EP2790834A1 - Système microfluidique 3d à zones emboîtées et réservoir intégré, son procédé de préparation et ses utilisations - Google Patents

Système microfluidique 3d à zones emboîtées et réservoir intégré, son procédé de préparation et ses utilisations

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EP2790834A1
EP2790834A1 EP12801607.8A EP12801607A EP2790834A1 EP 2790834 A1 EP2790834 A1 EP 2790834A1 EP 12801607 A EP12801607 A EP 12801607A EP 2790834 A1 EP2790834 A1 EP 2790834A1
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EP
European Patent Office
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porous
membrane
microfluidic system
interest
solution
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP12801607.8A
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German (de)
English (en)
Inventor
Thomas Berthelot
Hervé VOLLAND
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Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Original Assignee
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
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Publication date
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Priority claimed from FR1260083A external-priority patent/FR2997026A1/fr
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    • G01N2333/952—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from bacteria
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
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    • Y10T29/49—Method of mechanical manufacture
    • Y10T29/49826—Assembling or joining

Definitions

  • the present invention relates to the field of diagnostic devices and in particular the field of such devices based on microfluidic systems.
  • the present invention relates to a three-dimensional microfluidic system (or 3D) comprising hydrophilic zones, hydrophobic zones nested in each other and optionally an integrated reservoir and a method for preparing such a system.
  • Immunological sensors in the form of dipsticks are commonly used for the detection of many biological parameters but also to enable the detection of pathogens ("1D lateral-flow Systems”). They are based on the lateral movement of fluids to be analyzed through strips or strips of paper. These systems, although widely used, have limitations in their bioanalytical and fluidic capabilities. In this format where the sample migrates in one dimension, it is difficult to multiply the number of biological parameters detected. Indeed, the multiplication of lines or zones of detection decreases the spatial resolution and can lead to a bad analysis of the result. From 2008, new detection devices have appeared and have been designated “3D microfluidic devices” (for "3D microfluidic devices”).
  • the international application WO 2011/000047 [5] envisages the use of a paper-based 3D microfluidic system comprising a plurality of hydrophilic test zones, in which the sample to be tested and standard samples containing a known quantity of the analyte to be assayed are deposited on different test areas and then the colorimetric intensity of the test sample is compared to the standard colorimetric range obtained from the standard samples. Note that in microfluidic systems as described in
  • test areas are uniformly constituted by the same material.
  • each layer consists of the same base material locally having areas with physicochemical properties distinct from the (or) physicochemical treatment (s) undergone (s).
  • the technologies developed for producing these layers in the form of hydrophobic / hydrophilic matrices are derived from conventional lithographic techniques [1-2], "ink jet” techniques by printing hydrophobic molecules [3] or techniques wax printing by a laser printer [4].
  • the international application WO 2010/003188 proposes a process for preparing a microfluidic system from a hydrophilic substrate [6].
  • the method comprises the steps of (i) hydrophobing the surface of the substrate, (ii) depositing on the hydrophobed surface a mask having aperture areas for defining the periphery of the microfluidic channels, and (iii) applying, at the level of exposed surface via the opening areas, a treatment with irradiations so as to make the surface hydrophilic.
  • step (i) the surface is rendered hydrophobic by absorption or adsorption of a solution of a hydrophobic substance as defined on page 4, lines 29 to 33 in a volatile solvent.
  • the treatment with irradiations envisaged in particular is a plasma treatment or a corona treatment.
  • hydrophilic matrix tracks as prepared by the aforementioned methods are brought into contact with other chemicals such as resin, solvents, wax vapor, rinse solvent, and this, before their use in the microfluidic system. This contacting can lead to possible contamination of the fluidic channel by by-products and cause artifacts when using the microfluidic system.
  • the inventors have therefore set themselves the goal of developing a method of manufacturing a microfluidic device 3D (i) independent of the thickness of the porous matrix, (ii) reducing the number of manufacturing steps compared to the processes of the prior art thus ensuring a saving of time, (iii) at low cost, (iv) having a good lateral resolution and (v) being able to integrate into the minus two fluidic systems based on porous materials of different chemical nature.
  • the deposit of samples is either by immersion of a part of the device in the sample, or by depositing the sample on the device. In the latter case, the device is inserted into a cassette which allows the deposition of a larger or smaller sample volume.
  • plastic cassettes incorporating several have been developed. These cassettes use the distribution of the sample on the different strips and require a fractionation of the sample in as many aliquots as there are strips. Indeed, the previously described systems allow a capillary fractionation of the sample which can thus interact with different detection zones. This results in the analysis of small volumes for each parameter and therefore a decrease in the detection threshold or the need to use large sample volumes to overcome this fractionation.
  • the inventors have therefore set themselves the goal of developing a method of manufacturing a 3D microfluidic device having the advantages as previously listed and some embodiments of which also have a configuration allowing the analysis of several parameters without splitting. the sample in particular beyond a factor 2.
  • the present invention makes it possible to achieve the goal that the inventors have set themselves and to solve all or part of the technical problems of the prior art 3D microfluidic systems. More particularly, the system of the present invention and its method of preparation are based on the principle of marquetry. Indeed, the sandwich structure results from the stacking of layers in which the hydrophilic porous fibrous layer made locally hydrophobic is replaced by a mixed layer consisting of a hydrophobic support previously cut in the desired pattern, particularly by hand or by cutting with C0 2 laser printer, in which the porous hydrophilic material of interest is interlocked, the latter serving as a fluidic channel for the transfer of aqueous solutions and samples by capillary effect in the plane and / or in the thickness of the system final. It should be noted that the combination of a hydrophilic support with a porous hydrophobic material serving as a fluid channel is also conceivable in the context of the present invention.
  • the support portion and the fluidic channel type portion (s) may be prepared from different materials. There is no limitation as to the materials that can be used for these different parts, unlike the systems of the state of the art in which the initial layer must be in a single hydrophilic (or hydrophobic) material that can be rendered hydrophobic (or hydrophilic). following a given treatment.
  • microfluidic system according to the invention comprises several parts of fluidic channel type on the same layer, all or only some of these parts may be of a material, identical or different. Also, unlike systems of the prior art, the present invention allows to introduce, in the same stage, 2 to several types of porous matrix of different chemical nature, such as, for example, paper and glass fiber.
  • This latitude makes it possible not only to adapt the physicochemistry of the fluidic channels to the molecules to be analyzed, but also to envisage the preparation of 3D microfluidic systems according to the invention "à la carte". For example, it is possible to fit in a previously prepared support, one (or more) part (s) of fluidic channel type adapted (s) to one (or more) molecule (s) of interest, according to the wish of the user and at the moment when the user expresses it.
  • the present invention relates to a three-dimensional (or 3D) microfluidic system comprising a plurality of layers stacked one on top of the other, wherein at least one of said layers consists of a 1st and at least a 2 nd parts, distinct from each other, with the 2 nd part porous and wettable with a solution of interest fitting into a recess of the era nonporous portion and / or non-wettable by said solution of interest, said 2 nd portion serving as a fluid channel for transferring said solution of interest by capillarity effect in the plane and / or the thickness of said system.
  • the porous and wettable part 2 nd by a solution of interest is previously cut and is in a form adapted to its nesting in the recess of the 1st part.
  • the era part constitutes the support of the layer such as described above and (or) 2 nd (s) part (s) form (s) the fluid channel via the stack of layers that comprises the microfluidic system according to the invention.
  • the terms “ere aggr” and “support portion” are equivalent and used interchangeably.
  • the terms “2 nd part” and “fluidic channel-like portion” are equivalent and used interchangeably.
  • At least one layer of the 3D microfluidic system according to the invention may comprise a single 2 nd part porous and wettable with a solution of interest or at least two 2 ndes parts, at least three ndes two parts, at least four 2 nportions , porous and wettable by a solution of interest, of the same or different nature and of identical or different form, all of these 2 nthe parts nested in as many recesses as 2 nd parts, present in level of the support part of the layer.
  • the microfluidic system may comprise at least one layer of the constitutée ere adhere having at least one non-filled recess and at least one 2 nd part as defined above.
  • the microfluidic system may comprise (i) at least one layer of the constitutée ere adhere having an unmet recess and a 2 nd part as defined above, (ii) at least one layer of a constitutée ere the portion having an unmet recess and two 2 ndes parts as defined above and / or (iii) at least one layer of the constitutée ere aggr having an unmet recess and three parts ndes 2 as defined above .
  • the 3D microfluidic system according to the invention may comprise at least one layer (i) and at least one layer (ii), at least one layer (i) and at least one layer (iii) or at least one layer (ii). ) and at least one layer (iii).
  • the 3D microfluidic system according to the invention may comprise at least one layer (i), at least one layer (ii) and at least one layer (iii).
  • the stack of these layers constitutes a cannula and a reservoir integrated in the system.
  • the recesses of these different layers are in fluidic continuity with each other. vis-à-vis others.
  • all or a portion of the recesses are centered on a common axis.
  • all the recesses or some of the latter are centered on a common axis and have a cross section with respect to the plane of the same shape layer, the thickness being dependent on the thickness of the ere enamel wherein they been prepared.
  • a cavity defined by the recess of the portion of the st st layer and delimited by at least the next layer means, for each tank, a cavity defined by the recess of the portion of the st st layer and delimited by at least the next layer.
  • the cavity can be delimited by the following single layer: in this case, the reservoir is located at the layer of the upper end of the microfluidic system.
  • the cavity is delimited by both the next layer and the previous layer: in this case, the tank is said to be integrated in the system.
  • the next layer and / or the preceding layer has at least one recess possibly filled at the recess forming the reservoir, the two recesses being in fluid contact with each other.
  • the next layer comprises such a recess in which is nested a 2 nde part as previously defined.
  • the preceding layer comprises at least one recess that can be filled, partially filled or not filled by a 2 nde portion as defined above.
  • the next layer may also comprise at least one recess may be filled, partially filled or not filled by a 2 nd part as defined above, the recesses of the next and previous layers or portions thereof that can be centered on a common axis or on the contrary, not centered on a common axis.
  • the following layer may not comprise a recess in fluidic contact with the reservoir and, in this case, the preceding layer comprises at least two distinct recesses which may be, independently of one of the other, filled, partially filled or not filled by a 2 nd part as previously defined.
  • the solution of interest "descends" to the reservoir via a cannula or fluidic channel system and "rises” into the upper layers via a separate cannula or fluid channel system.
  • the tank used in a microfluidic system according to the invention is in fluid contact with at least one fluidic channel as defined above and, to this end, in the recess of the era portion corresponding to said reservoir, may be an element made of a hydrophilic and porous material (case of a solution of hydrophilic interest) or a hydrophobic and porous material (case of a solution of hydrophobic interest).
  • This element does not constitute a 2 nd part as defined above as it does not completely fill the recess in the l st part.
  • the l st and 2 nd (s) parts of at least one layer of the microfluidic system according to the invention are in particular defined in relation to their wettability or non-wettability vis-à-vis of a solution of interest.
  • the wettability is defined by the contact angle (or connection angle) that forms a drop of the solution of interest with the portion at the deposition site of this drop.
  • the 2 nd part (s) is (are) wettable with respect to the solution of interest
  • this generally means that drop of this solution deposited will form with respect to the deposition site generally a contact angle having a value less than 70 ° and in particular less than 60 ° while, for the era optionally part nonwettable, this means that the angle of contact formed between a drop of the solution and this part generally has a value greater than 90 ° and in particular greater than 95 °. From a practical point of view, this means that, when the solution of interest is deposited on the 2 nd part (s), it remains at this level without going into the 1st non-wettable part .
  • a liquid will wet the substrate that represents the part of the microfluidic system if it has a chemical affinity vis-à-vis it.
  • a hydrophilic (or hydrophobic) substrate will be wettable vis-à-vis the hydrophilic (or hydrophobic) liquids.
  • the definition of wettability as given above relates to the conventional definition of wettability with respect to a liquid on a flat surface.
  • the chemical nature and in particular the wettability of the surface of the (or 2 ) part (s) is involved in the transfer of the solution of interest which is done by capillarity but not only because the solution also passes through the open pores of the material of this (or these) 2 nde (s) part (s).
  • the 2 nd (s) part (s) can also be defined as permeable (s) to the solution of interest.
  • the (or 2 ) part (s) constitute (s) a porous system through which the solution of interest circulates, this circulation being faster than the hydrophilicity / hydrophobicity of the material. porous is compatible with the hydrophilicity / hydrophobicity of the solution of interest.
  • solution of interest is understood to mean any natural or synthetic hydrophilic or hydrophobic solution that one wishes to analyze and / or purify on a 3D microfluidic system according to the present invention. It should be emphasized that the implementation solution in the interest of the present invention should be neither a solvent of the era party nor a solvent of any of the two parts of emes 3D microfluidic system.
  • this solution of interest can be a biological fluid; a vegetable fluid such as sap, nectar and root exudate; a sample in a culture medium or in a biological culture reactor as a culture cellular higher eukaryotes, yeasts, fungi or algae; a liquid obtained from one (or more) animal (s) cell (s) or plant (s); a liquid obtained from an animal or plant tissue; a sample taken from a food matrix; a sample taken from a chemical reactor; town water, river, pond, lake, sea, air-cooled towers; a sample from a liquid industrial effluent; waste water, particularly from intensive livestock farms or chemical, pharmaceutical, cosmetic or nuclear industries; a pharmaceutical product; a cosmetic product; a perfume ; a soil sample or a mixture thereof.
  • a biological fluid such as sap, nectar and root exudate
  • a sample in a culture medium or in a biological culture reactor as a culture cellular higher eukaryotes, yeasts, fungi or algae
  • the biological fluid is preferably selected from the group consisting of blood such as whole blood or anti-coagulated whole blood, blood serum, blood plasma, lymph, saliva, sputum, tears, sweat, sperm, urine, stool, milk, cerebrospinal fluid, interstitial fluid, isolated bone marrow fluid, mucus or fluid from the respiratory tract, intestinal or genitourinary tract, cell extracts, extracts from tissues and organ extracts.
  • the biological fluid may be any fluid naturally secreted or excreted from a human or animal body or any fluid recovered from a human or animal body by any technique known to those skilled in the art such as extraction. , a sample or a wash. The steps of recovery and isolation of these different fluids from the human body or animal are performed prior to the implementation of the method according to the invention.
  • this implementation and in particular the detection method as defined below furthermore comprises a preliminary step of preparation of the solution of interest with possible dissolution of the sample by techniques known to those skilled in the art such as filtration, precipitation, dilution, distillation, mixing, concentration, lysis, etc.
  • the part (ie the support portion) of at least one layer, in particular one (or more) layer (s) and advantageously all of the system layers microfluidic according to the invention can be:
  • the (or) 2 nd (s) part (s) being, in the case of a solution of hydrophilic interest, absorbent (s) and porous (s).
  • the support portion of at least one layer, in particular one (or more) layer (s) and advantageously all the layers of the microfluidic system according to the invention is chosen in the group consisting of a porous and hydrophobic polymeric film; a hydrophobic porous membrane, gel or resin; a non-porous hydrophilic or hydrophobic polymeric film and a non-porous hydrophilic or hydrophobic membrane or resin.
  • the support portion of at least one layer, in particular one (or more) layer (s) and preferably all layers of the microfluidic system according to the invention is selected from the group consisting of a porous or non-porous film of polyethylene terephthalate (PET); a porous or non-porous membrane of polyethylene (PE); a porous or non-porous polypropylene (PP) membrane; a porous or non-porous film, or a porous or non-porous, fluorine-containing membrane such as a porous or non-porous film, or a porous or non-porous membrane of hydrophobic polyvinylidene fluoride (PVDF); a porous or non-porous membrane of polytetrafluoroethylene (PTFE); a porous or non-porous copolymer film comprising vinylidene fluoride and te
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • hydrophobic group is preferably meant, in the context of the present invention, a fluorinated group; an aryl group optionally substituted with one or more fluorine atoms and in particular a phenyl group optionally substituted with one or more fluorine atoms; and an alkyl group optionally substituted with one (or more) fluorine atom (s).
  • hydrophilic (s) and porous (s) is (are) advantageously selected (s) from the group consisting of a material Hydrophilic fibrous, tissue, hydrophilic film porous, a hydrophilic gel or a porous membrane bearing or functionalized with hydrophilic groups.
  • hydrophilic group is meant in the context of the present invention, a group selected from a hydroxyl group, a carbonyl group, a trialkoxysilane group, an anionic group, a cationic group, a tertiary amine group, an epoxy group, an ester group, an amide group, an anhydride acid group, a phosphonic acid group, a sulfonic acid group, an ammonium group and any conjugate bases thereof.
  • the (or) 2 nd (s) part (s) hydrophilic (s) and porous (s) is (are) advantageously selected (s) in the group consisting of paper including cellulosic nature; cotton paper; agarose; gelatin; cellulose; methylcellulose; carboxymethylcellulose; nitrocellulose; cellulose acetate ester; an alginate; a polyolefin; a porous membrane and, in particular a porous ion exchange membrane, functionalized, advantageously by radiografting, with hydrophilic groups such as a NAFION membrane; a membrane-type Sephadex resin or a PVDF membrane; a fiberglass fabric; a polyacrylamide gel; a sepharose gel or a mixture thereof.
  • hydrophilic groups such as a NAFION membrane; a membrane-type Sephadex resin or a PVDF membrane; a fiberglass fabric; a polyacrylamide gel; a sepharose gel or a mixture thereof.
  • the support part of at least one layer, in particular of one (or more) layer (s) and advantageously of all the layers of the microfluidic system according to the invention can be :
  • the support portion of one (or more) layer (s) and advantageously all the layers of the microfluidic system according to the invention is chosen from the group consisting of a polymer film porous and hydrophilic; a membrane, a gel or a porous hydrophilic resin; a non-porous hydrophilic or hydrophobic polymeric film and a non-porous hydrophilic or hydrophobic membrane or resin.
  • the support portion of at least one layer, in particular one (or more) layer (s) and preferably all layers of the microfluidic system according to the invention are selected from the group consisting of paper; cotton paper; agarose; gelatin; cellulose; methylcellulose; carboxymethylcellulose; nitrocellulose; cellulose acetate ester; an alginate; a polyolefin; a membrane and, in particular an ion exchange membrane, functionalized, advantageously by radiografting, with hydrophilic groups such as a NAFION membrane; a membrane-type Sephadex resin or a PVDF membrane; a fiberglass fabric; a non-porous film of polyethylene terephthalate (PET); a non-porous polyethylene (PE) membrane; a non-porous polypropylene (PP) membrane; a non-porous film of polyimide such as Kapton ®; a polyacrylamide gel;
  • hydrophobic (or) 2 nd (s) part (s) hydrophobic (s) and porous (s) is (are) chosen ( s) in the group consisting of a hydrophobic fibrous material, a hydrophobic fabric, a porous hydrophobic film, a gel or a porous membrane bearing or functionalized with hydrophobic groups.
  • a hydrophobic solution of interest for a hydrophobic solution of interest, (or) 2 nd (s) part (s) hydrophobic (s) and porous (s) is (are) advantageously selected (s) in the group consisting of paper made hydrophobic by treatment, a porous film of polyethylene terephthalate (PET); a porous polyethylene (PE) membrane; a porous polypropylene (PP) membrane; a porous film or a porous membrane containing fluorine such as a porous film or a porous membrane of hydrophobic polyvinylidene fluoride (PVDF); a porous polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane; a porous copolymer film comprising vinylidene fluoride and tetrafluoroethylene; a porous copolymer film comprising vinylidene fluoride and hexafluoropropylene; a polyacrylamide gel; a porous polymethyl meth
  • That ere the part of a layer 3D of the microfluidic system according to the invention is hydrophobic or hydrophilic, it may present on at least one adhesive face in direct contact with another layer of the system.
  • Such an adhesive face may consist of a PET transparency adhesive on both sides, glued on a 1st part of a layer.
  • This variant makes it possible to join two layers of the system together and / or to guarantee the seal between these two layers.
  • the (or) 2 "e (s) part (s) of a layer 3D microfluidic system according to the invention is (are) t hydrophobic (s) or hydrophilic (s), it (s) bit (Fri.
  • the 3D microfluidic system according to the invention may be used in methods for detecting and / or purification.
  • at least one reactant or compound is incorporated in the porous material of at least one 2 nd part implemented in the context of the present invention.
  • the material of this 2 nd portion comprises at least one reagent or compound
  • these can be either distributed throughout the volume of the material or located in a specific area of the material.
  • the reagents or compounds may be on the surface of the pores or channels of the material.
  • the reagents or compounds can be adsorbed on the surface of the pores or channels of this material and / or bound to this surface by non-covalent bonds (hydrogen bonds or ionic bonds) and / or by covalent bonds.
  • the reagent or the compound can be led to lower layers by the flow of the solution of interest, once the latter is placed on the system microfluidics.
  • the reagent or the compound remains in this material even in the presence of the solution of interest and the detection and / or trapping take place in this same layer. It is the same in the case of a reagent or a compound not covalently bound but too voluminous with respect to the pores and channels of the fluidic channel portion of the subsequent lower layer.
  • the reactive compound or the material of the 2nd part various methods known to those skilled in the art whether or not using spacer arms. are usable.
  • the experimental part hereinafter describes a process using cleavable aryl diazonium salts and based on the process described in International Application WO 2008/078052 [7] and a method using aryl azide salts for fixing reagents or compounds on a material of the 2 nd part.
  • the 3D microfluidic system according to the invention may comprise at least 2 layers, at least 3 layers, at least 4 layers, at least 5 layers, at least 10 layers, or even at least 50 layers, all or part of these layers. may have a lre and at least a 2 nde parts as previously defined.
  • the nomenclature “upper layers” and “lower layers” is assessed relative to the support on which the microfluidic system according to the invention is optionally placed.
  • the layer of the lower end corresponds to the layer in direct contact with this support, the layer of the upper end corresponding to the furthest layer vis-à-vis the support.
  • each layer may have an identical thickness or different from each other.
  • the thickness of each layer is between 0.1 ⁇ and 20 mm, in particular between 0.5 ⁇ and 5 mm, typically between 1 ⁇ and 1 mm, in particular between 2 ⁇ and 400 ⁇ and, more particularly, between 5 ⁇ and 200 ⁇ thus making it possible to obtain a 3D microfluidic system having a thickness of between 2 ⁇ and 100 mm, typically between 5 ⁇ and 50 mm, in particular between 10 ⁇ and 25 mm and, in particular, between 40 ⁇ and 10 ⁇ . mm.
  • the thickness of the (or) 2 nd (s) part (s) should be adjusted according to the thickness of the l st part.
  • the l st part and (or) 2 nd (s) part (s) have substantially identical thicknesses.
  • all the layers included in the 3D microfluidic system according to the invention exhibit the st part and at least one 2 nd part as defined above.
  • one or more of these layers may comprise at least one recess in the ere adhere, unmet.
  • some of the layers included in the 3D microfluidic system according to the invention have a support part with one (or more) recess (s) without, in the latter, a 2 nd portion of fluidic channel type such as previously defined is nested.
  • at least one layer of the stack of layers constituting the microfluidic system according to the invention consists solely of a non-porous support and / or non-wettable by a solution of interest and hollowed out at the level of one (or more) defined area (s). It is clear that this (or these) recess (s) are part of the (or) channel (channels) fluidic (s) that includes the microfluidic system.
  • this layer could then be considered as a switch or a fluidic selection or distribution system. Indeed, as long as the 2 ndivided parts of the layers, separated by the layer without 2 nde part, are not in contact, there is discontinuity in the fluidic system and the liquid can not pass, as explained in paragraph 84 of [1]. On the other hand, if a mechanical action of pressure or crushing on this zone is carried out as described in paragraph 83 of [1], the two stages are then brought into contact and the fluidics system is then connected and the solution of interest can pass.
  • a layer having a support portion with one (or more) recess (s) without, in the latter, a 2 nd portion of fluidic channel type as defined above is nested is advantageously present in the stack of layers that constitutes the 3D microfluidic system according to the present invention, among the upper and lower layers of this stack. More particularly, such a layer is the l st layer of this stack (ie the layer on which the solution of interest is deposited) and / or the final layer of said stack.
  • the (or) recess (s) which the l st layer (or layer of the upper end) serve (s) solution of interest tank and the last layer (or layer the lower end) can be used to maintain the layer just above it and in particular the (or) 2 nde ⁇ s) part (s) that includes it.
  • the reservoir is located at the top of the device (ie at the l st layer), whereas in the previously proposed variant implementing one or more layers having the era part, at least a 2 nde part as defined above and at least one unfinished recess at said 1st part, the reservoir is preferably at lower layers ie is integrated in the structure of the system.
  • layers with particular properties in terms of the number of 2 n parts or in terms of thickness, porosity and / or functionalization of the material constituting these 2 nd parts makes it possible to give the layers a particular function. Some of these layers may have a function in the distribution and division of the solution of interest, in the analysis, in the detection and / or in the purification.
  • the 3D microfluidic system according to the invention may in particular have at least one layer of which at least a 2 nde part as defined above and in particular whose 2 nde part as previously defined plays the role of biological bin.
  • the latter makes it possible to recover all or part of the solution of interest once the detection, quantification and / or purification of a given analyte has been carried out.
  • the shape of the recesses made in the era of part of the inventive system layers and hence that of the (or) 2 nd ⁇ s) part (s) optionally filling are very varied.
  • the 3D microfluidic system according to the invention can in particular have at least one layer which at least one 2 nd part as defined above and in particular with the 2 nd part as defined above has the shape spiral or double spiral.
  • the thickness of at least one layer and / or the porosity of at least a 2 nd portion of at least one layer of the 3D microfluidic system may be advantageous to control the thickness of at least one layer and / or the porosity of at least a 2 nd portion of at least one layer of the 3D microfluidic system according to the present invention.
  • Those skilled in the art know various techniques for controlling the porosity of a hydrophilic or hydrophobic porous material as previously described. This control is notably implemented at the time of preparation of the hydrophilic and porous material (or of the hydrophobic and porous material). It may depend on the conditions in particular weaving conditions in the context of a woven material and / or reagents used during this preparation and in particular the addition of blowing agents in the reaction medium.
  • a solution of interest in the form of a complex medium comprising molecules, such as proteins, peptides and modified sugars. or not, organic molecules entering the different signaling or metabolic pathways etc., in solution, cells but also cell debris membrane debris type.
  • the 3D microfluidic system according to the invention can, for example, be used to detect the presence of a particular protein in this complex mixture.
  • the complex can be deposited on the medium 2 nd portion of the first layer which has a thickness and a controlled porosity (less than the size of the cells and cellular debris) to purify the sample and get the output of this part 2 does, only the medium containing molecules, such as proteins, peptides, sugars, modified or unmodified, organic molecules falling within the various signaling pathways or metabolic etc., cells and cellular debris being trapped in the material constituting this part.
  • a controlled porosity less than the size of the cells and cellular debris
  • Another example is the deposition of a solution of interest containing previously lysed cells. Depositing the solution on the 2 nd portion of the first layer which has a thickness and a controlled porosity to purify the sample bearing trapped in the paper membrane debris and organelles and will leave just pass the internal contents to cells such as proteins, DNAs or different metabolites.
  • the same 3D microfluidic system it is possible for the same 3D microfluidic system to have parts made of porous materials that can be wetted by a different solution of interest, which make it possible to fix molecules or organic materials of different types on the same system.
  • the latter has, between at least two consecutive layers, an element capable of joining these two layers together and / or to guarantee the seal between these two layers.
  • an element capable of joining these two layers together and / or to guarantee the seal between these two layers.
  • such an element is present between all the layers that presents the microfluidic system according to the present invention.
  • This element may be in the form of a double-sided Scotch ® , stretch film of the Saran microwave stretch film type or a derivative of a supported adhesion primer.
  • the latter has at least one recess and in particular one (or more) recess (s) to ensure the continuity of the fluid channel between the two layers it is secured.
  • one (or more) of these recesses is (are) filled (s) by a porous and wettable material with a solution of interest, identical to or different from the material of one of the 2 nd (s) part (s) layers that it solidarises together.
  • this (or these) recess (s) is (are) left (s) in the state.
  • a supported adhesion primer bridges these two surfaces by means of covalent bonds.
  • adhesion primer supported is present on all or part of the era portion of at least one of the two layers. It is advantageously a supported cleavable aryl salt and, in particular, a supported cleavable aryl diazonium salt of formula (I) below:
  • n 0 or 1
  • - R represents an aryl group.
  • the present invention also relates to a device comprising a microfluidic system as defined above.
  • a device may be in the form of a plate, a box or a plastic or ceramic housing in which () the 3D microfluidic system according to the invention is placed.
  • the 3D microfluidic system or the device according to the invention can be embedded in a suitable packaging including instructions for use but also in a more complicated system where the consumable can be, for example, the 3D microfluidic system or the device according to the invention.
  • the present invention also relates to a method of manufacturing a 3D microfluidic system as defined above, said method comprising the steps of:
  • step (ai) cutting, in a layer of a porous material and wettable by said solution of interest in particular as defined above, at least one form consistent with the recess prepared in step (ai);
  • Step (I) of the process is to prepare the era part of a layer of 3D microfluidic system.
  • This recess can be obtained by any cutting technique known to those skilled in the art.
  • the latter is chosen from a selective chemical etching cut, a physical cut of the reactive ion etching (RIE) type, a manual cut such as embossing and a laser cut such as a pulsed laser including a YAG type source (acronym for "Yttrium Aluminum Garnet" or yttrium garnet aluminum) or a continuous laser including a source laser C0 2 .
  • RIE reactive ion etching
  • step (a1) at least one other recess can be prepared in the layer of a non-porous and / or non-wettable material by a solution of interest. This recess can be subsequently filled during the implementation of steps (bi) and (ci) or, conversely, remained in the uncapped state.
  • the recess (or recesses) prepared may have various forms. As conceivable forms, there may be mentioned a recess whose section relative to the plane of the layer is circular, oval, square, rectangular, triangular, star-shaped, cross, rod, spiral or double spiral . On the same layer, two recesses may have the same or different shape. Similarly, two materials filling two recesses each belonging to two successive layers and fluid continuity of each other may have a section relative to the plane of the layer of identical or different shape.
  • a recess whose cross-section relative to the plane of the layer is in a spiral or double spiral may have some advantage in terms of a layer which at least one 2 nd part is implementation in detection and / or purification methods. Indeed, such a configuration makes it possible to carry out several detection zones (ie zones comprising at least one reagent or compound, capable of detecting and / or trapping a constituent or an analyte present in a solution of interest). Thus, several constituents or analytes can be identified from the same sample of solution of interest without requiring fractionation of said sample.
  • Step (bi) of the method according to the present invention consists in preparing at least a 2 nd portion of a layer of the 3D microfluidic system according to the present invention.
  • shape in conformity with the recess is meant not only a shape fitting perfectly into the recess prepared in step (a1) but also a shape whose thickness is substantially equal to the thickness of the layer implemented in step (ai).
  • the cutout implemented in step (b 2 ) is also chosen from a cutout by selective chemical etching, a physical cut reactive ion etching type, manual cutting and laser cutting as previously defined.
  • 3D microfluidic system includes layers with the era part and at least one 2 nd part as defined above.
  • the layer obtained following the nesting step (ci) can be defined as a 2D microfluidic system as integrated in the plane of the support system.
  • step (ci) and the assembly of step (ei) can be carried out manually or in an automated manner.
  • the layers to be assembled may comprise not only one (or more) layer (s) as (s) prepared (s) by implementing steps (ai), (bi) and ( ci) but also one (or more) layer (s) prepared (s) by the sole implementation of step (ai) (ie one (or more) layer (s) constituted (s) of a material not porous and / or non-wettable for a liquid of interest and having one (or more) obviously left in the state) and / or one (or more) layer (s) of such adhesive ( s) than previously defined.
  • the method of preparation comprises the steps of:
  • ai preparing, in a layer of a non-porous material and / or non-wettable by a solution of interest especially as defined above and whose surface has a supported adhesion primer and in particular the cleavable aryl salt supported , a recess; bi) cutting, in a layer of a porous material and wettable by said solution of interest in particular as defined above, at least one form consistent with the recess prepared in step (a ⁇ );
  • step (ai ') the functionalization of the surface of the material by a supported adhesion primer can be done before or after the recess of the material.
  • Steps (bi), (ci) and (di) are as previously defined. Similarly, the implementation forms previously envisaged for step (ai) apply mutatis mutandis to step (ai ').
  • non-electrochemical conditions that can be used during step (ei ') are as defined in [8]. Note however that it is desirable that these conditions do not implement solutions likely to act on the materials constituting the layers of the microfluidic system.
  • the non-electrochemical conditions that can be used during step (ei ') are non-electrochemical photochemical conditions and consist in subjecting the supported adhesion primer and in particular the cleavable salt supported to irradiation (or insolation) in the UV or visible domain.
  • the wavelength used in step (ei ') of the process will be chosen without any inventive effort, depending on the adhesion primer and in particular the cleavable aryl salt used. Any wavelength belonging to the UV domain or to the visible range can be used in the context of the present invention.
  • the wavelength applied is between 300 and 700 nm, in particular between 350 and 600 nm and, in particular, between 380 and 550 nm.
  • the microfluidic system offers a great diversity in conceivable configurations.
  • the solution of interest is deposited on the layer of the era system and is recovered at a lower layer including at the last layer.
  • the detection can also be implemented at a lower layer and in particular at the level of the last layer.
  • the solution of interest may be in contact or pass through several layers multiple times, the era times to go to the tank in an inner layer system (meaning down), a 2 nd time to travel from the reservoir to the analysis or detection layer, the latter advantageously being the l st layer system (upward direction), and a 3rd and final time to move the layer analysis up to a lower layer and in particular the last layer which plays a role "trash” but which also has a role in the capillarity.
  • the present invention also relates to the use of a 3D microfluidic system as defined above or capable of being prepared by a manufacturing method as defined above to detect and possibly quantify at least one analyte that may be present in a solution of interest or in a gaseous fluid of interest.
  • gaseous fluid of interest is advantageously meant an air sample or a sample from a gaseous industrial effluent.
  • the present invention relates to a method for detecting and possibly quantifying at least one analyte that may be present in a solution of interest or in a gaseous fluid of interest, comprising the steps of:
  • step (a 2 ) depositing, on said 3D microfluidic system possibly prepared in step (a 2 ), said solution of interest or bringing into contact said gaseous fluid of interest with said 3D microfluidic system optionally prepared in step (a 2) );
  • the analyte to be detected and possibly quantified is present in the solution of interest or the gaseous fluid such as previously defined can be chosen from the group consisting of a molecule of biological interest; a molecule of pharmacological interest; a toxin; a carbohydrate; a peptide; a protein; a glycoprotein; an enzyme; an enzymatic substrate; a nuclear or membrane receptor; an agonist or antagonist of a nuclear or membrane receptor; a hormone; a polyclonal or monoclonal antibody; an antibody fragment such as an Fab, F (ab ') 2 , Fv fragment or a hypervariable domain or CDR for "Complementarity Determining Region"; a nucleotide molecule; a pollutant, advantageously organic, water; a pollutant, advantageously organic, of the air; a bacterium and a virus.
  • nucleotide molecule used herein is equivalent to the following terms and expressions: "nucleic acid”, “polynucleotide”, “nucleotide sequence”, “polynucleotide sequence”.
  • nucleotide molecule is meant, in the context of the present invention, a chromosome; a gene ; a regulatory polynucleotide; DNA, single-stranded or double-stranded, genomic, chromosomal, chloroplast, plasmidic, mitochondrial, recombinant or complementary; total RNA; messenger RNA; a ribosomal RNA (or ribozyme); a transfer RNA; a sequence serving as an aptamer; a portion or a fragment thereof.
  • the reagent used to functionalize the microfluidic system used in the context of the present invention is any molecule capable of forming with the analyte to detect a binding pair, the reagent and the analyte corresponding to the two partners of this binding pair.
  • the bonds used in the analyte-reagent link are either non-covalent and low energy bonds such as hydrogen bonds or Van der Waals bonds, or high energy bonds of the covalent bond type.
  • the reagent used is therefore dependent on the analyte to be detected. Depending on this analyte, the skilled person will know, without inventive effort, choose the most suitable reagent. It may be selected from the group consisting of a probe molecule; a carbohydrate; a peptide; a protein; a glycoprotein; an enzyme; an enzymatic substrate; a membrane or nuclear receptor; an agonist or antagonist of a membrane or nuclear receptor; a toxin; a polyclonal or monoclonal antibody; an antibody fragment such as a Fab fragment, F (ab ') 2 , Fv or a hypervariable domain (or CDR for "Complementarity Determining Region"); a nucleotide molecule as defined above; a peptide nucleic acid and an aptamer such as DNA aptamer or RNA aptamer.
  • probe molecule is meant, in the context of the present invention, a molecule specific for one (or more) analyte (s) for which contacting with at least one of these analytes results in at least one modification of the spectral properties of this probe molecule.
  • the probe molecule used in the context of the present invention is a molecule which has fluorogenic or chromogenic properties, that is to say that it becomes fluorescent or stains when it interacts with at least one specific analyte .
  • the interaction of the probe molecule with at least one specific analyte produces a detectable optical signal.
  • the interaction may consist in the creation of irreversible and selective binding, in particular of the covalent bonding type between the probe molecule and at least one specific analyte.
  • probe molecules that can be used in the context of the present invention and are known for detecting specific analytes such as an adhéhyde, formaldehyde, acetaldehyde, naphthalene, a primary amine, especially an aromatic amine, indole , skatole, tryptophan, urobilinogen, pyrrole, benzene, toluene, xylene, styrene or napthalene.
  • specific analytes such as an adhéhyde, formaldehyde, acetaldehyde, naphthalene, a primary amine, especially an aromatic amine, indole , skatole, tryptophan, urobilinogen, pyrrole, benzene, toluene, xylene, styrene or napthalene.
  • Such probe molecules are chosen in particular from the enaminomes and the corresponding ⁇ -diketone / amine pairs, the imines and the hydrazines, the 4-aminopent-3-en-2-one, the croconic acid and the probe molecules.
  • aldehyde function are p-dimethylaminobenzaldehyde, p-dimethylaminocinnamaldehyde, p-methoxybenzaldehyde and 4-methoxy-1-naphthaldehyde, mixtures and salts derived from these compounds.
  • a 3D microfluidic system capable of being prepared by a manufacturing method according to the present invention for detecting and possibly quantifying at least one analyte as defined above, thus finds applications in the field of biochemistry, microbiology, in the field of medical diagnosis, in the field of nuclear field, in the field of quality control, in the field of agro-food, in the field of the detection of illicit substances, in the field of defense and / or biodefense; in the field of veterinary, environmental and / or sanitary control and / or in the field of perfumery, cosmetics and / or aromas.
  • Step (a 2 ) when it is to be implemented, consists in preparing a 3D microfluidic system capable of detecting at least one given analyte, ie a 3D microfluidic system comprising at least one reagent capable of recognizing said analyte in a specific manner. .
  • depositing the solution of interest consists in depositing one (or more) drop (s) of said solution of interest at one (or more) ) channel (channels) fluidic (s) present (s) on the surface of the system muicrofluidic 3D.
  • the volume of solution of interest deposited on each fluidic channel is between 1 ⁇ and 10 ml, especially between 20 ⁇ and 5 ml, in particular between 400 ⁇ and 2 ml.
  • Step (c 2 ) of the method according to the present invention consists in detecting and possibly quantifying the signal emitted by
  • step (a 2 ) the binding pair formed between said analyte and the reagent present in the 3D microfluidic system possibly prepared in step (a 2 ),
  • a secondary reagent capable of recognizing the analyte or the binding pair formed between said analyte and the reagent.
  • the secondary reagent may be selected from the group consisting of a carbohydrate; a peptide; a protein; a glycoprotein; an enzyme; an enzymatic substrate; a membrane or nuclear receptor; an agonist or antagonist of a membrane or nuclear receptor; a toxin; a polyclonal or monoclonal antibody; an antibody fragment such as a Fab fragment, F (ab ') 2 , Fv or a hypervariable domain (or CDR for "Complementarity Determining Region"); a nucleotide molecule such as previously defined; a peptide nucleic acid and an aptamer such as DNA aptamer or RNA aptamer.
  • the analyte and / or the secondary reagent has at least one easily detectable group, ie a group which emits a measurable signal (enzymatic, fluorescent, chromogenic, radioactive, etc.) or which allows the formation of a measurable signal.
  • the easily detectable moiety may be an enzyme or a molecule capable of generating a detectable signal and optionally quantifiable under special conditions as when the power in the presence of a suitable substrate.
  • an enzyme or a molecule capable of generating a detectable signal and optionally quantifiable under special conditions as when the power in the presence of a suitable substrate.
  • biotin digoxygenine, 5-bromodeoxyuridine, alkaline phosphatase, peroxidase, glucose amylase and lysozyme.
  • the easily detectable moiety may be a fluorescent label, chimiofluorescent or bioluminescent such as cyanine and derivatives thereof, fluorescein and its derivatives, rhodamine and its derivatives, GFP (for " Green Fluorescent Protein ”) and its derivatives, coumarin and its derivatives and umbelliferone; luminol; luciferase and luciferin.
  • the latter may be a marker or radioactive isotope or an organic group containing at least one marker or radioactive isotope.
  • a marker or radioactive isotope is especially iodine-123, iodine-125, iodine-126, iodine-133, iodine-131, iodine-124, indium-111, indium-113m, bromine-77, bromine-76, gallium-67, gallium-68, ruthenium-95, ruthenium-97, technetium-99m, fluorine-19, fluorine-18 , carbon-13, nitrogen-15, oxygen-17, oxygen-15, oxygen-14, scandium-47, tellurium-122m, thulium-165, yttrium-199 , copper-64, copper-62, carbon-11, Pazote-13, gadolidium-68 and rubidium-82.
  • the latter may be a paramagnetic or ferromagnetic marker such as the N-oxide 2,2,6,6-tetramethylpiperidine (TEMPO) or capable of chelating paramagnetic ion complex or ferromagnetic such as Gd 3+ , Cu 2+ , Fe 3+ , Fe 2+ and Mn 2+ .
  • TEMPO N-oxide 2,2,6,6-tetramethylpiperidine
  • the latter may be a gold particle or a dense compound such as a nanoparticle and in particular, by way of example, a (nano) ferric oxide particle or gold.
  • the detection during step (c 2 ) according to the invention can be carried out in particular by colorimetric, (chemo) fluorescence, bioluminescence, radioactive, ferromagnetic, paramagnetic and / or electrical measurements.
  • this detection is carried out by measuring the variation of absorbance, (chemo) fluorescence, (bio) luminescence, radioactivity, ferromagnetism or paramagnetism of the 3D microfluidic system according to the present invention or at least one of the spots. it presents when this system is brought into contact with a solution of interest containing the analyte (s) as (s) previously defined (s).
  • the detection is carried out by optical measurement, the wavelength for which the absorbance, (chemo) fluorescence or (bio) luminescence of the reagent such as a probe molecule is preferably chosen is or the product formed by the interaction or reaction between the reagent and the detected analyte is the highest.
  • this detection is carried out by measuring the variation of the electrical signal emitted by the 3D microfluidic system according to the present invention or at least one of the spots that it presents when this system is brought into contact with a solution of interest containing the analyte (s) as previously defined.
  • the electrical and possibly optical, colorimetric detection of (chemo) fluorescence, bioluminescence, radioactive, ferromagnetic or paramagnetic may require that the 3D microfluidic system according to the present invention be deposited on a detection system including electrical tracks, in particular copper or copper. or or that the detection stage of the 3D microfluidic system according to the present invention comprises electrical tracks including copper or gold, protected from oxidation, in particular by the deposition of parylene.
  • These electrical connectors can be used for electrical detections or to integrate more complex systems such as diodes to stimulate fluorescence or phosphorescence of the reagent such as a probe molecule, or the product formed by the interaction or the reaction between the reagent and the analyte detected at the detection site.
  • the latter can be compared to the measurement obtained from calibrated solutions of known analytes to directly give information on the quantity and / or the nature of the analyte (s). content (s) in the solution of interest.
  • the exposure of the 3D microfluidic system according to the present invention to a liquid solution can give rise to a visual, photographic or scanner observation.
  • a comparison of the intensity of the staining developed with those previously established during a calibration for a predefined range of concentrations allows to roughly deduce the concentration of the analyte.
  • a measurement of the absorption variation at a point or wide spectral range as a function of the contact time is required to determine a rate of formation of the colored complex. The value of this speed will be compared to those obtained for a standard range under the same conditions.
  • solutions other than the solution of interest or that the gaseous fluid may have to be deposited on the 3D microfluidic system according to the present invention. Indeed, washing solutions to eliminate any non-specific binding involving the reagent, a solution containing the secondary reagent or solutions containing an ada pte substrate to an enzyme carried by the analyte or the secondary reagent may have to be deposited on the system. 3D microfluidic according to the invention.
  • the present invention finally relates to the use of a 3D microfluidic system as defined above or capable of being prepared by a manufacturing method as defined above for purifying an analyte present in a solution of interest or in a gaseous fluid. 'interest.
  • the present invention relates to a method for purifying at least one analyte present in a solution of interest or a gaseous fluid of interest, comprising the steps of:
  • step (a 3 ) depositing, on said 3D microfluidic system optionally prepared in step (a 3 ), said solution of interest or bringing into contact said gaseous fluid of interest with said 3D microfluidic system optionally prepared in step (a 3 );
  • step (a 2 ), step (b 2 ), the analyte to be detected and possibly quantified and to the solution of interest also applies mutatis mutandis to step (a 3 ), step (b 3 ), the analyte to be purified and the solution of interest in the purification process according to the present invention.
  • the purification process according to the invention may require the use of a microfluidic system comprising at least one reagent capable of recognizing the analyte at purify in a specific way.
  • the purification in step (c 3 ) is carried out by recovering the analyte from the binding pair formed by the latter and the reagent.
  • step (a 3 ) when it is to be implemented, consists of preparing a 3D microfluidic system of which one (or more) layer (s) comprises (include) one (or more) suitable compound (s). (s) trapping one (or more) of the components of the solution of interest, other than the analyte to be purified.
  • step (c 3 ) of the method consists in recovering the analyte at the level of at least one lower layer of the 3D microfluidic system.
  • porous polymer membranes having anion or cation exchange groups can be used to carry out a purification by chromatography-exchange chromatography. ions. It is also possible to use porous polymeric membranes or other porous materials previously modified by specific organic or biological molecules in order to perform affinity chromatography.
  • Figure 1 is a diagram of different support parts, usable in a 3D microfluidic system according to the invention.
  • Figure 2 is a schematic diagram of different parts of the fluidic channel type, usable in a 3D microfluidic system according to the invention.
  • Figure 3 is a diagram of a microfluidic system according to the invention with the various layers constituting it, the drop symbolizing the solution of interest to be analyzed or purified and the arrow the direction of migration of the sample.
  • Figure 4 shows a housing in which the 3D microfluidic system according to the invention can be inserted.
  • Figure 5 shows results obtainable for different solutions of interest ( Figures 5B, 5C, 5D, 5E and 5F) using a microfluidic system according to the invention as described in Figure 5A.
  • Figure 6 shows the various stages ( Figure 6A, 6B and 6C) with the 2 nd portion fitted into the bracket 1, before assembly of a 3D microfluidic system 3 stages (or layers).
  • Figure 7 shows the different stages ( Figures 7A, 7B, 7C, 7D and
  • Figure 8 shows a global system after assembly with Figure 8A showing the top of the system at which is introduced the solution of interest to be analyzed and Figure 8B the reading stage of the results.
  • Figure 9 is a schematization of a microfluidic system according to the invention used for the detection of botulinum toxin A (Figure 9A) and the detection layer of this system ( Figure 9B).
  • Figure 10 shows the results obtained with a solution of interest containing ( Figure 10B) or not ( Figure 10A) botulinum toxin A.
  • Figure 11 is a layer-by-layer representation of porous hydrophobic material elements and elements of porous hydrophilic material, alone or together, constituting a 3D microfluidic system with integrated reservoir and double spiral.
  • Figure 12 is a representation of the integrated, dual-spiral, 3D microfluidic system obtained from the elements shown in Figure 11.
  • Figure 13 is a schematic of the migration of the sample into the empty cannula and porous hydrophilic channels of the microfluidic system of Figure 12.
  • Figure 14 is a top view of the microfluidic system with integrated reservoir and double spiral (layer (1)), once a sample of interest introduced into the latter.
  • the 3D microfluidic system according to the present invention described below is a system suitable for hydrophilic solutions of interest.
  • FIG. 1 shows the "negatives" (1, 3, 5, 7 and 9) made in a PET type polymer sheet with one or two recesses (s) per negative, of identical or different shapes, obtained after manual cutting type stamping or by C0 2 laser printer.
  • Figure 2 shows the "positives” (10, 11 and 12) made in a sheet of paper or fiberglass, obtained after manual cutting type drawing or C0 2 laser printer. These 3 types of “positives” form the fluidic channel parts that fit into the recesses of the "negatives" prepared in 1.1.
  • the assembly of the device is done by:
  • Steps 2 and 3 can be repeated as many times as necessary.
  • a 3D microfluidic system that can be obtained from
  • the layers (1) and (9) of this system do not constitute layers with a lere and at least a 2 nde parts as defined in the present invention. Indeed, the recesses of the support part are left as is, without a "positive” is nested.
  • the layers (3), (5) and (7) in which a "positive” (10) is respectively nested, two "positive” (11) and two “positive” (12) are indeed layers with a l st and at least one 2 nd parts as defined in the present invention.
  • the layers (2), (4), (6) and (8) represent the double-sided Scotch ® respectively placed between the layers (1) and (3), (3) and (5), (5) and (5). 7) and (7) and (9). These layers have recess areas to ensure the continuity of the fluidic channel. Some of these recesses are left as layers (2) and (8), while in the others, nested "positives” material hydrophilic. Thus, two “positives” (11) are nested in the layers of Scotch ® (4) and (6).
  • the layers of hydrophobic material have clearly defined functions with:
  • the layer (1) which is the layer on which the sample of the solution of interest to be analyzed or purified represented by a drop is deposited;
  • the layer (3) which is a layer for dividing the sample, in the case presented, in two;
  • FIG. 5A presents a microfluidic system according to the invention with 4 pads, of different shapes facilitating in particular the reading of the results:
  • Figures 5B, 5C, 5D, 5E and 5F show the theoretical result obtained for a negative sample for the 3 agents tested; a positive sample for botulinum toxin A; a positive sample for anthrax; a positive sample for anthrax and ricin; and a sample made under unsuitable conditions.
  • III Examples of development of a system having a multi-pin reading stage.
  • the various stages forming the pa rt ere the support consist of PET sheet 100 microns thick.
  • the different stages were obtained after cutting with a C0 2 laser (Laser GCC Pro Spirit 25 watts).
  • the design was done on the Corel Draw 5 software.
  • the 2 nd portion (flow system) was obtained after cutting pa per Whatman CF1 by a C0 2 laser (Laser CCG Pro Spirit 25 watts). The design was done on the Corel Draw 5 software.
  • Figure 6 shows the different stages ( Figure 6A, 6B and 6C) with the
  • FIGS. 6A, 6B and 6C respectively correspond to the distribution, distribution and analysis stages of the solution of interest.
  • the various stages forming the pa rt ere the support consist of PET sheet 100 microns thick.
  • the different stages were obtained after cutting with a C0 2 laser (Laser GCC Pro Spirit 25 watts).
  • the design was done on the Corel Draw 5 software.
  • the 2 nd portion (flow system) was obtained after paper cutting Whatman CF1 by a C0 2 laser (Laser CCG Pro Spirit 25 watts).
  • the design was done on the Corel Draw 5 software.
  • Figure 7 shows the different stages ( Figures 7A, 7B, 7C, 7D and 7E) with the (s) 2 nd part (s) nested in the 1 st support before assembly.
  • FIGS. 7A, 7B, 7C, 7D and 7E respectively correspond to stages of distribution, distribution, distribution, distribution and analysis of the solution of interest. III.3. Reading stage for 16-point pH.
  • the various stages constituting the ere engage support consist of PET sheets 100 ⁇ thick. The different stages were obtained after cutting with a C0 2 laser (Laser GCC Pro Spirit 25 watts). The design was done on the Corel Draw 5 software.
  • the 2 nd portion (flow system) was obtained after pH Whatman paper cutting by a laser C0 2 (Laser CCG Pro Spirit 25 watts). The design was done on the Corel Draw 5 software.
  • FIG. 8 shows a global system after assembly. The figure
  • FIG. 8A shows the top of the system at which the solution of interest to be analyzed is introduced and Figure 8B shows the reading stage of the results.
  • the 3D microfluidic systems according to the invention can incorporate the reading stage of the system.
  • the 2 nd portion ie the fluid system that can be of the cellulose, for example
  • the 2 nd portion must be modified in order to graft it, so covalently, biolomecules or organic molecules of interest that will obtain the information that is to be extracted from the solution of interest.
  • a polymer having a function of interest in the context of the present invention can be grafted, covalently, in cellulose without destroying its macroscopic format. and in conditions compatible with the living. After modification of a cellulose sheet by these chemical processes, the grafting of biomolecules is carried out under conditions compatible with biology, well known to those skilled in the art.
  • a GraftFast TM solution for grafting acrylic acid is created.
  • the experimenter may refer to international application WO 2008/078052 [7].
  • a few drops of the solution thus obtained are deposited on a piece of 2 cm x 2 cm of a sheet of paper CF1 from Whatman. After 1 to 6 hours, the paper is then sintered with milliQ water (10 mL), then with 1 M sodium hydroxide solution (10 mL) and finally with milliQ water. (10mL) before being reacidified with 1M HCl solution (10mL). The paper is then dried in the air.
  • the ATR FTI R analysis clearly shows the presence of the vibration band at 1710 cm -1 corresponding to the vibration of the carboxylic acid group.
  • Example B Grafting a poly (carboxyl) phenylene layer onto paper (Example B).
  • 4 aminobenzoic acid Sigma Aldrich (2 mmol, 274.3 mg) is converted into a diazonium salt by adding this compound in a solution of HBF 4 at 48% in the presence of 1.1 equivalents of NaN0 2 (2.2 mmol, 151.8 mg) relative to the aniline derivative.
  • the diazonium salt is obtained after precipitation in ether and filtration.
  • the corresponding diazonium salt is dissolved in a solution of HCl at 0.25 N and then 2 mL of H 3 PO 2 at 50% by weight are introduced in order to provoke reduction of diazonium salts in solution (for more information, see [7]).
  • 1,4-Benzenediamine (Sigma Aldrich) (2 mmol, 216.3 mg) is converted into a diazonium salt by adding this compound in a solution of HBF 4 at 48% in the presence of 1.1 equivalents of NaN0 2. (2.2 mmol, 151.8 mg) relative to the aniline derivative.
  • the diazonium salt is obtained after precipitation in ether and filtration.
  • the corresponding diazonium salt is dissolved in a solution of HCl at 0.25 N and then 2 mL of H 3 PO 2 at 50% by weight are introduced in order to cause the reduction of the diazonium salts in solution (for more information, see [7]).
  • a few drops of the solution thus obtained are deposited on a piece of 2 cm x 2 cm of a sheet of paper CF3 from Whatman. After a time of 1 to 6 hours, the paper is then rinsed on a sintered by milliQ water (10 m L). then with a 1M sodium hydroxide solution (10 mL) and then with milliQ water (10 mL) and then reacidified with a solution of 1M HCl (10 mL). The paper is then dried in the air.
  • 3- (4-aminophenyl) propionic acid (Sigma aldrich) (2 m mol, 330.4 mg) is converted into a diazonium salt by adding this compound in a solution of HBF 4 at 48% in the presence of 1 1 equivalent of NaNO 2 (2.2 mmol, 151.8 mg) relative to the derivative of niline.
  • the diazonium salt is obtained after precipitation in ether and filtration.
  • the corresponding diazonium salt is dissolved in a solution of HCl at 0.25 N and then 2 mL of H 3 PO 2 at 50% by weight are introduced in order to cause the reduction of the diazonium salts in solution (for more information, see [7]).
  • a few drops of the solution thus obtained are deposited on a piece of 2 cm x 2 cm of a sheet of paper CF3 from Whatman. After 1 to 6 hours, the paper is then rinsed on a sintered with milliQ water. (10 ml) then with 1 M sodium hydroxide solution (10 ml) and then with milliq water (10 ml) and then reacidified with 1 M HCl solution (10 ml). The paper is then dried in the air.
  • the diazonium salt is obtained after precipitation in ether and filtration.
  • the corresponding diazonium salt is dissolved in a solution of HCl 0.25 N then 2 m L of H 3 PO 2 at 50% by weight are introduced to cause the reduction of diazonium salts in solution (for more information, see [7]).
  • 4-Aminobenzenethiol (Sigma Aldrich) (2 mmol, 250.4 mg) is converted into a diazonium salt by adding this compound in a solution of HBF 4 at 48% in the presence of 1.1 equivalents of NaNO 2 ( 2.2 mmol, 151.8 mg) relative to the aniline derivative.
  • the diazonium salt is obtained after precipitation in ether and filtration.
  • the corresponding diazonium salt is dissolved in a solution of HCl at 0.25 N and then 2 mL of H 3 PO 2 at 50% by weight are introduced in order to cause the reduction of the diazonium salts in solution (for more information, see [7]).
  • a few drops of the solution thus obtained are deposited on a piece of 2 cm x 2 cm of a sheet of paper CF3 from Whatman. After a time of 1 to 6 hours, the paper is then rinsed on a sintered with milliQ water (10 m L) then with 1 M sodium hydroxide solution (10 mL) and then with milliQ water (10 mL). mL) and then reacidified with 1 M HCl solution (10 mL). The paper is then dried in the air.
  • Example G Grafting of a layer of aminoaryl on paper (Example G). 1,4-Benzenediamine (Sigma Aldrich) is converted into a diazonium salt by adding this compound in a solution of 48% HBF 4 in the presence 1.1 equivalents of NaNO 2 (2.2 mmol, 151.8 mg) relative to the aniline derivative. The diazonium salt is obtained after precipitation in ether and filtration.
  • the diazonium salt is then resuspended in ether cold (4 ° C) and then 4 equivalents of NaN 3 (4 mmol, 260 mg) are added and the solution is returned to the temperature for 3 h. The resulting solution is filtered in order to get rid of the salts. The ether is evaporated to dryness to give the corresponding arylazide.
  • the latter is dissolved in water or in a biological buffer such as PBS or TRIS protected from light. A few drops of the solution thus obtained are deposited on a piece of 2 cm x 2 cm of a sheet of paper CF3 or CF1 from Whatman.
  • the paper is then subjected to irradiation at 385 nm for a time varying from 1 to 5 min.
  • the paper is then rinsed on a sintered by milliQ water. (10 mL) then with 1 M sodium hydroxide solution (10 mL) and finally with milliQ water (10 mL) before being reacidified with 1 M HCl solution (10 mL). The paper is then dried in the air.
  • Example H Grafting of a carboxylaryl layer on paper (Example H).
  • the 4-aminobenzoic acid (Sigma Aldrich) is converted into a diazonium salt by adding this compound in a solution of HBF 4 at 48% in the presence of 1.1 equivalents of NaNO 2 (2.2 mmol, 151.8 mg) relative to the aniline derivative.
  • the diazonium salt is obtained after precipitation in ether and filtration.
  • the diazonium salt is then resuspended in ether at cold (4 ° C.) and then 4 equivalents of NaN 3 (4 mmol, 260 mg) are added. and the solution returns to temperature for 3 h.
  • the resulting solution is filtered in order to get rid of the salts.
  • the ether is evaporated to dryness to give the corresponding arylazide.
  • the latter is dissolved in water or in a biological buffer such as PBS or TRIS protected from light. A few drops of the solution thus obtained are deposited on a piece of 2 cm x 2 cm of a sheet of paper CF3 or CF1 from Whatman.
  • the paper is then subjected to irradiation at 385 nm for a time varying from 1 to 5 min.
  • the paper is then rinsed on a sintered by milliQ water. (10 mL) then with 1 M sodium hydroxide solution (10 mL) and finally with milliQ water (10 mL) before being reacidified with 1 M HCl solution (10 mL). The paper is then dried in the air.
  • Example J Grafting a layer of ethylaminoaryl on paper (Example J).
  • the 4- (2-aminoethyl) aniline (Sigma Aldrich) is converted into a diazonium salt by adding this compound in a 48% solution of HBF 4 in the presence of 1.1 equivalents of NaNO 2 (2.2 mmol , 151.8 mg) relative to the aniline derivative.
  • the diazonium salt is obtained after precipitation in ether and filtration.
  • the diazonium salt is then resuspended in ether cold (4 ° C) and then 4 equivalents of NaN 3 (4 mmol, 260 mg) are added and the solution is returned to the temperature for 3 h. The resulting solution is filtered in order to get rid of the salts. The ether is evaporated to dryness to give the corresponding arylazide.
  • 3- (4-aminophenyl) propionic acid (Sigma Aldrich) is converted into a diazonium salt by adding this compound in a solution of HBF 4 at 48% in the presence of 1.1 equivalents of NaN0 2 (2.2 mmol, 151.8 mg) relative to the aniline derivative.
  • the diazonium salt is obtained after precipitation in ether and filtration.
  • the diazonium salt is then resuspended in ether cold (4 ° C) and then 4 equivalents of NaN 3 (4 mmol, 260 mg) are added and the solution is returned to the temperature for 3 h. The resulting solution is filtered in order to get rid of the salts. The ether is evaporated to dryness to give the corresponding arylazide.
  • the corresponding arylazide is dissolved in water or in a biological buffer such as PBS or TRIS protected from light. A few drops of the solution thus obtained are deposited on a piece of 2 cm x 2 cm of a sheet of paper CF3 or CF1 from Whatman. The paper is then subjected to irradiation at 385 nm for a time varying from 1 to 5 min. The paper is then rinsed on sintered with milliQ water (10 mL) then with 1 M sodium hydroxide solution (10 mL) and finally with milliQ water. (10 mL) before being reacidified with 1 M HCl solution (10 mL). The paper is then dried in the air.
  • a biological buffer such as PBS or TRIS protected from light.
  • a few drops of the solution thus obtained are deposited on a piece of 2 cm x 2 cm of a sheet of paper CF3 or CF1 from Whatman.
  • the paper is then subjected to irradiation at 385 nm for
  • 4-Aminobenzenethiol (Sigma Aldrich) is converted into a diazonium salt by adding this compound in a 48% solution of HBF 4 in the presence of 1.1 equivalents of NaNO 2 (2.2 mmol, 151.8 mg ) relative to the derivative of aniline.
  • the diazonium salt is obtained after precipitation in ether and filtration.
  • the diazonium salt is then resuspended in cold ether (4 ° C.) and then 4 equivalents of NaN 3 (4 mmol, 260 mg) are added and the solution is dissolved. returns to the temperature for 3 h. The resulting solution is filtered in order to get rid of the salts. The ether is evaporated to dryness to give the corresponding arylazide.
  • the corresponding arylazide is dissolved in water or in a biological buffer such as PBS or TRIS protected from light. A few drops of the solution thus obtained are deposited on a piece of 2 cm x 2 cm of a sheet of paper CF3 or CF1 from Whatman. The paper is then subjected to irradiation at 385 nm for a time varying from 1 to 5 min. The paper is then rinsed on sintered with milliQ water (10 mL) then with 1 M sodium hydroxide solution (10 mL) and finally with milliQ water (10 mL) before being reacidified with 1M HCl solution (10 mL). The paper is then dried in the air.
  • a biological buffer such as PBS or TRIS protected from light.
  • a few drops of the solution thus obtained are deposited on a piece of 2 cm x 2 cm of a sheet of paper CF3 or CF1 from Whatman.
  • the paper is then subjected to irradiation at 385 nm for a
  • aureus, antracis, anti-ovalbumin and anti-beta-lactoglobulin in solution in PBS buffer (1 mg / ml) are brought into contact (200 ⁇ l) with the papers of Examples A, B, C, D, E, F, G, H and J in the presence of a solution of EDC / NHS (for "1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide / N-hydroxysuccinimide) at 50 mM and are incubated with the papers for 12 h at 4 ° C. . The papers are then rinsed with PBS buffer and then blocked with BSA solution in PBS.
  • EDC / NHS for "1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide / N-hydroxysuccinimide
  • Anti-ricin, anti-enterotoxin B antibodies of Staphylococcus aureus, antacillus antracis, anti-ovalbumin and anti-beta-lactoglobulin in solution in PBS buffer (1 mg / ml) are brought into contact (200 ⁇ l) with the papers of Examples F and L and are incubated for 12 h at 4 ° C. The papers are then rinsed with PBS buffer and then they are blocked with a solution of BSA in PBS.
  • Anti-ricin, anti-enterotoxin B, Staphyloccocus aureus, anti-Bacillus antracis, anti-ovalbumin and anti-beta-lactoglobulin antibodies are modified with linkers having an arylazide group such as the ANB-NOS compound or the Sulfo-SANPAH compound ( Pierce, Thermo Fisher) of formula:
  • the antibodies thus obtained are purified by chromatography. Whatman CF1 paper is impregnated with 100 ⁇ l of a solution of these modified antibodies (1 mg / ml) with the arylazide group and then the samples are irradiated at 385 nm for a time varying from 1 to 5 min.
  • Figure 9A shows the different layers of the 3D microfluidic system according to the invention.
  • the system implemented for detecting botulinum toxin comprises layers (1) to (5) with the support part of the layers (1), (3) and ( 5) in PET polymer and the portion (s) of the fluidic channel type of the layers (3) and (5) in cellulose or nitrocellulose.
  • the layers (2) and (4) are made of double-sided Scotch ® with the recess of the layer (2) left in the state, while in the recesses of the layer (4) have been nested parts of cellulose or nitrocellulose.
  • the polymer sheets and the cellulose sheets are cut in the same pattern, one being the negative of the other. All the leaves are kept using double-sided Scotch ® .
  • the layer (5) corresponding to the analysis stage has fluidic channel portions functionalized, for one, by an anti-botulinum toxin A antibody produced by the CEA and, for the other, hereinafter designated "control plot", by a goat anti-mouse antibody (Jackson Immunoresearch Laboratories Inc., Code 115-005-004).
  • the fluidic part of the analysis stage ie layer (5) is in nitrocellulose and the various antibodies have been immobilized on the latter directly, by electrostatic interaction, without any other step than the deposition of the antibody solution.
  • 1 sample contains a botulinum toxin anti-mouse antibody
  • Figure 10A shows the result obtained after the deposition of a drop of 500 ⁇ sample 1, only the control pad being colored.
  • the 2 nd sample contains a botulinum toxin anti-mouse antibody labeled with colloidal gold (1 mcg; antibody and marking carried out by CEA, Volland et al, 2007 [9].)) And a non-toxic region of the toxin A botulic antibody recognized by the antibody (100 ng / ml, recombinant protein corresponding to the binding domain of botulinum toxin A, the preparation of this recombinant protein being described by Tavallaie et al., 2004 [10]) in phosphate buffer 0.1 M potassium (pH 7.4) + 0.15 M NaCl + 1 mg / ml serum bovine albumin + 0.01% sodium azide.
  • Figure 10B shows the result obtained following the deposition of a droplet of 500 ⁇ of the 2 nd sample, the two pads being colored.
  • the integrated reservoir microfluidic system 3D according to the present invention described below is a system suitable for hydrophilic solutions of interest.
  • a hollow pattern is made on different stages of the device. This hollow pattern is not subsequently filled with hydrophilic porous material, the stack of stages can create a cavity that is in contact with a hydrophilic porous material. The sample is deposited in the reservoir and then, by capillarity, it migrates into the hydrophilic porous material.
  • the spiral or double spiral fluidic circuit is cut manually or with a C0 2 laser printer:
  • the matrix in the hydrophobic or nonporous matrix, the matrix is recovered with its spiral or double spiral cutout which constitutes the "negative of the device";
  • the adhesive is recovered with its cutout.
  • the assembly of the device is done by
  • steps 2 and 3 can be repeated as many times as necessary.
  • FIG. 11 The various elements constituting the layers of a 3D microfluidic system with integral reservoir and spiral fluidic circuit and the assembled layers obtained are presented in FIG. 11 and the final microfluidic system is shown in FIG. corresponding to the double-sided scotch ® possibly present between two layers illustrated in Figures 11 and 12 are not shown on the latter.
  • the layers (1) and (9) of this system do not constitute layers with a lere and at least a 2 nde parts as defined in the present invention. Indeed, none of the recesses of the layer (1) is filled by a porous hydrophilic component.
  • This layer (1) is, on the one hand, the layer at which the sample of the solution of interest to be analyzed or purified represented by a drop is introduced via an unfinished circular recess and on the other hand , the layer at which other unconfirmed recesses vis-à-vis the detection zones made on the double spiral of the layer (2) allow the visualization of the signal that reveals or not the presence of the desired agent .
  • the support layer (9) is left in the participating state, in fact, in support of the hydrophilic portions of the upper stages.
  • a hydrophilic matrix corresponds to absorbent paper which maintains the movement of the sample in the device by capillarity and which retains it once the latter has circulated over the entire device, the The hydrophilic matrix of this layer (8) can be considered, therefore, as a "biological bin” or as a low-cost system acting as a "pump".
  • the layers (1), (2), (3), (4) and (5) all have an unfilled recess, the uncompleted recesses of these layers being centered on a common axis and having an identical diameter whereby they form a cannula-type channel for driving the solution sample of interest to be analyzed or purified from the layer (1) to the reservoir of the layer (6).
  • the layers (3), (4) and (5) all have a 1 st recess filled with a hydrophilic porous material for conveying by capillary action of the sample solution of interest to be analyzed or purifying tank from the layer (6) to the double spiral of the layer (2).
  • the hydrophilic porous material of this recess 1 filled at the layer (5) is in the extension of the porous hydrophilic material present at the level of the reservoir layer (6).
  • These 1 ers recesses do not have identical shapes from one layer to another and are not necessarily centered on a common axis, the only condition being that there is a fluidic continuity between the porous hydrophilic materials that fill them.
  • the layers (3), (4), (5), (6) and (7) each have two recesses of identical shape and filled with a porous hydrophilic material, advantageously with the same porous hydrophilic material; these two recesses each in the fluidic continuity of one of the ends of the double spiral of the layer (2) make it possible to route, by capillarity, the sample solution of interest, after it comes into contact with the spiral of material hydrophilic porous layer (2) to the hydrophilic material of the layer (8).
  • These recesses do not have identical shapes from one layer to another and are not necessarily focused on two common axes, the only requirement being that there is a preview ere fluidic continuity between the porous hydrophilic materials that meet 1 of these recesses and a 2 nd fluidic continuity between porous hydrophilic materials that fill the 2 nd of these recesses.
  • Figure 13 schematizes chronologically the movement of the sample in the system of Figure 12.
  • the double spiral of the layer may be functionalized by different reagents or compounds capable of detecting or trapping a constituent or an analyte that may be present in the solution of interest to be analyzed. More particularly, this functionalization with different reagents or compounds takes place at particular zones of the double spiral.
  • FIG. 14 presents the information that can be obtained by looking at the layer (1) of the system of FIG. 12. Thus, from a sample of interest deposited on the system according to the invention which is not divided into two at the level of the double spiral, it is possible to obtain information for 16 constituents or analytes present or not in this sample (16 pads of Figure 14).

Abstract

La présente invention concerne un système microfluidique tridimensionnel (ou 3D) comprenant une pluralité de couches (1, 3, 5, 7, 9) empilées les unes sur les autres, caractérisé en ce qu'au moins une desdites couches est constituée d'une 1ère (3) et d'au moins une 2nde (10) parties, distinctes l'une de l'autre, avec la 2nde partie poreuse et mouillable par une solution d'intérêt s'emboîtant dans un évidement de la 1ère partie non poreuse et/ou non mouillable par ladite solution d'intérêt, ledit système pouvant éventuellement présenter un réservoir intégré; son procédé de fabrication et ses différentes utilisations

Description

SYSTÈME MICROFLUIDIQUE 3D À ZONES EMBOÎTÉES
ET RÉSERVOIR INTÉGRÉ, SON PROCÉDÉ DE PRÉPARATION
ET SES UTILISATIONS
DESCRIPTION
DOMAINE TECHNIQUE
La présente invention concerne le domaine des dispositifs de diagnostic et notamment le domaine de tels dispositifs basés sur des systèmes microfluidiques.
En effet, la présente invention concerne un système microfluidique tridimensionnel (ou 3D) comprenant des zones hydrophiles, des zones hydrophobes emboîtées les unes dans les autres et éventuellement un réservoir intégré ainsi qu'un procédé de préparation d'un tel système.
ÉTAT DE LA TECHNIQUE ANTÉRIEURE
Les capteurs immunologiques sous forme de bandelettes (ou « dipsticks » en anglais) sont utilisés couramment pour la détection de nombreux paramètres biologiques mais également pour permettre la détection d'agents pathogènes (« 1D lateral-flow Systems »). Ils sont basés sur le mouvement latéral de fluides à analyser à travers des bandes ou bandelettes de papier. Ces systèmes, bien que largement utilisés, présentent des limites quant à leurs capacités bioanalytiques et fluidiques. Dans ce format où l'échantillon migre suivant une seule dimension, il est difficile de multiplier le nombre de paramètres biologiques détectés. En effet, la multiplication des lignes ou zones de détection diminue la résolution spatiale et peut conduire à une mauvaise analyse du résultat. A partir de 2008, de nouveaux dispositifs de détection sont apparus et ont été désignés « dispositifs microfluidiques 3D » (pour « 3D microfluidic devices »). Le concept général de ces nouveaux dispositifs consiste à créer des canaux hydrophiles microfluidiques dans une matrice hydrophobe et d'empiler les couches successives à l'aide de scotch® double face. En effet, en 2008, le groupe du Professeur G. Withesides (Université d'Harvard) a développé, sur le principe des capteurs immunologiques sous forme de bandelettes, des systèmes microfluidiques 3D à base de pa pier (et d'une manière plus générale à base d'une matrice fibreuse poreuse) et de SU-8 (résine photolithographique) [1-2]. Par la suite, des systèmes similaires mais présentant un mode de réalisation différent ont été développés par le groupe de W. Shen [3] ou par le groupe de B. Lin [4].
Ces systèmes sont notamment utilisables pour des analyses colorimétriques, quantitatives avec calibration intégrée. Ainsi, la demande internationale WO 2011/000047 [5] envisage l'utilisation d'un système microfluidique 3D à base de papier et comprenant plusieurs zones de test hydrophiles, dans laquelle l'échantillon à tester et des échantillons standards contenant une quantité connue de l'analyte à doser sont déposés sur différentes zones de test puis l'intensité colorimétrique de l'échantillon à tester est comparée à la gamme colorimétrique étalon obtenue à partir des échantillons standards. A noter que, dans les systèmes microfluidiques tels que décrits dans
[1] et [5], toutes les zones de test sont uniformément constituées par le même matériau.
Jusqu'à présent, ces systèmes microfluidiques 3D reposent tous sur une structure sandwich réalisée par empilement de couches distinctes pa rmi lesquelles au moins une est un matériau fibreux poreux hydrophile rendu localement hydrophobe suite à un traitement donné. Ainsi, chaque couche est constituée d'un même matériau de base présentant localement des zones aux propriétés physicochimiques distinctes de par le (ou les) traitement(s) physicochimique(s) subi(s). Plus particulièrement, les technologies développées pour réaliser ces couches se présentant sous forme de matrices hydrophobe/hydrophile sont dérivées des techniques lithographiques classiques [1-2], des techniques « jet d'encre » par impression de molécules hydrophobes [3] ou des techniques d'impression de cire par une imprimante laser [4]. Leurs concepts reposent donc sur l'élaboration dans une couche poreuse d'un réseau hydrophile entouré d'une matrice devenue hydrophobe, dans toute son épaisseur, suite à la modification chimique par imprégnation de SU-8, de cire ou de molécules hydrophobes. En particulier, la demande internationale WO 2010/003188 propose un procédé de préparation d'un système microfluidique à partir d'un substrat hydrophile [6]. Ce procédé comprend les étapes consistant à (i) rendre hydrophobe la surface du substrat, (ii) déposer sur la surface rendue hydrophobe un masque ayant des zones d'ouverture permettant de définir la périphérie des canaux microfluidiques et (iii) appliquer, au niveau de la surface exposée via les zones d'ouverture, un traitement avec des irradiations de manière à rendre la surface hydrophile. Lors de l'étape (i), la surface est rendue hydrophobe par absorption ou adsorption d'une solution d'une substance hydrophobe telle que définie page 4, lignes 29 à 33 dans un solvant volatile. Le traitement avec des irradiations notamment envisagé est un traitement plasma ou un traitement corona.
Les techniques utilisées pour obtenir ces structures sont donc dépendantes de l'épaisseur du matériau poreux utilisé. Ces modes de réalisation sont notamment non applicables aux matrices fibreuses poreuses épaisses. En effet, si le matériau à traiter pour le rendre hydrophobe est trop épais, il sera impossible de créer des canaux dans la matrice imprégnée de résine photolithographique comme SU-8 par photolithographie.
De la même façon, il est impossible que la cire imprègne la totalité de l'épaisseur du support épais. Même si la cire est pulvérisée à haute température, son refroidissement sera plus rapide que sa diffusion. Ainsi, même si la matrice est chauffée pour permettre à la cire de diffuser, il en résultera une forte altération du design voire même le bouchage du canal hydrophile dans son épaisseur empêchant ainsi la formation d'un système microfluidique 3D.
Par conséquent, pour des matrices épaisses, il est impossible d'utiliser l'approche photolithographie/résine photolithographique, l'impression ink-jet de cire ou de molécules hydrophobes pour obtenir une matrice complètement hydrophobe en contact des zones hydrophiles, sans entraîner une fuite du système en latéral des pistes hydrophiles et/ou sans perdre en résolution.
De plus, l'utilisation de résine photolithographique comme la SU-8 et des procédés photolithographiques sont extrêmement coûteux en argent et en temps puisqu'il s'agit de procédés multi-étapes impliquant des étapes de masquage, révélation, rinçage, etc.... A titre d'exemple, 500 mL de SU-8 valent, en 2011, 5000€.
A noter encore que les pistes de matrice hydrophiles telles que préparées par les procédés pré-cités sont mises en contact avec d'autres produits chimiques tels que résine, solvants, vapeur de cire, solvant de rinçage, et ce, avant leur utilisation dans le système microfluidique. Cette mise en contact peut entraîner une possible contamination du canal fluidique par des sous-produits et entraîner des artéfacts lors de l'utilisation du système microfluidique.
Enfin, avec les procédés pré-cités, il est impossible d'intégrer dans un même étage (entre deux scotch® double faces) deux ou plusieurs matériaux hydrophiles poreux de nature et/ou d'épaisseur différente, comme, par exemple, introduire dans le même étage une fluidique en papier (cellulose) et une fluidique en fibre de verre.
Les inventeurs se sont donc fixés pour but de mettre au point un procédé de fabrication d'un dispositif microfluidique 3D (i) indépendant de l'épaisseur de la matrice poreuse, (ii) réduisant le nombre d'étapes de fabrication par rapport aux procédés de l'art antérieur assurant ainsi un gain de temps, (iii) à bas coût, (iv) présentant une bonne résolution latérale et (v) pouvant intégrer au moins deux systèmes de fluidiques à base de matériaux poreux de nature chimique différente.
Enfin, dans les dispositifs microfluidiques 1D et 3D connus jusqu'à présent, le dépôt d'échantillons se fait soit par immersion d'une partie du dispositif dans l'échantillon, soit par dépôt de l'échantillon sur le dispositif. Dans ce dernier cas, le dispositif est inséré dans une cassette qui permet le dépôt d'un volume d'échantillon plus ou moins important.
Aussi, afin de détecter simultanément différents paramètres biologiques à l'aide de bandelettes, des cassettes plastiques en intégrant plusieurs ont été développées. Ces cassettes utilisent la répartition de l'échantillon sur les différentes bandelettes et nécessitent un fractionnement de l'échantillon en autant d'aliquotes qu'il y a de bandelettes. En effet, les systèmes précédemment décrits permettent un fractionnement par capillarité de l'échantillon qui peut ainsi interagir avec différentes zones de détection. Cela se traduit par l'analyse de petits volumes pour chaque paramètre et donc par une diminution du seuil de détection ou par la nécessité d'utiliser des volumes d'échantillons importants afin de pallier ce fractionnement.
Les inventeurs se sont donc fixés pour but de mettre au point un procédé de fabrication d'un dispositif microfluidique 3D présentant les avantages tels que précédemment listés et dont certaines formes de mise en œuvre possèdent également une configuration permettant l'analyse de plusieurs paramètres sans fractionner l'échantillon notamment au-delà d'un facteur 2.
EXPOSÉ DE L'INVENTION
La présente invention permet d'atteindre le but que se sont fixés les inventeurs et de résoudre tout ou partie des problèmes techniques des systèmes microfluidiques 3D de l'état de la technique. Plus particulièrement, le système de la présente invention et son procédé de préparation sont basés sur le principe de la marqueterie. En effet, la structure sandwich résulte de l'empilement de couches dans lesquelles la couche fibreuse poreuse hydrophile rendue localement hydrophobe est remplacée par une couche mixte constituée d'un support hydrophobe préalablement découpé selon le motif désiré, notamment par voie manuelle ou par découpe avec imprimante laser C02, dans lequel vient s'emboîter le matériau hydrophile poreux d'intérêt, ce dernier servant de canal fluidique permettant le transfert des solutions aqueuses et des échantillons par effet de capillarité dans le plan et/ou dans l'épaisseur du système final. Il convient de noter que l'association d'un support hydrophile avec un matériau hydrophobe poreux servant de canal fluidique est également envisageable dans le cadre de la présente invention.
Les avantages d'un système microfluidiques 3D par « marqueterie » selon l'invention par rapport aux systèmes développés dans l'état de la technique sont nombreux :
- diminution des coûts ;
- diminution du temps d'élaboration des systèmes, du fait de l'absence d'étapes de mise en contact, de diffusion, de recuit, d'insolation, de révélation, de lavage, d'impression et/ou de chauffe ;
- pas de limitation au niveau de l'épaisseur du matériau servant de canal fluidique contrairement aux systèmes précédents qui ne peuvent utiliser des matrices trop épaisses comme précédemment expliqué ;
- aucune obligation quant à un quelconque traitement des pistes de la matrice servant de canaux fluidiques pour les rendre mouillables par une solution d'intérêt, ces dernières peuvent être utilisées dans leur état « vierge » i.e. sans jamais avoir été mises en contact avec d'autres produits tels que résine, solvants, vapeur de cire ou solvant de rinçage ;
- grande liberté quant aux matériaux utilisables pour la partie support et pour la (ou les) partie(s) de type canal fluidique. En effet, le fait que la partie support et la (ou les) partie(s) de type canal fluidique soient emboîtées et donc dissociables les unes des autres permet d'envisager de nombreuses formes de mise en œuvre impossibles avec les systèmes microfluidiques de l'état de la technique. Tout d'abord, la partie support et la (ou les) partie(s) de type canal fluidique peuvent être préparées à partir de matériaux différents. Il n'existe pas de limitation quant aux matériaux utilisables pour ces différentes parties, contrairement aux systèmes de l'état de la technique dans lesquels la couche initiale doit être en un seul matériau hydrophile (ou hydrophobe) pouvant être rendue hydrophobe (ou hydrophile) suite à un traitement donné.
De même, lorsque le système microfluidique selon l'invention comprend plusieurs parties de type canal fluidique sur une même couche, toutes ces parties ou seulement certaines peuvent être en un matériau, identique ou différent. Aussi, contrairement aux systèmes de l'art antérieur, la présente invention permet d'introduire, dans le même étage, 2 à plusieurs types de matrice poreuse de nature chimique différente, comme, par exemple, du papier et de la fibre de verre.
Cette latitude permet non seulement d'adapter la physicochimie des canaux fluidiques aux molécules à analyser, mais aussi d'envisager la préparation de systèmes microfluidiques 3D selon l'invention « à la carte ». A titre d'exemple, il est possible d'emboîter dans un support préalablement préparé, une (ou plusieurs) partie(s) de type canal fluidique adaptée(s) à une (ou plusieurs) molécule(s) d'intérêt, selon le souhait de l'utilisateur et au moment où ce dernier l'exprime.
Ainsi, la présente invention concerne un système microfluidique tridimensionnel (ou 3D) comprenant une pluralité de couches empilées les unes sur les autres, dans lequel au moins une desdites couches est constituée d'une lere et d'au moins une 2nde parties, distinctes l'une de l'autre, avec la 2nde partie poreuse et mouillable par une solution d'intérêt s'emboîtant dans un evidement de la lere partie non poreuse et/ou non mouillable par ladite solution d'intérêt, ladite 2nde partie servant de canal fluidique assurant le transfert de ladite solution d'intérêt par effet de capillarité dans le plan et/ou l'épaisseur de dudit système.
Dans le système microfluidique selon l'invention, la lere partie et la
(ou les) 2nde(s) partie(s) sont chimiquement différentes du fait notamment de leur différence de mouillabilité et/ou de porosité.
Dans le système microfluidique selon l'invention, la 2nde partie poreuse et mouillable par une solution d'intérêt est préalablement découpée et se présente sous une forme adaptée à son emboîtement dans l'évidement de la lère partie.
De plus, la lere partie constitue le support de la couche tel que précédemment décrit et la (ou les) 2nde(s) partie(s) forme(nt) le canal fluidique via l'empilement des couches que comprend le système microfluidique selon l'invention. Ainsi, les expressions « lere partie » et « partie support » sont équivalentes et utilisables de façon interchangeable. De même, les expressions « 2nde partie » et « partie de type canal fluidique » sont équivalentes et utilisables de façon interchangeable.
Comme précédemment expliqué, au moins une couche du système microfluidique 3D selon l'invention peut comprendre une seule 2nde partie poreuse et mouillable par une solution d'intérêt ou au moins deux 2ndes parties, au moins trois 2ndes parties, au moins quatre 2ndes parties, poreuses et mouillables par une solution d'intérêt, de nature identique ou différente et de forme identique ou différente, l'ensemble de ces 2ndes parties s'emboîtant dans autant d'évidements que de 2ndes parties, présents au niveau de la partie support de la couche.
Dans une forme de mise en œuvre particulière, il est possible de maintenir au moins un des évidements de la lere partie non comblé. Ainsi, le système microfluidique de cette forme de mise en œuvre particulière comprend une pluralité de couches empilées les unes sur les autres, parmi lesquelles au moins une couche est constituée d'une lere partie et d'au moins une 2nde partie, distinctes l'une de l'autre, avec la 2nde partie poreuse et mouillable par une solution d'intérêt s'emboîtant dans un évidement de la lere partie non poreuse et/ou non mouillable par ladite solution d'intérêt, ladite lere partie présentant en outre au moins un évidement non comblé et ladite 2nde partie servant de canal fluidique assurant le transfert de ladite solution d'intérêt par effet de capillarité dans le plan et/ou l'épaisseur de dudit système.
Avantageusement, dans cette forme de mise en œuvre particulière, le système microfluidique peut comprendre au moins une couche constitutée d'une lere partie présentant au moins un évidement non comblé et d'au moins une 2nde partie telles que précédemment définies. En particulier, le système microfluidique peut comprendre (i) au moins une couche constitutée d'une lere partie présentant un évidement non comblé et d'une 2nde partie telles que précédemment définies, (ii) au moins une couche constitutée d'une lere partie présentant un évidement non comblé et de deux 2ndes parties telles que précédemment définies et/ou (iii) au moins une couche constitutée d'une lere partie présentant un évidement non comblé et de trois 2ndes parties telles que précédemment définies. Ainsi, le système microfluidique 3D selon l'invention peut comprendre au moins une couche (i) et au moins une couche (ii), au moins une couche (i) et au moins une couche (iii) ou au moins une couche (ii) et au moins une couche (iii). De même, le système microfluidique 3D selon l'invention peut comprendre au moins une couche (i), au moins une couche (ii) et au moins une couche (iii).
Lorsque le système microfluidique selon l'invention présente plusieurs couches comprenant chacune au moins un évidement non comblé et notamment un seul évidement non comblé, l'empilement de ces couches constitue une canule et un réservoir intégrés dans le système. Pour ce faire, les évidements de ces différentes couches sont en continuité fluidique les uns vis-à- vis des autres. Avantageusement, tous les évidements ou une partie de ces derniers sont centrés sur un axe commun. Avantageusement encore, tous les évidements ou une partie de ces derniers sont centrés sur un axe commun et présentent une section par rapport au plan de la couche de forme identique, leur épaisseur étant dépendante de l'épaisseur de la lere partie dans laquelle ils ont été préparés.
Dans le cadre de la présente invention, on entend, par réservoir, une cavité définie par l'évidement de la lere partie d'une lere couche et délimitée par au moins la couche suivante. La cavité peut être délimitée par la seule couche suivante : dans ce cas, le réservoir se situe au niveau de la couche de l'extrémité supérieure du système microfluidique. En variante, la cavité est délimitée à la fois par la couche suivante et par la couche précédente : dans ce cas, le réservoir est dit intégré dans le système. La couche suivante et/ou la couche précédente présente au moins un évidement éventuellement comblé au niveau de l'évidement formant le réservoir, les deux évidements étant en contact fluidique l'un avec l'autre. Dans le cas d'un réservoir non intégré, seule la couche suivante comprend un tel évidement dans lequel est emboîtée une 2nde partie telle que précédemment définie. Dans le cas d'un réservoir intégré, la couche précédente comprend au moins un évidement qui peut être comblé, partiellement comblé ou non comblé par une 2nde partie telle que précédemment définie. Dans ce mode de réalisation, la couche suivante peut également comprendre au moins un évidement qui peut être comblé, partiellement comblé ou non comblé par une 2nde partie telle que précédemment définie, les évidements des couches suivante et précédente ou parties de ces derniers pouvant être centrés sur un axe commun ou au contraire, non centrés sur un axe commun. En variante de ce mode de réalisation, la couche suivante peut ne pas comprendre d'évidement en contact fluidique avec le réservoir et, dans ce cas, la couche précédente comprend au moins deux évidements distincts qui peuvent être, indépendamment l'un de l'autre, comblés, partiellement comblés ou non comblés par une 2nde partie telle que précédemment définie. Dans cette variante particulière, la solution d'intérêt « descend » jusqu'au réservoir via un système de canule ou de canal fluidique et « remonte » dans les couches supérieures via un système de canule ou de canal fluidique distinct.
De façon avantageuse, le réservoir mis en œuvre dans un système microfluidique selon l'invention est en contact fluidique avec au moins un canal fluidique tel que précédemment défini et, pour ce faire, dans l'évidement de la lere partie correspondant audit réservoir, peut se trouver un élément en un matériau hydrophile et poreux (cas d'une solution d'intérêt hydrophile) ou en un matériau hydrophobe et poreux (cas d'une solution d'intérêt hydrophobe). Cet élément ne constitue pas une 2nde partie telle que précédemment définie puisqu'il ne permet pas de combler entièrement l'évidement réalisé dans la lere partie. Les lere et 2nde(s) parties d'au moins une couche du système microfluidique selon l'invention sont notamment définies par rapport à leur mouillabilité ou à leur non mouillabilité vis-à-vis d'une solution d'intérêt.
La mouillabilité est définie par l'angle de contact (ou angle de raccordement) que forme une goutte de la solution d'intérêt avec la partie au niveau du site de dépôt de cette goutte.
Ainsi, lorsque l'on précise que la (ou les) 2nde(s) partie(s) est(sont) mouillable(s) vis-à-vis de la solution d'intérêt, cela signifie, généralement, qu'une goutte de cette solution déposée va former par rapport au site de dépôt un angle de contact présentant généralement une valeur inférieure à 70° et notamment inférieure à 60° tandis que, pour la lere partie éventuellement non mouillable, cela signifie que l'angle de contact formé entre une goutte de la solution et cette partie présente généralement une valeur supérieure à 90° et notamment supérieure à 95°. D'un point de vue pratique, cela signifie que, lorsque la solution d'intérêt est déposée sur la (ou les) 2nde(s) partie(s), elle reste à ce niveau sans aller dans la lere partie non mouillable.
D'un point de vue chimique, un liquide va mouiller le substrat que représente la partie du système microfluidique s'il présente une affinité chimique vis-à-vis de celui-ci. Ainsi un substrat hydrophile (ou hydrophobe) va être mouillable vis-à-vis des liquides hydrophiles (ou hydrophobes).
Il convient de préciser que la définition de mouillabilité telle que donnée ci-dessus se rapporte à la définition classique de mouillabilité par rapport à un liquide sur une surface plane. Dans le cadre de la présente invention, la nature chimique et notamment la mouillabilité de la surface de la (ou des) 2nde(s) partie(s) intervient dans le transfert de la solution d'intérêt qui se fait par capillarité mais pas uniquement car la solution passe aussi par les pores ouverts du matériau de cette (ou ces) 2nde(s) partie(s). Ainsi, la (ou les) 2nde(s) partie(s) peuvent également être définies comme perméable(s) à la solution d'intérêt. Au final, la (ou des) 2nde(s) partie(s) constitue(nt) un système poreux au travers duquel la solution d'intérêt circule, cette circulation étant d'autant pus rapide que l'hydrophilie/hydrophobie du matériau poreux est compatible avec l'hydrophilie/hydrophobie de la solution d'intérêt.
Dans le cadre de la présente invention, on entend par « solution d'intérêt » toute solution naturelle ou synthétique, hydrophile ou hydrophobe, que l'on souhaite analyser et/ou purifer sur un système microfluidique 3D selon la présente invention. Il convient de souligner que la solution d'intérêt mise en œuvre dans le cadre de la présente invention ne doit être ni un solvant de la lere partie, ni un solvant de l'une quelconque des 2emes parties du système microfluidique 3D.
Ainsi, cette solution d'intérêt peut être un fluide biologique ; un fluide végétal tel que sève, nectar et exsudât racinaire ; un prélèvement dans un milieu de culture ou dans un réacteur de culture biologique comme une culture cellulaire d'eucaryotes supérieurs, de levures, de champignons ou d'algues ; un liquide obtenu à partir d'une (ou plusieurs) cellule(s) animale(s) ou végétale(s) ; un liquide obtenu à partir d'un tissu animal ou végétal ; un prélèvement dans une matrice alimentaire ; un prélèvement dans un réacteur chimique ; de l'eau de ville, de rivière, d'étang, de lac, de mer, de tours aéro-réfrigérées ; un prélèvement à partir d'un effluent industriel liquide ; de l'eau usée provenant notamment d'élevages intensifs ou d'industries du domaine chimique, pharmaceutique, cosmétique ou nucléaire ; un produit pharmaceutique ; un produit cosmétique ; un parfum ; un échantillon de terre ou un de leurs mélanges.
Le fluide biologique est avantageusement choisi dans le groupe constitué par le sang tel que du sang entier ou du sang entier anti-coagulé, le sérum sanguin, le plasma sanguin, la lymphe, la salive, le crachat, les larmes, la sueur, le sperme, l'urine, les selles, le lait, le liquide céphalo-rachidien, le liquide interstitiel, un fluide isolé de moelle osseuse, un mucus ou fluide du tractus respiratoire, intestinal ou génito-urinaire, des extraits cellulaires, des extraits de tissus et des extraits d'organes. Ainsi, le fluide biologique peut être tout fluide naturellement sécrété ou excrété d'un corps humain ou animal ou tout fluide récupéré, à partir d'un corps humain ou animal, par toute technique connue de l'homme du métier telle qu'une extraction, un prélèvement ou un lavage. Les étapes de récupération et d'isolement de ces différents fluides à partir du corps humain ou animal sont réalisées préalablement à la mise en œuvre du procédé selon l'invention.
De même, si un des prélèvements envisagés ne permet pas de le mettre en œuvre avec un système microfluidique 3D selon la présente invention, par exemple du fait de sa nature notamment solide, de sa concentration ou des éléments qu'il contient tels que résidus solides, déchets, suspension ou molécules interférentes, cette mise en œuvre et notamment le procédé de détection tel que défini ci-après comprend en outre une étape préalable de préparation de la solution d'intérêt avec éventuellement une mise en solution du prélèvement par les techniques connues de l'homme du métier telles que filtration, précipitation, dilution, distillation, mélange, concentration, lyse, etc.
Différentes formes de mise en œuvre quant à la lere partie d'au moins une couche du système microfluidique 3D selon l'invention sont envisageables. En effet, cette dernière peut être :
- poreuse et non mouillable par la solution d'intérêt ;
- non poreuse et mouillable par la solution d'intérêt ; ou
- non poreuse et non mouillable par la solution d'intérêt.
Ainsi, pour une solution d'intérêt hydrophile, la lere partie (i.e. la partie support) d'au moins une couche, notamment d'une (ou de plusieurs) couche(s) et avantageusement de l'ensemble des couches du système microfluidique selon l'invention peut être :
- poreuse et hydrophobe ;
- non poreuse et hydrophile ; ou
- non poreuse et hydrophobe ;
la (ou les) 2nde(s) partie(s) étant, dans le cas d'une solution d'intérêt hydrophile, hydrophile(s) et poreuse(s).
Avantageusement, pour une solution d'intérêt hydrophile, la partie support d'au moins une couche, notamment d'une (ou de plusieurs) couche(s) et avantageusement de l'ensemble des couches du système microfluidique selon l'invention est choisie dans le groupe constitué par un film polymère poreux et hydrophobe ; une membrane, un gel ou une résine poreuse hydrophobe ; un film polymère, hydrophile ou hydrophobe, non poreux et une membrane ou une résine, hydrophile ou hydrophobe, non poreuse.
En particulier, à titre d'exemples illustratifs et non limitatifs, pour une solution d'intérêt hydrophile, la partie support d'au moins une couche, notamment d'une (ou de plusieurs) couche(s) et avantageusement de l'ensemble des couches du système microfluidique selon l'invention est choisie dans le groupe constitué par un film, poreux ou non poreux, de polyéthylène téréphtalate (PET) ; une membrane, poreuse ou non poreuse, de polyéthylène (PE) ; une membrane, poreuse ou non poreuse, de polypropylène (PP) ; un film, poreux ou non poreux, ou une membrane, poreuse ou non poreuse, contenant du fluor telle qu'un film, poreux ou non poreux, ou une membrane, poreuse ou non poreuse, en polyfluorure de vinylidène (PVDF) hydrophobe ; une membrane, poreuse ou non poreuse, de polytétrafluoroéthylène (PTFE) ; un film copolymère, poreux ou non poreux, comprenant du fluorure de vinylidène et du tétrafluoroéthylène ; un film, poreux ou non poreux, copolymère comprenant du fluorure de vinylidène et de l'hexafluoropropylène ; un film, poreux ou non poreux, de polyméthacrylate de méthyle (PMMA) ; un film, poreux ou non poreux, de poly(n-butyl acétate) ; un film, poreux ou non poreux, de poly(benzyl méthacrylate) ; un film, poreux ou non poreux, de poly(chlorotrifluoroéthylène) ; une membrane poreuse et, notamment une membrane poreuse échangeuse d'ions, fonctionnalisée par des groupements hydrophobes ; un polymère styrénique comme une résine polystyrène avantageusement poreuse ; un film, poreux ou non poreux, de polyacrylonitrile ; un film, poreux ou non poreux, de polyméthacrylonitrile ; un film, poreux ou non poreux, de polyimide tel que du Kapton® et un de leurs mélanges. Par « groupement hydrophobe », on entend avantageusement, dans le cadre de la présente invention, un groupement fluoré ; un groupement aryle éventuellement substitué par un (ou plusieurs) atome(s) de fluor et notamment un groupement phényle éventuellement substitué par un (ou plusieurs) atome(s) de fluor ; et un groupement alkyle éventuellement substitué par un (ou plusieurs) atome(s) de fluor.
De même, pour une solution d'intérêt hydrophile, la (ou les) 2nde(s) partie(s) hydrophile(s) et poreuse(s) est(sont) avantageusement choisie(s) dans le groupe constitué par un matériel fibreux hydrophile, un tissu, un film hydrophile poreux, un gel hydrophile ou une membrane poreuse portant ou fonctionnalisée par des groupements hydrophiles. Par « groupement hydrophile », on entend, dans le cadre de la présente invention, un groupement choisi parmi un groupement hydroxyle, un groupement carbonyle, un groupement trialcoxysilane, un groupement anionique, un groupement cationique, un groupement aminé tertiaire, un groupement époxy, un groupement ester, un groupement amide, un groupement acide anhydride, un groupement acide phosphonique, un groupement acide sulfonique, un groupement ammonium et leurs éventuelles bases conjuguées.
Plus particulièrement, à titre d'exemples illustratifs et non limitatifs, pour une solution d'intérêt hydrophile, la (ou les) 2nde(s) partie(s) hydrophile(s) et poreuse(s) est(sont) avantageusement choisie(s) dans le groupe constitué par du papier notamment de nature cellulosique ; du papier coton ; de l'agarose ; de la gélatine ; de la cellulose ; de la méthylcellulose ; de la carboxyméthylcellulose ; de la nitrocellulose ; de l'ester acétate de cellulose ; un alginate ; une polyoléfine ; une membrane poreuse et, notamment une membrane poreuse, échangeuse d'ions, fonctionnalisée, avantageusement par radiogreffage, par des groupements hydrophiles telle qu'une membrane NAFION ; une résine de type Séphadex conditionnée en membrane ou une membrane de PVDF ; un tissu en fibre de verre ; un gel de polyacrylamide ; un gel de sépharose ou un de leurs mélanges.
En variante, pour une solution d'intérêt hydrophobe, la partie support d'au moins une couche, notamment d'une (ou plusieurs) couche(s) et avantageusement de l'ensemble des couches du système microfluidique selon l'invention peut être :
- poreuse et hydrophile ;
- non poreuse et hydrophobe ; ou
- non poreuse et hydrophile ; la (ou les) 2n els) partie(s) étant, dans le cas d'une solution d'intérêt hydrophobe, hydrophobe(s) et poreuse(s).
Avantageusement, pour une solution d'intérêt hydrophobe, la partie support d'une (ou de plusieurs) couche(s) et avantageusement de l'ensemble des couches du système microfluidique selon l'invention est choisie dans le groupe constitué par un film polymère poreux et hydrophile ; une membrane, un gel ou une résine poreuse hydrophile ; un film polymère, hydrophile ou hydrophobe, non poreux et une membrane ou une résine, hydrophile ou hydrophobe, non poreuse.
En particulier, à titre d'exemples illustratifs et non limitatifs, pour une solution d'intérêt hydrophobe, la partie support d'au moins une couche, notamment d'une (ou de plusieurs) couche(s) et avantageusement de l'ensemble des couches du système microfluidique selon l'invention est choisie dans le groupe constitué par du papier ; du papier coton ; de l'agarose ; de la gélatine ; de la cellulose ; de la méthylcellulose ; de la carboxyméthylcellulose ; de la nitrocellulose ; de l'ester acétate de cellulose ; un alginate ; une polyoléfine ; une membrane et, notamment une membrane échangeuse d'ions, fonctionnalisée, avantageusement par radiogreffage, par des groupements hydrophiles telle qu'une membrane NAFION ; une résine de type Séphadex conditionnée en membrane ou une membrane de PVDF ; un tissu en fibre de verre ; un film non poreux de polyéthylène téréphtalate (PET) ; une membrane non poreuse de polyéthylène (PE) ; une membrane non poreuse, de polypropylène (PP) ; un film non poreux de polyimide tel que du Kapton® ; un gel de polyacrylamide ; un gel de sépharose ou un de leurs mélanges.
En particulier, à titre d'exemples illustratifs et non limitatifs, pour une solution d'intérêt hydrophobe, la (ou les) 2nde(s) partie(s) hydrophobe(s) et poreuse(s) est(sont) choisie(s) dans le groupe constitué par un matériel fibreux hydrophobe, un tissu hydrophobe, un film poreux hydrophobe, un gel ou une membrane poreuse portant ou fonctionnalisée par des groupements hydrophobes.
Plus particulièrement, à titre d'exemples illustratifs et non limitatifs, pour une solution d'intérêt hydrophobe, la (ou les) 2nde(s) partie(s) hydrophobe(s) et poreuse(s) est(sont) avantageusement choisie(s) dans le groupe constitué par du papier rendu hydrophobe par traitement, un film poreux de polyéthylène téréphtalate (PET) ; une membrane poreuse de polyéthylène (PE) ; une membrane poreuse de polypropylène (PP) ; un film poreux ou une membrane poreuse contenant du fluor telle qu'un film poreux ou une membrane poreuse en polyfluorure de vinylidène (PVDF) hydrophobe ; une membrane poreuse de polytétrafluoroéthylène (PTFE) ; un film copolymère poreux comprenant du fluorure de vinylidène et du tétrafluoroéthylène ; un film copolymère poreux comprenant du fluorure de vinylidène et de l'hexafluoropropylène ; un gel polyacrylamide ; un film poreux de polyméthacrylate de méthyle (PMMA) ; un film poreux de poly(n-butyl acétate) ; un film poreux de poly(benzyl méthacrylate) ; un film poreux de poly(chlorotrifluoroéthylène) ; une membrane poreuse et, notamment une membrane poreuse échangeuse d'ions, fonctionnalisée par des groupements hydrophobes ; un polymère poreux styrénique comme une résine polystyrène poreuse ; un film poreux de polyacrylonitrile ; un film poreux de polyméthacrylonitrile et un de leurs mélanges.
Que la lere partie d'une couche du système microfluidique 3D selon l'invention soit hydrophobe ou hydrophile, elle peut présenter sur au moins une face autocollante en contact direct avec une autre couche du système. Une telle face autocollante peut consister en un transparent en PET collant sur les 2 faces, collé sur une lere partie d'une couche. Cette variante permet de solidariser deux couches du système ensemble et/ou de garantir l'étanchéité entre ces deux couches. Que la (ou les) 2" e(s) partie(s) d'une couche du système microfluidique 3D selon l'invention soi(en)t hydrophobe(s) ou hydrophile(s), elle(s) peu(ven)t comprendre au moins un réactif ou composé, apte à détecter et/ou à piéger un constituant ou un analyte présent dans une solution d'intérêt. En effet, comme explicité ci-après, le système microfluidique 3D selon l'invention peut être utilisé dans des procédés de détection et/ou de purification. En d'autres termes, au moins un réactif ou composé est incorporé au matériau poreux d'au moins une 2nde partie mise en œuvre dans le cadre de la présente invention.
Lorsque le matériau de cette 2nde partie comprend au moins un réactif ou composé, ces derniers peuvent être soit répartis dans l'ensemble du volume du matériau ou localisés en une zone précise du matériau. Avantageusement, les réactifs ou composés peuvent se trouver à la surface des pores ou canaux du matériau. Les réactifs ou composés peuvent être adsorbés à la surface des pores ou canaux de ce matériau et/ou liés à cette surface par des liaisons non- covalentes (liaisons hydrogène ou liaisons ioniques) et/ou par des liaisons covalentes.
Lorsque la liaison entre le réactif ou le composé et le matériau de la 2nde partie est faible, le réactif ou le composé peut être entraîné vers des couches inférieures par le flux de la solution d'intérêt, une fois cette dernière déposée sur le système microfluidique.
Au contraire, da ns le cas d'une liaison forte, le réactif ou le composé reste dans ce matériau même en présence de la solution d'intérêt et la détection et/ou le piégeage ont lieu dans cette même couche. I l en est, de même, dans le cas d'un réactif ou d'un composé non lié de façon covalente mais trop volumineux par rapport aux pores et aux canaux de la partie de type canal fluidique de la couche inférieure consécutive. Pour fixer, au moyen de liaisons covalentes, le réactif ou le composé au matériau de la 2eme partie, différents procédés, connus de l'homme du métier, utilisant ou non des bras espaceurs. sont utilisables. De plus, la partie expérimentale ci-après décrit un procédé utilisant des sels d'aryle diazonium clivables et basé sur le procédé décrit dans la demande internationale WO 2008/078052 [7] et un procédé utilisant des sels d'aryle azide pour fixer des réactifs ou composés sur un matériau de la 2eme partie.
De plus, le système microfluidique 3D selon l'invention peut comprendre au moins 2 couches, au moins 3 couches, au moins 4 couches, au moins 5 couches, au moins 10 couches, voire au moins 50 couches, toutes ou partie de ces couches pouvant présenter une lere et au moins une 2nde parties telles que précédemment définies.
Dans la présente invention, la nomenclature « couches supérieures » et « couches inférieures » s'apprécie par rapport au support sur le lequel le système microfluidique selon l'invention est éventuellement placé. Ainsi, la couche de l'extrémité inférieure correspond à la couche en contact direct avec ce support, la couche de l'extrémité supérieure correspondant à la couche la plus éloignée vis-à-vis de ce support.
Ces couches peuvent présenter une épaisseur identique ou différente les unes par rapport aux autres. Avantageusement l'épaisseur de chaque couche est comprise entre 0,1 μιη et 20 mm, notamment entre 0,5 μηι et 5 mm, typiquement entre 1 μιη et 1 mm, en particulier entre 2 μιτι et 400 μηι et, plus particulièrement, entre 5 μιη et 200 μιη permettant ainsi d'obtenir un système microfluidique 3D ayant une épaisseur comprise entre 2 μιη et 100 mm, typiquement entre 5 μιη et 50 mm, notamment entre 10 μιη et 25 mm et, en particulier, entre 40 μιη et 10 mm. Il convient de noter que, pour une même couche du système microfluidique 3D selon l'invention, l'épaisseur de la (ou des) 2nde(s) partie(s) doit être adaptée en fonction de l'épaisseur de la lere partie. Avantageusement, pour une même couche, la lere partie et la (ou des) 2nde(s) partie(s) ont des épaisseurs sensiblement identiques. Avantageusement, toutes les couches comprises dans le système microfluidique 3D selon l'invention présentent une lere partie et au moins une 2nde partie telles que précédemment définies. Dans une certaine forme de mise en œuvre, parmi les couches comprises dans le système microfluidique 3D selon l'invention présentant une lere partie et au moins une 2nde partie telles que précédemment définies, une ou plusieurs de ces couches peuvent comprendre a u moins un évidement, dans la lere partie, non comblé.
I l est également possible que certaines des couches comprises dans le système microfluidique 3D selon l'invention présentent une partie support avec un (ou plusieurs) évidement(s) sans que, dans ces derniers, une 2nde partie de type canal fluidique telle que précédemment définie soit emboîtée. En d'autres termes, au moins une couche de l'empilement de couches constituant le système microfluidique selon l'invention est uniquement constituée d'un support non poreux et/ou non mouillable par une solution d'intérêt et évidé au niveau d'une (ou plusieurs) zone(s) définie(s). I l est clair que cet (ou ces) évidement(s) font partie du (ou des) canal(canaux) fluidique(s) que comprend le système microfluidique.
Lorsqu'une telle couche est comprise entre deux couches comprenant une lere partie et au moins une 2nde partie telles que précédemment définies, cette couche pourrait alors être considérée comme un interrupteur ou un système de sélection ou de distribution de fluidique. En effet, tant que les 2ndes parties des couches, séparées par la couche sans 2nde partie, ne sont pas en contact, il y a discontinuité dans le système de fluidique et le liquide ne peut pas passer, comme expliqué au paragraphe 84 de [1]. Par contre, si une action mécanique de pression ou un écrasement sur cette zone est effectuée comme décrit au paragraphe 83 de [1], on met alors en contact les 2 étages et le système de fluidique est alors connecté et la solution d'intérêt peut passer.
Une couche présentant une partie support avec un (ou plusieurs) évidement(s) sans que, dans ces derniers, une 2nde partie de type canal fluidique telle que précédemment définie soit emboîtée est avantageusement présente, dans l'empilement de couches qui constitue le système microfluidique 3D selon la présente invention, parmi les couches supérieures et inférieures de cet empilement. Plus particulièrement, une telle couche est la lere couche de cet empilement (i.e. la couche sur laquelle la solution d'intérêt est déposée) et/ou la dernière couche de cet empilement. Dans cette forme de mise en œuvre, le (ou les) évidement(s) que présente la lere couche (ou couche de l'extrémité supérieure) serve(nt) de réservoir de solution d'intérêt et la dernière couche (ou couche de l'extrémité inférieure) peut servir à maintenir la couche juste au- dessus d'elle et notamment de la (ou des) 2nde<s) partie(s) que comprend cette dernière. Dans cette forme de mise en œuvre, le réservoir se trouve au niveau de la partie supérieure du dispositif (i.e. au niveau de la lere couche), alors que, dans la variante précédemment envisagée mettant en œuvre une ou plusieurs couches présentant une lere partie, au moins une 2nde partie telle que précédemment définie et au moins un évidement non comblé au niveau de ladite lere partie, le réservoir est avantageusement au niveau de couches inférieures i.e. est intégré dans la structure du système.
L'utilisation de couches aux propriétés particulières en terme de nombre de 2ndes parties ou en terme d'épaisseur, de porosité et/ou de fonctionnalisation du matériau constituant ces 2ndes parties permet de conférer aux couches une fonction particulière. Certaines de ces couches peuvent avoir une fonction dans la répartition et la division de la solution d'intérêt, dans l'analyse, dans la détection et/ou dans la purification.
Ainsi, le système microfluidique 3D selon l'invention peut notamment présenter au moins une couche dont au moins une 2nde partie telle que précédemment définie et notamment dont la 2nde partie telle que précédemment définie joue le rôle de poubelle biologique. Cette dernière permet de récupérer tout ou partie de la solution d'intérêt une fois la détection, la quantification et/ou la purification d'un analyte donné réalisée(s). De façon générale également et comme décrit ci-après, la forme des évidements réalisés dans la lere partie des couches du système de l'invention et donc celle de la (ou des) 2nde<s) partie(s) les comblant éventuellement sont très variées. Dans une forme de mise en œuvre particulière, le système microfluidique 3D selon l'invention peut notamment présenter au moins une couche dont au moins une 2nde partie telle que précédemment définie et notamment dont la 2nde partie telle que précédemment définie présente une forme en spirale ou en double spirale.
De même, il peut être avantageux de contrôler l'épaisseur d'au moins une couche et/ou la porosité d'au moins une 2nde partie d'au moins une couche du système microfluidique 3D selon la présente invention. L'homme du métier connaît différentes techniques permettant de contrôler la porosité d'un matériau poreux hydrophile ou hydrophobe tel que précédemment décrit. Ce contrôle est notamment mis en œuvre au moment de la préparation du matériau hydrophile et poreux (ou du matériau hydrophobe et poreux). Il peut dépendre des conditions notamment des conditions de tissage dans le cadre d'un matériau tissé et/ou des réactifs utilisés lors de cette préparation et notamment de l'ajout d'agents porogènes dans le milieu réactionnel.
Concernant l'intérêt d'un tel contrôle, on peut citer l'exemple de la filtration d'une solution d'intérêt se présentant sous forme d'un milieu complexe comprenant des molécules, telles que des protéines, des peptides, des sucres modifiés ou non, des molécules organiques rentrant dans les différentes voies de signalisation ou métaboliques etc., en solution, des cellules mais également des débris cellulaires de type débris membranaires. Le système microfluidique 3D selon l'invention peut, par exemple, être utilisé pour détecter la présence d'une protéine particulière dans ce mélange complexe. Aussi, afin d'éviter des artefacts de mesure, on peut déposer le milieu complexe sur la 2nde partie de la première couche qui a une certaine épaisseur et une porosité contrôlée (inférieure à la taille des cellules et des débris cellulaires) afin de purifier l'échantillon et obtenir en sortie de cette 2n e partie, seulement le milieu contenant les molécules, telles que des protéines, des peptides, des sucres modifiés ou non, des molécules organiques rentrant dans les différentes voies de signalisation ou métaboliques etc., les cellules et les débris cellulaires étant piégés dans le matériau constituant cette partie.
Un autre exemple est le dépôt d'une solution d'intérêt contenant des cellules préalablement lysées. Le dépôt de la solution sur la 2nde partie de la première couche qui a une certaine épaisseur et une porosité contrôlée permet de purifier l'échantillon en gardant emprisonnés dans le papier les débris membranaires et les organites et ne laissera passer simplement que les contenus internes aux cellules comme les protéines, les ADN ou les différents métabolites.
De même, il est possible d'avoir pour un même système microfluidique 3D, des 2ndes parties en des matériaux, poreux et mouillables par une solution d'intérêt donnée, différents, permettant de fixer des molécules ou des matières organiques de nature différente sur un même système. A titre d'exemples, on peut avoir des zones ou 2ndes parties contenant des matériaux poreux et mouillables par une solution d'intérêt donnée, différents de part leur nature chimique, de part leur épaisseur ou de part leur porosité. En effet dans un même système microfluidique 3D on peut avoir à analyser en même temps différents types de molécules biologiques comme des protéines et des éléments cellulaires. Cependant, ces différents éléments à analyser ne posséderont pas les mêmes propriétés physico-chimiques vis-à-vis de la matrice poreuse. En effet, certains pourront être adsorbés par effet électrostatique empêchant toute migration dans le système et rendant impossible l'analyse si c'est cet élément que l'on veut analyser ou quantifier. C'est notamment le cas de certaines bactéries qui sont adsorbées très fortement dans les membranes de nitrocellulose empêchant ainsi leur migration au sein du système et le rendant inefficace pour la détection. Au contraire si on veut se débarrasser de cet élément pour l'analyse on pourra alors utiliser ce phénomène. Par conséquent, si on veut analyser une protéine et une bactérie avec un même système microfluidique 3D selon l'invention et si la matrice poreuse utilisée pour la protéine ne peut servir à la bactérie (pour les raisons explicitées ci-dessus), il faut utiliser des canaux de conduction de natures différentes au sein du même étage i.e. d'une même couche.
Dans une forme de mise en œuvre particulière du système microfluidique selon la présente invention, ce dernier présente, entre au moins deux couches consécutives, un élément apte à solidariser ces deux couches ensemble et/ou à garantir l'étanchéité entre ces deux couches. Avantageusement, un tel élément, identique ou différent, est présent entre toutes les couches que présente le système microfluidique selon la présente invention.
Cet élément peut se présenter sous forme d'un scotch® double face, d'un film étirable du type film étirable micro-onde Saran ou d'un dérivé d'un primaire d'adhésion supporté.
Lorsque du scotch® double-face ou un film étirable est mis en œuvre, ce dernier présente au moins un évidement et notamment un (ou plusieurs) évidement(s) pour garantir la continuité du canal fluidique entre les deux couches qu'il solidarise. Avantageusement, un (ou plusieurs) de ces évidements est(sont) rempli(s) par un matériau poreux et mouillable par une solution d'intérêt, identique au ou différent du matériau d'une des 2nde(s) partie(s) des couches qu'il solidarise ensemble. En variante, cet (ou ces) évidement(s) est(sont) laissé(s) en l'état. Toutefois, comme précédemment explicité pour les couches du système pouvant présenter une partie support avec au moins un évidement sans qu'aucune 2nde partie de type canal fluidique telle que précédemment définie ne soit emboîtée, il peut être nécessaire d'agir mécaniquement par pression ou par écrasement sur les zones évidés non remplis, pour garantir la continuité fluidique des couches séparées par un tel scotch® ou film étirable. La notion de « dérivé d'un primaire d'adhésion supporté » utilisé dans le cadre de la présente invention est directement liée à l'invention décrite dans la demande internationale WO 2009/121944 [8]. En effet, cette demande concerne un procédé pour assembler deux surfaces entre elles. Dans le cadre de la présente invention, ces deux surfaces sont la surface inférieure d'une couche et la surface supérieure de la couche consécutive. Le dérivé d'un primaire d'adhésion supporté ponte ces deux surfaces au moyen de liaisons covalentes. Typiquement, un tel primaire d'adhésion supporté est présent sur tout ou partie de la lere partie d'au moins une des deux couches. Il s'agit avantageusement d'un sel d'aryle clivable supporté et, en particulier, un sel d'aryle diazonium clivable supporté de formule (I) suivante :
(surface)-(B)n-R-N2 +, A" (I)
dans laquelle :
- surface représentant la surface d'une lere partie d'une couche d'un système microfluidique 3D selon l'invention,
- (B)n représente un agent de liaison,
- n est égal à 0 ou 1,
- A représente un anion monovalent et
- R représente un groupe aryle.
B peut représenter une entité unique, au moins deux entités identiques ou différentes ou même un apprêt tel(les) que décrit(es) dans [8]. De même, toutes les variantes et formes de mise en œuvre envisagées dans [8] pour A et R sont utilisables dans le cadre de la présente invention. La présente invention concerne également un dispositif comprenant un système microfluidique tel que précédemment défini. Un tel dispositif peut se présenter sous forme d'une plaque, d'une boîte ou d'un boîtier en plastique ou en céramique dans laquelle(lequel) le système microfluidique 3D selon l'invention est placé. Le système microfluidique 3D ou le dispositif selon l'invention peut être intégré dans un packaging adapté avec notamment des instructions d'utilisation mais également dans un système plus compliqué où le consommable peut être, par exemple, le système microfluidique 3D ou le dispositif selon l'invention. La présente invention concerne également un procédé de fabrication d'un système microfluidique 3D tel que précédemment défini, ledit procédé comprenant les étapes consistant à :
ai) préparer, dans une couche d'un matériau non poreux et/ou non mouillable par une solution d'intérêt notamment tel que précédemment défini, un évidement ;
bi) découper, dans une couche d'un matériau poreux et mouillable par ladite solution d'intérêt notamment tel que précédemment défini, au moins une forme conforme à l'évidement préparé à l'étape (ai) ;
Ci) emboîter dans l'évidement préparé à l'étape (ai) la forme découpée à l'étape (bi), moyennant quoi une couche dudit système microfluidique 3D est obtenue ;
di) éventuellement répéter les étapes (ai), (bi) et (ci) ; et ei) assembler les différentes couches du système microfluidique 3D. L'étape (ai) du procédé vise à préparer la lere partie d'une couche du système microfluidique 3D. Cet évidement peut être obtenu par toute technique de découpe connue de l'homme du métier. Avantageusement, cette dernière est choisie parmi une découpe par attaque chimique sélective, une découpe physique du type gravure ionique réactive (ou RIE pour « Reactive Ion Etching »), une découpe manuelle telle qu'un emboutissage et une découpe au laser tel qu'un laser puisé avec notamment une source de type YAG (acronyme anglais pour « Yttrium Aluminium Garnet » ou grenat d'yttrium et d'aluminium) ou un laser continu notamment un laser à source C02. Ces lasers permettent d'obtenir une résolution de l'ordre de 5 à 10 μιτι. Lors de l'étape (ai), au moins un autre evidement peut être préparé dans la couche d'un matériau non poreux et/ou non mouillable par une solution d'intérêt. Cet evidement peut être ultérieurement comblé lors de la mise en œuvre des étapes (bi) et (ci) ou, au contraire, resté en l'état i.e. non comblé.
Lors de l'étape (ai), le (ou les) évidement(s) préparé(s) peu(ven)t présenter diverses formes. A titre de formes envisageables, on peut citer un évidement dont la section par rapport au plan de la couche est circulaire, ovale, carrée, rectangulaire, triangulaire, en forme d'étoile, de croix, de bâtonnet, de spirale ou de double spirale. Sur une même couche, deux évidements peuvent présenter une forme identique ou différente. De même, deux matériaux comblant deux évidements appartenant chacun à deux couches successives et en continuité fluidique l'un de l'autre peuvent présenter une section par rapport au plan de la couche de forme identique ou différente.
L'utilisation d'un évidement dont la section par rapport au plan de la couche est en forme de spirale ou de double spirale peut avoir un avantage certain au niveau d'une couche dont au moins une 2nde partie est mise en uvre dans des procédés de détection et/ou de purification. En effet, une telle configuration permet de réaliser plusieurs zones de détection (i.e. des zones comprenant au moins un réactif ou composé, apte à détecter et/ou à piéger un constituant ou un analyte présent dans une solution d'intérêt). Ainsi, plusieurs constituants ou analytes peuvent être identifiés à partir d'un même échantillon de solution d'intérêt et ce, sans nécessiter un fractionnement dudit échantillon.
L'étape (bi) du procédé selon la présente invention consiste à préparer au moins une 2nde partie d'une couche du système microfluidique 3D selon la présente invention. Par « forme conforme à l'évidement », on entend non seulement une forme s'emboîtant parfaitement dans l'évidement préparé à l'étape (ai) mais aussi une forme dont l'épaisseur est sensiblement égale à l'épaisseur de la couche mise en œuvre à l'étape (ai). Avantageusement, la découpe mise en œuvre à l'étape (b2) est également choisie parmi une découpe par attaque chimique sélective, une découpe physique du type gravure ionique réactive, une découpe manuelle et une découpe au laser telle que précédemment définie.
Les étapes (ai), (bi) et (ci) sont répétées autant de fois que le système microfluidique 3D comprend de couches avec une lere partie et au moins une 2nde partie telles que précédemment définies.
La couche obtenue suite à l'étape d'emboîtement (ci) peut être définie comme un système de microfluidique 2D car intégrée dans le plan du système support.
L'emboîtement de l'étape (ci) et l'assemblage de l'étape (ei) peuvent être réalisés de façon manuelle ou de façon automatisé.
Lors de l'étape (ei), les couches à assembler peuvent comprendre non seulement une (ou plusieurs) couche(s) telle(s) que préparée(s) par mise en œuvre des étapes (ai), (bi) et (ci) mais aussi une (ou plusieurs) couche(s) préparée(s) par la seule mise en œuvre de l'étape (ai) (i.e. une (ou plusieurs) couche(s) constituée(s) d'un matériau non poreux et/ou non mouillable pour un liquide d'intérêt et présentant un (ou plusieurs) évidemment(s) laissé(s) en l'état) et/ou une (ou plusieurs) couche(s) d'un adhésif telle(s) que précédemment définie(s).
Dans la forme de mise en œuvre particulière dans laquelle le système microfluidique 3D selon la présente invention comprend un dérivé d'un primaire d'adhésion supporté, le procédé de préparation comprend les étapes consistant à :
ai') préparer, dans une couche d'un matériau non poreux et/ou non mouillable par une solution d'intérêt notamment tel que précédemment défini et dont la surface présente un primaire d'adhésion supporté et notamment le sel d'aryle clivable supporté, un évidement ; bi) découper, dans une couche d'un matériau poreux et mouillable par ladite solution d'intérêt notamment tel que précédemment défini, au moins une forme conforme à l'évidement préparé à l'étape (a^) ;
Ci) emboîter dans l'évidement préparé à l'étape (ai') la forme découpée à l'étape (bi), moyennant quoi une couche dudit système microfluidique 3D est obtenue ;
di) éventuellement répéter les étapes (a^), (bi) et (ci) ; et ei') assembler les différentes couches du système microfluidique 3D en soumettant la surface du matériau non poreux et/ou non mouillable par une solution d'intérêt à des conditions non-électrochimiques pour obtenir, à partir du primaire d'adhésion supporté et notamment à partir du sel d'aryle clivable supporté, sur ladite surface, au moins une entité radicalaire et/ou ionique et en mettant en contact ladite surface présentant au moins une entité radicalaire et/ou ionique ainsi obtenue avec la surface de la couche consécutive.
Lors de l'étape (ai'), la fonctionnalisation de la surface du matériau par un primaire d'adhésion supporté peut se faire préalablement ou après l'évidement du matériau.
Les étapes (bi), (ci) et (di) sont telles que précédemment définies. De même, les formes de mise en œuvre précédemment envisagées pour l'étape (ai) s'appliquent mutatis mutandis à l'étape (ai').
Les conditions non électrochimiques utilisables lors de l'étape (ei') sont telles que définies dans [8]. A noter toutefois qu'il est souhaitable que ces conditions ne mettent pas en œuvre des solutions susceptibles d'agir sur les matériaux constituant les couches du système microfluidique.
Ainsi, de façon avantageuse, les conditions non électrochimiques utilisables lors de l'étape (ei') sont des conditions non électrochimiques photochimiques et consistent à soumettre le primaire d'adhésion supporté et notamment le sel clivable supporté à une irradiation (ou insolation) dans le domaine UV ou visible. La longueur d'onde employée lors de l'étape (ei') du procédé sera choisie, sans aucun effort inventif, en fonction du primaire d'adhésion et notamment du sel d'aryle clivable utilisé. Toute longueur d'onde appartenant a u domaine UV ou au domaine visible est utilisable dans le cadre de la présente invention. Avantageusement, la longueur d'onde appliquée est comprise entre 300 et 700 nm, notamment entre 350 et 600 nm et, en particulier, entre 380 et 550 nm.
Le système microfluidique offre une grande diversité quant a ux configurations envisageables. Pour les configurations les plus simples, la solution d'intérêt est déposée sur la lere couche du système et est récupérée au niveau d'une couche inférieure et notamment au niveau de la dernière couche. Lorsqu'un tel dispositif est utilisé en détection ou purification, la détection peut également être mise en œuvre au niveau d'une couche inférieure et notamment au niveau de la dernière couche.
En variante et notamment lorsque le système microfluidique présente un réservoir intégré en son sein, la solution d'intérêt peut être en contact ou traverser plusieurs couches plusieurs fois, une lere fois pour aller jusqu'au réservoir dans une couche interne au système (sens descendant), une 2nde fois pour aller du réservoir jusqu'à la couche d'analyse ou de détection, cette dernière étant avantageusement la lere couche du système (sens ascendant) et une 3eme et dernière fois pour aller de la couche d'analyse jusqu'à une couche inférieure et notamment la dernière couche qui joue un rôle « poubelle » mais qui a aussi un rôle dans la capillarité.
Quelle que soit la configuration envisagée, il est important de noter que l'acheminement de la solution d'intérêt dans ou au travers des couches du système ne se fait que par gravité et/ou capillarité, aucun élément de type pompe notamment mécanique n'est nécessaire à cet acheminement. La présente invention concerne aussi l'utilisation d'un système microfluidique 3D tel que précédemment défini ou susceptible d'être préparé par un procédé de fabrication tel que précédemment défini pour détecter et éventuellement quantifier au moins un analyte éventuellement présent dans une solution d'intérêt ou dans un fluide gazeux d'intérêt. Par « fluide gazeux d'intérêt », on entend avantageusement un prélèvement aérien ou un prélèvement à partir d'un effluent industriel gazeux.
En d'autres termes, la présente invention concerne un procédé pour détecter et éventuellement quantifier au moins un analyte éventuellement présent dans une solution d'intérêt ou dans un fluide gazeux d'intérêt, comprenant les étapes consistant à :
a2) éventuellement préparer un système microfluidique 3D apte à détecter ledit analyte selon un procédé de fabrication tel que précédemment défini ;
b2) déposer, sur ledit système microfluidique 3D éventuellement préparé à l'étape (a2), ladite solution d'intérêt ou mettre en contact ledit fluide gazeux d'intérêt avec ledit système microfluidique 3D éventuellement préparé à l'étape (a2) ; et
c2) détecter et éventuellement quantifier ledit analyte éventuellement présent.
L'analyte à détecter et éventuellement à quantifier est présent dans la solution d'intérêt ou le fluide gazeux tel(le) que précédemment défini(e) peut être choisi dans le groupe constitué par une molécule d'intérêt biologique ; une molécule d'intérêt pharmacologique ; une toxine ; un glucide ; un peptide ; une protéine ; une glycoprotéine ; une enzyme ; un substrat enzymatique ; un récepteur nucléaire ou membranaire ; un agoniste ou un antagoniste d'un récepteur nucléaire ou membranaire ; une hormone ; un anticorps polyclonal ou monoclonal ; un fragment d'anticorps tel qu'un fragment Fab, F(ab')2, Fv ou un domaine hypervariable ou CDR pour « Complementarity Determining Région » ; une molécule nucléotidique ; un polluant, avantageusement organique, de l'eau ; un polluant, avantageusement organique, de l'air ; une bactérie et un virus.
L'expression « molécule nucléotidique » utilisée dans la présente est équivalente aux termes et expressions suivants : « acide nucléique », « polynucléotide », « séquence nucléotidique », « séquence polynucléotidique ». Par « molécule nucléotidique », on entend, dans le cadre de la présente invention, un chromosome ; un gène ; un polynucléotide régulateur ; un ADN, simple-brin ou double-brin, génomique, chromosomique, chloroplastique, plasmidique, mitochondrial, recombinant ou complémentaire ; un ARN total ; un ARN messager ; un ARN ribosomal (ou ribozyme) ; un ARN de transfert ; une séquence faisant office d'aptamère ; une portion ou un fragment de ceux-ci.
Le réactif utilisé pour fonctionnaliser le système microfluidique mis en œuvre dans le cadre de la présente invention est toute molécule capable de former avec l'analyte à détecter une paire de liaison, le réactif et l'analyte correspondant aux deux partenaires de cette paire de liaison. Les liaisons mises en œuvre dans la liaison analyte-réactifs sont soit des liaisons non covalentes et de faible énergie telles que des liaisons hydrogène ou des liaisons de Van der Waals, soit des liaisons de forte énergie de type liaisons covalentes.
Le réactif utilisé est donc dépendant de l'analyte à détecter. En fonction de cet analyte, l'homme du métier saura, sans effort inventif, choisir le réactif le mieux adapté. Il peut être choisi dans le groupe constitué par une molécule-sonde ; un glucide ; un peptide ; une protéine ; une glycoprotéine ; une enzyme ; un substrat enzymatique ; un récepteur membranaire ou nucléaire ; un agoniste ou un antagoniste d'un récepteur membranaire ou nucléaire ; une toxine ; un anticorps polyclonal ou monoclonal ; un fragment d'anticorps tel qu'un fragment Fab, F(ab')2, Fv ou un domaine hypervariable (ou CDR pour « Complementarity Determining Région ») ; une molécule nucléotidique telle que précédemment définie ; un acide nucléique peptidique et un aptamère tel qu'un aptamère ADN ou un aptamère ARN. Par « molécule-sonde », on entend, dans le cadre de la présente invention, une molécule spécifique à un (ou plusieurs) analyte(s) pour laquelle la mise en contact avec au moins un de ces analytes entraîne au moins une modification des propriétés spectrales de cette molécule-sonde.
La molécule-sonde mise en œuvre dans le cadre de la présente invention est une molécule qui présente des propriétés fluorogène ou chromogène, c'est-à-dire qu'elle devient fluorescente ou se colore lorsqu'elle interagit avec au moins un analyte spécifique. D'une façon générale, l'interaction de la molécule-sonde avec au moins un analyte spécifique produit un signal optique détectable. L'interaction peut consister en la création d'une liaison irréversible et sélective, notamment de type liaison covalente entre la molécule- sonde et au moins un analyte spécifique.
L'homme du métier connaît différentes molécules-sondes utilisables dans le cadre de la présente invention et connues pour détecter des analytes spécifiques comme un adhéhyde, du formaldéhyde, de l'acétaldéhyde, du naphtalène, une aminé primaire notamment aromatique, de l'indole, du scatole, du tryptophane, de l'urobilinogène, du pyrrole, du benzène, du toluène, du xylène, du styrène ou du napthalène. De telles molécules-sondes sont notamment choisies parmi les énaminomes et les couples β-dicétone/amine correspondants, les imines et les hydrazines, le 4-aminopent-3-en-2-one, l'acide croconique et les molécules-sondes à fonction aldéhyde que sont le p- diméthylaminobenzaldéhyde, le p-diméthylaminocinnamaldéhyde, le p- méthoxybenzaldéhyde et le 4-méthoxy-l-naphtaldéhyde, les mélanges et les sels dérivés de ces composés.
L'utilisation d'un système microfluidique 3D selon l'invention ou susceptible d'être préparé par un procédé de fabrication selon la présente invention pour détecter et éventuellement quantifier au moins un analyte tel que précédemment défini trouve ainsi des applications dans le domaine de la biochimie, de la microbiologie, dans le domaine du diagnostic médical, dans le domaine du nucléaire, dans le domaine du contrôle qualité, dans le domaine de l'agro-alimentaire, dans le domaine du dépistage de substances illicites, dans le domaine de la défense et/ou de la biodéfense ; dans le domaine du contrôle vétérinaire, environnemental et/ou sanitaire et/ou dans le domaine de la parfumerie, des cosmétiques et/ou des arômes.
L'étape (a2), lorsqu'elle doit être mise en œuvre, consiste à préparer un système microfluidique 3D apte à détecter au moins un analyte donné i.e. un système microfluidique 3D comprenant au moins un réactif apte à reconnaître ledit analyte de manière spécifique.
Lors de l'étape (b2) du procédé selon la présente invention, le dépôt de la solution d'intérêt consiste à déposer une (ou plusieurs) goutte(s) de ladite solution d'intérêt au niveau d'un (ou plusieurs) canal(canaux) fluidique(s) présent(s) à la surface du système muicrofluidique 3D. Le volume de solution d'intérêt déposé sur chaque canal fluidique est compris entre 1 μΙ et 10 ml, notamment entre 20 μΙ et 5 ml, en particulier, entre 400 μΙ et 2 ml.
L'étape (c2) du procédé selon la présente invention consiste à détecter et éventuellement quantifier le signal émis par
- l'analyte,
- la paire de liaison formée entre ledit analyte et le réactif présent dans le système microfluidique 3D éventuellement préparé à l'étape (a2),
- un réactif secondaire apte à reconnaître l'analyte ou la paire de liaison formée entre ledit analyte et le réactif.
Le réactif secondaire peut être choisi dans le groupe constitué par un glucide ; un peptide ; une protéine ; une glycoprotéine ; une enzyme ; un substrat enzymatique ; un récepteur membranaire ou nucléaire ; un agoniste ou un antagoniste d'un récepteur membranaire ou nucléaire ; une toxine ; un anticorps polyclonal ou monoclonal ; un fragment d'anticorps tel qu'un fragment Fab, F(ab')2, Fv ou un domaine hypervariable (ou CDR pour « Complementarity Determining Région ») ; une molécule nucléotidique telle que précédemment définie ; un acide nucléique peptidique et un aptamère tel qu'un aptamère ADN ou un aptamère ARN.
En vue de la détection, l'analyte et/ou le réactif secondaire présente au moins un groupement facilement détectable i.e. un groupement qui émet un signal mesurable (enzymatique, fluorescent, chromogénique, radioactif,...) ou qui permet la formation d'un signal mesurable.
Dans une lere forme de mise en œuvre du groupement facilement détectable, ce dernier peut être une enzyme ou une molécule capable de générer un signal détectable et éventuellement quantifiable dans des conditions particulières comme lors de la mise en présence d'un substrat adapté. A titre d'exemples illustratifs et non limitatifs, on peut citer la biotine, la digoxygénine, la 5-bromodéoxyuridine, une phosphatase alcaline, une peroxydase, une glucose amylase et une lysozyme.
Dans une 2eme forme de mise en œuvre du groupement facilement détectable, ce dernier peut être un marqueur fluorescent, chimiofluorescent ou bioluminescent tel que la cyanine et ses dérivés, la fluorescéine et ses dérivés, la rhodamine et ses dérivés, la GFP (pour « Green Fluorescent Protein ») et ses dérivés, la coumarine et ses dérivés et l'umbelliférone ; le luminol ; la luciférase et la luciférine.
Dans une 3eme forme de mise en œuvre du groupement facilement détectable, ce dernier peut être un marqueur ou isotope radioactif ou un groupement organique contenant au moins un marqueur ou isotope radioactif. Un tel marqueur ou isotope radioactif est notamment l'iode-123, l'iode-125, l'iode-126, l'iode-133, l'iode-131, l'iode-124, l'indium-111, l'indium-113m, le brome-77, le brome-76, le gallium-67, le gallium-68, le ruthénium-95, le ruthénium-97, le technétium-99m, le fluor-19, le fluor-18, le carbone-13, l'azote- 15, l'oxygène-17, l'oxygène-15, l'oxygène-14, le scandium-47, le tellurium-122m, le thulium-165, l'yttrium-199, le cuivre-64, le cuivre-62, le carbone-11, l'Pazote- 13, le gadolidium-68 et le rubidium-82. Dans une 4eme forme de mise en œuvre du groupement facilement détectable, ce dernier peut être un marqueur paramagnétique ou ferromagnétique tel que du 2,2,6,6-tétraméthylpipéridine N-oxyde (TEMPO) ou un complexe capable de chélater des ions paramagnétiques ou ferromagnétiques comme Gd3+, Cu2+, Fe3+, Fe2+ et Mn2+.
Dans une 5eme forme de mise en œuvre du groupement facilement détectable, ce dernier peut être une particule d'or ou un composé dense tel qu'une nanoparticule et notamment, à titre d'exemple, une (nano)particule d'oxyde ferrique ou d'or.
Ainsi, la détection lors de l'étape (c2) selon l'invention peut être réalisée notamment par mesures colorimétriques, de (chimio)fluorescence, de bioluminescence, radioactives, ferromagnétiques, paramagnétiques et/ou électriques.
Avantageusement, cette détection est effectuée en mesurant la variation d'absorbance, de (chimio)fluorescence, de (bio)luminescence, de radioactivité, de ferromagnétisme ou de paramagnétisme du système microfluidique 3D selon la présente invention ou du moins d'un des spots qu'il présente lorsque ce système est mis en contact avec une solution d'intérêt contenant le (ou les) analyte(s) tel(s) que précédemment défini(s). A titre d'exemples, lorsque la détection est réalisée par mesure optique, on choisit de préférence la longueur d'onde pour laquelle l'absorbance, la (chimio)fluorescence ou la (bio)luminescence du réactif tel qu'une molécule-sonde, ou du produit formé par l'interaction ou la réaction entre le réactif et l'analyte détecté est la plus élevée.
En variante, cette détection est effectuée en mesurant la variation du signal électrique émis par le système microfluidique 3D selon la présente invention ou du moins l'un des spots qu'il présente lorsque ce système est mis en contact avec une solution d'intérêt contenant le (ou les) analyte(s) tel(s) que précédemment défini(s). La détection électrique et éventuellement optique, colorimétrique, de (chimio)fluorescence, de bioluminescencee, radioactive, ferromagnétique ou paramagnétique peut nécessiter que le système microfluidique 3D selon la présente invention soit déposé sur un système de détection incluant des pistes électriques notamment en cuivre ou en or ou que l'étage de détection du système microfluidique 3D selon la présente invention comprenne des pistes électriques notamment en cuivre ou en or, protégées de l'oxydation notamment par le dépôt de parylène. Ces connectiques électriques peuvent servir pour des détections électriques ou pour intégrer des systèmes plus complexes comme des diodes pour stimuler la fluorescence ou la phosphorescence du réactif tel qu'une molécule-sonde, ou du produit formé par l'interaction ou la réaction entre le réactif et l'analyte détecté sur le site de la détection.
Quelle que soit la nature de la mesure effectuée, cette dernière peut être comparée à la mesure obtenue à partir de solutions calibrées d'analytes connus pour donner directement une information sur la quantité et/ou la nature du (ou des) analyte(s) contenu(s) dans la solution d'intérêt.
Dans une forme de mise en œuvre particulière, l'exposition du système microfluidique 3D selon la présente invention à une solution liquide peut donner lieu à une observation visuelle, photographique ou via un scanner. Dans ce cas, une comparaison de l'intensité de la coloration développée avec celles préalablement établies lors d'un étalonnage pour une gamme prédéfinie de concentrations, permet de déduire grossièrement la concentration de l'analyte. Pour une mesure quantitative fine, une mesure de la variation d'absorption en un point ou sur une gamme spectrale large en fonction du temps de contact est nécessaire afin de déterminer une vitesse de formation du complexe coloré. La valeur de cette vitesse sera comparée à celles obtenues pour une gamme étalon dans les mêmes conditions.
Prélablement ou lors de l'étape de détection (c2), des solutions autres que la solution d'intérêt ou que le fluide gazeux peuvent devoir être déposées sur le système microfluidique 3D selon la présente invention. En effet, des solutions de lavage pour éliminer toute liaison non spécifique impliquant le réactif, une solution contenant le réactif secondaire ou des solutions contenant un substrat ada pté à une enzyme portée par l'analyte ou le réactif secondaire peuvent devoir être déposées sur le système microfluidique 3D selon l'invention.
La présente invention concerne enfin l'utilisation d'un système microfluidique 3D tel que précédemment défini ou susceptible d'être préparé par un procédé de fabrication tel que précédemment défini pour purifier un analyte présent dans une solution d'intérêt ou dans un fluide gazeux d'intérêt. En d'autres termes, la présente invention concerne un procédé pour purifier au moins un analyte présent dans une solution d'intérêt ou un fluide gazeux d'intérêt, comprenant les étapes consistant à :
a3) éventuellement préparer un système microfluidique 3D apte à purifier ledit analyte selon un procédé de fabrication tel que précédemment défini ;
b3) déposer, sur ledit système microfluidique 3D éventuellement préparé à l'étape (a3), ladite solution d'intérêt ou mettre en contact ledit fluide gazeux d'intérêt avec ledit système microfluidique 3D éventuellement préparé à l'étape (a3) ; et
c3) purifier ledit analyte.
Tout ce qui a été décrit, dans le cadre du procédé de détection et d'éventuelle quantification, quant à l'étape (a2), à l'étape (b2), à l'analyte à détecter et éventuellement à quantifier et à la solution d'intérêt s'applique également mutatis mutandis à l'étape (a3), à l'étape (b3), à l'analyte à purifier et à la solution d'intérêt dans le procédé de purification selon la présente invention.
En effet, dans une lere forme de mise en œuvre, le procédé de purification selon l'invention peut nécessiter l'utilisation d'un système microfluidique comprenant au moins un réactif apte à reconnaître l'analyte à purifier de manière spécifique. La purification lors de l'étape (c3) est réalisée en récupérant l'analyte de la paire de liaison formée par ce dernier et le réactif.
Dans une 2nde forme de mise en œuvre, le procédé de purification selon l'invention ne met pas en œuvre un réactif spécifique de l'analyte tel que précédemment défini. Mais, dans cette forme de mise en œuvre, la purification se fait par élimination progressive des constituants de la solution d'intérêt, autres que l'analyte à purifier. Ainsi, l'étape (a3), lorsqu'elle doit être mise en œuvre, consiste à préparer un système microfluidique 3D dont une (ou plusieurs) couche(s) comprend(comprennent) un (ou plusieurs) composé(s) apte(s) à piéger un (ou plusieurs) des constituants de la solution d'intérêt, autres que l'analyte à purifier. Dans cette forme de mise en œuvre, l'étape (c3) du procédé consiste à récupérer l'analyte au niveau d'au moins une couche inférieure du système microfluidique 3D.
Dans le cadre de l'utilisation du système microfluidique 3D selon la présente invention dans le domaine de la purification, des membranes polymères poreuses possédant des groupes échangeurs d'anions ou de cations peuvent être mises en œuvre pour réaliser une purification par chromatographie échangeuse d'ions. Il est également possible d'utiliser des membranes polymères poreuses ou d'autres matériaux poreux modifiés préalablement par des molécules organiques ou biologiques spécifiques afin de réaliser de la chromatographie d'affinité.
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront encore à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous donnés à titre il lustratif et non limitatif, en référence aux figures annexées.
BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS
La Figure 1 est une schématisation de différentes parties support, utilisables dans un système microfluidique 3D selon l'invention. La Figure 2 est une schématisation de différentes parties de type canal fluidique, utilisables dans un système microfluidique 3D selon l'invention.
La Figure 3 est une schématisation d'un système microfluidique selon l'invention avec les différentes couches le constituant, la goutte symbolisant la solution d'intérêt à analyser ou à purifier et la flèche le sens de migration de l'échantillon.
La Figure 4 présente un boîtier dans lequel le système microfluidique 3D selon l'invention peut être inséré.
La Figure 5 présente des résultats susceptibles d'être obtenus pour différentes solutions d'intérêt (Figures 5B, 5C, 5D, 5E et 5F) en utilisant un système microfluidique selon l'invention tel que décrit à la Figure 5A.
La Figure 6 présente les différents étages (Figure 6A, 6B et 6C) avec la 2eme partie emboîtée dans le 1er support avant assemblage d'un système microfluidique 3D à 3 étages (ou couches).
La Figure 7 présente les différents étages (Figures 7A, 7B, 7C, 7D et
7E) avec la (ou les) 2eme(s> partie(s) emboîtée(s) dans le 1er support avant assemblage d'un système microfluidique 3D à 5 étages (ou couches).
La Figure 8 présente un système global après assemblage avec la Figure 8A présentant le dessus du système au niveau duquel est introduite la solution d'intérêt à analyser et la Figure 8B l'étage de lecture des résultats.
La Figure 9 est une schématisation d'un système microfluidique selon l'invention utilisé pour la détection de toxine botulique A (Figure 9A) et de la couche de détection de ce système (Figure 9B).
La Figure 10 présente les résultats obtenus avec une solution d'intérêt contenant (Figure 10B) ou non (Figure 10A) de la toxine botulique A.
La Figure 11 est une représentation, couche par couche, des éléments en matériau hydrophobe poreux et des éléments en matériau hydrophile poreux, seuls ou associés ensemble constituant un système microfluidique 3D à réservoir intégré et à double spirale. La Figure 12 est la représentation du système microfluidique 3D à réservoir intégré et à double spirale obtenu à partir des éléments présentés à la Figure 11.
La Figure 13 est un schéma de la migration de l'échantillon dans la canule vide et les canaux poreux hydrophiles du système microfluidique de la Figure 12.
La Figure 14 est une vue de dessus du système microfluidique 3D à réservoir intégré et à double spirale (couche (1)), une fois un échantillon d'intérêt introduit dans ce dernier.
EXPOSÉ DÉTAILLÉ DE MODES DE RÉALISATION PARTICULIERS
I. Préparation d'un système microfluidique 3D selon l'invention.
Le système microfluidique 3D selon la présente invention décrit ci- après est un système adapté pour les solutions d'intérêt hydrophiles.
1.1. Préparation des parties support des couches du système.
La Figure 1 présente les « négatifs » (1, 3, 5, 7 et 9) réalisés dans une feuille polymère de type PET avec un ou deux évidement(s) par négatif, de formes identiques ou différentes, obtenus après découpe manuelle type emboutissage ou par imprimante à laser C02.
Trois de ces 5 « négatifs » forment les parties support telles que précédemment définies des couches du système (cf. Figure 3).
1.2. Préparation des parties de type « canal fluidique » des couches du système.
La Figure 2 présente les « positifs » (10, 11 et 12) réalisés dans une feuille de papier ou en fibre de verre, obtenus après découpe manuelle type emboutissage ou par imprimante à laser C02. Ces 3 types de « positifs » forment les parties de type canal fluidique qui s'emboîtent dans les évidements des « négatifs » préparés au point 1.1.
1.3. Montage du système et système ainsi obtenu.
Le montage du dispositif se fait par :
1/ emboîtement de la pièce hydrophile découpée (« positif ») dans le matériau hydrophobe (« négatif »), l'ensemble constituant une couche mixte du système selon l'invention ;
2/ collage sur la surface de cette couche mixte de l'adhésif double face découpé pour laisser des évidements au niveau du canal fluidique ;
3/ positionnement d'une nouvelle couche mixte sur la surface de l'adhésif.
Les étapes 2 et 3 peuvent être répétées autant de fois que nécessaire. Un système microfluidique 3D pouvant être obtenu à partir des
« négatifs » et des « positifs » des Figures 1 et 2 est présenté à la Figure 3.
Les couches (1) et (9) de ce système ne constituent pas des couches avec une lere et au moins une 2nde parties telles que définies dans la présente invention. En effet, les évidements de la partie support sont laissés en l'état, sans qu'un « positif » n'y soit emboîté. Par contre, les couches (3), (5) et (7) dans lesquelles sont respectivement emboîtés un « positif » (10), deux « positifs » (11) et deux « positifs » (12) sont bien des couches avec une lere et au moins une 2nde parties telles que définies dans la présente invention.
Les couches (2), (4), (6) et (8) représentent le scotch® double-face respectivement placé entre les couches (1) et (3), (3) et (5), (5) et (7) et (7) et (9). Ces couches présentent des zones d'évidement pour garantir la continuité du canal fluidique. Certains de ces évidements sont laissés en l'état couches (2) et (8), alors que, dans les autres, sont emboîtés des « positifs » en matériau hydrophile. Ainsi, deux « positifs » (11) sont emboîtés dans les couches de scotch® (4) et (6).
Dans le système microfluidique présenté à la Figure 3, les couches en matériau hydrophobe ont des fonctions bien déterminées avec :
- la couche (1) qui est la couche sur laquelle l'échantillon de la solution d'intérêt à analyser ou à purifier représentée par une goutte est déposé ;
- la couche (3) qui est une couche permettant la division de l'échantillon, dans le cas présenté, en deux ;
- les couches (5) et (7) correspondant aux étages d'analyse ; et - la couche (9) qui participe au soutien des parties hydrophiles des étages supérieurs et notamment de l'étage (7).
L'ensemble de ces couches est déposé sur du papier absorbant pour maintenir la migration et l'ensemble du dispositif est inséré dans une petite boîte plastique telle que présentée à la Figure 4.
II. Exemple d'un système microfluidique 3D selon l'invention multiparamétrique.
La Figure 5A présente un système microfluidique selon l'invention avec 4 plots, de formes différentes facilitant notamment la lecture des résultats :
- avec un plot contrôle ;
- un plot dont la partie de type canal fluidique présente dans la couche d'analyse des anticorps anti-anthrax et donc apte à révéler, dans la solution d'intérêt à analyser, la présence d'anthrax « Plot Anthrax » ;
- un plot dont la partie de type canal fluidique présente dans la couche d'analyse des anticorps anti-ricine et donc apte à révéler la présence de ricine « Plot Ricine » avec dans la partie hydrophile ; et - un plot dont la partie de type canal fluidique présente dans la couche d'analyse des anticorps anti-toxine botulique A et donc apte à révéler la présence de toxine botulique A « Plot Toxine Botulique A ».
Les Figures 5B, 5C, 5D, 5E et 5F présentent le résultat théorique, obtenu pour un échantillon négatif pour les 3 agents testés ; un échantillon positif pour la toxine botulique A ; un échantillon positif pour l'anthrax ; un échantillon positif pour l'anthrax et pour la ricine ; et un échantillon réalisé dans des conditions non appropriées. III. Exemples d'élaboration d'un système présentant un étage de lecture multi-plots.
I II .1. Etage de lecture à 4 plots.
Les différents étages constituant la lere pa rtie support sont constitués de feuilles de PET de 100 pm d'épaisseur. Les différents étages ont été obtenus après découpe avec un laser C02 (Laser GCC Pro Spirit 25 watts). Le design a été effectué sur le logiciel Corel Draw 5.
La 2eme partie (système fluidique) a été obtenue après découpe de pa pier Whatman CF1 par un laser C02 (Laser GCC Pro Spirit 25 watts). Le design a été effectué sur le logiciel Corel Draw 5.
La Figure 6 présente les différents étages (Figure 6A, 6B et 6C) avec la
2eme partie emboîtée dans le 1er support avant assemblage. En particulier, les
Figures 6A, 6B et 6C correspondent respectivement aux étages de distribution, de répartition et d'analyse de la solution d'intérêt.
I II .2. Etage de lecture à 16 plots.
Les différents étages constituant la lere pa rtie support sont constitués de feuilles de PET de 100 pm d'épaisseur. Les différents étages ont été obtenus après découpe avec un laser C02 (Laser GCC Pro Spirit 25 watts). Le design a été effectué sur le logiciel Corel Draw 5. La 2eme partie (système fluidique) a été obtenue après découpe de papier Whatman CF1 par un laser C02 (Laser GCC Pro Spirit 25 watts). Le design a été effectué sur le logiciel Corel Draw 5.
La Figure 7 présente les différents étages (Figures 7A, 7B, 7C, 7D et 7E) avec la (ou les) 2eme(s) partie(s) emboîtée(s) dans le 1er support avant assemblage. En particulier, les Figures 7A, 7B, 7C, 7D et 7E correspondent respectivement à des étages de distribution, de répartition, de distribution, de répartition et d'analyse de la solution d'intérêt. III.3. Etage de lecture pour le pH à 16 plots.
Les différents étages constituant la lere partie support sont constitués de feuilles de PET de 100 μιη d'épaisseur. Les différents étages ont été obtenus après découpe avec un laser C02 (Laser GCC Pro Spirit 25 watts). Le design a été effectué sur le logiciel Corel Draw 5.
La 2eme partie (système fluidique) a été obtenue après découpe de papier pH Whatman par un laser C02 (Laser GCC Pro Spirit 25 watts). Le design a été effectué sur le logiciel Corel Draw 5.
La Figure 8 présente un système global après assemblage. La Figure
8A présente le dessus du système au niveau duquel est introduit la solution d'intérêt à analyser et la Figure 8B l'étage de lecture des résultats.
IV. Modification chimique de la cellulose pour le greffage covalent de biomolécules.
IV.1. Remarques préliminaires.
Les systèmes microfluidiques 3D selon l'invention peuvent incorporés l'étage de lecture du système.
Pour ce faire, la 2eme partie (i.e. le système fluidique qui peut être de la cellulose par exemple), doit être modifié afin de pouvoir y greffer, de manière covalente, des biolomécules ou des molécules organiques d'intérêt qui permettront d'obtenir l'information que l'on veut extraire de la solution d'intérêt.
L'homme du métier sait qu'il est extrêmement difficile de modifier la cellulose. Ces modifications ont généralement lieu sur de la cellulose sous forme de fibrilles dans des conditions incompatibles avec le vivant (solvant organique et températures élevées). De plus, il est quasi-impossible de travailler sur de la cellulose mise en forme, par exemple, sous la forme d'une feuille sans détruire la structure macroscopique du matériau.
Afin de contourner ces problèmes, les inventeurs ont développé des procédés permettant de modifier dans des conditions compatibles avec le vivant de la cellulose sous forme de feuilles sans altération de la structure macroscopique. Deux voies synthétiques ont été utilisées, la première basée sur une réduction en solution de sels de diazonium pour laquelle l'homme du métier peut trouver plus d'informations dans la demande internationale WO 2008/078052 [7] et l'autre basée sur une réaction photochimique à 385 nm utilisant des dérivés arylazides. Chacune de ces voies peut se dérouler, de manière préférentielle, dans l'eau ou dans des solutions de tampon biologique mais peut être également utilisée dans des systèmes de mélange de solvants ou bien en solvant organique. Ces deux voies ont permis d'introduire au niveau de la feuille de cellulose des fonctions permettant de greffer des molécules biologiques ou des molécules organiques dans des conditions biologiquement compatibles, du type acide carboxylique, aminé ou bien thiol.
De la même manière que ce qui est décrit dans la demande internationale WO 2008/078052 [7], un polymère présentant une fonction intéressante dans le cadre de la présente invention peut être greffé, de manière covalente, dans la cellulose sans déstructurer son format macroscopique et dans des conditions compatibles avec le vivant. Après modification d'une feuille de cellulose par ces procédés chimiques, le greffage des biomolécules s'effectue dans des conditions compatibles avec la biologie, bien connues de l'homme du métier.
I l est bien entendu que ces procédés peuvent être également utilisés pour la modification d'étages intermédiaires du système, si, par exemple, il y a nécessité de purifier de manière « active » (i.e. une purification via notamment une reconnaissance anticorps/antigène et non par tout procédé de type « passif » comme la taille de la porosité qui permet une purification mécanique) ou bien pour introduire tout groupe nécessaire au bon fonctionnement du système de microfluidique 3D comme, par exemple, l'introduction de groupes anioniques ou cationiques pour obtenir, à partir de cellulose, un équivalent d'une résine Séphadex.
IV.2. Greffage de groupements.
A. Greffage d'acide polyacrylique sur une feuille de papier (Exemple
A).
Une solution GraftFast™ pour greffer de l'acide acrylique est créée. Pour plus d'informations, l'expérimentateur peut se référer à la demande internationale WO 2008/078052 [7].
Quelques gouttes de la solution ainsi obtenue sont déposées sur un morceau de 2 cm x 2 cm d'une feuille de papier CF1 de chez Whatman. Après un temps de 1 à 6 h, le papier est alors rincé sur un fritté par de l'eau milliQ (10 mL), puis par une solution de soude à 1 M (10 mL) et enfin par de l'eau milliQ. (10 m L) avant d'être réacidifié avec une solution de HCI à 1 M (10 mL). Le papier est alors séché à l'air. L'analyse ATR FTI R montre bien la présence de la ba nde de vibration à 1710 cm"1 correspondante à la vibration du groupe acide carboxylique.
B. Greffage d'une couche de poly(carboxyl) phénylène sur du papier (Exemple B). L'acide 4 aminobenzoïque (Sigma Aldrich) (2 mmol, 274,3 mg) est transformé en sel de diazonium par ajout de ce composé dans une solution de HBF4 à 48% en présence d'1,1 équivalent de Na N02 (2,2 mmol, 151,8 mg) par rapport au dérivé de l'aniline. Le sel de diazonium est obtenu après précipitation dans l'éther et filtration.Le sel de diazonium correspondant est dissous dans une solution de HCI à 0,25 N puis 2 mL de H3P02 à 50% en masse sont introduits afin de provoquer la réduction des sels de diazonium en solution (pour plus d'information, voir [7]).
Quelques gouttes de la solution ainsi obtenue sont déposées sur un morceau de 2 cm x 2 cm d'une feuille de papier CF3 de chez Whatman. Après un temps de 1 à 6 h, le papier est a lors rincé sur un fritté par de l'eau milliQ (10 mL), puis par une solution de soude à 1 M (10 mL) et, enfin, par de l'eau milliQ. (10 m L) avant d'être réacidifié avec une solution de HCI à 1 M (10 mL). Le papier est alors séché à l'air.
C. Greffage d'une couche de poly(amino) phénylène sur du papier (Exemple C).
Le 1,4 benzènediamine (Sigma Aldrich) (2 mmol, 216,3 mg) est transformé en sel de diazonium par ajout de ce composé dans une solution de HBF4 à 48% en présence d'1,1 équivalent de Na N02 (2,2 mmol, 151,8 mg) par rapport au dérivé de l'aniline. Le sel de diazonium est obtenu après précipitation dans l'éther et filtration.
Le sel de diazonium correspondant est dissous dans une solution de HCI à 0,25 N puis 2 mL de H3P02 à 50% en masse sont introduits afin de provoquer la réduction des sels de diazonium en solution (pour plus d'information, voir [7]).
Quelques gouttes de la solution ainsi obtenue sont déposées sur un morceau de 2 cm x 2 cm d'une feuille de papier CF3 de chez Whatman. Après un temps de 1 à 6 h, le papier est alors rincé sur un fritté par de l'eau milliQ (10 m L) puis par une solution de soude à 1 M (10 mL) puis par de l'eau milliQ (10 mL) puis réacidifié avec une solution de HCI à 1 M (10 mL). Le papier est alors séché à l'air.
D. Greffage d'une couche de poly(éthyl carboxyl)phénylène sur du papier (Exemple D).
L'acide 3-(4-aminophényl)propionique (Sigma aldrich) (2 m mol, 330,4 mg) est transformé en sel de diazonium par ajout de ce composé dans une solution de HBF4 à 48% en présence d'1,1 équivalent de NaN02 (2,2 mmol, 151,8 mg) par rapport au dérivé de l'a niline. Le sel de diazonium est obtenu après précipitation dans l'éther et filtration.
Le sel de diazonium correspondant est dissous dans une solution de HCI à 0,25 N puis 2 mL de H3P02 à 50% en masse sont introduits afin de provoquer la réduction des sels de diazonium en solution (pour plus d'information, voir [7]).
Quelques gouttes de la solution ainsi obtenue sont déposées sur un morceau de 2 cm x 2 cm d'une feuille de papier CF3 de chez Whatman. Après un temps de 1 à 6 h, le papier est alors rincé sur un fritté par de l'eau milliQ. (10 m L) puis par une solution de soude à 1 M (10 mL) puis par de l'eau milliQ (10 mL) puis réacidifié avec une solution de HCI à 1 M (10 mL). Le papier est alors séché à l'air.
E. Greffage d'une couche de poly(éthylamino) phénylène sur du papier (Exemple E).
La 4-(2-aminoéthyl)aniline (Sigma Aldrich) (2 mmol, 272,4 mg) est transformée en sel de diazonium par ajout de ce composé dans une solution de HBF4 à 48% en présence d'1,1 équivalent de Na N02 (2,2 mmol, 151,8 mg) par rapport au dérivé de l'aniline.
Le sel de diazonium est obtenu après précipitation dans l'éther et filtration. Le sel de diazonium correspondant est dissous dans une solution de HCI à 0,25 N puis 2 m L de H3P02 à 50% en masse sont introduits afin de provoquer la réduction des sels de diazonium en solution (pour plus d'information, voir [7]).
Quelques gouttes de la solution ainsi obtenue sont déposées sur un morceau de 2 cm x 2 cm d'une feuille de papier CF3 de chez Whatman. Après un temps de de 1 à 6 h, le papier est alors rincé sur un fritté par de l'eau milNQ (10 mL) puis par une solution de soude à 1 M (10 mL) puis par de l'eau milNQ (10 mL) puis réacidifié avec une solution de HCI à 1 M (10 mL). Le pa pier est a lors séché à l'air. F. Greffage d'une couche de poly(thiol) phénylène sur du papier
(Exemple F).
Le 4-aminobenzènethiol (Sigma Aldrich) (2 mmol, 250,4 mg) est transformé en sel de diazonium par ajout de ce composé dans une solution de HBF4 à 48% en présence d'1,1 équivalent de Na N02 (2,2 mmol, 151,8 mg) par rapport au dérivé de l'aniline. Le sel de diazonium est obtenu après précipitation dans l'éther et filtration.
Le sel de diazonium correspondant est dissous dans une solution de HCI à 0,25 N puis 2 mL de H3P02 à 50% en masse sont introduits afin de provoquer la réduction des sels de diazonium en solution (pour plus d'information, voir [7]).
Quelques gouttes de la solution ainsi obtenue sont déposées sur un morceau de 2 cm x 2 cm d'une feuille de papier CF3 de chez Whatman. Après un temps de 1 à 6 h, le papier est alors rincé sur un fritté par de l'eau milliQ (10 m L) puis par une solution de soude à 1 M (10 mL) puis par de l'eau milliQ (10 mL) puis réacidifié avec une solution de HCI à 1 M (10 mL). Le papier est alors séché à l'air.
G. Greffage d'une couche d'aminoaryl sur du papier (Exemple G). La 1,4 benzènediamine (Sigma Aldrich) est transformée en sel de diazonium par ajout de ce composé dans une solution de HBF4 à 48% en présence d'1,1 équivalent de Na N02 (2,2 mmol, 151,8 mg) par rapport au dérivé de l'aniline. Le sel de diazonium est obtenu après précipitation da ns l'éther et filtration.
Le sel de diazonium est ensuite resuspendu da ns de l'éther à froid (4°C) puis 4 équivalents de NaN3 (4 mmol, 260 mg) sont ajoutés et la solution revient à la température pendant 3 h. La solution résultante est filtrée afin de se débarrasser des sels. L'éther est évaporé à sec pour donner l'arylazide correspondant.
Ce dernier est dissous dans l'eau ou da ns un tampon biologique comme le PBS ou le TRIS à l'abri de la lumière. Quelques gouttes de la solution ainsi obtenue sont déposées sur un morceau de 2 cm x 2 cm d'une feuille de papier CF3 ou CF1 de chez Whatman. Le pa pier est alors soumis à une irradiation à 385 nm pendant un temps variant de 1 à 5 min. Le papier est a lors rincé sur un fritté par de l'eau milliQ. (10 mL) puis par une solution de soude à 1 M (10 mL) et enfin par de l'eau milliQ (10 mL) avant d'être réacidifié avec une solution de HCI à 1 M (10 mL). Le papier est alors séché à l'air.
H. Greffage d'une couche de carboxylaryl sur du papier (Exemple H). L'acide 4 aminobenzoïque (Sigma Aldrich) est transformé en sel de diazonium par ajout de ce composé dans une solution de HBF4 à 48% en présence d'1,1 équivalent de Na N02 (2,2 mmol, 151,8 mg) par rapport au dérivé de l'aniline. Le sel de diazonium est obtenu après précipitation da ns l'éther et filtration.Le sel de diazonium est ensuite resuspendu dans de l'éther à froid (4°C) puis 4 équivalents de NaN3 (4 mmol, 260 mg) sont ajoutés et la solution revient à la température pendant 3 h. La solution résultante est filtrée afin de se débarrasser des sels. L'éther est évaporé à sec pour donner l'arylazide correspondant.
Ce dernier est dissous dans l'eau ou da ns un tampon biologique comme le PBS ou le TRIS à l'abri de la lumière. Quelques gouttes de la solution ainsi obtenue sont déposées sur un morceau de 2 cm x 2 cm d'une feuille de papier CF3 ou CF1 de chez Whatman. Le papier est alors soumis à une irradiation à 385 nm pendant un temps variant de 1 à 5 min. Le papier est a lors rincé sur un fritté par de l'eau milliQ. (10 mL) puis par une solution de soude à 1 M (10 mL) et enfin par de l'eau milliQ (10 mL) avant d'être réacidifié avec une solution de HCI à 1 M (10 mL). Le papier est alors séché à l'air.
J. Greffage d'une couche d'éthylaminoaryl sur du papier (Exemple J). La 4-(2-aminoéthyl)aniline (Sigma Aldrich) est transformée en sel de diazonium par ajout de ce composé dans une solution de HBF4 à 48% en présence d'1,1 équivalent de Na N02 (2,2 mmol, 151,8 mg) par rapport au dérivé de l'aniline. Le sel de diazonium est obtenu après précipitation da ns l'éther et filtration.
Le sel de diazonium est ensuite resuspendu da ns de l'éther à froid (4°C) puis 4 équivalents de NaN3 (4 mmol, 260 mg) sont ajoutés et la solution revient à la température pendant 3 h. La solution résultante est filtrée afin de se débarrasser des sels. L'éther est évaporé à sec pour donner l'arylazide correspondant.
Ce dernier est dissous dans l'eau ou da ns un tampon biologique comme le PBS ou le TRIS à l'abri de la lumière. Quelques gouttes de la solution ainsi obtenue sont déposées sur un morceau de 2 cm x 2 cm d'une feuille de papier CF3 ou CF1 de chez Whatman. Le pa pier est alors soumis à une irradiation à 385 nm pendant un temps variant de 1 à 5 min. Le papier est a lors rincé sur un fritté par de l'eau milliQ (10 mL) puis par une solution de soude à 1 M (10 mL) et enfin par de l'eau milliQ (10 mL) avant d'être réacidifié avec une solution de HCI à 1 M (10 mL). Le papier est alors séché à l'air. K. Greffage d'une couche d'éthylcarboxylaryl sur du papier (Exemple
K).
L'acide 3-(4-aminophényl)propionique (Sigma Aldrich) est transformé en sel de diazonium par ajout de ce composé dans une solution de HBF4 à 48% en présence d'1,1 équivalent de NaN02 (2,2 mmol, 151,8 mg) par rapport au dérivé de l'aniline. Le sel de diazonium est obtenu après précipitation dans l'éther et filtration.
Le sel de diazonium est ensuite resuspendu da ns de l'éther à froid (4°C) puis 4 équivalents de NaN3 (4 mmol, 260 mg) sont ajoutés et la solution revient à la température pendant 3 h. La solution résultante est filtrée afin de se débarrasser des sels. L'éther est évaporé à sec pour donner l'arylazide correspondant.
L'arylazide correspondant est dissous dans l'eau ou dans un tampon biologique comme le PBS ou le TRIS à l'abri de la lumière. Quelques gouttes de la solution ainsi obtenue sont déposées sur un morceau de 2 cm x 2 cm d'une feuille de papier CF3 ou CF1 de chez Whatman. Le papier est alors soumis à une irradiation à 385 nm pendant un temps variant de 1 à 5 min. Le papier est alors rincé sur un fritté par de l'eau milliQ (10 mL) puis par une solution de soude à 1 M (10 mL) et enfin par de l'eau milliQ. (10 mL) avant d'être réacidifié avec une solution de HCI à 1 M (10 mL). Le papier est alors séché à l'air.
L. Greffage d'une couche de thioaryl sur du papier (Exemple L).
Le 4-aminobenzènethiol (Sigma Aldrich) est transformé en sel de diazonium par ajout de ce composé dans une solution de HBF4 à 48% en présence d'1,1 équivalent de Na N02 (2,2 mmol, 151,8 mg) par rapport au dérivé de l'aniline. Le sel de diazonium est obtenu après précipitation da ns l'éther et filtration.
Le sel de diazonium est ensuite resuspendu da ns de l'éther à froid (4°C) puis 4 équivalents de NaN3 (4 mmol, 260 mg) sont ajoutés et la solution revient à la température pendant 3 h. La solution résultante est filtrée afin de se débarrasser des sels. L'éther est évaporé à sec pour donner l'arylazide correspondant.
L'arylazide correspondant est dissous dans l'eau ou dans un tampon biologique comme le PBS ou le TRIS à l'abri de la lumière. Quelques gouttes de la solution ainsi obtenue sont déposées sur un morceau de 2 cm x 2 cm d'une feuille de papier CF3 ou CF1 de chez Whatman. Le papier est alors soumis à une irradiation à 385 nm pendant un temps variant de 1 à 5 min. Le papier est alors rincé sur un fritté par de l'eau milliQ (10 mL) puis par une solution de soude à 1 M (10 mL) et enfin par de l'eau milliQ (10 mL) avant d'être réacidifié avec une solution de HCI à 1 M (10 mL). Le papier est alors séché à l'air.
IV.3. Greffage d'anticorps.
A. sur les papiers des Exemples A, B, Q D, E, F, G, H et J.
Des anticorps anti-ricine, anti-entérotoxine B de Staphyloccocus
Aureus, antracis, anti-ovalbumine et anti-béta-lactoglobuline en solution dans du tampon PBS (1 mg/mL) sont mis en contact (200 μί) avec les papiers des Exemples A, B, C, D, E, F, G, H et J en présence d'une solution d'EDC/NHS (pour « l-ethyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide/N- hydroxysuccinimide) à 50 mM et sont incubés avec les papiers pendant 12 h à 4°C. Les papiers sont ensuite rincés avec du tampon PBS puis ils sont bloqués avec une solution de BSA dans le PBS.
B. sur les papiers des Exemples F et L.
Des anticorps anti-ricine, anti-entérotoxine B de Staphyloccocus Aureus, ant\-Bacillus antracis, anti-ovalbumine et anti-béta-lactoglobuline en solution dans du tampon PBS (1 mg/mL) sont mis en contact (200 μΐ) avec les papiers des Exemples F et L et sont incubés 12 h à 4°C. Les papiers sont ensuite rincés avec du tampon PBS puis ils sont bloqués avec une solution de BSA dans le PBS.
IV.4. Greffage sur du papier d'anticorps modifiés par un bras arylazide.
Des anticorps anti-ricine, anti entérotoxine B de Staphyloccocus Aureus, ant\-Bacillus antracis, anti-ovalbumine et anti-béta-lactoglobuline sont modifiés avec des linkers possédant un groupe arylazide comme le composé ANB- NOS ou le composé Sulfo-SANPAH (Pierce, Thermo Fisher) de formule :
Les anticorps ainsi obtenus sont purifiés par chromatographie. Du papier Whatman CFl est imbibé avec 100 pL d'une solution de ces anticorps modifiés (1 mg/mL) avec le groupe arylazide puis les échantillons sont soumis à une irradiation à 385 nm pendant un temps variant de 1 à 5 min.
I l faut noter que l'utilisation de ces groupes photo-activables permet de ne pas modifier ni altérer les biomolécules et leur activité biologique. Après la réaction photochimique, les papiers sont rincés avec du tampon PBS (1 mL).
V. Utilisation d'un système microfluidique 3D selon l'invention pour détecter la toxine botuliaue A.
V.l. Conception du système.
La Figure 9A présente les différentes couches du système microfluidique 3D selon l'invention. En faisant référence aux couches telles que décrites pour le système du point I, le système mis en œuvre pour détecter la toxine botulique comprend des couches (1) à (5) avec la partie support des couches (1), (3) et (5) en polymère PET et la (ou les) partie(s) de type canal fluidique des couches (3) et (5) en cellulose ou en nitrocellulose.
Les couches (2) et (4) sont réalisées en scotch® double-face avec l'évidement de la couche (2) laissé en l'état, alors que, dans les évidements de la couche (4), ont été emboîtées des parties en cellulose ou en nitrocellulose.
Comme précédemment décrit les feuilles de polymère et les feuilles de cellulose sont découpées suivant le même motif, l'un étant le négatif de l'autre. L'ensemble des feuilles est maintenu à l'aide de scotch® double face.
Enfin, comme présenté à la Figure 9B, la couche (5) correspondant à l'étage d'analyse présente des parties de type canal fluidique fonctionnalisées, pour l'une, par un anticorps anti-toxine botulique A produit par le CEA et, pour l'autre ci-après désigné « plot contrôle », par un anticorps chèvre anti-souris (Jackson Immunoresearch Laboratories Inc ; Code 115-005-004). La partie cana l fluidique de l'étage d'analyse (i.e. couche (5)) est en nitrocellulose et les différents anticorps ont été immobilisés sur cette dernière de façon directe, par interaction électrostatique et ce, sans autre étape que le dépôt de la solution d'anticorps.
V.2. Résultats obtenus.
Deux échantillons différents ont été testés sur des systèmes microfluidiques tels que préparés au point III.1.
Le 1er échantillon contient un anticorps de souris anti-toxine botulique
A marqué à l'or colloïdal (1 μg ; anticorps et marquage réalisé au CEA, Volland et al., 2007 [9])) sans toxine botulique A dans du tampon phosphate de potassium 0,1 M (pH 7,4) + NaCI 0,15 M + 1 mg/ml d'albumine bovine sérique + 0,01% d'azide de sodium. La Figure 10A présente le résultat obtenu suite au dépôt d'une goutte de 500 μΙ du 1er échantillon, seul le plot contrôle étant coloré.
Le 2nd échantillon contient un anticorps de souris anti-toxine botulique A marqué à l'or colloïdal (1 μg ; anticorps et marquage réalisé au CEA, Volland et al., 2007 [9])) et une région non toxique de la toxine botulique A reconnue par l'anticorps (100 ng/ml, protéine recombinante correspondant a u domaine de liaison de la toxine botulique A ; la préparation de cette protéine recombinante étant décrite par Tavallaie et al., 2004 [10]) dans du tampon phosphate de potassium 0,1 M (pH 7,4) + NaCI 0,15 M + 1 mg/ml d'albumine bovine sérique + 0,01% d'azide de sodium. La Figure 10B présente le résultat obtenu suite au dépôt d'une goutte de 500 μΙ du 2nd échantillon, les deux plots étant colorés.
Ces résultats montrent que la détection d'une toxine au niveau de la zone réactionnelle est réalisable.
VI. Préparation d'un système microfluidique 3D à réservoir intégré et double spirale selon l'invention.
Le système microfluidique 3D à réservoir intégré selon la présente invention décrit ci-après est un système adapté pour les solutions d'intérêt hydrophiles.
Les matériaux mis en œuvre et la réalisation des parties support et des parties de type « canal fluidique » sont tels que définis a ux paragraphes 1.1 et 1.2 ci-dessus. VI .1. Réalisation du réservoir intégré.
Un motif en creux est réalisé sur différents étages du dispositif. Ce motif en creux n'étant pas ultérieurement comblé par du matériau poreux hydrophile, l'empilement des étages permet de créer une cavité qui est en contact avec un matériau poreux hydrophile. L'échantillon est déposé dans le réservoir puis, par capillarité, il migre dans le matériau poreux hydrophile.
VI.2. Réalisation du motif en spirale.
Le circuit fluidique en spirale ou double spirale est découpé manuellement ou à l'aide d'une imprimante laser C02 :
- dans la matrice hydrophobe ou non poreuse, on récupère la matrice avec sa découpe en spirale ou double spirale qui constitue le « négatif du dispositif » ;
- dans le matériau hydrophile poreux, on récupère la pièce découpée en spirale ou double spirale qui constitue le « positif » du dispositif et
- dans l'adhésif, on récupère l'adhésif avec sa découpe.
VI.3. Montage du système et système ainsi obtenu.
Le montage du dispositif se fait par
1/ emboîtement de la pièce hydrophile découpée (« positif ») dans le matériau hydrophobe (« négatif »), l'ensemble constituant une couche mixte ;
2/ collage sur la surface de cette couche mixte de l'adhésif double face découpé ;
3/ positionnement d'une nouvelle couche mixte, d'une couche mixte comprenant au moins une zone évidée non comblée ou d'une couche support en matériau hydrophobe dont aucun des évidements n'est comblé sur la surface de l'adhésif,
les étapes 2 et 3 pouvant être répétées autant de fois que nécessaire.
Les différents éléments constituant les couches d'un système microfluidique 3D à réservoir intégré et à circuit fluidique en spirale et les couches assemblées obtenues sont présentés à la Figure 11 et le système microfluidique final est présenté à la Figure 12. A noter que les couches correspondant au scotch® double-face éventuellement présentes entre deux couches illustrées aux Figures 11 et 12 ne sont pas représentées sur ces dernières.
Les couches (1) et (9) de ce système ne constituent pas des couches avec une lere et au moins une 2nde parties telles que définies dans la présente invention. En effet, aucun des évidements de la couche (1) n'est comblé par une pièce hydrophile poreuse. Cette couche (1) est, d'une part, la couche au niveau de laquelle l'échantillon de la solution d'intérêt à analyser ou à purifier représentée par une goutte est introduit via un évidement circulaire non comblé et, d'autre part, la couche au niveau de laquelle d'autres évidements non comblés en vis-à-vis des zones de détection réalisées sur la double spirale de la couche (2) permettent la visualisation du signal qui révèle ou non la présence de l'agent recherché. De même, la couche support (9) est laissée en l'état participant, de fait, au soutien des parties hydrophiles des étages supérieurs.
De plus, le système des Figures 11 et 12 se caractérise par
(i) au niveau de la couche (2), une double spirale d'analyse en matériau hydrophile poreux au niveau duquel des zones de détection ont été réalisées notamment par mise en œuvre d'un ou plusieurs des protocoles décrits au paragraphe IV ;
(i) au niveau de la couche (6), un réservoir dont la base est formée par une partie du support de la couche (7) et les parois par les bords d'un des évidements de la couche (6), l'évidement du réservoir, bien que non comblé, présentant un élément en un matériau hydrophile poreux, et
(iii) au niveau de la couche (8), une matrice hydrophile correspond à du papier absorbant qui maintient le mouvement de l'échantillon dans le dispositif par capillarité et qui le conserve une fois que ce dernier a circulé sur tout le dispositif, la matrice hydrophile de cette couche (8) peut être considérée, de ce fait, comme une « poubelle biologique » ou comme un système à bas coût jouant le rôle d'une « pompe ». Les couches (1), (2), (3), (4) et (5) présentent toutes, un évidement non comblé, les évidements non comblés de ces couches étant centrés sur un axe commun et ayant un diamètre identique moyennant quoi ils forment un canal de type canule permettant de conduire l'échantillon de solution d'intérêt à analyser ou à purifier de la couche (1) jusqu'au réservoir de la couche (6).
En outre, les couches (3), (4) et (5) présentent toutes un 1er évidement comblé par un matériau hydrophile poreux permettant l'acheminement par capillarité de l'échantillon de solution d'intérêt à analyser ou à purifier du réservoir de la couche (6) jusqu'à la double spirale de la couche (2). Le matériau hydrophile poreux de ce 1er évidement comblé au niveau de la couche (5) est dans le prolongement du matériau hydrophile poreux présent au niveau du réservoir de la couche (6). Ces 1ers évidements ne présentent pas des formes identiques d'une couche à l'autre et ne sont pas forcément centrés sur un axe commun, la seule condition étant qu'il existe une continuité fluidique entre les matériaux hydrophiles poreux qui les comblent.
Enfin, les couches (3), (4), (5), (6) et (7) présentent, chacune, deux évidements de forme identique et comblés par un matériau hydrophile poreux, avantageusement par un même matériau hydrophile poreux ; ces deux évidements chacun dans la continuité fluidique d'une des extrémités de la double spirale de la couche (2) permettent d'acheminer, par capillarité, l'échantillon de solution d'intérêt, après sa mise en contact avec la spirale en matériau hydrophile poreux de la couche (2) jusqu'au matériau hydrophile de la couche (8). Ces évidements ne présentent pas des formes identiques d'une couche à l'autre et ne sont pas forcément centrés sur deux axes communs, la seule condition étant qu'il existe une lere continuité fluidique entre les matériaux hydrophiles poreux qui comblent le 1er de ces évidements et une 2nde continuité fluidique entre les matériaux hydrophiles poreux qui comblent le 2nd de ces évidements.
Ainsi, dans le système présenté à la Figure 12, l'échantillon d'intérêt est en contact ou traverse plusieurs couches plusieurs fois, une lere fois pour aller jusqu'au réservoir de la couche (6) (sens descendant), une 2n e fois pour aller du réservoir de la couche (6) jusqu'à la couche (2) d'analyse (sens ascendant) et une 3eme et dernière fois pour aller de la couche d'analyse (2) jusqu'à la couche (8) « poubelle ». La Figure 13 schématise chronologiquement le mouvement de l'échantillon dans le système de la Figure 12.
Comme expliqué précédemment, la double spirale de la couche peut être fonctionnalisée par différents réactifs ou composés aptes à détecter ou piéger un constituant ou un analyte éventuellement présent dans la solution d'intérêt à analyser. Plus particulièrement, cette fonctionnalisation par des réactifs ou composés différents se fait au niveau de zones particulières de la double spirale. La Figure 14 présente l'information qui peut être obtenue en regardant la couche (1) du système de la Figure 12. Ainsi, à partir d'un échantillon d'intérêt déposé sur le système selon l'invention qui n'est divisé en deux qu'au niveau de la double spirale, il est possible d'obtenir une information pour 16 constituants ou analytes présents ou non dans cet échantillon (16 plots de la Figure 14).
BIBLIOGRAPHIE
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2. Martinez, A. et al., 2008, « Three-dimensional microfluidic devices fabricated in layered paper and tape », PNAS, vol. 105, pages 19606-19611.
3. Li, X. et al. , « Fabrication of paper-based microfluidic sensors by printing », Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, pages 564-570.
4. Lu, Y. et al., 2010, « Fabrication and characterization of paper- based microfluidics prepared in nitrocellulose membrane by wax printing », Anal. Chem., vol. 82, pages 329-335.
5. Demande internationale WO 2011/000047, au nom de Monash University, publiée le 6 janvier 2011.
6. Demande internationale WO 2010/003188, au nom de Monash University, publiée le 14 janvier 2010.
7. Demande internationale WO 2008/078052, au nom du CEA, publiée le 3 juillet 2008. 8. Demande internationale WO 2009/1211944, au nom du CEA, publiée le 8 octobre 2009. 9. Volland H., et al., 2008, « A sensitive sandwich enzyme immunoassay for free or complexed Clostridium botulinum neurotoxin type A. », J. Immunol. Methods, vol. 330, pages 120-129. 10. Tavallaie, M., et al., 2004. « Interaction between the two subdomains of the C-terminal part of the botulinum neurotoxin A is essential for the génération of protective antibodies. », FEBS Lett., vol. 572, page 299.

Claims

REVENDICATIONS
1) Système microfluidique tridimensionnel (ou 3D) comprenant une pluralité de couches empilées les unes sur les autres, caractérisé en ce qu'au moins une desdites couches est constituée d'une lere et d'au moins une 2nde parties, distinctes l'une de l'autre, avec la 2nde partie poreuse et mouillable par une solution d'intérêt, préalablement découpée, s'emboîtant dans un évidement de la lere partie non poreuse et/ou non mouillable par ladite solution d'intérêt, ladite 2nde partie servant de canal fluidique assurant le transfert de ladite solution d'intérêt par effet de capillarité dans le plan et/ou l'épaisseur de dudit système.
2) Système microfluidique 3D selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite lere partie est :
- poreuse et hydrophobe ;
- non poreuse et hydrophile ; ou
- non poreuse et hydrophobe ;
la (ou les) 2nde(s) partie(s) étant hydrophile(s) et poreuse(s).
3) Système microfluidique 3D selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ladite lere partie est choisie dans le groupe constitué par un film, poreux ou non poreux, de polyéthylène téréphtalate (PET) ; une membrane, poreuse ou non poreuse, de polyéthylène (PE) ; une membrane, poreuse ou non poreuse, de polypropylène (PP) ; un film, poreux ou non poreux, ou une membrane, poreuse ou non poreuse, contenant du fluor telle qu'un film, poreux ou non poreux, ou une membrane, poreuse ou non poreuse, en polyfluorure de vinylidène (PVDF) hydrophobe ; une membrane, poreuse ou non poreuse, de polytétrafluoroéthylène (PTFE) ; un film copolymère, poreux ou non poreux, comprenant du fluorure de vinylidène et du tétrafluoroéthylène ; un film, poreux ou non poreux, copolymère comprenant du fluorure de vinylidène et de l'hexafluoropropylène ; un film, poreux ou non poreux, de polyméthacrylate de méthyle (PMMA) ; un film, poreux ou non poreux, de poly(n-butyl acétate) ; un film, poreux ou non poreux, de poly(benzyl méthacrylate) ; un film, poreux ou non poreux, de poly(chlorotrifluoroéthylène) ; une membrane poreuse et, notamment une membrane poreuse echangeuse d'ions, fonctionnalisée par des groupements hydrophobes ; un polymère styrénique comme une résine polystyrène avantageusement poreuse ; un film, poreux ou non poreux, de polyacrylonitrile ; un film, poreux ou non poreux, de polyméthacrylonitrile ; un film, poreux ou non poreux, de polyimide tel que du Kapton® et un de leurs mélanges.
4) Système microfluidique 3D selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ladite 2nde partie est choisie dans le groupe constitué par du papier notamment de nature cellulosique ; du papier coton ; de l'agarose ; de la gélatine ; de la cellulose ; de la méthylcellulose ; de la carboxyméthylcellulose ; de la nitrocellulose ; de l'ester acétate de cellulose ; un alginate ; une polyoléfine ; une membrane poreuse et, notamment une membrane poreuse, échangeuse d'ions, fonctionnalisée par des groupements hydrophiles telle qu'une membrane NAFION ; une résine de type Séphadex conditionnée en membrane ou une membrane de PVDF ; un tissu en fibre de verre ; un gel de polyacrylamide ; un gel de sépharose ou un de leurs mélanges.
5) Système microfluidique 3D selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite lere partie est :
- poreuse et hydrophile ;
- non poreuse et hydrophile ; ou
- non poreuse et hydrophobe ;
la (ou les) 2nde(s) partie(s) étant hydrophobe(s) et poreuse(s). 6) Système microfluidique 3D selon la revendication 1 ou 5, caractérisé en ce que ladite lere partie est choisie dans le groupe constitué par du papier ; du papier coton ; de l'agarose ; de la gélatine ; de la cellulose ; de la méthylcellulose ; de la carboxyméthylcellulose ; de la nitrocellulose ; de l'ester acétate de cellulose ; un alginate ; une polyoléfine ; une membrane et, notamment une membrane echangeuse d'ions, fonctionnalisée, avantageusement par radiogreffage, par des groupements hydrophiles telle qu'une membrane NAFION ; une résine de type Séphadex conditionnée en membrane ou une membrane de PVDF ; un tissu en fibre de verre ; un film non poreux de polyéthylène téréphtalate (PET) ; une membrane non poreuse de polyéthylène (PE) ; une membrane non poreuse, de polypropylène (PP) ; un film non poreux de polyimide tel que du Kapton® ; un gel de polyacrylamide ; un gel de sépharose ou un de leurs mélanges. 7) Système microfluidique 3D selon l'une quelconque des revendications 1, 5 ou 6, caractérisé en ce que ladite 2nde partie est choisie dans le groupe constitué par du papier rendu hydrophobe par traitement, un film poreux de polyéthylène téréphtalate (PET) ; une membrane poreuse de polyéthylène (PE) ; une membrane poreuse de polypropylène (PP) ; un film poreux ou une membrane poreuse contenant du fluor telle qu'un film poreux ou une membrane poreuse en polyfluorure de vinylidène (PVDF) hydrophobe ; une membrane poreuse de polytétrafluoroéthylène (PTFE) ; un film copolymère poreux comprenant du fluorure de vinylidène et du tétrafluoroéthylène ; un film copolymère poreux comprenant du fluorure de vinylidène et de l'hexafluoropropylène ; un gel polyacrylamide ; un film poreux de polyméthacrylate de méthyle (PMMA) ; un film poreux de poly(n-butyl acétate) ; un film poreux de poly(benzyl méthacrylate) ; un film poreux de poly(chlorotrifluoroéthylène) ; une membrane poreuse et, notamment une membrane poreuse échangeuse d'ions, fonctionnalisée par des groupements hydrophobes ; un polymère poreux styrenique comme une résine polystyrène poreuse ; un film poreux de polyacrylonitrile ; un film poreux de polyméthacrylonitrile et un de leurs mélanges.
8) Système microfluidique 3D selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'au niveau d'au moins une couche constituée d'une lere partie et d'au moins une 2nde partie, distinctes l'une de l'autre, avec la 2nde partie poreuse et mouillable par une solution d'intérêt s'emboîtant dans un évidement de la lere partie non poreuse et/ou non mouillable par ladite solution d'intérêt, ladite lere partie présente en outre au moins un évidement non comblé.
9) Système microfluidique 3D selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une couche uniquement constituée d'un support non poreux et/ou non mouillable par une solution d'intérêt et évidé au niveau d'une ou plusieurs zones définies.
10) Système microfluidique 3D selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une couche dont au moins une 2nde partie joue le rôle de poubelle biologique.
11) Système microfluidique 3D selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une couche dont au moins une 2nde partie présente une forme en spirale ou en double spirale.
12) Système microfluidique 3D selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il présente, entre au moins deux couches consécutives, un élément apte à solidariser ces deux couches ensemble et/ou à garantir l'étanchéité entre ces deux couches.
13) Système microfluidique 3D selon la revendication 12, caractérisé en ce que ledit élément se présente sous forme d'un scotch® double face, d'un film étirable du type film etirable micro-onde Saran ou d'un dérivé d'un primaire d'adhésion supporté.
14) Dispositif comprenant un système microfluidique 3D tel que défini à l'une quelconque des revendications précédentes.
15) Procédé de fabrication d'un système microfluidique 3D tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 13, ledit procédé comprenant les étapes consistant à :
ai) préparer, dans une couche d'un matériau non poreux et/ou non mouillable par une solution d'intérêt, un évidement ;
bi) découper, dans une couche d'un matériau poreux et mouillable par ladite solution d'intérêt, au moins une forme conforme à l'évidement préparé à l'étape (ai) ;
Ci) emboîter dans l'évidement préparé à l'étape (ai) la forme découpée à l'étape (bi), moyennant quoi une couche dudit système microfluidique 3D est obtenue ;
di) éventuellement répéter les étapes (ai), (bi) et (ci) ; et ei) assembler les différentes couches du système microfluidique 3D.
16) Procédé de fabrication selon la revendication 15, caractérisé en ce que, lors de ladite étape (ai), ledit évidement présente une section par rapport au plan de la couche en forme de spirale ou de double spirale. 17) Utilisation d'un système microfluidique 3D tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 13 ou susceptible d'être préparé par un procédé de fabrication selon la revendication 15 ou 16 pour détecter et éventuellement quantifier au moins un analyte éventuellement présent dans une solution d'intérêt ou dans un fluide gazeux d'intérêt.
18) Utilisation d'un système microfluidique 3D tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 13 ou susceptible d'être préparé par un procédé de fabrication selon la revendication 15 ou 16 pour purifier au moins un analyte présent dans une solution d'intérêt ou dans un fluide gazeux d'intérêt.
19) Utilisation selon la revendication 17 ou 18, caractérisé en ce que ledit analyte est choisi dans le groupe constitué par une molécule d'intérêt biologique ; une molécule d'intérêt pharmacologique ; une toxine ; un glucide ; un peptide ; une protéine ; une glycoprotéine ; une enzyme ; un substrat enzymatique ; un récepteur nucléaire ou membranaire ; un agoniste ou un antagoniste d'un récepteur nucléaire ou membranaire ; une hormone ; un anticorps polyclonal ou monoclonal ; un fragment d'anticorps tel qu'un fragment Fab, F(ab')2, Fv ou un domaine hypervariable ou CDR pour « Complementarity Determining Région » ; une molécule nucléotidique ; un polluant, avantageusement organique, de l'eau ; un polluant, avantageusement organique, de l'air ; une bactérie et un virus.
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