺、膀胱、卵巢、结肠和乳腺的癌症。例如，可治疗的恶性病包括：急性和慢性白血病，淋巴瘤，骨髓瘤，肉瘤，例如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、淋巴管肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤，结肠癌，卵巢癌，前列腺癌，胰腺癌、乳腺癌，鳞状细胞癌，基底细胞癌，腺癌，汗腺癌，皮脂腺癌，乳头状癌，乳头状腺癌，囊腺癌、髓样癌，支气管癌，绒毛膜癌，肾细胞癌，肝癌，胆管癌，精原细胞瘤，胚胎癌，宫颈癌，睾丸癌，肺癌，小细胞肺癌，膀胱癌，上皮癌，神经胶质瘤，星形细胞瘤，室管膜瘤，松果体瘤，血管母细胞瘤，听神经瘤，髓母细胞瘤，颅咽管瘤，少突神经胶质瘤，脑膜瘤，黑素瘤，神经母细胞瘤和成视网膜细胞瘤。
用于治疗此类疾病的可能方法之一是表达本文所述的靶向PDK1多核苷酸的反义构建物，并将其施用至癌细胞，从而抑制基因功能并阻止癌细胞的生长或进展。
可使用反义构建物以抑制基因功能，从而阻止增殖性细胞的生长或进展。与正义核酸或mRNA互补的反义构建物，即核酸，例如RNA构建物详述于US6,100,090(Monia等)和Neckers等的1992,Crit Rev Oncog 3(1-2):175-231，以上文献的教导专门通过引用并入本文。
在具体的实施例中，可通过完全或部分地减少PDK1的量、表达或活性，例如通过能够结合并破坏PDK1mRNA的siRNA来预防或治疗例如结肠直肠癌、膀胱癌、食道癌和脑癌的癌症及其mTOR抑制剂抗性形式(例如，此类癌症的雷帕霉素抗性或雷帕霉素衍生物抗性形式)。本发明特别提供了通过RNA干扰下调PDK1的抗PDK1试剂。所述抗PDK1试剂可以包括小干扰RNA(siRNA)或小发卡RNA(shRNA)。
RNA干扰(RNAi)是通过直接引入的双链RNA(dsRNA)诱导转录后基因沉默(PTGS)的方法，并且已经成为用于敲除多种生物中的特异基因表达的有用工具。RNAi描述于Fire等人的Nature 391:806-811(1998)。PTGS的其他方法是已知的并且包括，例如引入转基因或病毒。通常，在PTGS中，经沉默的基因的转录本被合成但由于其被快速降解而不积累。包括RNAi在内的用于PTGS的方法描述于，例如Ambion.com网站，“/hottopics/”目录，“rnai”文件夹中。
本文描述了用于体外RNAi的适合方法。此类方法之一包括引入siRNA(小干扰RNA)。目前的模型表明，这些21-23个核苷酸的dsRNAs能够诱导PTGS。用于设计有效siRNAs的方法描述于，例如上述Ambion.com网站。也可通过全部或部分的PDK1核酸序列编码RNA前体，例如小发卡RNA(shRNA)。
或者，双链(ds)RNA也是干扰多种生物中基因表达的有力途径，其已在哺乳动物中取得了成功(Wianny and Zernicka-Goetz,2000,Nat Cell Biol 2:70-75)。可将对应于PDK1多核苷酸序列的双链RNA引入到候选生物的卵母细胞和细胞中或在其中表达，从而干扰PDK1活性。
调节PDK1基因表达的其他方法是本领域技术人员已知的，并且包括负显性方法(dominant negative approaches)。因此，另一种方法是使用与内源基因产物竞争的本文PDK1多肽的无功能变体，从而导致功能抑制。
还可通过引入抑制基因表达或功能活性的肽或小分子而调节PDK1基因的表达。因此，可将通过本文所述试验鉴定为结合或调控，例如下调PDK1多肽量、活性或表达的化合物施用到癌或增殖性细胞，以抑制PDK1多肽的功能。此类化合物可以以有效量与药学上可接受的载体一起施用以下调PDK1表达或活性，或通过活化或下调控制PDK1表达、活性或量的第二信号，并由此缓解异常症状。
本文所述的抗PDK1多肽的适合抗体也可用作治疗剂。抗PDK1抗体可包括兔抗PDK1抗体。
或者，也可采用基因疗法以控制所述受试者中的相关细胞对PDK1的内源产生。例如，如下文的论述，可对编码PDK1 siRNA或其部分的多核苷酸进行工程化以用于在复制缺陷型逆转录载体中表达。随后，可分离所述逆转录表达构建物，并将其引入到转导了包含编码抗PDK1 siRNA的RNA的逆转录质粒载体的包装细胞中，从而使所述包装细胞产生包含目标序列的感染性病毒颗粒。可将这些生产细胞施用到受试者，以在体内对细胞进行工程化，并调控PDK1的体内表达。关于基因疗法的综述可参见Chapter 20,Gene Therapy and otherMolecular Genetic-based Therapeutic Approaches,(and references cited therein)inHuman Molecular Genetics,T Strachan and A P Read,BIOS Scientific PublishersLtd(1996)。
在一些实施方式中，PDK1的水平在癌细胞中降低。此外，在此类实施方式中，治疗可靶向或特异于癌细胞，例如结肠直肠癌细胞、膀胱癌细胞、食道癌细胞和脑癌细胞。
PDK1的表达可特异地仅在致病性(diseased)癌细胞(即，那些癌性细胞)中降低，但在其他致病性(non-diseased)癌细胞中基本没有降低。在这些方法中，在其他细胞，即不是结肠直肠癌细胞、膀胱癌细胞、食道癌细胞或脑癌细胞的细胞中，PDK1的表达基本没有降低。因此，在此类实施方式中，在治疗期间或治疗后，PDK1水平在所述其他细胞中保持基本相同或近似。
可通过靶向给药，即仅向结肠直肠癌细胞、膀胱癌细胞、食道癌细胞和脑癌细胞而不向其他细胞施加治疗，实现所述细胞的细胞特异性PDK1水平降低。然而，在其他实施方式中，采用所述细胞中PDK1表达的下调(在其他细胞或组织类型中基本没有下调)。此类方法可有利地利用组织特异性表达载体来组织特异性地表达例如siRNA。
鉴定mTOR拮抗剂和PDK1拮抗剂
可使用拮抗剂，特别是小分子来特异性地抑制mTOR和/或PDK1或以上二者。
因此，本发明公开了小分子mTOR抑制剂，以及用于筛选这些小分子mTOR抑制剂的方法。可通过检测调节，优选下调结合或其他活性来筛选mTOR激酶拮抗剂。本文所述的方法和组合物中可采用所鉴定的任何mTOR拮抗剂。
本发明还公开了PDK1的小分子抑制剂，以及用于筛选这些小分子抑制剂的方法。可通过检测调节，优选下调PDK1本身或与PDK1相关的任何活性，例如PDK1介导的Myc磷酸化活性等，来筛选PDK1抑制剂。
所述“下调”包括对所研究行为的任何负面影响；其可以是整体或部分的。因此，在检测到结合时，候选拮抗剂能够减少、改善或消除两个实体之间的结合。优选地，与不存在所述候选分子时的结合(或任何其他活性)相比，通过所述候选分子实现结合(或任何其他活性)下调至少10%，优选至少20%，优选至少30%，优选至少40%，优选至少50%，优选至少60%，优选至少70%，优选至少80%，优选至少90%或更多。因此，适合用作拮抗剂的候选分子是能够降低10%或更多结合或其他活性的分子。
多肽结合试验
可通过本领域已知的任何方式鉴定mTOR活性或表达的调节剂或拮抗剂。可在检测mTOR与推定分子之间结合的试验中，通过其与mTOR的结合对此类推定分子进行鉴定。
类似地，可通过本领域已知的任何方式鉴定PDK1活性或表达的调节剂和拮抗剂。可在检测PDK1与推定分子之间结合的试验中，通过其与PDK1的结合对此类推定分子进行鉴定。
用于鉴定与多肽结合的物质的一种试验包括使没有固定的候选物质接触固定在固体支持物上的多肽，并检测所述多肽和候选物质是否相互结合和/或结合程度。或者，可将候选物质固定，而不固定所述多肽。这可以用于检测能够结合mTOR多肽或PDK1，视具体情况或其片段、同源物、变体或衍生物的物质。
在优选的试验方法中，将所述多肽固定在珠子，例如琼脂糖珠上。通常通过将mTOR多肽或PDK1，视具体情况或其片段、同源物、变体或衍生物作为GST-融合蛋白在细菌、酵母或高级真核细胞系中表达，并使用谷胱甘肽-琼脂糖珠从粗细胞提取物纯化GST-融合蛋白而实现(Smith and Johnson,1988)。作为对照，在没有所述多肽的情况下，检测非GST-融合蛋白的候选物质与所述被固定的多肽的结合。随后，测定所述候选物质与所述被固定的多肽的结合。在本领域中，此类试验被称作GST下拉试验(GST pulldown assay)。同样地，可将候选物质固定，而不固定所述多肽。
还可使用用于固定一种组分的不同亲和纯化系统，例如Ni-NTA琼脂糖和用组氨酸标记组分进行此类试验。
可通过本领域熟知的多种方法测定mTOR多肽或PDK1多肽，或其片段、同源物、变体或衍生物与所述候选物质的结合。例如，可标记(例如使用放射性标记、表位标签或酶-抗体结合物)非固定组分。或者，可通过免疫检测技术测定结合。例如，可对反应混合物进行Western杂交，并使用检测非固定组分的抗体探测印迹。还可以使用ELISA技术。
通常，添加的候选物质的终浓度为1至1000nmol/ml，更优选1至100nmol/ml。在抗体的情况下，所使用的终浓度通常为100至500μg/ml，更优选200至300μg/ml。
还可通过检测对mTOR或PDK1和与其结合的任何分子之间的结合的调节来鉴定mTOR和PDK1的调节剂和拮抗剂。
活性试验
用于检测调节剂或拮抗剂的试验通常包括检测在候选分子存在下，对mTOR的任何活性(优选激酶活性)或PDK1活性的调节，任选一起检测没有候选分子时对活性的调节。
所述试验包括使候选分子(例如，文库形式)接触mTOR或PDK1，所述mTOR或PDK1为多肽、编码所述多肽的核酸，或包含所述物质的细胞、细胞器、提取物或其他材料与候选调节剂接触。可检测mTOR或PDK1的相关活性(如下文所述)，以确定所述候选调节剂的存在是否具有任何作用。还可以使用启动子结合试验，以检测结合和/或影响mTOR或PDK1转录或表达的候选调节剂。随后，可选择候选调节剂做进一步的研究，或分离备用。此类筛选方法的细节是本领域熟知的，例如，描述于Handbook of Drug Screening,edited by RamakrishnaSeethala,Prabhavathi B.Fernandes(2001,New York,NY,Marcel Dekker,ISBN0-8247-0562-9)。
本文描述的筛选方法优选采用体内试验，尽管其也可经设定而用于体外应用。体内试验通常包括使包含mTOR或PDK1的细胞接触所述候选分子。在体外试验中，任选在其他组分，例如粗的或半纯化细胞提取物或纯化蛋白存在下，使mTOR或PDK1暴露于所述候选分子。在进行体外试验的情况下，优选采用候选分子的阵列(例如，阵列文库)。优选体内试验。因此，优选mTOR或PDK1包含在细胞内，优选异源包含。此类细胞优选为转基因细胞，其如上文所述经工程化以表达mTOR或PDK1的细胞。
在采用提取物的情况下，可包含细胞质提取物或核提取物，其制备方法是本领域熟知的。
应理解，可使用包含mTOR或PDK1的细胞的任何组分，例如，细胞器。如所述，优选的实施方式利用细胞质或核制备物，例如，包括包含mTOR的细胞核。参见Zhang等人的Predominant Nuclear Localization of Mammalian Target ofRapamyinin Normal and Malignant Cells in Culture.J.Biol.Chem.,Jul 2002;277:28127–28134。所述核制备物可包含一个或多个细胞核，其可通过例如清洁剂处理而被透化或半透化。
因此，在具体实施方式中，试验设计可包括以下：制备在各孔中包括表达mTOR或PDK1的一个或多个细胞的多孔微滴定板；可将源自，例如文库的单独的候选分子或候选分子的混合物(pool)添加到各孔中，并测量对mTOR或PDK1活性的调节。在使用所述混合物时，可将其细分成进一步的混合物，并以相同的方式测试。随后，检测mTOR或PDK1活性，例如激酶活性。
可选地，或在上述试验方法之外，还可使用“消减(substractive)”程序以鉴定mTOR或PDK1的调节剂或拮抗剂。在所述“消减”程序中，提供多种分子，其包含能够发挥调节剂作用的一种或多种候选分子(例如，细胞提取物、核提取物、分子文库等)，并从所述多种分子中去除、耗竭或消减一种或多种组分。随后，如所描述的，通过暴露于包含所述mTOR或PDK1的细胞(或其组分)而检测“经消减”提取物等的活性。
因此，例如，可按如下所述进行“免疫耗竭”试验以鉴定此类调节剂。可从多能细胞，例如多能EG/ES细胞制备细胞质或核提取物。可对所述提取物进行耗竭或片段化以除去推定的调节剂，例如通过使用合适抗体的免疫耗竭法。如果所述提取物的调节剂被耗竭，其将失去影响mTOR或PDK1功能或活性或表达的能力。可需要一系列的消减和/或耗竭以鉴定所述调节剂或拮抗剂。
还应理解，上述“耗竭”或“消减”试验可用作鉴定用于进一步筛选的推定调节因子的预备步骤。此外或可选地，所述“耗竭”或“消减”试验可用于确定通过其他方式(例如，本文他处描述的“阳性”筛选)鉴定为推定调节剂的分子的调节活性。
可对经过所述试验且认定为目标的候选分子进行分离和进一步研究。目标分子的分离方法将取决于所用分子的类型，其是否为文库形式，任一次检测多少候选分子，是否有后续的批处理过程等。
可以提供文库形式的候选分子。在优选的实施方式中，同时筛选多于一种候选分子。可通过本领域已知的方式产生候选分子的文库，例如小分子文库、多肽文库、核酸文库、化合物文库(例如组合文库)、反义分子例如反义DNA或反义RNA的文库、抗体文库等。此类文库适合高通量筛选。可使包含mTOR或PDK1的不同细胞暴露于所述文库的单个成员，并测定对mTOR活性或PDK1活性的影响。可将阵列技术应用于此目的。所述细胞可以是在空间上分离的，例如分离在微滴定板的孔中。
在优选的实施方式中，采用小分子文库。所述“小分子”指分子量优选小于约50kDa的分子。在具体实施方式中，小分子的分子量优选小于约30kDa，更优选小于约15kDa，最优选小于约10kDa。此类小分子的文库(本文称作“小分子文库”)可包含多肽、小肽，例如20个或更少氨基酸如15、10或5个氨基酸的肽，简单化合物等。
可选地或此外，可在如下文详述的组合文库中筛选mTOR或PDK1的调节剂或拮抗剂。
mTOR活性试验(assay)
mTOR的任何活性均可用作试验的基础。
具体地，可检测mTOR介导的细胞活性以鉴定拮抗剂。例如，mTOR负责对包括真核起始因子4E(eIF4E)和核糖体S6激酶1(S6K1)、RNA聚合酶I和eEF2激酶在内的底物进行磷酸化。因此，可使用例如本领域已知的激酶试验，测定所述推定拮抗剂或激动剂对mTOR介导的对这些底物中的一种或多种(或源自其序列的肽)的激酶活性。
此类试验可采用4E-BP1和/或S6K1作为底物，或使用来自这些多肽的肽作为底物。已知mTOR在Thr37和Thr46将4E-BP1磷酸化，并在Thr389将S6K1磷酸化(Schalm SS,Fingar DC,Sabatini DM,Blenis J.Curr Biol.2003 May13;13(10):797-806;Schalm SS,Blenis J.Curr Biol.2002Apr 16;12(8):632-9.)，因此，可使用已知的肽合成方法产生包含这些位置的肽底物。
用于检测mTOR激酶活性的实例性检测方法描述于Gary G.Chiang,RobertT.Abraham.,Determination of the Catalytic Activities of mTOR and Other Membersof the Phosphoinositide-3-Kinase-Related Kinase Family.,Checkpoint Controls andCancer:Volume 2:Activation and Regulation Protocols,July 2004,pps.125-142(ISBN:1-59259-811-0),Volume#:281,Series:Methods in Molecular Biology。
mTOR激酶试验
进一步的mTOR试验公开在Molecular Mechanism of mTOR Downstream Signalling(PhD Thesis,S.Schalm,17th September 2003,Fachbereich Biologie,Chemie,Pharmazie,Freie Berlin，http://www.diss.fu-berlin.de/2003/249/index.html)。
细胞在包含10%FBS的DMEM中生长48小时，并在裂解缓冲剂B(40mMHEPES、120mM NaCl、50mM NaF、1mM EDTA、50mM β-甘油磷酸酯、0.2%CHAPS、1mM Na3VO4、40mg/ml PMSF、5μg/ml胃蛋白酶抑制剂、10μg/ml亮肽素、1mM DTT、ddH2O，pH 7.5)中裂解。将150-mm平板的全部细胞裂解物的三分之一与抗mTOR抗体(例如，Bethyl,Inc,Texas USA)一起温育2小时，随后再与蛋白G-琼脂糖珠一起温育1小时。使用1ml mTOR清洗缓冲剂A (含20mM Tris、500mM NaCl、1mM EDTA、20mM β-甘油磷酸酯、5mM EGTA、1mM DTT、1mM Na3VO4、40mg/ml PMSF、10μg/ml亮肽素、5μg/ml胃蛋白酶抑制剂的ddH2O，pH 7.4)清洗免疫沉淀物两次，使用mTOR清洗缓冲剂B(含10mM HEPES、50mM β-甘油磷酸酯、50mM NaCl、1mM DTT、1mM Na3VO4、40mg/ml PMSF、10μg/ml亮肽素、5μg/ml胃蛋白酶抑制剂的ddH2O，pH 7.4)清洗1次，并使用ST (50mM Tris-HCl、5mM Tris-碱、150mM NaCl、ddH2O，pH 7.28)清洗1次。
在30℃，在mTOR激酶检测缓冲剂(10mM HEPES、50mM NaCl、50mM β-甘油磷酸酯、10mM MnCl2、100μM无标记ATP、10μCi[γ-32P]ATP(NewEngland Nuclear)，pH 7.4)中，分析经清洗的免疫沉淀物中的重组GST-4E-BP1WT或GST-4E-BP1 F114A(即，亚克隆至pGEX-2T/GST的人4E-BP1，Pharmacia)的激酶试验30分钟。通过12%SDS-PAGE分离反应(产物)，并通过放射自显影法评估掺入到GST-4E-BP1的32P，并通过磷成像(BioRad)定量。将在30°C于1分钟内催化1pmol磷酸根转移到每个反应体积的底物所需的激酶(即蛋白)的量定义为一个激酶单位。
mTOR报告子试验
可按如下所述鉴定活化或促进mTOR活性的分子和试剂：为了筛选mTOR活化分子，将杂合基因转染到哺乳动物细胞中，所述杂合基因编码具有衍生自TOP mRNA的5’UTR(例如L5核糖体蛋白mRNA)和来自报告基因(例如GFP或萤光素酶)的编码区的mRNA。将所述细胞进行血清饥饿，或用雷帕霉素处理以关闭报告子的翻译。使细胞接暴露于候选分子或文库成员。添加mTOR活化分子将上调所述报告子的翻译(参见图8A和实施例8)。
可按如下所述鉴定抑制mTOR活性的分子和试剂：为了筛选mTOR抑制分子，将杂合基因转染到哺乳动物细胞中，所述杂合基因编码具有5’UTR和来自报告基因(例如GFP或萤光酶)的编码区的mRNA，其中所述5’UTR源自帽介导的翻译被抑制时其翻译上调的mRNA，例如p27Kip1 mRNA。将所述细胞进行血清饥饿或用雷帕霉素处理以开启报告子的翻译。随后，可添加血清或除去雷帕霉素以活化mTOR并关闭报告子的翻译。使细胞暴露于候选分子或文库成员。当报告子关闭时，可添加mTOR抑制分子以上调所述报告子的翻译(参见图8B和实施例9)。
细胞周期试验
此外，本发明显示mTOR活性能够延长细胞周期时间；因此，可测定在候选分子存在或缺失时的细胞周期以鉴定mTOR活性的拮抗剂或激动剂。
PDK1活性的试验
为了测试PDK1活性，可对PDK1的多种其他生化活性中的任一种进行测定。因此，可通过任意一种或多种以下本领域已知的方法测试推定拮抗剂或激动剂对PDK1活性的影响。
PDK1活性试验是本领域已知的，并且包括，例如Upstate Biotechnology和Millipore销售的PDK1激酶检测试剂盒(目录号：17-280，Upstate Biotechnology,Lake Placid,NY,USA)，以及
Figure BDA00002111634800421
PDK1激酶检测试剂盒(目录号：7577，Cell Signalling Technology,Danvers,Massachusetts,USA)。
文库
候选分子的文库，例如多肽或核酸的文库可用于筛选本文所述的mTOR拮抗剂和PDK1抑制剂。使所述文库暴露于mTOR蛋白，并测定其对所述蛋白活性的影响(如果存在)。类似地，可使所述文库暴露于试验系统，并测定其对PDK1的影响(如果存在)。
用于分离大文库中的期望成员的筛选方法是本领域已知的，其代表为噬菌体展示技术。在所述系统中将不同的肽序列展示在丝状噬菌体的表面上(Scottand Smith 1990，如上)，现已证实此类系统可用于产生抗体片段(和编码所述抗体片段的核苷酸序列)的文库，以用于体外筛选并扩增结合靶抗原的特异抗体片段。将编码VH和VL区的核苷酸序列连接到编码将其引导至大肠杆菌的周质间隙的引导信号的基因片段，由此获得的抗体片段通常作为与噬菌体外壳蛋白(例如pIII或pVIII)的融合物而展示在噬菌体的表面上。或者，抗体片段外在地展示在λ噬菌体壳体(phagebody)上。基于噬菌体的展示系统的优点在于，由于其为生物系统，所选的文库成员可简单地通过在细菌细胞中培养包含所选文库成员的噬菌体而扩增。此外，由于编码多肽文库成员的核苷酸序列包含在噬菌体或噬菌粒载体上，所以测序、表达和后续的基因操作相对简单。
用于构建噬菌体抗体展示文库和λ噬菌体表达文库的方法是本领域熟知的(McCafferty et al(1990)，如上；Kang et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,88:4363；Clackson et al.(1991)Nature,352:624；Lowman et al.(1991)Biochemistry,30:10832；Burton et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.,88:10134；Hoogenboom et al.(1991)Nucleic Acids Res.,19:4133；Chang et al.(1991)J.Immunol.,147:3610；Breitling et al.(1991)Gene,104:147；Marks et al(1991)，如上；Barbas et al(1992)，如上；Hawkins and Winter(1992)J.Immunol.,22:867；Marks et al.,1992,J.Biol.Chem.,267:16007；Lerner et al.(1992)Science,258:1313，通过引用并入本文)。如果有必要，可对此类技术进行修饰以用于多肽文库的一般表达。
一个特别有利的方法是使用scFv噬菌体文库(Bird,R.E.,et al.(1988)Science242:423-6,Huston et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.,85:5879-5883；Chaudhary et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.,87:1066-1070；McCafferty etal(1990)，如上；Clackson et al(1991)，如上；Marks et al(1991)，如上；Chiswellet al.(1992)Trends Biotech.,10:80；Marks et al(1992)，如上)。现已描述了展示在噬菌体外壳蛋白上的scFv文库的多种实施方式。噬菌体展示方法的改进也是已知的，例如描述于WO96/06213和WO92/01047(Medical Research Council等)和WO97/08320(Morphosys，如上)，以上通过引用并入本文。
可选的文库选择技术包括噬菌体λ表达系统，其可以噬菌斑或溶原性细菌的菌落而进行直接筛选，二者在此前均有描述(Huse et al.(1989)Science,246:1275；Caton and Koprowski(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,87；Mullinax et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,87:8095；Persson et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,88:2432)，并可用于本文所述的方法和组合物中。这些表达系统可用于筛选文库的大量不同成员，数量级为约106或更高。其他筛选系统依赖于，例如文库成员的直接化学合成。一个早期方法包括在一组针或棒上合成肽，例如描述于WO84/03564。美国专利第4,631,211号公开了类似的方法，其包括在珠子上合成肽，形成肽文库，在该肽文库中每个珠子都是一个单独的文库成员；WO92/00091中描述了相关的方法。基于珠子的方法的显著改进涉及使用独特的识别标签，例如寡核苷酸，标记每个珠子，从而有利于鉴定每个文库成员的氨基酸序列。这些改进的基于珠子的方法描述于WO93/06121。
另一种化学合成方法包括通过将每个不同的文库成员(例如，独特的肽序列)放置在阵列中预定的离散位置的方式，在表面上合成肽(或拟肽)的阵列。通过其在阵列中的空间定位确定每个文库成员的身份。确定阵列中出现预定分子(例如，受体)与反应性文库成员之间结合性相互作用的位置，从而基于空间定位鉴定出反应性文库成员的序列。这些方法描述于美国专利第5,143,854号；WO90/15070和WO92/10092；Fodor et al.(1991)Science,251:767；Dower and Fodor(1991)Ann.Rep.Med.Chem.,26:271。
用于产生多肽或核苷酸的文库的其他系统包括使用无细胞酶系统用于文库成员的体外合成。在一个方法中，通过交替轮的针对靶配体的选择和PCR扩增选择RNA(Tuerk and Gold(1990)Science,249:505；Ellington and Szostak(1990)Nature,346:818)。类似的技术可用于鉴定结合预定人转录因子的DNA序列(Thiesen and Bach(1990)Nucleic Acids Res.,18:3203；Beaudry and Joyce(1992)Science,257:635；WO92/05258和WO92/14843)。以类似的方式，可使用体外翻译合成多肽，作为用于产生大文库的方法。通常包括稳定的多核糖体复合体的这些方法进一步描述于WO88/08453、WO90/05785、WO90/07003、WO91/02076、WO91/05058和WO92/02536。不基于噬菌体的可选展示系统，例如WO95/22625和WO95/11922(Affymax)公开的那些，使用多核糖体展示筛选用多肽。这些和上述所有文献也通过引用并入本文。
具体地，所述文库可包含锌指文库；锌指是本领域已知的，且作为转录因子。适合的锌指文库公开在，例如WO 96/06166和WO 98/53057。锌指文库的构建可利用测定与特定DNA序列相互作用的规则，其公开于，例如WO 98/53058和WO 98/53060。能够特异性地与甲基化DNA相互作用的锌指公开在WO99/47656。上述锌指文库可以阵列的形式固定，例如WO 01/25417中的公开。因此，能够改变细胞效力的优选分子包括锌指。
组合文库
文库，特别是候选分子的文库，可以适合地为组合文库的形式(也称作组合化学文库)。
本文中使用的术语“组合文库”是由随机选择的亚单位组成的多种化合物的集合。可从组合文库筛选能够抑制mTOR或PDK1的分子。
目前，可获得化合物的多种组合文库，包括对蛋白水解酶和非蛋白水解酶具有活性的文库，G蛋白偶联受体(GPCR)的激动剂和拮抗剂的文库，对非GPCR靶标(例如，整联蛋白、离子通道、域相互作用、核受体和转录因子)具有活性的文库，以及全细胞肿瘤学和抗感染靶的文库等。Dolle and Nelson(1999),Journalof Combinatorial Chemistry,Vol 1 No 4,235-282提供了组合文库，特别是其构建和使用的全面综述。还可参考Combinatorial peptide library protocols(edited byShmuel Cabilly,Totowa,N.J.:Humana Press,c 1998.Methods in Molecular Biology;v.87)。具体的组合文库及其构建方法公开在美国专利第6,168,914号(Campbell等)，以及Baldwin等人(1995),“Synthesis of a Small Molecule Library Encodedwith Molecular Tags,”J.Am.Chem.Soc.117:5588-5589，以及这些文献提到的参考文献中。
在优选的实施方式中，所筛选的组合文库是经设计以潜在地包含与细胞组分相互作用以影响基因表达的分子的文库。例如，可筛选针对染色质结构蛋白的组合文库。可用于该实施方式的其他文库包括针对组蛋白修饰酶(例如，组蛋白乙酰化或组蛋白甲基化酶)或DNA修饰(例如DNA甲基化或去甲基化)的文库
描述化学组合文库、其产生和应用的其他文献包括可得自于URLhttp://www.netsci.org/Science/Combichem/的那些，包括The Chemical Generationof Molecular Diversity.Michael R.Pavia,Sphinx Pharmaceuticals,A Division of EliLilly(公开于1995年7月)；Combinatorial Chemistry:A Strategy for the Future-MDL Information Systems discusses the role its Proj ect Library plays in managingdiversity libraries(公开于1995年7月)；Solid Support Combinatorial Chemistry inLead Discovery and SAR Optimization,Adnan M.M.Mjalli and Barry E.Toyonaga,Ontogen Corporation(公开于1995年7月)；Non-Peptidic Bradykinin ReceptorAntagonists From a Structurally Directed Non-Peptide Library.Sarvajit Chakravarty,Babu J.Mavunkel,Robin Andy,Donald J.Kyle*,Scios Nova Inc.(公开于1995年7月)；Combinatorial Chemistry Library Design using Pharmacophore Diversity KeithDavies and Clive Briant,Chemical Design Ltd.(公开于1995年7月)；A DatabaseSystem for Combinatorial Synthesis Experiments-Craig James and David Weininger,Daylight Chemical Information Systems,Inc.(公开于1995年7月)；An InformationManagement Architecture for Combinatorial Chemistry,Keith Davies and CatherineWhite,Chemical Design Ltd.(公开于1995年7月)；Novel Software Tools forAddressing Chemical Diversity,R.S.Pearlman,Laboratory for Molecular Graphicsand Theoretical Modeling,College of Pharmacy,University of Texas(公开于1996年6/7月)；Opportunities for Computational Chemists Afforded by the New Strategiesin Drug Discovery:An Opinion,Yvonne Connolly Martin,Computer AssistedMolecular Design Project,Abbott Laboratories(公开于1996年6/7月)；Combinatorial Chemistry and Molecular Diversity Course at the University ofLouisville:A Description,Arno F.Spatola,Department of Chemistry,University ofLouisville(公开于1996年6/7月)；Chemically Generated Screening Libraries:Present and Future.Michael R.Pavia,Sphinx Pharmaceuticals,A Division of EliLilly(公开于1996年6/7月)；Chemical Strategies For Introducing CarbohydrateMolecular Diversity Into The Drug Discovery Process..Michael J.Sofia,TranscellTechnologies Inc.(公开于1996年6/7月)；Data Management for CombinatorialChemistry.Maryjo Zaborowski,Chiron Corporation and Sheila H.DeWitt,Parke-Davis Pharmaceutical Research,Division of Warner-Lambert Company(公开于1995年11月)；和The Impact of High Throughput Organic Synthesis on R&D inBio-Based Industries,John P.Devlin(公开于1996年3月)。
组合化学的技术在现代方法中被广泛接受用于产生新的先导药物(Gallop,M.A.et al.,1994,J.Med.Chem.37:1233-1251;Gordon,E.M.et al.,1994,J.Med.Chem.37:1385-1401)。所使用的组合方法之一是基于以下策略，其包括在固相支持物的每个颗粒上合成包含不同结构的文库，使所述文库与可溶性受体相互作用，鉴定与大分子靶相互作用的“珠子”，和确定所鉴定出的“珠子”携带的结构(Lam,K.S.et al.,1991,Nature 354:82-84)。此方法的替代方式是从所述固体支持物顺次释放所限定的化合物试样，随后测定溶液中的活性，鉴定释放活性化合物的颗粒，并通过直接测序(Salmon,S.E.et al.,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:11708-11712)，或通过解读其编码(Kerr,J.M.et al.,1993,J.Am.Chem.Soc.115:2529-2531；Nikolaiev,V.et al.,1993,Pept.Res.6:161-170；Ohlmeyer,M.H.J.et al.,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:10922-10926)阐明其结构。
可使用用于产生肽的等摩尔混合物的简单原则合成可溶性随机组合文库，其最早由Furka描述(Furka,A.et al.,1988,Xth International Symposium onMedicinal Chemistry,Budapest 1988；Furka,A.et al.,1988,14th InternationalCongress of Biochemistry,Prague 1988；Furka,A.et al.,1991,Int.J.Peptide ProteinRes.37:487-493)。用于迭代筛选的可溶文库的构建还描述于Houghten,R.A.etal.1991,Nature 354:84-86。K.S.Lam公开了使用不溶的随机组合文库的强大性出乎意料的新型技术。Lam在固相支持物上合成随机组合文库，从而使每个支持物都具有分子结构相同的测试化合物，并筛选文库，但不用预先通过固相结合方法从支持物除去测试化合物(Lam,K.S.et al.,1991,Nature 354:82-84)。
因此，候选分子的文库可以是合成的组合文库(例如，组合化学文库)、细胞提取物、体液(例如，尿、血、泪、汗或唾液)，或合成或天然产物的其他混合物(例如，小分子文库或发酵混合物)。
分子的文库可包括，例如氨基酸、寡肽、多肽、蛋白质、或者肽或蛋白质的片段；核酸(例如，反义、DNA、RNA或肽核酸PNA)；适体；或碳水化合物或多糖。文库的每个成员可以是单一的，或混合物的一部分(例如，压缩文库)。所述文库可包含纯化的化合物，或可以是“不纯净的”(即，包含显著量的杂质)。
本文所述的方法还可使用商购的文库(例如，来自Affymetrix、ArQule、NeoseTechnologies、Sarco、Ciddco、Oxford Asymmetry、Maybridge、Aldrich、Panlabs、Pharmacopoeia、Sigma或Tripose)。
除上述文库之外，还可使用所谓多样性文案(diversity files)的专门文库以评估新方法的特异性、可靠性或重复性。多样性文案包含大量化合物(例如，1000或更多的小分子)，其代表能够潜在地导致试验中非特异性检测结果的很多类型的化合物。多样性文案可商购，或者也可以由商购自上文所述供应商的单个化合物组合而来。
抗体
可用于调控这些蛋白活性的mTOR的特异拮抗剂(例如，用于治疗或预防诸如癌症的疾病的方法)可包括抗mTOR蛋白的抗体。
类似地，PDK1抑制剂可包括针对参与PDK1的任何分子的抗体。
本文使用的抗体是指能够结合所选靶标的完整抗体或抗体片段，包括Fv、ScFv、Fab’和F(ab’)2、单克隆和多克隆抗体、工程化抗体(包括嵌合抗体、CDR-接枝抗体和人源化抗体)以及使用噬菌体展示或替代技术产生的人工选择抗体。小片段，例如Fv和ScFv由于个体小且由此产生的有利组织分布而具有用于诊断和治疗性应用的有利性质。
本文所述的抗体可以是包含诸如标签的效应蛋白的改造抗体(alteredantibodies)。特别优选可使体内或体外的抗体分布成像的标签。此类标签可以是放射性标签或不透射线的标签，例如金属颗粒，其在胚胎或细胞团块中易于观察。此外，其可以是荧光标签或在组织样品上可见的其他标签。
可使用重组DNA技术以改进本文所述的抗体。因此，可构建嵌合抗体以降低在诊断或治疗性应用中的免疫原性。此外，还可通过CDR接枝将抗体人源化[参见欧洲专利申请0 239 400(Winter)]和任选的框架修饰[EP 0 239 400]，从而使免疫原性最小化。
抗体可得自于动物血清，或者，在单克隆抗体或其片段的情况下，可产自细胞培养物。可根据既定方法使用重组DNA技术在细菌或优选哺乳动物细胞培养物中产生抗体。优选地，所选的细胞培养系统分泌抗体产物。
因此，本发明公开了用于生产抗体的方法，所述方法包括培养已经转化有包含表达盒的杂合载体的宿主，例如大肠杆菌或哺乳动物细胞，和分离所述蛋白质，其中所述表达盒包含可操作地连接到第一DNA序列的启动子，所述第一DNA序列编码在正确的读码框中连接到第二DNA序列的信号肽，所述第二DNA序列编码所述抗体蛋白。
在适合的培养基中进行杂交瘤细胞或哺乳动物宿主细胞的操作，所述培养基为常规的标准培养基，例如Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)或RPMI 1640培养基，其任选地补充了哺乳动物血清，例如胎牛血清，或微量元素和维持生长的补充物，例如饲养细胞，如正常小鼠腹膜渗出液细胞、脾细胞、骨髓巨噬细胞、2-氨基乙醇、胰岛素、转铁蛋白、低密度脂蛋白或油酸等。细菌细胞或酵母细胞的宿主细胞的操作同样在本领域已知的适合培养基中进行，例如细菌在培养基LB、NZCYM、NZYM、NZM、Terrific Broth、SOB、SOC、2xYT或M9基本培养基中，酵母在培养基YPD、YEPD、基本培养基或完全极限省却培养基(Complete Minimal Dropout Medium)。
体外生产提供了相对纯的抗体制剂，并且可扩大规模以得到大量的期望抗体。用于细菌细胞、酵母或哺乳动物细胞培养的技术是本领域已知的，并且包括均质悬浮培养，例如在气升式反应器或在连续搅拌反应器中，或固定或截留细胞培养，例如在空心纤维、微囊中，在琼脂糖微珠或陶瓷芯(cartridage)上。
还可通过哺乳细胞体内扩增获得大量的期望抗体。出于此目的，将产生期望抗体的杂交瘤细胞注射到组织相容的哺乳动物中，以使产生抗体的肿瘤生长。任选地，在注射前向所述动物提供烃，特别是矿物油，例如降植烷(四甲基-十五烷)。1~3周后，从那些哺乳动物的体液分离抗体。例如，将通过融合适合的骨髓瘤细胞和来自Balb/c小鼠的产抗体脾细胞而获得的杂交瘤细胞，或源自产生期望抗体的杂交瘤细胞系Sp2/0的转染细胞，经腹膜内注射到任选地由降植烷预处理的Balb/c小鼠中，并在1~2周后从所述动物获取腹水。
上述和其他技术论述于，例如Kohler and Milstein,(1975)Nature256:495-497；US 4,376,110；Harlow and Lane,Antibodies:a Laboratory Manual,(1988)Cold Spring Harbor，以上通过引用并入本文。用于制备重组抗体分子的技术描述于上述文献，以及例如EP 0623679；EP 0368684和EP 0436597，也通过引用并入本文。
优选通过PGC或其他多能细胞(例如ES或EG细胞)的免疫荧光染色，通过免疫印迹，通过酶免疫测定，例如夹心试验或印迹试验，或放射性免疫试验，从细胞培养上清筛选期望的抗体。
对于抗体的分离，可将培养上清或腹水中的免疫球蛋白浓缩，例如通过使用硫酸铵沉淀，对吸湿物料(例如聚乙二醇)的透析，通过选择性膜的过滤等。如果必要和/或需要，可通过常规的层析方法纯化抗体，例如凝胶过滤、离子交换层析、DEAE-纤维素层析和/或(免疫)亲和层析，例如使用mTOR或其片段或蛋白质A的亲和层析。
还可提供分泌单克隆抗体的杂交瘤。优选的杂交瘤在遗传上稳定，分泌具有期望特异性的单克隆抗体，并且可通过解冻和再克隆而从深冻培养物活化。
还包括分泌靶向mTOR的单克隆抗体的杂交瘤细胞系的制备方法，其特征在于使用一种或多种mTOR多肽或其抗原性片段免疫适合的哺乳动物，例如Balb/c小鼠，将接受免疫的哺乳动物的产抗体细胞与适合的骨髓瘤细胞系的细胞融合，克隆融合获得的杂交细胞，并选择分泌期望抗体的细胞克隆。例如，将用mTOR免疫的Balb/c小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞系PAI或骨髓瘤细胞系Sp2/0-Ag14的细胞融合，针对期望抗体的分泌筛选所得的杂交细胞，并克隆阳性杂交瘤细胞。
优选的是用于制备杂交瘤细胞系的方法，其特征在于通过在数月，例如2~4个月之间，多次，例如4-6次，皮下和/或腹膜内注射10和107至108之间的表达mTOR的细胞和适合的佐剂，在末次注射后2~4天从接受免疫的小鼠采集脾细胞，并在融合促进剂(优选聚乙二醇)存在下与骨髓瘤细胞系PAI的细胞融合。优选地，在包含约30%至50%的分子量约4000的聚乙二醇的溶液中，将骨髓瘤细胞与3~20倍过量的来自免疫小鼠的脾细胞融合。融合后，在上文所述的适合培养基中扩增细胞，并以规律的间隔补充选择培养基，例如HAT培养基，以防止正常骨髓瘤细胞长得超过期望的杂交瘤细胞。
还公开了重组DNA，其包含编码上文所述靶向mTOR的抗体的重链可变区和/或轻链可变区的插入物。根据定义，所述DNA包括编码的单链DNA、由所述编码的DNA及其互补DNA组成的双链DNA，或这些互补(单链)DNA本身。
此外，编码靶向mTOR的抗体的重链可变区和/或轻链可变区的DNA可以是酶促或化学合成的DNA，其具有编码重链可变区和/或轻链可变区的真实DNA序列或其突变体。真实DNA序列的突变体是编码上述抗体的重链可变区和/或轻链可变区的DNA，其中在所述重链可变区和/或轻链可变区中有一个或多个氨基酸被删除或被一个或多个其他取代。优选所述修饰在所述抗体的重链可变区和/或轻链可变区的CDR之外。此类突变DNA还可以是沉默突变体，其中一个或多个核苷酸被取代为其他核苷酸，且新的密码仍编码相同的氨基酸。此突变序列也称作简并序列。简并序列在遗传密码的含义内简并，其中无限数量的核苷酸被其他核苷酸取代，而不导致原始编码氨基酸序列的变化。由于其不同的限制性位点和/或特异宿主特别是大肠杆菌优选的特定密码子的频率，此简并序列可有助于获得重链鼠可变区和/或轻链鼠可变区的最优表达。
术语突变体可包括根据本领域已知的方法，通过真实DNA的体外诱变获得的DNA突变体。
为了完整的四聚体免疫球蛋白分子的组装和嵌合抗体的表达，将编码重链和轻链可变区的重组DNA插入物与编码重链和轻链恒定区的相应DNA融合，随后转入适合的宿主细胞，例如在引入到杂合载体后。
还公开了包含插入物的重组DNA，所述插入物编码与人恒定区g，例如γ1、γ2、γ3或γ4，优选γ1或γ4融合的抗mTOR抗体的重链鼠可变区。同样还公开了包含插入物的重组DNA，所述插入物编码与人恒定区κ或λ，优选κ融合的抗mTOR抗体的轻链鼠可变区。
在另一个实施方式中，本发明公开了编码重组多肽的重组DNA，其中重链可变区和轻链可变区通过间隔基团(spacer group)的方式连接，所述间隔基团任选地包含有利于所述抗体在宿主细胞中加工的信号序列和/或编码有利于所述抗体纯化肽的DNA和/或切割位点和/或肽间隔子和/或效应分子。
编码效应分子的DNA可以是编码可用于诊断或治疗性应用的效应分子的DNA。因此，特别涉及为毒素或酶的效应分子，特别是能够催化前药的活化的酶。编码此效应分子的DNA具有编码天然存在的酶或毒素的DNA或其变体的序列，并且可通过本领域熟知的方法制备。
抗体递送
可通过本领域已知的技术方式，例如通过使用脂质体、聚合物(例如聚乙二醇(PEG)、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)共聚物、聚酰胺胺(PAMAM)树状聚合物、HEMA、线性聚酰胺胺聚合物等)等，将针对mTOR蛋白的抗体或针对PDK1的抗体，例如抗PDK1抗体递送到细胞中。还可以将免疫球蛋白和/或抗体以与能够跨质膜和/或核膜的蛋白的蛋白融合物或结合物形式递送至细胞中。例如，所述免疫球蛋白和/或靶标可融合或结合到负责转位活性的此类蛋白的结构域或序列。优选的转位域和序列包括来自HIV-1反式激活蛋白(Tat)、果蝇触足(Drosophila Antennapedia)同源域蛋白和单纯疱疹-1病毒VP22蛋白的结构域和序列。
其他方面
本发明的其他方面列出在以下编号段落中；可理解本发明包括这些方面：
段1：用于测定癌细胞是否有可能对mTOR抑制剂治疗具有抗性的方法，所述方法包括检测细胞中或细胞的：(i)PPP2R2B(GenBank登录号：NM_181678)，或(ii)PDK1(GenBank登录号：NM_002613)，或以上二者。
段2：如段1所述的方法，其包括检测所述细胞中或所述细胞的PPP2R2B启动子的甲基化。
段3：如段1或2所述的方法，其中与没有mTOR抑制剂抗性的癌细胞相比，PPP2R2B启动子的高甲基表明所述癌细胞可能对mTOR抑制剂治疗具有抗性。
段4：如段1、2或3所述的方法，其包括检测所述细胞中或所述细胞的PPP2R2B或PDK1或以上两者的表达和/或活性。
段5：如前述任一段所述的方法，其中PDK1的活性包括PDK1介导的Myc磷酸化活性。
段6：根据前述任一段所述的方法，其中与没有mTOR抑制剂抗性的癌细胞相比，PPP2R2B表达和/或活性的下降，或PDK1表达和/或活性的提高，或以上二者表明所述癌细胞可能对mTOR抑制剂治疗具有抗性。
段7：用于为患有或疑似患有癌症的个体选择治疗的方法，所述方法包括(a)提供所述患者的细胞；(b)通过上述任一段所述的方法检测所述细胞的mTOR抑制剂抗性；和(c)在所述细胞被确定为没有mTOR抑制剂抗性的情况下，选择mTOR抑制剂对所述个体进行治疗，在所述细胞被确定为具有mTOR抑制剂抗性的情况下，则为所述个体选择不同的治疗。
段8：用于确定患有癌症或疑似患有癌症的个体是否将对mTOR抑制剂治疗作出响应的方法，所述方法可包括对所述个体的细胞实施上述段1~6中任一项所述的方法，并且在所述细胞被确定为没有mTOR抑制剂抗性的情况下，确定所述个体可能对mTOR抑制剂治疗作出响应。
段9：用于提高癌细胞对mTOR抑制剂治疗的敏感性的方法，所述方法包括提高所述细胞中或所述细胞的PPP2R2B表达和/或活性，或降低PDK1表达和/或活性，或上述二者。
段10：用于治疗或预防患有癌症或疑似患有癌症的个体的癌症的方法，所述方法包括提高所述个体中或所述个体的PPP2R2B表达和/或活性，或降低PDK1表达和/或活性，或上述二者。
段11：如段9或10所述的方法，其中通过减少PPP2R2B启动子的甲基化而提高PPP2R2B的表达。
段12：如段9、10或11所述的方法，其包括使所述细胞暴露于，或向患者施用诸如例如5-aza-dC的去甲基化试剂。
段13：如段9~12中任一项所述的方法，其包括使所述细胞暴露于，或向患者施用诸如BX912(CAS登陆号：702674-56-4)的PDK1抑制剂。
段14：用于治疗或预防患有癌症或疑似患有癌症的个体的癌症的方法，所述方法包括施用PDK1表达和/或活性的抑制剂和mTOR抑制剂。
段15：PDK1表达和/或活性的抑制剂和mTOR抑制剂的组合，其用在治疗或预防癌症的方法中。
段16：PDK1表达和/或活性的抑制剂和mTOR抑制剂的组合在制备用于治疗或预防癌症的药物中的应用。
段17：PPP2R2B或PDK1或以上二者的应用，其作为癌细胞对诸如雷帕霉素或其衍生物的mTOR抑制剂的敏感性的生物标记。
段18：如前述任一段所述的方法或组合物，其中所述mTOR抑制剂包括雷帕霉素或其衍生物。
段19：如前述任一段所述的方法或组合物，其中所述癌细胞是结肠癌细胞，和/或所述癌症包括结肠直肠癌(CRC)。
实施例
实施例1：试验方法-样品、细胞系和药剂
如前描述(Jiang et al.,2008)根据地方伦理委员会由新加坡细胞组织联网(Singapore Tissue Network)获得人组织样品。用于此研究的癌细胞系购自美国典型培养物保藏中心(Manassas,VA)。
具有DNMT1和DNMT3B的遗传中断的HCT116细胞(HCT116DKO)由BertVogelstein博士(Johns Hopkins University,MD)惠赠。HEK-TERV细胞由Dana-Farber Cancer Institute的W.C.Hahn博士惠赠。5-AzaC和强力霉素购自Sigma。
雷帕霉素和PI-103购自Alexis(San Diego,CA)。PDK1抑制剂BX912和PIK3CA抑制剂PIK90得自于Axon Medchem(荷兰，格罗宁根)。
实施例2：试验方法-质粒构建物和诱导型细胞系
使用来自正常结肠组织的100ng总RNA和以下引物：5’-GGTACCACCatggaggaggacattgatacc-3’和5’-CTCGAGCAgttaaccttgtcctgga-3’，通过RT-PCR分离全长PPP2R2B编码区。将PCR产物克隆到pcDNA4/myc-hisB的Kpn I和Xho I位点之间以用于过表达研究，或克隆到pcDNA4/TO/myc-hisB以用于诱导型系统。
使用来自HEK293细胞的100ng总RNA和以下引物：5’-tcGAATTCgccaggaccaccagccagc-3’和5’-GAGAATTCctgcacagcggcgtccgg-3’，通过RT-PCR扩增全长PDK1。将PCR产物克隆到pHA.CE载体的EcoRI之间，并测序。为了产生PPP2R2B Tet-on诱导型细胞系，首先根据T-Rex系统试剂盒(Invitrogen)的说明书分离表达pcDNA6-TR(Invitrogen)并利用灭瘟素(Blasticidin,10μg/ml)筛选的DLD1或HCT116稳定细胞系，随后使用pcDNA4/TO/PPP2R2B-myc转染，并使用博莱霉素(100μg/ml)筛选。根据强力霉素诱导的PPP2R2B表达，筛选所产生的克隆。对于强力霉素处理，使用终浓度为1μg/ml的强力霉素处理诱导型细胞。
为了进行PPP2R2B的逆转录病毒表达，将myc标记的PPP2R2B片段亚克隆到pMN GFP/IRES逆转录病毒载体(Linda Penn博士试验室惠赠)的BamH I和Xba I位点之间。使用包装了pMN对照载体或pMN-PPP2R2B-myc基因的逆转录病毒感染细胞48小时，并使用GFP分类以用于进一步的分析。
实施例3：试验方法-Illuminar基因表达数据，半定量RT-PCR和Taqman试验
人CRC和配对的正常对照的Illuminar基因表达数据此前已有描述(Jiang etal.,2008)，并可见于GEO公共数据库(登录号GSE10972)。
对于RT-PCR，使用寡聚(dT)12-18引物和Superscript II逆转录酶(Invitrogene)逆转录总RNA。使用100ng cDNA用于PCR。使用引物PPP2R2B F：5'-ATGGAGGAGGACATTGATACC-3′和PPP2R2B R：5'-ACATTGTATTCACCCCTACG-3'扩增PPP2R2B cDNA。
使用TaqMan探针(Applied Biosystems)，在PRISM 7900序列检测系统(Applied Biosystems)上进行PPP2R2B的实时定量PCR。相对于GAPDH mRNA的水平，进行样品的标准化。
实施例4：试验方法-DNA甲基化分析
根据厂商的说明，使用EZ DNA甲基化-Gold试剂盒(ZYMO Research)进行DNA的亚硫酸氢盐修饰。通过此前描述的甲基化特异性PCR(MSP)和亚硫酸氢盐基因组测序(BGS)(Jiang et al.,2008)测定CpG岛DNA甲基化状态。
用于甲基化组的靶向PPP2R2B启动子的MSP引物包括：PPP2R2B 5M1，5'-AGTAGTAGTTGCGAGTGCGC-3'，PPP2R2B 3M1：5'-GAACAACCGCGACAAAATAAT-3'。用于非甲基化组的为：PPP2R2B 5U1，5'-AGTAGTAGTAGTTGTGAGTGTGT-3'，PPP2R2B 3U1，5'-AAACAACCACAACAAAATAATACC-3'。通过亚硫酸氢盐基因组测序确认所选样品的MSP结果。
用于PPP2R2B启动子的链特异性BGS引物为PPP2R2B BGS1，5'-ATTATTGTTGTTGGGAAAGA-3'和PPP2R2B BGS2，5'-CAAAATAATACCTTTCTAAACCC-3'。经要求可获得用于MSP和亚硫酸氢盐测序PCR的条件。
实施例5：试验方法-抗体
使用以下抗体：Myc、p-Myc(T58/S62)、p70-S6K、p-p70S6K(T421/S424)、p-p70S6K(T389)、p-p70S6K(S371)、p-AKT(S473)、p-AKT(T308)、p-PDK1(S241)、S6、p-S6(S235/236)、p-MEK1/2(S217/221)、p-ERK1/2(T202/Y204)、p-p38MAPK(T180/Y182)、PP2A A亚基(81G5)、p110α和p110β(Cell SignalingTechnology)。
p-PDK1(S410)(Abcam)、β-连环蛋白和PDK1(BD Biosciences)，和抗-PP2AB亚基(B55)(Upstate Biotechnology)；HA(SC-805)和β-肌动蛋白(Santa CruzBiotech)和Myc(9E10)(Sigma-Aldrich)。
实施例6：试验方法-细胞存活率、衰老和BrdU掺入
使用CellTiter-GloTM发光细胞存活率实验(Promega)测量细胞存活率。
简要而言，将1000个细胞接种到96孔板，并按照厂商的说明测量细胞数量。为了检测DLD1-tet on细胞的衰老，使用Dox处理细胞48小时，根据衰老检测试剂盒(BioVision)的说明，进行SA-β-Gal染色。通过量化DNA含量进行细胞周期分析。
使用70%乙醇固定细胞，并用碘化丙啶(50μg/ml)染色法染色。通过FACScalibur(BD Bioscience)分析经染色的细胞，并通过使用CellQuest软件(BDbioscience)量化。
对于BrdU掺入试验，按照上文所述处理细胞，并在收获前与BrdU试剂一起温育5小时。固定细胞，并根据厂商的说明(BD Bioscience)，使用BrdU抗体和7-AAD染色。通过FACScalibur(BD Bioscience)分析经染色的细胞，并通过使用CellQuest软件(BD bioscience)量化。
实施例7：试验方法-RNA干扰
靶向Myc、p70S6K、PPP2R1A、AKT1、PIK3CA、PDK1、mTOR、raptor和rictor mRNA的特异siRNA寡聚物此前已有描述(Cappellen et al.,2007;Heinonen et al.,2008;Sablina et al.,2007;Sarbassov et al.,2005;Vasudevan et al.,2009)且列出在表S3中。PIK3CB siRNA购自Santa Cruz Biotech。
靶向PPP2R2B的
Figure BDA00002111634800561
siRNA和无靶向的对照购自Dharmacon(Lafayett,CO)。靶向序列5’-GCUUACUUUCUUCUGUCUA-3’的单独PPP2R2BsiRNA得自于Sigma-Proligo。
按照厂商的说明，使用Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen)，用100nM终浓度的siRNA双链转染细胞。
实施例8：试验方法-锚定独立性集落形成试验
对于DLD1和HCT116诱导型细胞的转化灶形成试验，将1x104个细胞接种到带有或不带Dox或雷帕霉素处理的6孔板上。培养细胞2周，在甲醇固定后，使用龙胆紫染色存活的集落，并对可见的集落(>50个细胞)进行计数。
对于锚定独立性生长，将细胞悬浮在包含0.3%琼脂、10%胎牛血清的DMEM中，并平铺到包含0.6%琼脂、10%FBS和1.0μg/ml强力霉素的DMEM的6孔板中。4周后，使用碘硝基氯化四氮唑(Sigma)对集落染色过夜。
计算来自三个复孔的随机选择的图像部分的集落数。
实施例9：试验方法-免疫共沉淀
对于免疫沉淀分析，通过使用Fugen HD(Roche)，用HA-PDK1和PPP2R2B-Myc瞬时转染293T细胞。转染后48小时，裂解细胞，并使用HA-标签抗体(SC-805,Santa,Cruz)和Myc-标签抗体(9E10,Roche)进行免疫沉淀。
为了研究PPP2R2B-Myc与内源PDK1之间的直接相互作用，使用Dox处理DLD1-PPP2R2B细胞24小时，裂解细胞并使用抗PDK1和抗Myc-标签抗体进行免疫沉淀。
实施例10：试验方法-共聚焦分析
将细胞接种到12孔板中的载玻片上。在使用Dox处理48小时后，使用含3.7%多聚甲醛的PBS固定细胞，并使用0.2%Triton-X100透化。
将细胞依次与一抗(抗-Myc或抗-p-PDK1(S241))和结合有Alexa Fluor 488或Alexa Fluor 546的二抗(Invitrogen)一起温育各1小时，并与DAPI温育15分钟以进行核染色。
随后，将其封固在Fluorsave(CalBiochem)封固介质中。通过Zeiss LSM510共聚焦显微镜检测染色的细胞。
实施例11：试验方法-蛋白质磷酸酶活性
对于磷酸酶试验，将DLD1-PPP2R2B或DLD1对照细胞悬浮在裂解缓冲剂(50mM Tris-HCl，pH 7.4，7.5%甘油、1mM EDTA、150mM NaCl、0.5%NP-40、1mM Na3VO4、完全蛋白酶抑制剂)中，通过离心除去碎片，与c-Myc(9E10,RocheInc.)一起温育，随后与抗小鼠IgG珠子(Roche)一起温育。
将珠子重悬在PP2A磷酸酶反应缓冲剂中，并根据厂商的说明使用丝氨酸/苏氨酸磷酸酶检测试剂盒(Upstate)分析PP2A活性。使用荧光酶标仪(Sunrise,Tecan)测量荧光。
实施例12：试验方法-小鼠异种移植物和药物处理
雌性无胸腺BALB/c裸鼠(5-8周龄)圈养在生物资源中心(Biological ResourceCentre)。分别在鼠侧腹两侧皮下植入3x106个DLD1-PPP2R2B或对照DLD1细胞。
当肿瘤达到~70mm3时，将小鼠分成2组(每组6只)，并通过经口灌胃施用强力霉素，每天100mg/kg。每隔一天，通过整体重和肿瘤大小监测肿瘤进展。对于雷帕霉素和强力霉素的组合处理，每隔一天施用相同剂量的强力霉素，在第3、5、7和11天通过腹膜内注射施用4mg/kg雷帕霉素。
每隔2~3天，使用卡尺测量肿瘤的尺寸，并在每个数据时间点计算来自7-9只小鼠的肿瘤体积。所有的动物工作参照新加坡动物试验指南进行。
实施例13：CRC中通过DNA高甲基导致的PPP2R2B表达丧失
考虑到发现PP2A家族成员在包括CRC在内的人恶性病中的低突变频率，本发明人尝试测定在CRC中其是否在表观遗传学上被失活。
通过查询本发明人此前公开的一系列CRC细胞系的表达数据(Jiang et al.,2008)，本发明人发现编码B55β的PPP2R2B是在所有检测的CRC细胞系中被一致下调或沉默，但在正常结肠粘膜样品中没有下调或沉默的唯一亚基(表S1)。
使用24对源自患者的CRC肿瘤和配对的正常粘膜对照的基因表达阵列数据进一步证实了PPP2R2B的显著下调(p<0.01，图1A)，且发现这发生在>90%的CRC样品中(图1B和表S2)。
RT-PCR分析确认了在6种随机选择的CRC和配对的对照，以及一系列CRC细胞系中的PPP2R2B下调(图1C和图1D)。与此不同，没有发现此前报道在肺癌中下调的PPP2R2A或PPP2R5C(Chen et al.,2004)在CRC中下调。
本发明人随后测定了CRC中的PPP2R2B表达的丧失(loss)是否与启动子DNA的高甲基相关。甲基化特异性PCR(MSP)分析发现了CRC细胞系以及所有8种被检测的CRC肿瘤样品中均被高甲基化的PPP2R2B启动子，但在其配对的正常对照中则没有发现(图1E)。
此外，删除DNMT1和DNMT3B二者的HCT116细胞(DKO)或经5-aza-dC处理的DLD1细胞显示了PPP2R2B的重表达(图1G)，这与通过MSP和硫酸氢盐基因组测序(图1H和图1I)所证实的DKO中去甲基化的PPP2R2B启动子有关。
综上，这些结果证明，CRC中的PPP2R2B通过启动子的DNA高甲基而在表观遗传学上丧失。此外，Oncomine数据采集显示，PPP2R2B在其他人癌症，例如膀胱、脑和食道癌中也被显著下调(图8)。
实施例14：PPP2R2B在CRC细胞中的重表达导致衰老、降低的细胞增殖和异种移植肿瘤的生长抑制
癌症中的PPP2R2B表达丧失表明其在正常情况下发挥肿瘤抑制剂的功能。为了研究这种可能性，本发明人建立了具有强力霉素(Dox)诱导表达的Myc-标记PPP2R2B的稳定DLD1和HCT116细胞系，命名为DLD1-PPP2R2B或HCT116-PPP2R2B。
如在DLD1-PPP2R2B细胞中所显示的，通过利用识别B55α/β亚基的抗体检测到添加Dox 3天导致PPP2R2B-Myc(B55β-Myc)的表达水平与内源B55α相当(图2A)。此外，RT-PCR分析显示，在DLD1-PPP2R2B细胞中，Dox处理后的PPP2R2B mRNA表达水平类似于正常结肠组织(数据未显示)。
因此，PPP2R2B-Myc在CRC细胞中以生理学相关水平被诱导。在此条件下，PPP2R2B的恢复表达导致典型的衰老表型，包括变大且变平的细胞形态，以及提高的与衰老相关的β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)(图2B)。
因此，根据BrdU掺入测定的DNA合成在通过Dox表达PPP2R2B后显著下降(图2C)，这表明细胞增殖受到抑制。此外，PPP2R2B的恢复导致了软琼脂中的锚定独立性生长受到强烈抑制(图2D)。
通过使用GFP和PPP2R2B二者的逆转录病毒转导，在两种额外的CRC细胞系中进一步证实了PPP2R2B的强生长抑制作用，其导致类似的形态学变化(图9A)和软琼脂中的生长抑制(图9B)。
为了评估PPP2R2B对体内肿瘤生长的抑制能力，将表达PPP2R2B或空载体的Dox诱导型DLD1细胞经皮下注射到裸鼠中，并在有或没有每日Dox处理的条件下监测所形成肿瘤的生长3周。
数据显示，源自DLD1-PPP2R2B细胞的肿瘤生长在用Dox处理的小鼠中受到显著抑制，而来自表达对照载体的DLD1细胞的肿瘤生长则没有受到Dox处理的影响(图2E)。因此，此结果证实了PPP2R2B在异种移植物小鼠模型中的生长抑制活性。
实施例15：PPP2R2B敲减促进了细胞转化
本发明人随后评估了PPP2R2B的消除是否足以促进表达hTERT和致癌性Ras的永生化人胚肾(HEK)成纤维细胞(HEK-TERV)的细胞转化。
在此前充分表征的转化模型中，通过过表达小T抗原对PP2A的抑制导致了高效转化(Chen et al.,2004;Hahn et al.,2002;Sontag et al.,1993)。通过靶向PPP2R2B mRNA的不同区域的小干扰RNA(siRNA)定向敲减导致了HEK-TERV细胞的锚定独立性生长的大幅增加，其效率类似于过表达小T抗原时的观察结果(图2F和图2G)。
基于功能获得和损失二者的数据，本发明人提出PPP2R2B发挥肿瘤抑制剂的功能，其丧失促进了致癌性转化。
实施例16：结合有PPP2R2B的PP2A复合体调节CRC细胞中Myc和P70s6k的磷酸化
PP2AB调控亚基以背景依赖的方式指导细胞中去磷酸化事件的底物特异性(Virshup and Shenolikar,2009)。包括AKT、p70S6K、mTOR、β-连环蛋白和Myc在内的多种致癌蛋白此前已经被鉴定为多种细胞系统中的PP2A底物(Andrabi etal.,2007;Arnold and Sears,2008;Peterson et al.,1999;Seeling et al.,1999;Yeh etal.,2004)。
为了解析出负责PPP2R2B的生长抑制作用的可能机理，本发明人以HCT116-PPP2R2B细胞为起点探测了可能受PP2A影响且已知在CRC中重要的多种致癌信号转导途径(图3A)。此分析的结果鉴定出在Dox处理后通过PPP2R2B的重表达而被抑制的两个磷酸化事件。
第一个是p70S6K的磷酸化。使用磷酸化特异性抗体，本发明人证明了PPP2R2B重表达后T421/S424的磷酸化显著减少，而T389的磷酸化没有受到影响，这表明PPP2R2B对p70S6K的位点特异性调节。
第二个是c-Myc的磷酸化，其通过使用特异于T58/S62的磷-Myc抗体而检测到，并且也在PPP2R2B重表达后被下调。所检测的其他致癌信号，例如p-AKT、p-ERK、β-连环蛋白和p-p38没有受到PPP2R2B重表达的明显影响(图3A)。
在时间过程分析中进一步确认了在DLD1细胞中PPP2R2B对p70S6K和c-Myc(下文称作Myc)的影响(图3B)。所述数据显示PPP2R2B表达的Dox诱导导致Myc和p70S6K(T421/S424，而非T389)相对于总p70S6K和Myc蛋白水平的快速去磷酸化，这表明这些变化是PPP2R2B的早期作用，并且不可能是生长抑制的次生效应。
Myc磷酸化的降低最终导致Dox处理48小时时的蛋白积累减少（图3C），这与在先发现的S62的Myc磷酸化增加与Myc蛋白积累相关相符(Arnold andSears,2006;Junttila et al.,2007;Yeh et al.,2004)。因此，p70S6K和Myc是受到PPP2R2B-PP2A复合体影响的两个下游信号，然而没有观察到已知对结肠癌重要的其他致癌信号转导途径的表达或磷酸化状态的明显差异。本发明人还确认了PPP2R2B表达对细胞生长、NIH-3T3-Ras转化细胞中Myc和p70S6K的磷酸化的抑制性作用(图10A和图10B)。
应注意到，PPP2R2B重表达对于已知在NIH3T3细胞中被PP2A/B55α或B56β复合体靶向的AKT T308磷酸化(Kuo et al.,2008;Padmanabhan et al.,2009)，或在CRC中作为PP2Aα靶标的β-连环蛋白磷酸化(Su et al.,2008)都没有影响。此外，在人乳腺上皮细胞中，SV40小T抗原(ST)介导的PP2A抑制与提高的AKTS473磷酸化和mTOR介导的p70S6K T389磷酸化相关(Andrabi et al.,2007;Chenet al.,2005;Zhao et al.,2003)，但这些变化在本发明的所述细胞背景中并没有观察到。这些发现与不同PP2A/B亚基的组织特异性方式的底物特异性相符，并且显示了结合有PPP2R2B的PP2A复合体(PP2A-B55β)与其他PP2A复合体的差别在于影响不同的下游底物。
为了证明异位的PPP2R2B事实上与其他PP2A亚基相互作用以形成活性PP2A复合体，本发明人进行了免疫共沉淀试验以显示PPP2R2B的确与PP2A结构亚基(A)和催化亚基(C)二者共沉淀(图3D)。此外，在使用合成的磷酸苏氨酸肽RRA(pT)VA作为底物的体外PP2A试验(Chen et al.,2004)中，来自Dox处理的DLD1-PPP2R2B细胞的PPP2R2B免疫沉淀物清楚地显示了比对照高的PP2A活性(图3E)，这证实了PPP2R2B的重表达修复了CRC细胞中相关PP2A活性的丧失。
为了证实PPP2R2B重表达后p70S6K(T421/424)或Myc的去磷酸化需要PP2A活性，本发明人通过siRNA删除了DLD1-PPP2R2B细胞中PP2A复合物的A亚基，并且发现此分子操作清楚地阻止了PPP2R2B对Myc和p70S6K的去磷酸化(图3F)。这些试验共同提供的证据证实了PP2A-PPP2R2B复合物调节p70S6K和Myc磷酸化的功能性作用。此外，本发明人还检测了PP2A-PPP2R2B免疫沉淀物中的p70S6K（图11A和图11B），但无法检测Myc与PPP2R2B之间的物理相互作用。尽管此前发现另一种PP2A亚基B56α在HEK293细胞中与Myc相互作用并将其去磷酸化(Arnold and Sears,2006;Junttila et al.,2007)，但PPP2R2B-PP2A复合体(B55β)可在CRC细胞中间接地调节Myc磷酸化。
最后，本发明人还评估了CRC中Myc和p70S6K下调的功能性意义。本发明人发现，Myc敲减强烈地抑制了DLD1细胞的活性，而p70S6K敲减没有产生显著的影响(图3G)。因此，这些数据表明了Myc抑制对PPP2R2B的生长抑制作用的功能性贡献。这与Myc在结肠直肠肿瘤发生中的已证实功能相符(Korineket al.,1997;Morin et al.,1997;Sansom et al.,2007)。
实施例17：PPP2R2B重表达敏化了mTORC1抑制剂雷帕霉素
mTOR激酶抑制剂雷帕霉素具有偶发的抗癌活性，且其对mTOR下游底物p70S6K的影响通常被用作评估雷帕霉素响应的替代标记物(Sawyers,2008)。PPP2R2B与p70S6K信号转导之间的似乎可能的关联促使本发明人研究PPP2R2B表达状态可影响细胞对雷帕霉素敏感性的可能性。
因此，本发明人比较了在Dox存在或缺失的情况下，雷帕霉素对DLD1-PPP2R2B细胞的细胞存活率的影响。数据显示，如5天的细胞存活率试验或14天的集落形成试验(图4A和图4B)所测定的，当PPP2R2B在Dox处理后重表达时，雷帕霉素诱导的生长抑制更有效的多。此外，通过流式细胞术的细胞周期分析显示，Dox对PPP2R2B表达的诱导导致细胞周期G2停滞，通过添加雷帕霉素进一步显著提高了所述细胞周期G2停滞，这表明PPP2R2B和雷帕霉素协同诱导了细胞周期停滞(图4C和图12)。
为了在体内验证所述体外结果，本发明人使用DLD1-PPP2R2B和对照DLD1细胞研究了Dox和雷帕霉素对裸鼠中异种移植肿瘤的生长的影响。尽管单独的雷帕霉素或Dox处理仅温和地减弱了肿瘤生长，但其组合在DLD1-PPP2R2B细胞中产生了强烈的肿瘤生长抑制，而在对照细胞中则没有(图4D)。
在体外和体内获得的这些结果共同证明，CRC细胞中PPP2R2B的重表达导致雷帕霉素治疗作用的改进。因此，这些数据表明，PPP2R2B在表观遗传学上的丧失是影响CRC对mTOR抑制剂的敏感性的分子事件。
实施例18：雷帕霉素诱导了Myc磷酸化和CRC细胞中的蛋白积累，而这受到了PPP2R2B重表达的抑制
以mTORC2依赖方式导致PI3K活化和AKT S473磷酸化的反馈机理与癌症中的雷帕霉素抗性相关联(O'Reilly et al.,2006;Sarbassov et al.,2006)。实际上，CRC细胞的雷帕霉素处理导致了对AKT S473磷酸化的诱导，但此磷酸化在PPP2R2B重表达后不受影响(图4E)。
另一方面，在载体对照和表达PPP2R2B的细胞中，雷帕霉素处理均有效消除了p70S6K和S6二者的磷酸化(图4E)，因此排除了PPP2R2B诱导的雷帕霉素敏化与AKT S473或p70S6K相关的可能性。
与此相反，有趣的是，本发明人发现雷帕霉素处理导致了Myc磷酸化和蛋白质积累的强烈诱导。这种对Myc蛋白的作用不是由于Myc mRNA增加(数据未显示)，并且在PPP2R2B重表达后几乎完全被消除(图4E)。
时间过程分析表明，Myc响应早在4小时发生，与AKT S473磷酸化的诱导平行，这揭示了响应雷帕霉素的其他反馈事件(图4F)。
由于敲减mTOR或mTOR1基本组分raptor，而不敲减mTORC2组分rictor导致了Myc磷酸化的类似诱导，本发明人进一步证实了雷帕霉素诱导的Myc磷酸化和积累确实是mTORC1抑制的结果(图4G)。
考虑到Myc在CRC肿瘤发生中的重要作用，此观察结果直接表明了PPP2R2B介导的对雷帕霉素的敏化的可能机理。
为了证实PPP2R2B表达与Myc响应以及雷帕霉素敏感性的关联，本发明人比较了HCT116细胞和DNMTs-缺陷型HCT116(DKO)细胞，后者因启动子的去甲基化而导致重新表达PPP2R2B(参见此前的图1I)。与DLD1细胞中类似，在HCT116中雷帕霉素强烈地诱导了Myc磷酸化，而在DKO细胞中Myc以低的基础水平表达而没有响应雷帕霉素(图13A)。但是，应注意，在两个细胞系中雷帕霉素诱导了类似的AKT S473磷酸化，而与PPP2R2B表达状态无关(图13A)。
因此，与亲本HCT116细胞相比，显示没有Myc响应的DKO对雷帕霉素处理更加敏感(图13B)。综上，PPP2R2B对Myc的作用与雷帕霉素响应密切相关，并且支持了PPP2R2B在调控Myc磷酸化以及由此调控雷帕霉素敏感性中的作用。
此外，与CRC中PPP2R2B的一致性沉默对应，所检测的所有CRC细胞系均显示了雷帕霉素处理后Myc磷酸化的显著诱导(图13C)。与Myc诱导一致，所有这些CRC细胞系通常均具有雷帕霉素抗性，在使用10nM雷帕霉素处理5天后显示小于10%的生长抑制(图13D)，而该浓度在其他癌细胞系中通常导致强的生长抑制(参见下文图14D)。这表明，CRC细胞中的PPP2R2B缺乏与雷帕霉素抗性相关。
与结肠癌不同，Oncomine数据库(Rhodes DR.,et al,2004)显示了包括肾癌、肝癌和卵巢癌在内的多种其他人恶性病中的表达提高(图6S7A)。与CRC系中PPP2R2B的沉默表达相反，实时Taqman试验证实了源自上述肿瘤的一系列细胞系中的PPP2R2B表达，包括来自肝癌的HepG2和HepB3细胞；来自肾癌的786-O和Caki2细胞；来自卵巢癌的OVCAR3、OVCAR5和SK-OV-3细胞；以及来自骨肉瘤的U2OS细胞(图14B)。
特别值得注意的是，尽管在所有情况下均显示了AKT S473磷酸化的一致诱导，这些表达PPP2R2B的细胞系都没有显示响应雷帕霉素的Myc磷酸化诱导(图14C)。此外，与CRC细胞系相比，这些细胞系通常对雷帕霉素更加敏感(图14D)。这些结果共同提供了显示以下的证据：
(1)癌细胞中的PPP2R2B沉默或表达与对雷帕霉素的敏感性或抗性相关；
(2)这种相关性至少部分与雷帕霉素诱导Myc磷酸化的能力有关。
实施例19：雷帕霉素诱导的Myc磷酸化是PDK1依赖性的，但是PIK3CA-AKT非依赖性的
mTORC2依赖性AKT S473活化依赖于生长因此刺激后的受体酪氨酸激酶(RTK)信号转导，且此过程需要PIK3CA(编码p110α)(Guertin and Sabatini,2007;Sekulic et al.,2000)，此过程需要PIK3CA(编码p110α)(Jia et al.,2008;Knight etal.,2006;Zhao et al.,2006)。
本发明人发现，血清饥饿消除了雷帕霉素诱导的AKT S473磷酸化，但对雷帕霉素诱导的Myc磷酸化没有显著影响(图5A)。此外，P1K3CA和mTORC1的双抑制剂PIK-103(Fan et al.,2006)降低了AKT S473磷酸化，但增强了Myc磷酸化(图5B)。这些发现表明，雷帕霉素通过不依赖于P1K3CA的独特机理诱导Myc磷酸化。
为了进一步阐明导致雷帕霉素诱导的Myc磷酸化的上游信号，本发明人敲减了PI3K和mTOR途径中的多个主要成分。结果显示，PDK1敲减有效地抑制了雷帕霉素诱导的Myc磷酸化，而PIK3CA、PIK3CB或AKT1的敲减则没有此作用(图5C)。在DLD1和SW480细胞中使用两种额外的PDK1siRNA和PDK1shRNA的进一步试验证实了其对Myc磷酸化的影响(图5D和图5E)；但应注意，PDK1敲减对AKT-S473磷酸化没有可辨别的影响，但通过PIK3CA敲减可清楚地消除AKT-S473磷酸化(图5C)。相反，在与异位PDK1共表达时，异位Myc显示了增强的磷酸化和积累，进一步支持了PDK1在Myc上调中的作用。
为了证实这一发现，本发明人使用了PDK1的特异性小分子抑制剂BX912(Feldman et al.,2005)和PIK3CA特异性抑制剂PIK90(Fan et al.,2006;Knight etal.,2006)。与PDK1敲减相符，BX912处理消除了雷帕霉素诱导的Myc磷酸化(图5F)，但对AKT S473没有多大影响。相反，PIK90不能抑制雷帕霉素诱导的Myc磷酸化；但有效地消除了AKT S473磷酸化(图5G)。
综上，这些结果提供了确凿的证据证明，雷帕霉素诱导了PDK1依赖性的Myc磷酸化，同时有PIK3CA敏感性的AKT S473磷酸化。
实施例20：PPP2R2B结合并抑制PDK1活性
本发明人随后测试了PPP2R2B可与PDK1直接相互作用并调节其活性的可能性。
PPP2R2B和PDK1质粒在293T细胞中的共转染证实了这种假设，并显示异位PDK1与PPP2R2B-Myc免疫共沉淀，反之亦然(图6A)。这在DLD1-PPP2R2B细胞中得到了进一步的证实，其中，在所述细胞中Dox诱导的PPP2R2B与内源PDK1免疫共沉淀(图6B)。
已知需要将PDK1从细胞溶胶招募到质膜以活化其下游靶标(Kikani et al.,2005)。PPP2R2B与PDK1均主要位于胞质中（图15A和图15B）。因此，PDK1与PPP2R2B的胞质相互作用可影响其膜招募。
实际上，在DLD1-PPP2R2B细胞的Dox处理后，本发明人检测到质膜中总PDK1和磷酸化PDK1二者均下调(图6C)。此外，在血清饥饿的DLD1-PPP2R2B细胞中，异位PDK1-HA主要在细胞溶胶中检出，但在血清刺激后在细胞溶胶和细胞膜二者中均表达，这中表达在使用Dox处理细胞以诱导PPP2R2B时被消除(图6D)。综上，所述结果证明，PPP2R2B-PP2A复合体结合并抑制用于活化的PDK1膜募集。由于Myc响应雷帕霉素而主要积累在细胞核中(图15C)，胞质PPP2R2B-PDK1对Myc的作用更可能是间接的，并且经过PDK1下游激酶底物的途径。
PPP2R2B在>90%的CRC中丧失。本发明人随后评估了PDK1活性是否在原发CRC组织中被一致性地上调，而此前从未对其进行过评估。对固定在包含正常组织和人结肠直肠癌肿瘤的组织微阵列(TMA)玻片上的原发肿瘤和正常组织进行免疫组化(IHC)染色。结果显示了与正常组织相比，人结肠直肠癌中磷酸化PDK1的强染色(图6E)。
尽管分别出现在30%和20%的CRC中的PIK3CA和PTEN的突变也引起PDK1的诱导，但PPP2R2B的丧失可提供用于解释CRC中均匀PDK1上调的额外机理。
该发现强烈表明，PDK1可以是CRC的理想治疗靶标。
实施例21：PDK1和Myc的抑制而非PIK3CA和AKT的抑制敏化了雷帕霉素的治疗反应
本发明人随后评估了两种不同的信号转导途径如何促成了雷帕霉素抗性。
PDK1或Myc敲减在HCT116细胞中导致对雷帕霉素的敏感性显著增加，而PIK3CA或AKT敲减则没有产生类似的作用(图7A)。PDK1消除对Myc和雷帕霉素敏感性的影响在表达逆转录病毒PDK1 shRNA的SW480细胞中进一步得到证实(图7B)。
这些结果支持CRC细胞中PDK1-Myc诱导和雷帕霉素抗性之间的因果关系。此外，这些数据支持了与PIK3CA-AKT信号转导相比，PDK1-Myc信号转导在CRC细胞的雷帕霉素抗性中具有更加重要的作用。
对PPP2R2B调控PDK1的鉴定提出了用于克服雷帕霉素抗性的实践方法，其可通过PDK1的药理学抑制而实现。
本发明人发现PDK1 shRNA或BX912诱导了与PPP2R2B重新、表达后所见类似的形态变化，但PIK90则没有(图16A)。此外，BX912与雷帕霉素协同地诱导了CRC细胞的G2/M停滞，PIK90则没有(图7C和图16B)，这也与PPP2R2B和雷帕霉素对G2/M的协同作用明显一致(参见上文的图4C)。
因此，PDK1的药理学抑制在表型上模拟了PPP2R2B重表达的作用，但PIK3CA则没有，这进一步支持了PPP2R2B和PDK1之间的遗传相互作用。因此，本发明人在5天的细胞存活率试验(图7D)和2周的集落形成试验(图7E)二者中均观察到了BX912和雷帕霉素在CRC细胞中对细胞存活率的协同丧失作用。
这些发现支持了CRC中PPP2R2B的丧失导致响应雷帕霉素处理的PDK1依赖性Myc磷酸化的激活并进而以独立于PIK3CA-AKT的方式导致雷帕霉素抗性的模型(图7F)。PDK1的药理学抑制可通过预防Myc磷酸化克服雷帕霉素抗性，这指出了用于CRC治疗的潜在组合方案。
实施例22：讨论
在本文中，本发明人鉴定了在CRC细胞系和源自患者的CRC样品中被转录失活的特异性PP2A肿瘤抑制复合体。
功能性分析揭示了其作为潜在的肿瘤抑制机制的PDK1-Myc轴抑制。此调控在CRC中的显著丧失造成了响应mTORC1抑制剂雷帕霉素的致癌性Myc磷酸化的强激活，从而导致雷帕霉素抗性。
该研究提供了对重要的致癌性信号转导途径的表观遗传控制的阐明，并且鉴定了雷帕霉素敏感性的分子决定性且潜在的生物标记物。此外，所阐明的途径还提供了缓解雷帕霉素抗性的治疗途径。
实施例23：讨论-作为肿瘤抑制剂的PPP2R2B-结合的PP2A复合体
在本文中，本发明人证明了PP2A调节B亚基PPP2R2B在结肠直肠癌中通过DNA高甲基而在表观遗传学上被失活，并且提供了PPP2R2B可作为肿瘤抑制剂的证据。
尽管事实上已经在转化模型系统中充分证实了PP2A的肿瘤抑制剂功能(Chen et al.,2005;Chen et al.,2004;Sablina et al.,2007;Zhao et al.,2003)，但发现PP2A亚基仅在8-15%的人癌症中被突变或删除。由于显示PP2A亚基在人癌症中的显著且广泛改变的证据极少，这使得难以确认PP2A作为真正肿瘤抑制剂的功能。
本发明的研究现鉴定了PPP2R2B编码的特异亚基PP2A在表观遗传学上的丧失均匀地发生在>90%的结肠直肠肿瘤样品中。据Oncomine数据库显示，在结肠直肠癌之外，PPP2A2B也在其他癌症中被下调，例如膀胱、脑和食道癌。
因此，考虑到在多种亚基中PP2A突变的低频率(<15%)，导致基因抑制的表观遗传学机理可在如CRC的人癌症的PP2A失活中发挥更主导的作用。
实施例24：讨论-PPP2R2B-PP2A介导的肿瘤抑制的分子机理
由于PP2A调控亚基的底物多样性，在各种组织或细胞背景中观察到大量致癌性信号转导途径并不奇怪。本发明人假定PPP2R2B结合的特异PP2A复合体的丧失可促进CRC细胞存活和增殖所需的某些致癌性基因信号转导途径的下调。
本发明人确定了，作为PPP2R2B的重要下游靶标，Myc在介导PPP2R2B的肿瘤抑制作用中发挥作用。这与Myc在CRC肿瘤发生中的关键作用一致(Sansom et al.,2007)。尽管PPP2R2B对CRC细胞中的Wnt途径没有可辨别的影响，其调节了Myc磷酸化和蛋白质积累。因此，其对Myc的影响与PPP2R2B对依赖于Wnt途径以获得生长优势的CRC细胞的强生长抑制作用一致。
尽管现已发现独特的PP2A亚基B56α结合Myc并调节其稳定性(Arnold andSears,2006;Junttila et al.,2007)，但本发明人无法检测到PPP2R2B-PP2A(B55β)与Myc之间的相互作用。实际上，本发明人显示，由于PPP2R2B结合PDK1并影响PDK1对Myc磷酸化的活性，Myc的PPP2R2B调控经由PDK1。
由于迄今尚未鉴定出上游激酶，PDK1被认为是PI3K信号转导的主要调控剂。因此可见，对基于蛋白磷酸酶的调控的确定与此主要激酶调控剂的调控机理一致。
因此，在发生在50%CRC中的PIK3CA或PTEN突变之外，PPP2R2B的丧失可能提供了导致PDK1异常(deregulation)的更普遍机理。因此，本发明人鉴定了促成CRC中PDK1-Myc信号转导的活化的表观遗传学机理。
实施例25：讨论-PDK1-Myc与PIK3CA-AKT在雷帕霉素抗性中的作用
本发明的研究揭示了PDK1响应雷帕霉素而对调控Myc的新功能。这种PDK1-Myc信号转导不依赖PIK3CA-AKT，并可构成导致雷帕霉素抗性的可选反馈机理。
尽管本发明人证实了Myc作为PDK1的下游靶标，但PDK1可不直接调控Myc。PDK1可能经由其他下游激酶的途径而影响Myc磷酸化。导致雷帕霉素诱导Myc磷酸化的精确反馈机理仍不清楚且需要进一步的研究。
尽管现已提出PIK3CA和mTORC2依赖性AKT S473磷酸化是在某些背景下造成雷帕霉素抗体的一个关键机理(O'Reilly et al.,2006;Sarbassov et al.,2006)，但在CRC中这种途径对于雷帕霉素抗性的重要性可能不如雷帕霉素诱导的Myc磷酸化，这是由于PIK3CA或AKT的敲减并不敏化雷帕霉素。因此，本发明人提出，由PDK1和Myc磷酸化组成的不依赖AKT的信号转导模式促成了由于PPP2R2B丧失而产生的CRC的雷帕霉素抗性。可见，此观点与近期的发现相符，即AKT通常不是具有活化的PI3K途径的癌细胞的增殖所需的(Vasudevan et al.,2009)。因此，受PPP2R2B调控的PDK1-Myc信号转导的确立拓宽了对癌细胞生长控制和雷帕霉素抗性的理解，并且强化了表观遗传学机理在调控致癌性信号转导和治疗反应中的重要性。
实施例26：讨论–临床和治疗的启示
正在临床研发多种雷帕霉素类似物(Easton and Houghton,2006;Faivre et al.,2006;Granville et al.,2006)。
遗憾的是，临床进展表明，雷帕霉素仅显示了在少数的癌症，特别是套细胞淋巴瘤、子宫内膜癌和肾细胞癌中的前景。
综上，对雷帕霉素的治疗反应高度可变，这表明非常需要能够预测雷帕霉素的治疗效果的生物标记物。本发明的数据表明，PPP2R2B启动子甲基化可以是影响癌细胞对mTOR抑制剂的敏感性的表观遗传学事件。
此发现可能对雷帕霉素衍生物在人癌症中的临床试验具有重要意义：PPP2R2B可作为用于患者选择的预测指标之一，而Myc磷酸化可用作评估药物反应的替代指标。
最后，本发明的数据支持PDK1作为CRC中的治疗靶标，这是因为PDK1的去除降低了Myc信号转导并缓解了雷帕霉素抗性。使用小分子PDK1抑制剂BX912进一步说明了这种观点，BX912能够消除雷帕霉素诱导的Myc磷酸化并由此在CRC中与雷帕霉素发挥协同作用。显然，现已显示了PDK1抑制剂可在体外和体内的癌症中作为有效的抗癌剂(Maurer et al.,2009;Peifer and Alessi,2008)，并且正在进行临床研发。因此，本发明提出，其与基于雷帕霉素的mTORC1抑制剂的组合可成为CRC靶向治疗的有用选择。
实施例27：PLK1作为介导PDK1引导的转化的关键激酶
上文已经显示了PDK1诱导Myc磷酸化，且这种作用可由其他激酶间接介导。为了鉴定PDK1途径中可能对Myc磷酸化具有关键作用的激酶，本发明在HEK-PDK1和HEK-对照细胞中进行了小分子激酶抑制剂筛选，以鉴定与对照细胞相比更有选择性地影响PDK1细胞的那些抑制剂。
两种PLK1激酶抑制剂BI2136和GW843682X显示了与HEK载体对照细胞(PMN)相比对HEK-PDK1细胞的选择性生长抑制作用。在HEK-PMN对照、HEK-PDK1、HEK-Myc和HEK-shPTEN (通过小发卡RNA敲减PTEN)细胞中的更谨慎的剂量反应分析进一步证实了这一发现，并且显示BI2536和GW843682X更有选择性地抑制了PDK1或Myc转化的HEK细胞，而非HEK-PMN和HEK-shPTEN细胞的增殖(图17)。
该发现表明，PLK1可对PDK1转化细胞的生长优势具有关键作用，但PI3K-AKT活化(PTEN敲减)转化的细胞并不需要。
使用转化有PDK1或P3KE545K (组成型活化PI3K)的前列腺上皮细胞在另一种细胞模型中进一步证实了这个结论(图18)。
此外，PLK1抑制剂BI2536选择性地诱导了PDK1转化细胞的凋亡，但在对照或PI3K(E545)-转化细胞中则没有这种作用(图19)。综上，这些发现表明了PLK1在PDK1驱动的转化中的关键作用。
实施例28：PDK1在多种细胞系统中诱导了PLK1磷酸化
与PLK1对PDK1转化细胞的上述作用相符，Western杂交分析显示在PDK1转化的HEK、RWPE和HMEC细胞中PLK1磷酸化的诱导，伴随着诱导的Myc磷酸化，但在shPTEN细胞中则没有。
这些发现表明，PDK1活化导致了PLK1和Myc磷酸化，但PI3K-AKT途径的活化则不能导致PLK1和Myc磷酸化。
实施例29：PLK1是调节Myc磷酸化的上游激酶
为了评估PLK1过表达是否足以诱导Myc磷酸化，本发明使用PLK1和Myc质粒共转染293T细胞。结果显示，PLK1的异位表达诱导了强的Myc磷酸化(图21)。
这证实，PLK1在PDK1驱动的转化中作为Myc磷酸化的上游调控剂。相反，使用siRNA敲减PLK1消除了PDK1转化细胞中的Myc磷酸化(图22)。
实施例30：可通过PLK1抑制剂消除mTOR抑制剂BEZ235在结肠癌细胞中诱导的Myc磷酸化，且PLK1抑制剂BI2536与BEZ235的组合在生长抑制和凋亡中具有协同作用
本发明人此前发现，mTOR抑制剂雷帕霉素在结肠癌细胞中诱导了PDK1依赖性Myc磷酸化，其导致雷帕霉素抗性。
此外，本发明人还发现，PDK1抑制剂可阻断雷帕霉素诱导的Myc磷酸化，并敏化雷帕霉素处理。
本发明现在证明，mTOR抑制剂BEZ235也能够诱导Myc磷酸化，且PLK1抑制剂消除了这种Myc诱导(图23)。
作为结果，BI2536与BEZ235的组合在结肠癌细胞系SW480和DLD1细胞中激发了强的协同性生长抑制(图24)、凋亡(图25)或长期集落形成(图26)。
实施例31：PDK1活化了癌性干细胞细胞进程
PDK1驱动的转化诱导了可自我更新的肿瘤球形成，其是癌性干细胞的特征，而E454K和shPTEN转化细胞则不能如此(图27)。PLK1抑制剂BI2536处理(图28)或PLK1敲减(图29)消除了PDK1驱动的肿瘤球形成。
此外，PDK1活化了干细胞因子，例如Sox2、Lin28B、Aldh1A2的表达，而shPTEN则不能(图30)。
最后，1000个PDK1转化细胞足以在NOD/SCID小鼠中诱导强力的异种移植肿瘤形成，而需要多于10倍的Myc细胞以产生肿瘤(图31)，这证实了PDK转化细胞具有高度的致癌性，并且可诱导癌性干细胞形成。
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本文中提到的每个申请和专利，以及上述每个申请和专利中引用或参考的每篇文献，包括在每个申请和专利的审查期间(“申请引用的文献”)，以及在每个申请和专利中或申请引用的文献中引用或提到的任何产品的厂商说明或目录，均通过引用并入本文。此外，本文中引用的所有文献，以及本文引用的文献中引用或参考的所有文献，以及本文引用或提到的任何产品的任何厂商说明或目录，均通过引用并入本文。
本发明所述方法和系统的各种修饰和变式对本领域技术人员是显而易见的，不脱离本发明的精神和范围。尽管已经结合具体的优选实施方式描述了本发明，但应理解，所要求保护的发明不应被过度地限制到这些具体实施方式。实际上，对分子生物学或相关技术人员而言显而易见的用于实施本发明的所述方式的各种修饰包括在权利要求的范围之内。

Claims (18)

1.用于测定癌细胞是否有可能对mTOR抑制剂治疗具有抗性的方法，所述方法包括检测细胞中或细胞的：(i)PPP2R2B(GenBank登录号：NM_181678)，或(ii)PDK1(GenBank登录号：NM_002613)，或以上二者。
2.如权利要求1所述的方法，其包括检测所述细胞中或所述细胞的PPP2R2B启动子的甲基化，优选与没有mTOR抑制剂抗性的癌细胞相比，PPP2R2B启动子的高甲基化表明所述癌细胞可能对mTOR抑制剂治疗具有抗性。
3.如权利要求1或2所述的方法，其包括检测所述细胞中或所述细胞的PPP2R2B或PDK1或者以上两者的表达和/或活性(例如PDK1介导的Myc磷酸化活性)。
4.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中与没有mTOR抑制剂抗性的癌细胞相比，PPP2R2B表达和/或活性的下降，或PDK1表达和/或活性的提高，或以上二者表明所述癌细胞可能对mTOR抑制剂治疗具有抗性。
5.用于为患有或疑似患有癌症的个体选择治疗的方法，所述方法包括：(a)提供所述患者的细胞；(b)通过上述任一项权利要求所述的方法检测所述细胞的mTOR抑制剂抗性；和(c)在所述细胞被测定为没有mTOR抑制剂抗性的情况下，选择mTOR抑制剂对所述个体进行治疗，在所述细胞被测定为具有mTOR抑制剂抗性的情况下，则为所述个体选择不同的治疗。
6.用于测定患有癌症或疑似患有癌症的个体是否会对mTOR抑制剂治疗作出响应的方法，所述方法包括对所述个体的细胞实施权利要求1~4中任一项所述的方法，其中，在所述细胞被测定为没有mTOR抑制剂抗性的情况下，则确定所述个体可能对mTOR抑制剂治疗作出响应。
7.用于提高癌细胞对mTOR抑制剂治疗的敏感性的方法，所述方法包括提高所述细胞中或所述细胞的PPP2R2B表达和/或活性，或降低PDK1表达和/或活性，或上述二者。
8.用于治疗或预防患有癌症或疑似患有癌症的个体的癌症的方法，所述方法包括提高所述个体中或所述个体的PPP2R2B表达和/或活性，或降低PDK1表达和/或活性，或上述二者。
9.如权利要求7或8所述的方法，其中通过减少所述PPP2R2B启动子的甲基化，例如通过使所述细胞暴露于，或向患者施用去甲基化试剂，如5-aza-dC或阿扎胞苷，从而提高PPP2R2B的表达。
10.如权利要求7~9中任一项所述的方法，其包括使所述细胞暴露于，或向患者施用PDK1抑制剂，如BX912(CAS登录号：702674-56-4)或BX795(CAS登录号：702675-74-9)。
11.用于治疗或预防患有或疑似患有癌症的个体的癌症的方法，所述方法包括施用PDK1表达和/或活性的抑制剂和mTOR抑制剂。
12.PDK1表达和/或活性的抑制剂和mTOR抑制剂的组合，其用在治疗或预防癌症的方法中。
13.PDK1表达和/或活性的抑制剂和mTOR抑制剂的组合在制备用于治疗或预防癌症的药物中的应用。
14.PPP2R2B或PDK1或以上二者的应用，其作为癌细胞对mTOR抑制剂的敏感性的生物标记，或作为结肠直肠癌(CRC)的生物标记，如雷帕霉素抗性结肠直肠癌的生物标记。
15.如前述任一项所述的方法或组合物，其中所述mTOR抑制剂包括雷帕霉素或其衍生物，或其中所述PDK1抑制剂包括shRNA、BX912(CAS登录号：702674-56-4)或BX795(CAS登录号：702675-74-9)，或其任意组合。
16.PDK1或其拮抗剂，其用在治疗结肠直肠癌(CRC)的方法中。
17.如前述任一项所述的方法或组合物，其中所述癌症选自结肠直肠癌(CRC)、膀胱癌、脑癌和食道癌组成的组，优选结肠直肠癌(CRC)。
18.参考附图1~31并如其所示的基本如上文所述的方法、组合或应用。
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