JP6238208B2 - 細胞展開用マイクロチャンバーチップ - Google Patents
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Description
細胞展開用マイクロチャンバーチップ(41)および(42)は、マイクロチャンバー(30)の内壁面まで細胞非接着性表面処理(「ブロッキング処理」ともいう。)が施されており、細胞がマイクロチャンバー(30)の内壁に吸着することなく底面に集積しやすいため、顕微鏡下の明視野による細胞観察が容易となる。
<細胞展開用マイクロチャンバーチップ>
図1,2によると、本発明の細胞展開用マイクロチャンバーチップ(41)および(42)はそれぞれ、一個以上の細胞を格納、保持することができる「マイクロチャンバー」(30)が「基板」(10)の「上面」(11)に形成されている「マイクロチャンバーチップ」(20)の「上面」(11)と該マイクロチャンバー(30)の「内壁面」(31)とが、細胞が該上面(11)に非特異的に吸着するのを抑制できる「ブロッキング剤」(50)で被覆されていることを特徴とする。ブロッキング剤(50)による被覆は、基板(10)の上面(11)からマイクロチャンバー(30)の内壁面(31)まで連続していることが好ましい。しかしながら、実際の態様では、上面(11)と内壁面(31)との境界上で一部寸断して被覆されているマイクロチャンバー(30)も存在するので、本発明はこのような態様も包含される。なお、内壁面(31)は、マイクロチャンバー(30)を構成する面のうち底面(32)を除く部分(側面)を指す。
図2に示されるように、例えば本発明の細胞展開用マイクロチャンバーチップ(41)を製造する方法は、後述する工程(a)および(b)を含むことが好ましい。
工程(a)とは、基板(10)の上面(11)にマイクロチャンバー(30)を形成することによって、マイクロチャンバーチップ(20)を製造する工程である。
本発明で用いる基板の材料としては、従来公知のマイクロプレート等と同じ材料を使用でき、また金型を用いて成形できる材料であってもよく、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリジメチルシロキサン〔PDMS〕、ポリメチルメタクリレート〔PMMA〕、環状オレフィンコポリマー〔COC〕などのポリマーが挙げられる。基板は、(金型成形された)ポリマーに、金属、ガラス、石英ガラスなどからなる基板を張り合わせたような複数の材料を組み合わせたものであってもよい。
本発明におけるマイクロチャンバーとは、一個以上の細胞を「格納」し、「保持」することができる凹状の微細穴(マイクロウェル)をいう。ここで、「格納」とは、本発明の細胞展開用マイクロチャンバーチップ表面に細胞懸濁液を添加した際に細胞がマイクロチャンバーに入る(収容される)ことをいい、「保持」とは、マイクロチャンバーに格納された細胞が、細胞展開用マイクロチャンバーチップ表面に添加された染色液や洗浄液等によってマイクロチャンバー外に出ないことをいう。
工程(a)で得られるマイクロチャンバーチップ(20)は、基板(10)の上面(11)にマイクロチャンバー(30)が形成されたものである。本発明では、次のブロッキング処理工程(b)により基板(10)の上面(11)をブロッキング剤で被覆するので、マイクロチャンバー(30)を形成するこの工程(a)の段階ではブロッキング効果をもたらす処理(特に底面までブロッキング剤で被覆してしまうおそれのある処理)を行う必要はない。必要に応じて、本発明の作用効果を阻害しない範囲の表面処理、例えばUVオゾン処理のように基板の細胞接着性を高める表面処理を行った上で、ブロッキング処理を施すことができる。
工程(b)とは、工程(a)で得られたマイクロチャンバーチップ(20)の上面(11)に対して、ブロッキング剤(50)を含有するブロッキング処理液(51)を当接することによって、基板(10)の上面(11)とマイクロチャンバー(30)の内壁面(の一部〜全部)を、ブロッキング剤(50)で被覆する工程である。
ブロッキング処理工程(b)の実施形態の具体例として、例えば、以下に説明する(b-1)〜(b-4)のような四つの方式が挙げられる。
ブロッキング剤(50)とは、基板(10)の上面(11)を被覆することで、細胞がそこに非特異的に吸着するのを抑制する物質を指す。また、ブロッキング処理液(51)は、本発明のブロッキング処理工程(b)を行う際に用いられる、ブロッキング剤(50)を適当な溶媒で希釈することにより調製される溶液を指し、ブロッキング剤(50)を含有(例えば溶解や分散などの態様を包含する。)している。
(b-1)は、流速制御方式ともいい、図3(A)および図4(A)に示すように、基板(10)の上面(11)の一端からブロッキング処理液(51)(例えばBSA溶液)を送液する方式である。
(b-2)は、スタンプ方式ともいい、図3(B)で示されるように、ブロッキング処理液(51)を浸みこませた「印肉」(71)を有する「スタンプ」(70)を、基板(10)の上面(11)に接触(または押印)させる方式である。主に、天板(60)を備えない、開放系のマイクロチャンバーチップ(20)に対して適用される。また、流速制御方式(b-1)、単純添加方式(b-3)または単純浸漬方式(b-4)ではブロッキング処理を行いにくいマイクロチャンバーチップ(20)に対しても、このスタンプ方式(b-2)であれば適切にブロッキング処理できる場合がある。
(b-3)は、単純添加方式ともいい、図3(C)に示されるように、基板(10)の上面(11)の全部にわたってブロッキング処理液(51)を滴下する方式である。主に、天板(60)を備えない、開放系のマイクロチャンバーチップ(20)に対して適用される。滴下されたブロッキング処理液(51)によって基板(10)の上面(11)が覆われるが、ブロッキング処理液(51)の表面張力によってマイクロチャンバー(30)の内部にはブロッキング処理液(51)は過度に入り込まない。ブロッキング処理液(51)が水性溶液である場合、マイクロチャンバー(30)の内部に入り込む度合いの制御として、水と基板との接触角が挙げられる。接触角が小さいほどブロッキング処理液(51)の入り込む度合いが高くなる。例えば、接触角が100度では、ほぼ基板上面しかブロッキング処理されないが、接触角が80度以下ではブロッキング処理液(51)がマイクロチャンバー(30)の内部に入り込み始め、マイクロチャンバー(30)の内壁面(31)の一部がブロッキング処理される。マイクロチャンバー(30)の底面(32)にまでブロッキング処理液(51)が入り込まないようにするには、接触角としては20度以上80度以下が好ましく、30度以上70度以下がより好ましい。
(b-4)は、単純浸漬方式ともいい、図3(D)に示されるように、マイクロチャンバーチップ(20)を裏返し、基板(10)の上面(11)の全部にわたってブロッキング処理液(51)に浸す方式である。天板(60)を備える閉鎖系のマイクロチャンバーチップ(20)に適用する場合、天板(60)を配設する前に、天板(60)の一方の面または天板全部をブロッキング処理液(51)に浸せばよい。
[実施例1]
〈細胞懸濁液の調製〉
細胞懸濁液として、Jurkat細胞のPBS溶液(1×107cells/mL)を調製した。
ポリスチレン製の基板から所定の金型を用いて、マイクロチャンバーチップ(縦×横が25mm×70mm)を作製した。このマイクロチャンバーの開口部の直径は100μm、マイクロチャンバーの深さは50μmであり、マイクロチャンバーの形状は底面が平坦な逆円錐形であった。
まず、PDMSからなるシリコーンゴムの平滑な表面を、60分間のUVオゾン処理(メイワフォーシス(株)製の「PC440」)により親水性に改質後、BSAのAlexa Fluor(登録商標) 488コンジュゲート(インビトロジェン社製)を0.5重量%含有するPBSに1時間浸漬させることによってスタンプを作製した。
その後、マイクロチャンバーチップ表面をPBSで洗浄することによって、図6(B)の模式図にあるようにマイクロチャンバー(30)の内壁面(31)の途中までブロッキング剤(50)で被覆された細胞展開用マイクロチャンバーチップが得られた。
先ず、得られた細胞展開用マイクロチャンバーチップに天板を配設し、細胞展開用マイクロチャンバーチップの上面から天板の内面まで100μm離間させた。また、流路の幅が5mmとなるように側壁を設けた。その後、PBSを10mL、70%エタノールを1mL、さらにPBSを10mLの順に1mm/秒の流速で送液した。
顕微鏡の明視野にて観察し撮像した画像も図6(B)に示す。
実施例1の〈ブロッキング処理〉において、スタンプをマイクロチャンバーチップに押し付ける時間を20分間から10秒間に変更した以外は実施例1と同様にしてBSA由来の蛍光強度を測定した後、細胞展開を行い、顕微鏡の明視野にて観察し撮像した。これらの結果をそれぞれ図6(A)に示す。
スタンプ時間が10秒間の場合(比較例1;図6(A))、マイクロチャンバーの内壁面にも細胞が吸着し、底面にいる細胞と重なり観察しづらくなる場合があるのに対して、スタンプ時間が20分間の場合(実施例1;図6(B))、マイクロチャンバーの内壁面にもブロッキング処理が施されているため、細胞が底面に集積し、観察しやすくなることがわかる。
11・・・・ 上面
20・・・・ マイクロチャンバーチップ
30・・・・ マイクロチャンバー
31・・・・ マイクロチャンバー(30)の内壁面
32・・・・ マイクロチャンバー(30)の底面
41,42・・・細胞展開用マイクロチャンバーチップ
50・・・・ ブロッキング剤
51・・・・ ブロッキング処理液
60・・・・ 天板
70・・・・ スタンプ
71・・・・ 印肉
80・・・・ 流路
Claims (3)
- 一個以上の細胞を格納、保持することができるマイクロチャンバー(30)が基板(10)の上面(11)に形成されているマイクロチャンバーチップ(20)の上面(11)と該マイクロチャンバー(30)の内壁面(31)とが、細胞が該上面(11)に非特異的に吸着するのを抑制できるブロッキング剤(50)で被覆されている、細胞展開用マイクロチャンバーチップであって、
上記ブロッキング剤(50)が、カゼイン、スキムミルク、アルブミン、ポリエチレングリコールおよびリン脂質からなる群から選択される少なくとも一種を含み、
水と基板(10)との接触角が30度以上70度以下である、細胞展開用マイクロチャンバーチップ。 - 上記マイクロチャンバー(30)の開口部の直径が、20μm以上150μm以下であり、
上記マイクロチャンバー(30)の深さが、20μm以上100μm以下である、請求項1に記載の細胞展開用マイクロチャンバーチップ。 - 上記マイクロチャンバー(30)が有底である、請求項1または2に記載の細胞展開用マイクロチャンバーチップ。
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