CN111094534A - 用于微腔体细胞培养容器的处理特征 - Google Patents

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CN111094534A CN201880058305.4A CN201880058305A CN111094534A CN 111094534 A CN111094534 A CN 111094534A CN 201880058305 A CN201880058305 A CN 201880058305A CN 111094534 A CN111094534 A CN 111094534A
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Abstract

本公开提供了细胞培养容器(100)，其具有用于培养细胞的表面(316)，所述表面(316)具有适于以3D培养细胞的微腔体阵列(115)，所述微腔体阵列或者在容器的底表面中一体提供，或者是由具有微腔体阵列的插入件(216)来提供，所述插入件(216)被放置在容器的底表面上或固定于容器的底表面。本公开提供了在细胞培养室中的挡件(113)和在容器的颈部中的堰板(130)，其控制液体流入和流出微腔体，以在扰动最小化的情况下使微腔体得以填充和排空，从而对微腔体中的球体产生较少的干扰。

Description

用于微腔体细胞培养容器的处理特征
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年7月14日提交的题为“Cell Culture Containers and Methodsof Culturing Cells(细胞培养容器及培养细胞的方法)”的系列号为62/532,648的美国临时申请的优先权权益，本文以该申请的内容为基础并通过引用将其全部结合入本文。
技术领域
本公开一般涉及细胞培养容器和培养细胞的方法，更具体地，涉及用于容纳和操纵三维细胞的细胞培养容器以及在所述细胞培养容器中培养三维细胞的方法。
背景技术
在细胞培养容器中容纳和培养三维细胞是已知的。
发明内容
下文给出了本公开的简化归纳，以便提供对具体实施方式所描述的一些示例性实施方式的基本理解。
在实施方式中，本公开提供了细胞培养容器，其具有颈缩开口，细胞培养室，顶部，底部，侧壁，端壁和用于培养细胞并且具有微腔体阵列的表面，所述微腔体阵列或者与容器的底表面成为一体来提供，或者是由具有微腔体阵列的插入件来提供，所述插入件被放置在容器的底表面上或固定于容器的底表面。在实施方式中，微腔体的阵列不沿着容器的细胞培养室的整个长度延伸。在实施方式中，微腔体的阵列沿着小于细胞培养室的整个长度(Lc)延伸。在实施方式中，微腔体的阵列延伸长度(Li)。Li小于Lc。在实施方式中，在微腔体的阵列与容器的端壁之间具有挡件。挡件具有长度(Lb)。挡件占据容器的端壁与微腔体阵列之间的空间。Li+Lb＝Lc。在实施方式中，当将容器放置成颈缩开口朝上时，挡件限定了储器。挡件控制进入到微腔体中的液体的流动，以在扰动最小化的情况下使培养基填充微腔体，从而对微腔体中的球体产生较少的干扰。在实施方式中，挡件可以是成角度的、弯曲的、正方形的或任何形状。在另外的实施方式中，并且同样是为了减少由液体移动到容器中或从容器中移出所造成的扰动，容器的颈缩开口可以具有堰板(dam)，其阻挡液体(例如液体培养基)流动进入或离开容器。在实施方式中，堰板可以是正方形的或弯曲的或任何形状。这些特征可以单独或组合存在。例如，容器可以具有微腔体阵列以及弯曲或直的堰板。容器可以具有微腔体阵列和挡件，并且所述挡件可以是成角度的或正方形。容器可以具有微腔体阵列和堰板以及挡件。并且，堰板可以是弯曲的或正方形的，且挡件可以是成角度的或正方形的。还提供了用于培养细胞，引入培养基以及从容器移除培养基的方法。
以上实施方式是示例性的，并且可单独或与本文提供的任意一个或多个实施方式以任意形式组合来提供而不会偏离本公开的范围。另外，应当理解的是，前面的一般性描述和以下的具体实施方式都呈现了本公开的实施方式，且都旨在提供用于理解所描述和所要求保护的实施方式的性质和特性的总体评述或框架。包括的附图提供了对实施方式的进一步理解，附图结合于本说明书中并构成说明书的一部分。附图例示了本公开的各个实施方式，并与说明书一起用来解释其原理和操作。
附图说明
当参照附图阅读时，可以进一步理解本公开的这些特征、实施方式和优点以及其他特征、实施方式和优点，附图中：
图1根据本公开的实施方式，示意性例示了第一示例性细胞培养容器的侧视图；
图2根据本公开的实施方式，示出了第一示例性细胞培养容器沿着图1的线2-2的平面图；
图3根据本公开的实施方式，示出了第一示例性细胞培养容器沿着图2的线3-3的截面图；
图4根据本公开的实施方式，示出了第一示例性细胞培养容器沿着图1的线4-4的截面图；
图5根据本公开的实施方式，例示了以图4的视图5获取的一部分第一示例性细胞培养容器的一个示例性实施方式的放大示意图，其包括具有微腔体阵列的表面，所述微腔体阵列包括多个微腔体；
图6根据本公开的实施方式，示出了沿着图5的线6-6的部分的第一示例性细胞培养容器的截面图，其包括具有微腔体阵列的表面，所述微腔体阵列包括多个微腔体；
图7根据本公开的实施方式，示出了图6的部分的第一示例性细胞培养容器的截面图的一个替代性示例实施方式，其包括具有微腔体阵列的表面，所述微腔体阵列包括多个微腔体；
图8根据本公开的实施方式，示出了沿着图2的线8-8的第一示例性细胞培养容器的一部分的局部截面图的一个示例性实施方式，其包括阶梯状轮廓；
图9根据本公开的实施方式，示出了图8的部分的第一示例性细胞培养容器的局部截面图的一个替代性示例实施方式，其包括倾斜的轮廓；
图10根据本公开的实施方式，示出了沿着图1的线10-10的第一示例性细胞培养容器的一部分的局部截面图的一个示例性实施方式，其包括含凸形轮廓的挡件；
图11根据本公开的实施方式，示出了图10的部分的第一示例性细胞培养容器的局部截面图的一个替代性示例实施方式，其包括含凹形轮廓的挡件；
图12根据本公开的实施方式，示出了图3的第一示例性细胞培养容器的截面图的一个替代性示例实施方式，其包括在第一示例性细胞培养容器中培养细胞的方法；
图13根据本公开的实施方式，示出了在图12的第一示例性细胞培养容器中培养细胞的方法的一个示例性步骤；
图14根据本公开的实施方式，例示了以图13的视图14获取的一部分第一示例性细胞培养容器的一个示例性实施方式的放大示意图，其包括具有微腔体阵列的表面，所述微腔体阵列包括多个微腔体；
图15根据本公开的实施方式，示出了在图13的第一示例性细胞培养容器中培养细胞的方法的一个示例性步骤；
图16根据本公开的实施方式，例示了以图17的视图16获取的一部分第一示例性细胞培养容器的一个示例性实施方式的放大示意图，其包括具有微腔体阵列的表面，所述微腔体阵列包括多个微腔体，并且例示了在所述多个微腔体的至少一个微腔体中培养细胞的方法；
图17根据本公开的实施方式，示出了包括挡件的图10的部分的第一示例性细胞培养容器的局部截面图的一个替代性示例实施方式，以及示出了利用分配端口将材料添加到容器中的方法；
图18根据本公开的实施方式，示出了包括挡件的图10的部分的第一示例性细胞培养容器的局部截面图的一个替代性示例实施方式，以及示出了利用收集端口从容器移除材料的方法。
具体实施方式
下文将参照附图更完整地描述各个特征，附图中示出了本公开的示例性实施方式。只要可能，在所有附图中使用相同的附图标记来表示相同或类似的部分。但是，本公开可以以许多不同的形式实施并且不应被解读成限于本文中提出的实施方式。
细胞培养容器(例如烧瓶)可提供用于培养细胞的无菌室。在一些实施方式中，培养细胞可提供关于疾病和毒理学研究，药剂和治疗的功效，肿瘤特性、生物体、遗传学以及细胞和与细胞相关的其他科学、生物学和化学原理的信息。相比于二维细胞培养物，在一些实施方式中，三维细胞培养物可产生多细胞结构，其在生理学上更精确，并且相比于二维细胞培养物，更逼真地代表细胞可在实际生命应用中存在和生长的环境。例如，发现三维细胞培养物更接近地提供模拟“体内”(即，在活体内，在实景中)细胞生长的真实环境；而发现二维细胞培养物提供模拟“体外”(即，在玻璃中，在实验室环境中)细胞生长的环境，其不能那么好地代表实景环境。通过与三维细胞培养物的相互作用以及观察其性质和行为，可实现关于以下方面的细胞理解的进步，例如，疾病和毒理学研究，药剂和治疗的功效，肿瘤特性、生物体、遗传学以及细胞和与细胞相关的其他科学、生物学和化学原理。
在实施方式中，细胞培养容器100可包括底部108、顶部101、以及端壁107和侧壁106，它们各自具有内表面，所述内表面接触液体培养基材以及所培养的细胞。这些内表面限定了细胞培养室103。这些表面中的至少一个表面可以更加特别适于细胞生长。例如，细胞培养表面可以用涂层处理，以促进或阻止细胞粘着于表面。或者，为了支持球体细胞的培养，细胞生长表面可包括多个微腔体或隔室(例如，微米尺寸的孔穴、亚毫米尺寸的孔穴)，它们例如以阵列布置。细胞生长表面可与烧瓶一体，或者可以是放置在或固定在细胞生长室中的具有微腔体阵列的单独表面。顶表面、底表面、一个或多个侧表面或它们的组合可包括成阵列的微腔体。
例如，在一些实施方式中，在多个微腔体的每个微腔体中可形成单个球体。被引入到容器中的液体培养基中的细胞将通过重力沉降到微腔体中。悬浮在液体培养基中的一个或多个细胞将经过液体落下并沉降在每个微腔体中。微腔体的形状(例如，限定孔穴的凹表面)，以及防止细胞粘附于表面的微腔体的表面涂层也可促进细胞生长成三维形式，从而在每个微腔体中形成球体。
例如，微腔体可以波状或正弦形状形成，从而形成具有圆化顶部和圆化底部的微腔体或微孔穴。当液体培养基填充容器时，这些圆化边缘可防止气泡的形成。在一些实施方式中，烧瓶可填充有促进三维细胞培养物(例如细胞团、类器官或球体)的生长的材料(例如，培养基、固体、液体、气体)。例如，可向细胞培养室或容器添加包含悬浮在液体中的细胞的培养基。悬浮的细胞可通过重力聚集在多个微腔体中并且可形成(例如，生长)为细胞组或细胞簇。成组或成簇的细胞在三个维度上生长以形成3D细胞，或被称为球体或类器官。在单个微腔体中形成单个细胞簇或球体。因此，细胞培养表面具有微腔体阵列的容器或细胞培养室可用于培养球体阵列，并且每个球体位于其自身的微腔体中。
在培养期间，球体可消耗培养基(例如，养料、营养物)并且产生作为副产物的代谢物(例如废物)。因此，在一些实施方式中，在培养期间可向细胞培养室添加培养基形式的养料，并且在培养期间可从细胞培养室移除废培养基。这种更换培养基来饲养细胞以及移除废产物的能力对于细胞的长期培养是重要的。然而，添加和移除培养基可产生扰动，其可破坏微腔体中的球体或者使置于微腔体中的球体移位。当微腔体涂覆有低结合性涂层以防止细胞粘住微腔体表面时尤为如此。球体是疏松的(不粘附于表面)，并且可移位及漂浮在它们的微腔体放置位置之外。出于许多原因，在培养中正在生长的球体移位不是优选的。球体可能随着移除使用过的培养基而从培养物中移除。移出的球体可沉降到被占用的微腔体中，并且可与其他球体融合以形成非均匀的3D细胞结构。也就是说，在培养基更换后，培养中的一些球体可以比其他球体更大。这降低了细胞培养的均匀性并且可以影响在3D细胞上进行的分析或其他测试的结果。在本公开中，公开了减少扰动的结构，从而降低球体从微腔体移出的风险并因此促进了球体的长期培养。
参考图1-18描述了细胞培养容器100以及在示例性细胞培养容器100中培养细胞的方法的实施方式。图1示意性例示了示例性细胞培养容器100的侧视图。图2是容器100沿着图1的线2-2的平面图。如图1和图2所示，其示出了细胞培养容器100的一个实施方式。细胞培养容器100具有端口或孔105(图1中显示具有盖子104，但参见图3)以及将端口或孔105连接到细胞培养室103的颈部112。在实施方式中，所述孔可以可松脱地密封。例如，在实施方式中，颈部112的孔105部分可以具有螺纹(内螺纹或外螺纹)，其允许通过具有互补螺纹结构的盖子104而用盖子104可松脱地密封105。或者，颈缩开口105可通过闭合容器领域中已知的任何其他机构可松脱地密封。孔105组合颈部112成为颈缩开口109(参见图3)。颈缩开口109延伸通过细胞培养室103的壁并且与细胞培养室103流体连通。颈缩开口113允许将液体引入容器的细胞培养室(内部)以及从中移除。
在实施方式中，当容器100的取向是用于细胞生长时，容器100的细胞培养表面200是容器100的底部108。在实施方式中，当容器100被放置成使容器100的底部108平放在表面上时，容器100的取向用于细胞生长。容器100还可以具有侧壁106以及与颈缩开口109相对的端壁107、顶部101和底部108。在实施方式中，顶部101与容器100的细胞培养表面200相对。在实施方式中，颈缩开口109与容器100的端壁107相对。在实施方式中，细胞培养表面200具有微腔体阵列115。容器100的这些结构中的每个结构(颈缩开口109、顶部101、底部108、侧壁106和端壁107)具有面向容器100内侧的内表面。也就是说，顶部101具有内表面201。端壁107具有内表面207。侧壁106具有内表面206。颈部112具有内表面212，并且在实施方式中，底部108具有内表面。容器的内侧是细胞培养室103，其是容器100的内侧的空间，所述细胞培养室103由顶部101、底部108、侧壁106和端壁107限定，其中，细胞位于容器100的内侧。
图2示出了容器100沿着图1的线2-2的平面图。在一些实施方式中，细胞培养容器100可由某种材料制造，所述材料包括但不限于聚合物、聚碳酸酯、玻璃和塑料。在一个实施方式中，容器100例示为由清澈(例如透明)材料制造；但是在一些实施方式中，容器100可替代性地由半透明材料、半不透明材料或不透明材料制造而不会偏离本公开的范围。
如示出了容器100沿着图2的线3-3的截面图的图3所示，底部108可以具有在底部108上的插入件216。插入件216具有内表面316。插入件216的内表面316可以具有微腔体的阵列115。在实施方式中，微腔体的阵列115中的微腔体涂覆有抑制细胞粘附的涂层。在实施方式中，具有微腔体的阵列115的插入件216的内表面316(参见图5-7)形成了细胞培养表面200。插入件可以具有适于形成微腔体阵列115的任何材料，包括聚合物、聚碳酸酯、玻璃和塑料。在实施方式中，在容器100的制造期间将插入件216放置在底部108上。在实施方式中，在容器100的制造期间，使用本领域已知的任何方法，包括胶合、焊接、声波焊接、超声焊接、激光焊接等，将插入件216固定于底部108。
回到图1和图2，在一些实施方式中，容器100可包括盖子104，其被取向成覆盖端口105以密封和/或阻塞端口105，从而阻挡从容器100外侧经过端口105到达细胞培养室103中的路径。为了清楚起见，将盖子104移除，因此，在其他附图中未示出盖子104，但是应理解，在一些实施方式中，可提供盖子104并将其选择性地添加到容器100的端口105中或从中移除而不偏离本公开的范围。在一些实施方式中，盖子104可包括过滤器，其允许气体传递到容器100的细胞培养室103中和/或从中传递出。例如，在一些实施方式中，盖子104可包括透气性过滤器，其被取向成调节细胞培养室103中的气体压力，从而防止细胞培养室103相对于容器100外侧的环境(例如，大气)的压力而加压(例如，超压)。
图4示出了沿着图1的线4-4的截面图。在一些实施方式中，端壁107沿着容器100的轴线110与端口105相对定位，并且具有微腔体阵列115的插入件216跨越细胞培养室103的长度“Li”。在实施方式中，当存在插入件时插入件216的长度“Li”或者当在细胞培养室103的底部108的内表面208中提供微腔体时微腔体阵列115的长度小于容器100的细胞培养室103的长度“Lc”。也就是说，在实施方式中，微腔体阵列115不沿着容器的细胞培养室的整个长度Lc延伸。在实施方式中，微腔体阵列延伸小于细胞培养室的整个长度(Lc)。在实施方式中，微腔体的阵列延伸长度(Li)。Li小于Lc。在实施方式中，在微腔体阵列115与容器100的端壁107之间具有挡件113。挡件113具有长度(Lb)。挡件113占据容器100的端壁107与微腔体阵列115之间的空间。
等式1：Li+Lb＝Lc。
在实施方式中，当将容器放置成颈缩开口朝上时，挡件限定了储器。沿着容器100的端壁107，存在具有挡件面114的挡件113(下文有更详细描述)。图4还示出了在容器100的颈缩开口109中的堰板130。在图4的实施方式中，堰板是正方形，但是堰板可以是任何形状，包括弯曲形、凹形、凸形、波浪形或任何其他形状。此外，堰板的轮廓可以是正方形，如图4所示，或者堰板的轮廓可以是弯曲形、凹形、凸形或任何其他形状。
图5示出了以图4的视图5获取的具有微腔体阵列115的一部分表面的放大示意图。此外，图6示出了具有微腔体阵列115的部分表面沿着图5的线6-6的截面图，并且图7示出了图6的截面图的替代性实施方式。如图5-7所示，在一些实施方式中，在微腔体阵列115中的每个微腔体120(显示为120a、120b、120c)具有在每个微腔体120顶部处的开口123a、123b、123c(例如，在微腔体阵列115的内表面116中)。而且，在微腔体阵列115中的每个微腔体120可包括限定孔穴122a、122b、122c的凹表面121a、121b、121c(参见图6和图7)。另外，每个微腔体120a、120b、120c可包括孔穴122a、122b、122c。无论微腔体阵列115是与容器100的底部108一体的还是微腔体阵列是由具有微腔体阵列115的插入件216来提供的，这些结构均存在。
如图6所示，在一些实施方式中，微腔体阵列115的内表面116可包括限定微腔体120的非线性(例如，波状、正弦曲线形)轮廓。具有微腔体阵列115的表面的底侧126可包括平面(例如平坦)轮廓，如图6中显示为126a。无论微腔体阵列是与容器100的底部108一体的还是微腔体阵列是由具有微腔体阵列115的插入件216来提供的，这些结构均存在。类似地，如图7所示，在一些实施方式中，微腔体阵列115的内表面116和外表面126均可包括非平面(例如，波状、正弦曲线形)轮廓。无论微腔体阵列是与容器100的底部108一体的还是微腔体阵列是由具有微腔体阵列115的插入件216来提供的，这些结构均存在。如图7所示，当微腔体阵列115与容器100的底部108是一体的时，在实施方式中，当微腔体120的轮廓具有不均匀厚度时，内表面显示出微腔体120的阵列，并且表面的底侧具有微突起物126b的阵列。在图7中，这些显示为126b。容器100的底部108的外表面126将展现出这些波状，并且可以是“隆起的”。也就是说，在实施方式中，容器100的底部108的外表面126可以显示出各个微腔体的底部外形。如图7所示，微腔体的底部外形是微腔体的波状结构的底侧，但是微腔体可以为任何形状，因此，容器100的底部108的外表面可以是作为微腔体120的底侧的任何形状。也就是说，容器100的底部108的外表面126可以具有微突起物阵列或者可以是“隆起的”。当微腔体阵列由插入件216来提供时也是如此。在这种情况中，插入件的外表面可以是“隆起的”，而容器100的底部108的外表面是平面的。也就是说，插入件216可以具有隆起的外表面126b，或者具有包括微突起物126b的阵列的外表面，其具有微突起物126b的阵列，并且插入件216可以抵靠底部108的内表面，而该内表面可以是光滑的。
图6所示的具有微腔体阵列115的表面例示了具有微腔体阵列115的内表面116，在图6中，其具有产生微腔体阵列115的波状或正弦曲线形的轮廓。微腔体阵列115的外表面126a具有平面(例如平坦)轮廓。在示出了微腔体阵列115的内表面116和外表面126的图7中，底表面具有圆化的微突起物的阵列。图7所示的微腔体阵列115的轮廓有所削减。因此，在实施方式中，产生微腔体阵列的材料的更薄的轮廓得到了具有微突起物126b的阵列的底表面。这可减少用于制造具有微腔体阵列115的表面的材料量，并且相比于例如具有微腔体阵列115且其中微腔体阵列115的外表面126a包括平面(例如平坦)轮廓的表面(图6)，这提供了具有微腔体阵列115且所述微腔体阵列115包括壁更薄的微腔体120a、120b、120c的表面。在一些实施方式中，壁更薄的微腔体120a、120b、120c可提供更薄的材料轮廓，其使得微腔体120的壁可以是透气性的。在实施方式中，这可以允许具有微腔体阵列的表面有更高的气体传递率(例如，透气性)，以在细胞培养期间将更多的气体提供到孔穴122a、122b、122c中以及使更多气体从孔穴122a、122b、122c中出来。因此，在一些实施方式中，使微腔体阵列115的内表面116和外表面126均具有非平面(例如，波状、正弦曲线形)轮廓(例如参见图7)可提供更健康的细胞培养环境，从而改进细胞在微腔体120a、120b、120c中的培养。此外，在实施方式中，可以使用不同的制造方法来制造图6和图7所示的两种轮廓。图6所示的轮廓可以通过将形状戳印或压印或模制到相对较厚的材料的平坦片的一侧中来制造。图7所示的轮廓可以通过模制或轧制材料薄片以制造图7所示的较薄轮廓来制造。
在一些实施方式中，具有微腔体阵列115的表面可以是聚合材料，包括但不限于聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯、聚碳酸酯、聚砜、聚苯乙烯共聚物、含氟聚合物、聚酯、聚酰胺、聚苯乙烯丁二烯共聚物、完全氢化的苯乙烯类聚合物、聚碳酸酯PDMS共聚物和聚烯烃，如聚乙烯、聚丙烯、聚甲基戊烯、聚丙烯共聚物和环烯烃共聚物。此外，在一些实施方式中，由凹表面121a、121b、121c限定的孔穴122a、122b、122c的至少一部分可涂覆有低结合性材料，从而使所述孔穴122a、122b、122c的至少一部分对细胞无粘附性。例如，在一些实施方式中，可向由凹表面121a、121b、121c限定的孔穴122a、122b、122c的至少一部分施涂以下中的一种或多种：全氟聚合物，烯烃，琼脂糖，非离子性水凝胶，例如聚丙烯酰胺，聚醚，例如聚环氧乙烷，多元醇，例如聚乙烯醇，或者它们的混合物。
另外，在一些实施方式中，所述多个微腔体120中的每个微腔体120a、120b、120c可包括各种特征及这些特征的变化形式而不偏离本公开的范围。例如，在一些实施方式中，所述多个微腔体120可被布置成阵列(微腔体阵列115)，包括线性阵列(如图所示)、对角阵列、矩形阵列、圆形阵列、径向阵列、六角密堆布置等。此外，在一些实施方式中，开口123a、123b、123c可包含各种形状。在一些实施方式中，开口123a、123b、123c可包括圆形、椭圆形、矩形、四边形、六边形及其他多边形形状中的一种或多种。此外，在一些实施方式中，开口123a、123b、123c可包括约100微米(μm)至约5000μm的尺寸(例如，直径、宽度、正方形或矩形的对角线等)。例如，在一些实施方式中，开口123a、123b、123c可包括以下尺寸：100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm、500μm、550μm、600μm、650μm、700μm、750μm、800μm、850μm、900μm、950μm、1000μm、1500μm、2000μm、2500μm、3000μm、3500μm、4000μm、4500μm、5000μm以及在约100μm至约5000μm的范围中涵盖的任何尺寸或尺寸范围。
在一些实施方式中，由凹表面121a、121b、121c限定的孔穴122a、122b、122c可包括各种形状。在一些实施方式中，由凹表面121a、121b、121c限定的孔穴122a、122b、122c可包括圆形、椭圆形、抛物线形、双曲线形、人字形、倾斜的或其他截面轮廓形状中的一种或多种形状。此外，在一些实施方式中，孔穴122a、122b、122c的深度(例如，从由开口123a、123b、123c限定的平面到凹表面121a、121b、121c的深度)可包括约100微米(μm)至约5000μm的尺寸。例如，在一些实施方式中，孔穴122a、122b、122c的深度可包括以下尺寸：100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm、500μm、550μm、600μm、650μm、700μm、750μm、800μm、850μm、900μm、950μm、1000μm、1500μm、2000μm、2500μm、3000μm、3500μm、4000μm、4500μm、5000μm，在约100μm至约5000μm的范围中涵盖的任何尺寸或尺寸范围。
在一些实施方式中，可在多个微腔体115中的至少一个微腔体120a、120b、120c中培养的三维细胞150(例如，球体、类器官150a、150b、150c)(参见图16)可包括约50μm至约5000μm的尺寸(例如直径)，以及在约50μm至约5000μm范围内涵盖的任何尺寸或尺寸范围。在一些实施方式中，可提供比所公开的确切尺寸更大或更小的尺寸，因此，除非另有说明，否则比所公开的确切尺寸更大或更小的尺寸被认为是在本公开的范围内。例如，在一些实施方式中，开口123a、123b、123c的一种或多种尺寸，孔穴122a、122b、122c的深度，以及三维细胞150(例如球体150a、150b、150c)的尺寸可以比所公开的确切尺寸更大或更小而不偏离本公开的范围。
附加或替代性地，如示出了沿着图2的线8-8的一部分容器100的局部截面图的图8所示，在一些实施方式中，沿着容器100的端壁107可存在挡件113。在实施方式中，例如，如图8所示，挡件可以具有阶梯状或正方形轮廓114a。同样地，图9示出了图8的部分容器100的局部截面图的一个替代性实施方式，在一些实施方式中，如图9所示，挡件113可包括倾斜或成角度的轮廓114b。如下文更完整论述的，在一些实施方式中，阶梯状或倾斜的挡件113可提供关于在细胞培养容器100中培养细胞的方法的优点。
附加或替代性地，回到图3和图4，在一些实施方式中，细胞培养容器100可包括从容器100的颈部112的内表面延伸的堰板130。如图3和图4所示，堰板可以为矩形形状。在一些实施方式中，堰板130可包括面向端口的表面131，该堰板130阻挡限定在端口105与具有微腔体阵列115的表面之间的流体路径。在一些实施方式中，堰板130的面向端口的表面131可以基本上垂直于容器100的轴线110。或者，图10示出了沿着图1的线10-10的一部分第一示例性细胞培养容器100的局部截面图的一个示例性实施方式，如图10所示，在一些实施方式中，堰板130的面向端口的表面131可包括凸形轮廓131a。此外，如图11所示，在一些实施方式中，堰板130的面向端口的表面131可包括凹形轮廓131b。在一些实施方式中，可提供堰板130以阻挡材料流到容器100中及从容器100流出。在另外的实施方式中，堰板130可以是正方形或弯曲的或任何形状。
另外，回到图3，在一些实施方式中，例如，堰板130的边缘135的至少一部分可与顶部101的内表面201间隔距离“d1”。在一些实施方式中，通过使挡件130的自由端135的至少一部分与内表面201间隔开，在一些实施方式中，可提供可到容器100的尾部(例如与端口105相对)的入口。例如，在一些实施方式中，可将一种或多种仪器(未示出)插入到容器100的端口105中，通过堰板130(例如，通过距离“d1”)以进入位于堰板130后方的细胞培养室103的区域。因此，在一些实施方式中，堰板130可减慢材料沿着第一流动路径(参考图17的161a、161b和161c)和第二流动路径(参见图18的163a、163b)中的至少一者流动的速度，同时还允许块体进入到容器100的细胞培养室103中。
如图12所示，在一些实施方式中，当容器100依靠端壁107立起时，容器100的轴线110可基本上在重力“g”的方向上延伸，同时在细胞培养室103的储器141中容纳有预定量的液体140，并且该预定量的液体140中的液体不接触多个微腔体115中的一个或多个微腔体120。储器141是在顶部101与挡件113之间的区域，其底部由端壁107界定，侧面由容器100的侧壁106限定。储器141被结构化和布置用于容纳液体而不使液体进入微腔体120。由于挡件113的原因，并且由于微腔体阵列115不在容器的底部108上一直延伸到端壁107，而是微腔体阵列115在挡件113处终止，使得在容器100中具有储器141。也就是说，容器中存在储器141是因为微腔体阵列的长度(Li)小于容器的长度(Lc)。此外，储器141的尺寸和形状被设置用于容纳预定量的液体140。
例如，在一些实施方式中，容器100可以被放置在例如水平面上(未示出)，依靠端壁107放置并且容器100的轴线110基本上在重量“g”的方向上竖直延伸。附加或替代性地，在一些实施方式中，容器100可由一种或多种结构(例如，框架、底座、人手等)支承(例如，握住、悬挂)并且轴线110基本上在重力“g”的方向上延伸。在一些实施方式中，在液体通过(例如，如箭头106所示)端口105而从容器100之外进入到细胞培养室103中时和/或在细胞培养室103的储器141中容纳有预定量的液体140并且该预定量的液体140中的液体不接触微腔体阵列115的一个或多个微腔体120时，至少基于对容器100进行定位和/或支承，可使容器100的轴线110基本上在重力“g”的方向上延伸。
在一些实施方式中，当容器100静止时，在细胞培养室103的储器141中可容纳预定量的液体140，并且该预定量的液体140中的液体不接触多个微腔体115中的一个或多个微腔体120。或者，在一些实施方式中，当容器100运动(例如，非静止)时，在细胞培养室103的储器141中可容纳预定量的液体140，并且该预定量的液体140中的液体不接触多个微腔体115中的一个或多个微腔体120。例如，在一些实施方式中，在细胞培养室103的储器141中容纳预定量的液体140时，可赋予容器100平移运动和/或旋转运动，而该预定量的液体140中的液体不会接触多个微腔体120中的一个或多个微腔体120a、120b、120c。因此，除了基本上在重力“g”的方向上延伸之外或者作为对其的替代，在一些实施方式中，当细胞培养室103的储器141中容纳预定量的液体140时，容器100的轴线110可在限定相对于重力“g”的方向为非零角度的一个或多个方向上延伸而不会使该预定量的液体140中的液体接触微腔体阵列115中的一个或多个微腔体120。
另外，在一些实施方式中，在容器100的储器141中容纳预定量的液体140的持续时间期间，在细胞培养室103的储器141中容纳预定量的液体140，并且该预定量的液体140中的液体不接触微腔体阵列115中的一个或多个微腔体120时，容器100的轴线110的取向(例如，相对于重量“g”的方向)可保持不变。或者，在一些实施方式中，在容器100的储器141中容纳预定量的液体140的持续时间期间，在细胞培养室103的储器141中容纳预定量的液体140，并且该预定量的液体140中的液体不接触多个微腔体120中的一个或多个微腔体120时，容器100的轴线110的取向(例如，相对于重量“g”的方向)可改变一次或多次。另外，在一些实施方式中，根据本公开的实施方式，在容器100的储器141中可容纳预定量的液体140，并且该预定量的液体140中的液体在瞬间(例如，相比于持续的时间)不接触多个微腔体120中的一个或多个微腔体120。在图12所示的实施方式中，挡件面114是倾斜或成角度的挡件面114b。虽然图12例示了内表面316具有微腔体阵列115的插入件216，但是本领域普通技术人员应认识到，也可以提供具有成一体的微腔体阵列115的细胞培养容器的底部108。
如图13示意性所示，在一些实施方式中，所述方法可包括：在细胞培养室103的储器141中容纳预定量的液体140并且所述预定量的液体140中的液体不接触所述多个微腔体115(参见图12)中的一个或多个微腔体120之后，移动容器100以造成至少一部分的所述预定量的液体140沿着细胞培养室103的长度“Li”从储器141流到具有微腔体阵列115的表面上并沉积在所述多个微腔体115(或者内表面316具有微腔体阵列115的插入件216)中的至少一个微腔体120中。例如，在一些实施方式中，移动容器100可包括：平移容器100和/或将容器100从第一取向(例如，图12提供的取向)旋转到第二取向(例如，图13提供的取向)。通过移动容器100以造成至少一部分的预定量的液体140沿着细胞培养室103的长度“L”从储器141流到具有微腔体阵列115的表面上并且沉积在多个微腔体115的至少一个微腔体120中，可控制液体沉积到所述至少一个微腔体120中，并且在一些实施方式中，可确保液体沉积到所述至少一个微腔体120中。
例如，图14例示了在图13的视图14处获取的一部分第一示例性细胞培养容器100的一个示例性实施方式的放大示意图，其示出了至少一部分的预定量的液体140沿着细胞培养室103的长度“Li”从储器141流到具有微腔体阵列115的表面上，并且沉积在多个微腔体115的至少一个微腔体120中。图14例示了微腔体的开口(123a、123b、123c)，微腔体的孔穴(122a、122b、122c)，微腔体壁125和微腔体的底表面(121a、121b和121c)。这些特征构成了微腔体(120a、120b和120c)。在一些实施方式中，可控制及减慢(例如，在几分钟的持续时间期间内进行)造成液体流动的容器100的移动。例如，已经观察到，用液体直接填充多个微腔体120中的微腔体120a、120b、120c(例如，不是基于本公开的方法)可导致抑制和/或阻止细胞生长的不期望的填充特性。不意欲囿于理论，认为，当试着用液体直接并迅速(例如，在几秒钟的持续时间期间进行)填充多个微腔体120的微腔体120a、120b、120c时，至少基于液体的表面张力以及孔穴122a、122b、122c中的气体的存在，液体可形成在微腔体120a、120b、120c的开口123a、123b、123c上延伸的屏障，从而将气体(例如，空气或气泡)困在孔穴122a、122b、122c中。在一些实施方式中，相对于细胞培养时间，气体渗透通过具有微腔体阵列115的表面的速率可能太慢(例如，发生几小时或几天的持续时间)，使得对于实际应用，气泡仍保留在孔穴122a、122b、122c中，并且液体保持在孔穴122a、122b、122c之外，导致在孔穴122a、122b、122c中不能够培养细胞。也就是说，气泡不利于细胞培养。
然而，已经观察到，通过采用本公开的方法的一个或多个特征，例如，通过移动容器100以造成至少一部分的预定量的液体140沿着细胞培养室103的长度“Li”从储器141流到具有微腔体阵列115的表面上并且沉积在多个微腔体115的至少一个微腔体120a、120b、120c中，液体可通过所述至少一个微腔体120a、120b、120c的相应开口123a、123b、123c的一部分而进入孔穴122a、122b、122c。例如，随着液体流到孔穴122a、122b、122c中，液体可置换孔穴122a、122b、122c中的气体，由此用液体填充孔穴122a、122b、122c。另外，在一些实施方式中，通过在几分钟的持续时间期间进行该步骤，例如，随着液体沿着细胞培养室103的长度“Li”从储器141逐渐流到具有微腔体阵列115的表面上并通过所述至少一个微腔体120a、120b、120c的相应开口123a、123b、123c的一部分进入孔穴122a、122b、122c，基本上可从孔穴122a、122b、122c置换孔穴122a、122b、122c中的所有气体。也就是说，用液体培养基从储器141缓慢地填充微腔体120减少了微腔体120中的气泡形成并改进了细胞培养。
在一些实施方式中，容器100的挡件113的轮廓114可提供促进液体至少基于容器100的移动而从储器141流到具有微腔体阵列115的表面上的表面。例如，在一些实施方式中，挡件113的倾斜或成角度的轮廓141b可提供斜表面，流体沿着该斜表面可从储器141流到具有微腔体阵列115的表面(微腔体阵列可由插入件216提供)。在一些实施方式中，挡件113可邻接具有微腔体阵列115的表面，并且流体可沿着挡件113的倾斜轮廓141b从储器141流动并沉积到至少一个微腔体120a、120b、120c中，并且具有受控的流动(例如，减少了或没有液体飞溅以及减少了或没有湍流)，从而在从孔穴122a、122b、122c置换气体时，提供通过所述至少一个微腔体120a、120b、120c的相应开口123a、123b、123c沉积到孔穴122a、122b、122c中的液体的稳定流。
如图15所示，在一些实施方式中，至少基于容器100的移动，可造成预定量的液体140从储器141流到具有微腔体阵列115的整个表面上。此外，图16例示了以图15的视图16获取的一部分细胞培养容器100的一个实施方式的放大示意图，其包括在细胞培养容器100中培养细胞150的方法。例如，在一些实施方式中，所述方法可包括：在所述至少一个微腔体120a、120b、120c中沉积所述至少一部分的预定量的液体140后，在多个微腔体115的至少一个微腔体120a、120b、120c中培养细胞150(例如，球体150a、球体150b、球体150c)。如图15和图16所示，在一些实施方式中，在多个微腔体120的所述至少一个微腔体120a、120b、120c中培养细胞150时，容器100的轴线110相对于重力“g”的方向可基本上垂直。
例如，如图17所示，在一些实施方式中，一种在细胞培养容器100中培养细胞150的方法可包括：通过将分配端口160插入到端口105中，将材料(例如，养料、营养物、液体培养基)添加到细胞培养室103中，然后，将材料从分配端口160分配到细胞培养室103中。例如，在一些实施方式中，所述方法可包括：将分配端口160插入到容器100的端口105中。所述方法还可包括：使材料沿着第一流动路径161a、161b在容器100的细胞培养室103中流动。通过从分配端口160分配材料，材料可沿着第一流动路径161a、161b流动，从而将材料从容器100之外添加到细胞培养室103中。此外，在一些实施方式中，所述方法可包括：阻挡材料沿着第一流动路径161a、161b的流动。例如，在一些实施方式中，阻挡沿着第一流动路径161a、161b的流动可包括：使用堰板130使沿着第一流动路径161a、161b的流动转向。在一些实施方式中，使用堰板130使沿着第一流动路径161a、161b的流动转向可包括：将沿着第一流动路径161a、161b的流动分成至少两个分流161c、161d。例如，在一些实施方式中，该两个分流161c、161d中的至少一个分流可侧向围绕堰板130的外周界(例如，在堰板130的外周界与侧壁201的内表面102之间)在细胞培养室103中流动。在一些实施方式中，所述方法可包括：在将材料从分配端口160分配到细胞培养室103中时，在所述多个微腔体120的至少一个微腔体120a、120b、120c中培养细胞150(参见图16)。
此外，如图18所示，在一些实施方式中，所述方法可包括：通过将收集端口162通过端口105插入，然后利用收集端口162从细胞培养室103收集材料，从细胞培养室103移除材料(例如，废物、副产物、液体培养基)。例如，在一些实施方式中，所述方法可包括：将收集端口162插入到端口105中，通过利用收集端口162收集材料，使材料沿着第二流动路径163a,163b在细胞培养室103中流动，从而从细胞培养室103移除材料。在一些实施方式中，所述方法可包括：阻挡材料沿着第二流动路径163a、163b的流动。例如，在一些实施方式中，阻挡沿着第二流动路径163a、163b的流动可包括：使用堰板130使沿着第二流动路径163a、163b的流动转向。在一些实施方式中，使用堰板130使沿着第二流动路径163a、163b的流动转向可包括：将沿着第二流动路径163a、163b的流动分成至少两个分流163c、163d。例如，在一些实施方式中，该两个分流163c、163d中的至少一个分流可侧向围绕堰板130的外周界(例如，在挡件130的外周界与侧壁106的内表面102之间)在细胞培养室103中流动。在一些实施方式中，所述方法可包括：在利用收集端口162从细胞培养室103收集材料时，在所述多个微腔体120的至少一个微腔体120a、120b、120c中培养细胞150。
在一些实施方式中，在多个微腔体120的至少一个微腔体120a、120b、120c中培养细胞时，用堰板130阻挡材料沿着第一流动路径161a、161b和第二流动路径163a、163b中的至少一者流动可分别将材料添加到或移除出容器100的细胞培养室103，而不会例如干扰细胞150的培养。例如，在一些实施方式中，分配端口160可通过使材料沿着第一流动路径161a、161b以某速度从分配端口160流动(例如，分配、吹动)到细胞培养室103中，可将材料加入到细胞培养室103中，从而在端口105和细胞培养室103中及周围建立正压力。同样地，在一些实施方式中，收集端口162可通过使材料沿着第二流动路径163a、163b以某速度从细胞培养室103流动(例如，收集、吸出)到收集端口162中，可从细胞培养室103移除材料，从而在端口105和细胞培养室103中及周围建立负压力。因此，在一些实施方式中，堰板130可减慢材料沿着第一流动路径161a、161b和第二流动路径163a、163b中的至少一者流动的速度，从而相应地降低在端口105和细胞培养室103中及周围的正压力和负压力。因此，在一些实施方式中，堰板130可减少和/或防止材料沿着第一流动路径161a、161b和/或第二流动路径163a、163b流动，从而使得在多个微腔体120的至少一个微腔体120a、120b、120c中培养的细胞150不会移出。例如，在一些实施方式中，如果材料的流动使得一个或多个细胞移出，则一个或多个微腔体120a、120b、120c可包含不止一个球体或者不包含球体。此外，在一些实施方式中，通过减少和/或防止材料流动导致在容器100中培养的细胞150移出，可获得更优质的细胞培养物以及与细胞培养物相关的更精确的科学结果。
现将参考图12-16描述在第一示例性细胞培养容器100中培养细胞的方法。如图12所示，在一些实施方式中，一种在细胞培养容器100中培养细胞150(参见图16)的方法可包括：使液体通过(例如，如箭头106所示)端口105而从容器100之外进入到细胞培养室103中，由此在细胞培养室103中提供预定量的液体140。虽然所述方法是针对包括具有倾斜轮廓114b的挡件113的容器100来描述的，但应理解，根据本公开的实施方式，在一些实施方式中，所述方法可以针对非平面边界部分114(示于图3)和阶梯状轮廓114a(示出图8)以及容器100的壁101的内表面102的其他轮廓的相同或相似方式来使用而不会偏离本公开的范围。
在一些实施方式中，所述方法可包括：使细胞培养室103的储器141中容纳预定量的液体140，并且该预定量的液体140中的液体不接触具有微腔体阵列115的表面的多个微腔体120中的一个或多个微腔体120a、120b、120c。例如，在一些实施方式中，当细胞培养室103的储器141中容纳预定量的液体140时，该预定量的液体140中的液体可接触挡件113，但是该预定量的液体140中的液体不接触多个微腔体120中的一个或多个微腔体120a、120b、120c。如下文更完整论述地，在所述方法的这一阶段，防止预定量的液体140中的液体接触多个微腔体120中的一个或多个微腔体120a、120b、120c可提供多个优点，例如，其促进改进了细胞150(参见图16)的培养。
如示出了容器100沿着图2的线3-3的截面图的图3所示，底部108可以具有在底部108上的插入件216。插入件216具有内表面316。插入件216的内表面316具有微腔体阵列115，在另外的实施方式中，细胞培养容器100可包括具有微腔体阵列115并且所述微腔体阵列115包括多个微腔体120的表面(参见图5-7)。在一些实施方式中，具有微腔体阵列115的表面以及壁101的内表面102可限定容器100的细胞培养室103，并且端口105延伸通过壁101而与细胞培养室103流体连通。例如，在一些实施方式中，细胞培养室103可包括容器的内部空间体积103。
在实施方式中，颈缩开口的内表面可以具有一个或多个堰板以在将液体引入到容器中时，使进入到容器中的液体流动转向，并且减少在细胞培养表面上培养的细胞所经历的扰动。在另外的实施方式中，一种培养细胞的方法可包括：首先放置容器以使其颈缩开口面向上放置，从而通过使流体沿着容器的顶部流动而使流体进入容器，并且从容器的后端移除流体，由此来更换培养基。在另外的实施方式中，一种培养细胞的方法可包括：在放置容器以使其颈缩开口面向上放置时，引入培养基，使培养基填充容器的后端，然后通过小心倾斜容器直到具有微腔体阵列的表面倒下，使培养基流到具有微腔体阵列的表面上。
在一些实施方式中，容器在容器的颈部具有堰板，以干扰进入到细胞培养室中的液体的流动。在另外的实施方式中，一种培养细胞的方法可包括：将分配端口插入到容器的端口中。所述方法可包括：使材料沿着第一流动路径在由壁的内表面和具有微腔体阵列的表面限定的容器的细胞培养室中流动，由此将材料从容器之外加入到细胞培养室中。所述方法可包括：阻挡材料沿着第一流动路径流动。
在一些实施方式中，一种培养细胞的方法可包括：使液体通过容器中的端口而从容器之外进入到由壁的内表面和具有微腔体阵列的表面限定的容器的细胞培养室中，由此在细胞培养室的储器中提供预定量的液体。所述方法可包括：在细胞培养室的储器中容纳预定量的液体并且该液体不接触所述多个微腔体中的一个或多个微腔体。
在一些实施方式中，一种细胞培养容器可包括壁以及具有微腔体阵列的表面。具有微腔体阵列的表面以及容器的壁和顶部的内表面限定了容器的细胞培养室或者细胞培养室。端口可延伸通过容器的壁而与细胞培养室流体连通。
本文公开了细胞培养容器和培养细胞的方法的多个方面。示出的是一些选定方面的概述。
对本领域的技术人员而言，显而易见的是，可以对本公开进行各种修改和变动而不偏离本公开的范围和精神。因此，本公开旨在涵盖对本公开的这些修改和变动，只要这些修改和变动在所附权利要求及其等同方案的范围之内。

Claims (20)

1.一种细胞培养容器，其包括：
细胞培养室，其包括顶部、底部、侧壁和颈缩开口，所述颈缩开口延伸通过细胞培养室的壁而与细胞培养室流体连通；
具有微腔体阵列的细胞培养表面；
在与颈缩开口相对的壁和微腔体阵列之间的挡件；
其中，微腔体阵列延伸长度(Li)，其小于细胞培养室的长度(Lc)；并且
其中，挡件长度(Lb)加上微腔体阵列的长度(Li)等于细胞培养室的长度(Lc)；
由此使得当容器被取向成颈缩开口向上时，在挡件与细胞培养室的顶部之间具有储器。
2.如权利要求1所述的细胞培养容器，其中，所述底部包括微腔体阵列。
3.如权利要求2所述的细胞培养容器，其中，微腔体阵列与底部的内表面是一体的。
4.如权利要求3所述的细胞培养容器，其中，微腔体阵列的底表面是平面。
5.如权利要求3所述的细胞培养容器，其中，微腔体阵列的底表面包括微突起物的阵列。
6.如权利要求1所述的细胞培养容器，其还包括在底部上的插入件，其中，所述插入件包括微腔体阵列。
7.如权利要求6所述的细胞培养容器，其中，所述插入件固定于底部。
8.如权利要求6所述的细胞培养容器，其中，微腔体阵列的底表面是平面。
9.如权利要求6所述的细胞培养容器，其中，微腔体阵列的底表面包括微突起物的阵列。
10.如权利要求1-9中任一项所述的细胞培养容器，其中，所述挡件是倾斜的。
11.如权利要求1-9中任一项所述的细胞培养容器，其中，所述挡件是正方形。
12.如权利要求1-11中任一项所述的细胞培养容器，其还包括在容器的颈缩开口中的堰板。
13.如权利要求12所述的细胞培养容器，其中，所述堰板是弯曲的。
14.如权利要求12所述的细胞培养容器，其中，所述堰板是矩形。
15.一种在如权利要求1-14中任一项所述的细胞培养容器中培养细胞的方法，包括：
使容器依靠与容器的颈缩开口相对的端壁放置；
将悬浮在液体培养基中的细胞引入到容器中，其中，细胞和液体培养基被置于挡件与容器顶部之间的空间中的储器中；
旋转容器以使细胞和液体培养基流到包含微腔体阵列的细胞培养表面上。
16.如权利要求15所述的方法，还包括：在容器中培养细胞的步骤。
17.如权利要求16所述的方法，还包括：旋转容器以使细胞和培养基流到储器中。
18.一种培养细胞的方法，所述方法包括：
将分配端口插入到细胞培养容器的颈缩开口中；
通过从分配端口分配材料，使材料沿着第一流动路径在由壁的内表面和包含微腔体阵列的表面限定的容器的细胞培养室中流动，由此将材料从容器之外加入到细胞培养室中；以及
阻挡材料沿着第一流动路径流动。
19.如权利要求18所述的方法，阻挡沿着第一流动路径流动包括：使用堰板使沿着第一流动路径的流动转向。
20.如权利要求19所述的方法，使用堰板使沿着第一流动路径的流动转向包括：将沿着第一流动路径的流动分成至少两个分流。
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