JP6877009B2 - 細胞培養容器及び観察用試料セル - Google Patents
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Description
本発明は、細胞培養容器及び観察用試料セルに関し、特に三次元培養した細胞の観察可能な細胞培養容器に関する。
培養ゲル中で細胞組織を三次元培養することにより血管組織、気管支組織などを形成する研究が行われている（例えば、特許文献１〜３参照）。これらの研究では、通常、ディッシュ中又はウェル中に厚い培養ゲル層を形成し、この培養ゲル層に細胞又は細胞組織を包埋して細胞組織を培養している。培養した細胞組織の観察手法としては、倒立型顕微鏡又は正立型顕微鏡で培養ゲル層の下側又は上側から細胞組織を観察する手法が取られている。また、培養した細胞組織の三次元画像の取得には、レーザー顕微鏡が用いられている（例えば、非特許文献１参照）。
Science 13 August 2004 vol. 305 pp 1007-1009
しかし、従来の細胞組織を三次元培養する研究では、上側又は下側からの細胞組織の明視野像しか得ることができないため、明視野像での細胞組織の三次元構造の認識が困難である。また高さ方向の厚みがある細胞組織の場合、細胞密度の濃い部分を光が透過しないため細胞組織の観察が困難である。また、レーザー顕微鏡による観察では、レーザーが細胞組織にダメージを与えるため長時間のライブ観察が難しいという問題がある。また、レーザー顕微鏡は高価である。さらにレーザー顕微鏡による三次元画像取得ではｚ軸方向の解像度に限界がある。
本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであり、様々な角度から三次元培養した細胞を観察することができる細胞培養容器／観察用試料セルを提供する。
本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであり、様々な角度から三次元培養した細胞を観察することができる細胞培養容器／観察用試料セルを提供する。
本発明は、細胞又は細胞組織を包埋する培養ゲルと、前記培養ゲルを内包する第１容器とを備え、前記培養ゲルは、第１容器内のスペースを満たし、第１容器は、ハイドロゲルからなる透光性の窓部を有することを特徴とする細胞培養容器を提供する。
また、本発明は、細胞又は細胞組織を包埋する培養ゲルと、前記培養ゲルを内包する第１容器とを備え、前記培養ゲルは、第１容器内のスペースを満たし、第１容器は、ハイドロゲルからなる透光性の窓部を有することを特徴とする観察用試料セルを提供する。
さらに、本発明は、細胞又は細胞組織を包埋する培養ゲルが充填される内部空間を有する第１容器を備え、第１容器は、ハイドロゲルからなる透光性の窓部を有することを特徴とする細胞培養容器も提供する。
また、本発明は、細胞又は細胞組織を包埋する培養ゲルと、前記培養ゲルを内包する第１容器とを備え、前記培養ゲルは、第１容器内のスペースを満たし、第１容器は、ハイドロゲルからなる透光性の窓部を有することを特徴とする観察用試料セルを提供する。
さらに、本発明は、細胞又は細胞組織を包埋する培養ゲルが充填される内部空間を有する第１容器を備え、第１容器は、ハイドロゲルからなる透光性の窓部を有することを特徴とする細胞培養容器も提供する。
本発明の細胞培養容器／観察用試料セルは細胞又は細胞組織を包埋する培養ゲルを備えるため、培養ゲル中で細胞組織を三次元培養することができる。
本発明の細胞培養容器／観察用試料セルは培養ゲルを内包する第１容器を備え、培養ゲルは第１容器内のスペースを満たすため、第１容器中に培養ゲル及び細胞組織を閉じ込めることができ、第１容器内で培養ゲルが流動すること及び細胞組織の相対位置がずれることを抑制することができる。このことにより、細胞組織の相対位置がずれることを抑制して第１容器を水平方向、鉛直方向又は斜め方向に回転させることができる。
第１容器は、透光性を有する窓部を有するため、第１容器内部の細胞組織を窓部から顕微鏡などにより観察することができる。また、細胞組織の相対位置がずれることを抑制して第１容器を回転させることができるため、様々な角度から細胞組織を観察することができ、細胞組織の三次元的な立体形状を容易に明らかにすることができる。また、レーザー顕微鏡を用いて様々な角度から細胞組織を観察することが可能になるため、ｘ軸方向、ｙ軸方向、ｚ軸方向のすべてで解像度の高い細胞組織の三次元画像を取得することが可能になる。
第１容器の窓部はハイドロゲルからなるため、第１容器の外部の液体培地から培養に必要なタンパク質（分子量：数万〜数十万）などを窓部を介して培養ゲル及び細胞組織に供給することができる。このことにより、第１容器の内部の細胞組織の活性を長期間維持することが可能になる。また、培養ゲルが液体培地を吸収し膨潤することを抑制することができ、細胞組織の相対位置がずれることを抑制することができる。
本発明の細胞培養容器／観察用試料セルは、例えば、生物学、医学、薬学などに関する研究、再生医療、創薬などに利用することができる。
本発明の細胞培養容器／観察用試料セルは培養ゲルを内包する第１容器を備え、培養ゲルは第１容器内のスペースを満たすため、第１容器中に培養ゲル及び細胞組織を閉じ込めることができ、第１容器内で培養ゲルが流動すること及び細胞組織の相対位置がずれることを抑制することができる。このことにより、細胞組織の相対位置がずれることを抑制して第１容器を水平方向、鉛直方向又は斜め方向に回転させることができる。
第１容器は、透光性を有する窓部を有するため、第１容器内部の細胞組織を窓部から顕微鏡などにより観察することができる。また、細胞組織の相対位置がずれることを抑制して第１容器を回転させることができるため、様々な角度から細胞組織を観察することができ、細胞組織の三次元的な立体形状を容易に明らかにすることができる。また、レーザー顕微鏡を用いて様々な角度から細胞組織を観察することが可能になるため、ｘ軸方向、ｙ軸方向、ｚ軸方向のすべてで解像度の高い細胞組織の三次元画像を取得することが可能になる。
第１容器の窓部はハイドロゲルからなるため、第１容器の外部の液体培地から培養に必要なタンパク質（分子量：数万〜数十万）などを窓部を介して培養ゲル及び細胞組織に供給することができる。このことにより、第１容器の内部の細胞組織の活性を長期間維持することが可能になる。また、培養ゲルが液体培地を吸収し膨潤することを抑制することができ、細胞組織の相対位置がずれることを抑制することができる。
本発明の細胞培養容器／観察用試料セルは、例えば、生物学、医学、薬学などに関する研究、再生医療、創薬などに利用することができる。
本発明の細胞培養容器／観察用試料セルは、細胞又は細胞組織を包埋する培養ゲルと、前記培養ゲルを内包する第１容器とを備え、前記培養ゲルは、第１容器内のスペースを満たし、第１容器は、ハイドロゲルからなる透光性の窓部を有することを特徴とする。
本発明の細胞培養容器／観察用試料セルに含まれる窓部は、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル、アルギン酸ナトリウム又はコラーゲンゲルを含むことが好ましい。
このことにより、窓部が透光性を有することができる。また、第１容器外部の液体培地に含まれるタンパク質などの栄養が窓部を透過することができ、培養ゲル及び細胞組織に栄養を供給することができる。また、第１容器を回転させた場合でも窓部が変形することを抑制することができる。
本発明の細胞培養容器／観察用試料セルに含まれる第１容器の形状は立方体をはじめとする直方体であることが好ましく、第１容器は各面に窓部を有することが好ましい。
このことにより、上下左右前後の６面から第１容器内部の細胞組織を観察することができ、三次元培養した細胞組織の三次元構造を把握することができる。また、顕微鏡のステージに第１容器を容易に設置することができ、細胞組織を容易に観察することができる。
このことにより、窓部が透光性を有することができる。また、第１容器外部の液体培地に含まれるタンパク質などの栄養が窓部を透過することができ、培養ゲル及び細胞組織に栄養を供給することができる。また、第１容器を回転させた場合でも窓部が変形することを抑制することができる。
本発明の細胞培養容器／観察用試料セルに含まれる第１容器の形状は立方体をはじめとする直方体であることが好ましく、第１容器は各面に窓部を有することが好ましい。
このことにより、上下左右前後の６面から第１容器内部の細胞組織を観察することができ、三次元培養した細胞組織の三次元構造を把握することができる。また、顕微鏡のステージに第１容器を容易に設置することができ、細胞組織を容易に観察することができる。
本発明の細胞培養容器／観察用試料セルに含まれる第１容器は、窓部を囲む枠部を有することが好ましい。
このことにより、第１容器の強度を大きくすることができ、細胞培養容器／観察用試料セルの取り扱いが容易になる。また、窓部が傷つくことを抑制することができる。
本発明の細胞培養容器は液体培地を溜める第２容器をさらに備えることが好ましく、第１容器は液体培地中に配置されることが好ましい。
このことにより、第２容器に溜めた液体培地に含まれるタンパク質などの栄養を窓部を介して培養ゲル及び細胞組織に供給することができる。このことにより、第１容器の内部の細胞組織の活性を長期間維持することが可能になる。また、第１容器を第２容器から容易に取り出すことができ、第１容器の外部容器を容易に交換することができる。このことにより、培養時と観察時で外部容器を変えることが可能になり、それぞれに適した外部容器を使用することが可能になる。
このことにより、第１容器の強度を大きくすることができ、細胞培養容器／観察用試料セルの取り扱いが容易になる。また、窓部が傷つくことを抑制することができる。
本発明の細胞培養容器は液体培地を溜める第２容器をさらに備えることが好ましく、第１容器は液体培地中に配置されることが好ましい。
このことにより、第２容器に溜めた液体培地に含まれるタンパク質などの栄養を窓部を介して培養ゲル及び細胞組織に供給することができる。このことにより、第１容器の内部の細胞組織の活性を長期間維持することが可能になる。また、第１容器を第２容器から容易に取り出すことができ、第１容器の外部容器を容易に交換することができる。このことにより、培養時と観察時で外部容器を変えることが可能になり、それぞれに適した外部容器を使用することが可能になる。
以下、本発明の一実施形態を図面を用いて説明する。図面や以下の記述中で示す構成は、例示であって、本発明の範囲は、図面や以下の記述中で示すものに限定されない。
図１は第１実施形態の細胞培養容器／観察用試料セルの概略斜視図であり、図２は図１の破線Ｘ−Ｘにおける細胞培養容器／観察用試料セルの概略断面図である。図３は、第２実施形態の細胞培養容器の概略断面図である。図４は、第３実施形態の細胞培養容器／観察用試料セルの概略断面図である。図５（ａ）〜（ｃ）は、それぞれ第４〜第６実施形態の細胞培養容器／観察用試料セルの概略斜視図である。なお、本実施形態の細胞培養容器は、第１〜第６実施形態の細胞培養容器を含む。
本実施形態の細胞培養容器１０／観察用試料セル１０は、細胞７又は細胞組織７を包埋する培養ゲル６と、培養ゲル６を内包する第１容器１とを備え、培養ゲル６は、第１容器１内のスペースを満たし、第１容器１は、ハイドロゲルからなる透光性の窓部４を有することを特徴とする。
また、本実施形態の細胞培養容器１０は、細胞組織を三次元培養するための容器である。また、本実施形態の細胞培養容器１０は、細胞培養容器としての機能と観察用試料セルとしての機能の両方を有することができる。
なお、細胞７又は細胞組織７を包埋する培養ゲル６とは、細胞７又は細胞組織７を埋め込んだ培養ゲル６をいう。
本実施形態の細胞培養容器１０／観察用試料セル１０は、細胞７又は細胞組織７を包埋する培養ゲル６と、培養ゲル６を内包する第１容器１とを備え、培養ゲル６は、第１容器１内のスペースを満たし、第１容器１は、ハイドロゲルからなる透光性の窓部４を有することを特徴とする。
また、本実施形態の細胞培養容器１０は、細胞組織を三次元培養するための容器である。また、本実施形態の細胞培養容器１０は、細胞培養容器としての機能と観察用試料セルとしての機能の両方を有することができる。
なお、細胞７又は細胞組織７を包埋する培養ゲル６とは、細胞７又は細胞組織７を埋め込んだ培養ゲル６をいう。
本実施形態の細胞培養容器１０は、培養ゲルに包埋した細胞７又は細胞組織７を含むことができる。また、細胞組織７は、生細胞であってもよく、パラホルムアルデヒドなどで固定したものであってもよく、透過処理を施したものであってもよい。
また、本実施形態の細胞培養容器１０は、図３に示した第２実施形態の細胞培養容器１０のように第２容器２を有してもよい。
本実施形態の細胞培養容器１０は、観察用試料セル１０であってもよい。この場合、細胞培養容器１０（観察用試料セル）を顕微鏡にセットして、顕微鏡により培養ゲル６で培養した細胞組織７を観察することができる。細胞組織７を観察する顕微鏡は、光学顕微鏡であってもよく、レーザー顕微鏡であってもよい。
本実施形態の細胞培養容器１０は、細胞７又は細胞組織７を包埋する培養ゲル６が充填される内部空間１３を有する第１容器１を備え、第１容器１は、ハイドロゲルからなる透光性の窓部４を有するものであってもよい。この場合、細胞培養容器１０に培養ゲル６及び細胞７又は細胞組織７を充填した後に、細胞７などを培養し、観察することができる。また、この細胞培養容器１０は、第１容器１の内部空間１３に培養ゲル６などを注入するための開口１２を有することができる。この開口１２には、第１容器１の内部空間１３に培養ゲル６などを注入した後、ハイドロゲルからなる透光性の窓部４を形成することができる。細胞培養容器１０は、例えば、図１０、１１に示したような構成を有することができる。
以下、本実施形態の細胞培養容器１０／観察用試料セル１０について説明する。
また、本実施形態の細胞培養容器１０は、図３に示した第２実施形態の細胞培養容器１０のように第２容器２を有してもよい。
本実施形態の細胞培養容器１０は、観察用試料セル１０であってもよい。この場合、細胞培養容器１０（観察用試料セル）を顕微鏡にセットして、顕微鏡により培養ゲル６で培養した細胞組織７を観察することができる。細胞組織７を観察する顕微鏡は、光学顕微鏡であってもよく、レーザー顕微鏡であってもよい。
本実施形態の細胞培養容器１０は、細胞７又は細胞組織７を包埋する培養ゲル６が充填される内部空間１３を有する第１容器１を備え、第１容器１は、ハイドロゲルからなる透光性の窓部４を有するものであってもよい。この場合、細胞培養容器１０に培養ゲル６及び細胞７又は細胞組織７を充填した後に、細胞７などを培養し、観察することができる。また、この細胞培養容器１０は、第１容器１の内部空間１３に培養ゲル６などを注入するための開口１２を有することができる。この開口１２には、第１容器１の内部空間１３に培養ゲル６などを注入した後、ハイドロゲルからなる透光性の窓部４を形成することができる。細胞培養容器１０は、例えば、図１０、１１に示したような構成を有することができる。
以下、本実施形態の細胞培養容器１０／観察用試料セル１０について説明する。
１．培養ゲル
培養ゲル６は、培養ゲル６に包埋された細胞７又は細胞組織７を培養するためのゲルである。培養ゲル６に包埋する細胞は、一定のパターンで集合した構造を有する細胞組織であってもよく、このような組織構造を有さない細胞であってもよい。また、組織構造を有さない細胞７を培養することにより、細胞組織７が成長してもよい。
細胞７又は細胞組織７を培養ゲル６に包埋することにより、培養ゲル６を介して細胞７又は細胞組織７に栄養を供給することができる。また、培養ゲル６が細胞組織７の足場になることができ、細胞組織７が三次元的に成長することができる。
培養ゲル６は、例えば、コラーゲン、ラミニン、エンタクチン、プロテオグリカンなどを含むことができる。また、培養ゲル６は、ＴＧＦ−β、線維芽細胞増殖因子、組織プラスミノーゲン活性化因子などを含むことができる。さらに、培養ゲル６には、例えば、マトリゲル（登録商標）を用いることができる。
培養ゲル６は、第１容器１に内包され、外部の液体培地に直接接触しないため、培養ゲル６が液体培地を吸収し膨潤することにより細胞組織７の相対位置がずれることを抑制することができる。
培養ゲル６は、培養ゲル６に包埋された細胞７又は細胞組織７を培養するためのゲルである。培養ゲル６に包埋する細胞は、一定のパターンで集合した構造を有する細胞組織であってもよく、このような組織構造を有さない細胞であってもよい。また、組織構造を有さない細胞７を培養することにより、細胞組織７が成長してもよい。
細胞７又は細胞組織７を培養ゲル６に包埋することにより、培養ゲル６を介して細胞７又は細胞組織７に栄養を供給することができる。また、培養ゲル６が細胞組織７の足場になることができ、細胞組織７が三次元的に成長することができる。
培養ゲル６は、例えば、コラーゲン、ラミニン、エンタクチン、プロテオグリカンなどを含むことができる。また、培養ゲル６は、ＴＧＦ−β、線維芽細胞増殖因子、組織プラスミノーゲン活性化因子などを含むことができる。さらに、培養ゲル６には、例えば、マトリゲル（登録商標）を用いることができる。
培養ゲル６は、第１容器１に内包され、外部の液体培地に直接接触しないため、培養ゲル６が液体培地を吸収し膨潤することにより細胞組織７の相対位置がずれることを抑制することができる。
２．第１容器
第１容器１は、培養ゲル６を内包するように設けられる。また、細胞組織７を包埋した培養ゲル６が第１容器１内のスペースを満たす。このことにより、第１容器１中に培養ゲル６及び細胞組織７を閉じ込めることができ、第１容器１内で培養ゲル６が流動すること及び細胞組織７の相対位置がずれることを抑制することができる。また、細胞組織７の相対位置がずれることを抑制して第１容器１を水平方向、鉛直方向又は斜め方向に回転させることができる。さらに、第１容器１を設けることにより、細胞組織７を包埋した培養ゲル６の取り扱いが容易になる。このことにより、第１容器１を入れる外部容器を容易に交換することができる。例えば、多数のウェルを有するプラスチック材質のウェルプレート中に第１容器１を入れて細胞組織７を培養し、組織細胞７の蛍光画像などを取得する場合に、第１容器１をウェルプレートから取り出し、光透過性の高いガラス底面の外部容器に入れることができる。このことにより、明瞭な蛍光画像などを取得することができる。なお、プラスチック材質のウェルプレートは、光透過性の点から蛍光画像取得には適していない。また、撮影後は、第１容器１をウェルプレートに戻すことができる。
第１容器１は、培養ゲル６を内包するように設けられる。また、細胞組織７を包埋した培養ゲル６が第１容器１内のスペースを満たす。このことにより、第１容器１中に培養ゲル６及び細胞組織７を閉じ込めることができ、第１容器１内で培養ゲル６が流動すること及び細胞組織７の相対位置がずれることを抑制することができる。また、細胞組織７の相対位置がずれることを抑制して第１容器１を水平方向、鉛直方向又は斜め方向に回転させることができる。さらに、第１容器１を設けることにより、細胞組織７を包埋した培養ゲル６の取り扱いが容易になる。このことにより、第１容器１を入れる外部容器を容易に交換することができる。例えば、多数のウェルを有するプラスチック材質のウェルプレート中に第１容器１を入れて細胞組織７を培養し、組織細胞７の蛍光画像などを取得する場合に、第１容器１をウェルプレートから取り出し、光透過性の高いガラス底面の外部容器に入れることができる。このことにより、明瞭な蛍光画像などを取得することができる。なお、プラスチック材質のウェルプレートは、光透過性の点から蛍光画像取得には適していない。また、撮影後は、第１容器１をウェルプレートに戻すことができる。
第１容器１は、第１容器１を回転させても形状が変わらない強度を有することができる。また、第１容器１は閉鎖構造を有することができ、その内部のスペースを培養ゲル６及び細胞組織７が満たすことができる。
第１容器１の形状は、例えば、多面体であってもよい。このことにより、第１容器１が基準となる面を有することができ、細胞組織７の観察面を特定することが可能になる。このことにより、細胞組織７の三次元構造を特定する座標系を定めることができる。例えば３次元直交座標を定める場合、例えば、多面体における１つの平面を基準面とし、その平面に沿ってＸ−Ｙ座標を取り、当該平面に垂直にＺ座標をとることができる。また、多角形が互いに直交する３つの平面を持つ場合、その３つの平面を基準面として３次元直交座標系を定め定めてもよい。
第１容器１の形状は、図１〜４に示した第１容器１のように立方体であってもよく、図５（ａ）に示したように直方体であってもよく、図５（ｂ）に示したように六角柱であってもよい。また、第１容器１の形状は、図５（ｃ）に示したように円柱であってもよい。
また、第１容器１の形状は、４面体（三角錐）、５面体（三角柱、４角錐など）であってもよく、直方体以外の６面体（平行６面体、双三角錐など）、７面体（５角柱、６角錐など）、８面体（双四角錐など）であってもよい。また、１０面体（双五角錐など）１２面体（正１２面体、菱形１２面体、立方１２面体など）であってもよい。第１容器１における面の数はさらに多くてもよいが、各窓部４の面積を広く確保する観点から面の数はあまり多過ぎない方がよく、４面体、５面体、６面体、７面体、８面体が好ましい。特に６面体の場合は３方向に面積の大きな窓が面するので、３次元観察に適している。
第１容器１は、例えば、各辺の長さが１ｍｍ以上５ｃｍ以下となる大きさにすることができる。また、第１容器１の容量は、例えば、１μＬ以上１０ｍＬ以下とすることができる。
第１容器１の形状は、例えば、多面体であってもよい。このことにより、第１容器１が基準となる面を有することができ、細胞組織７の観察面を特定することが可能になる。このことにより、細胞組織７の三次元構造を特定する座標系を定めることができる。例えば３次元直交座標を定める場合、例えば、多面体における１つの平面を基準面とし、その平面に沿ってＸ−Ｙ座標を取り、当該平面に垂直にＺ座標をとることができる。また、多角形が互いに直交する３つの平面を持つ場合、その３つの平面を基準面として３次元直交座標系を定め定めてもよい。
第１容器１の形状は、図１〜４に示した第１容器１のように立方体であってもよく、図５（ａ）に示したように直方体であってもよく、図５（ｂ）に示したように六角柱であってもよい。また、第１容器１の形状は、図５（ｃ）に示したように円柱であってもよい。
また、第１容器１の形状は、４面体（三角錐）、５面体（三角柱、４角錐など）であってもよく、直方体以外の６面体（平行６面体、双三角錐など）、７面体（５角柱、６角錐など）、８面体（双四角錐など）であってもよい。また、１０面体（双五角錐など）１２面体（正１２面体、菱形１２面体、立方１２面体など）であってもよい。第１容器１における面の数はさらに多くてもよいが、各窓部４の面積を広く確保する観点から面の数はあまり多過ぎない方がよく、４面体、５面体、６面体、７面体、８面体が好ましい。特に６面体の場合は３方向に面積の大きな窓が面するので、３次元観察に適している。
第１容器１は、例えば、各辺の長さが１ｍｍ以上５ｃｍ以下となる大きさにすることができる。また、第１容器１の容量は、例えば、１μＬ以上１０ｍＬ以下とすることができる。
第１容器１は、透光性の窓部４を有する。このため、第１容器１内部の細胞組織７を窓部４から顕微鏡などにより観察することができる。また、第１容器１の形状が図１〜４、図５（ａ）、（ｂ）のように多面体である場合、窓部４は第１容器１の各面に設けることができる。このことにより、第１容器１内部の細胞組織７を第１容器１の各面からそれぞれ観察することができる。例えば、図１〜４のように、窓部４は、第１容器１の各面に設けることができる。なお、窓部４から細胞組織７を観察する際、第１容器１を光透過性の高いガラス容器にいれて細胞組織７を観察することができる。このことにより、液体培地などが顕微鏡に付着することを防止することができる。
例えば、窓部４の形状は、膜状であってもよい。また、窓部４の形状は、平板状であってもよい。窓部４の厚みは厚くしてもよいが、このように膜状あるいは平板状にして、その厚みを小さく設定することにより、窓部４の透光性やタンパク質透過性を向上させることができる。
また、第１容器１は、細胞組織７の相対位置がずれることを抑制して回転させることができるため、第１容器１の窓部４を設けた各面が観察用試料セル１０の観察面となるように第１容器１を回転させることができる。特に、第１容器１の上面と下面とが入れ替わるように第１容器１を回転させることや、第１容器１を横倒しにするように回転させることが可能になる。従って、第１容器１の各面から内部の細胞組織７を観察することが可能になり、細胞組織７の三次元的な立体形状を容易に明らかにすることができる。なお、細胞組織７の観察に用いる顕微鏡は、光学顕微鏡であってもよく、レーザー顕微鏡であってもよい。
第１容器１の形状が図５（ｃ）のように円柱である場合、窓部４は円柱の側面に設けることができる。このことにより、レーザー顕微鏡を用いて細胞組織７の三次元画像を取得することができる。また、窓部４は、円柱の上面および下面にも設けることができる。このことにより、上面及び下面からも細胞組織７を観察することができ、三次元画像の解像度を向上させることができる。
例えば、窓部４の形状は、膜状であってもよい。また、窓部４の形状は、平板状であってもよい。窓部４の厚みは厚くしてもよいが、このように膜状あるいは平板状にして、その厚みを小さく設定することにより、窓部４の透光性やタンパク質透過性を向上させることができる。
また、第１容器１は、細胞組織７の相対位置がずれることを抑制して回転させることができるため、第１容器１の窓部４を設けた各面が観察用試料セル１０の観察面となるように第１容器１を回転させることができる。特に、第１容器１の上面と下面とが入れ替わるように第１容器１を回転させることや、第１容器１を横倒しにするように回転させることが可能になる。従って、第１容器１の各面から内部の細胞組織７を観察することが可能になり、細胞組織７の三次元的な立体形状を容易に明らかにすることができる。なお、細胞組織７の観察に用いる顕微鏡は、光学顕微鏡であってもよく、レーザー顕微鏡であってもよい。
第１容器１の形状が図５（ｃ）のように円柱である場合、窓部４は円柱の側面に設けることができる。このことにより、レーザー顕微鏡を用いて細胞組織７の三次元画像を取得することができる。また、窓部４は、円柱の上面および下面にも設けることができる。このことにより、上面及び下面からも細胞組織７を観察することができ、三次元画像の解像度を向上させることができる。
第１容器１の窓部４はハイドロゲルからなる。このことにより、第１容器１の外部の液体培地などから培養に必要なタンパク質（分子量：数万〜数十万）などを窓部４を介して培養ゲル６及び細胞組織７に供給することができる。また、細胞培養容器１０は、液体培地９を溜める第２容器２を備えることができ、第１容器１を液体培地９中に配置することができる。例えば、図３に示した第２実施形態の細胞培養容器１０のように第２容器２を備えることができる。このことにより、第２容器２に溜めた液体培地９に含まれるタンパク質などの栄養を窓部４を介して培養ゲル６及び細胞組織７に供給することができる。このことにより、第１容器１の内部の細胞組織７の活性を長期間維持することが可能になる。また、培養ゲル６が液体培地９と直接接触しないため、培養ゲル６が液体培地９を吸収し膨潤することを抑制することができ、細胞組織７の相対位置がずれることを抑制することができる。例えば、第２容器２は、複数のウェルを有するウェルプレートとすることができる。このことにより、複数の第１容器１をそれぞれ異なるウェル中に入れて培養することができ、多数の細胞組織７を培養することが可能になる。
第２容器２に溜めた液体培地９は定期的に入れ替えてもよい。また、細胞培養容器１０が新たな液体培地を溜めた第３容器を備え、第２容器２内で第１容器１内の細胞組織を一定期間培養した後、第１容器１を第２容器２から取り出し、第１容器１を第３容器に溜めた液体培地中に入れてもよい。また、第２容器２は複数のウェルを備えてもよい。１つのウェル内で第１容器１内の細胞組織７を一定期間培養した後、第１容器１をウェルから取り出し、第１容器１を異なるウェルに入れてもよい。このことにより、第１容器１の周りの液体培地の栄養分が低下することを抑制することができ、細胞組織７の活性を長期間維持することができる。
窓部４を構成するハイドロゲルは、タンパク質を通し、かつ、自立できるだけの硬さがあれば特に限定されない。ハイドロゲルとは、水中の分散質が繋がってネットワークを形成し系全体として固体状になったものである。
例えば、窓部４の強度並びにタンパク質透過性は、窓部４に用いられているハイドロゲルのネットワークを形成する分散質の濃度を調整することによって調整することができる。
ネットワークを形成する分散質の濃度が高いほど窓部４の強度が高くなる。窓部４の強度としては５０ｇ／ｃｍ2以上のゲル強度を有することが好ましく、このことにより、第１容器１の内部の培養ゲル６の重さにより窓部４が変形することを抑制することができる。
一方、分散質の濃度が高すぎると、タンパク質透過性が低下するので、タンパク質透過性を確保する上で、窓部４の強度が１００００ｇ／ｃｍ2以下となるように分散質の濃度に抑えることが好ましい。
従って、窓部４の強度としては５０ｇ／ｃｍ2以上１００００ｇ／ｃｍ2以下が好ましい。なお、このようなゲル強度を得るための分散質の適切な濃度は、分散質の種類により異なる。
例えば、窓部４は、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル、アルギン酸ナトリウム又はコラーゲンゲルを含むことができる。このことのより、窓部４が透光性を有することができる。また、第２容器２に溜めた液体培地９に含まれるタンパク質などの栄養が窓部４を透過することができ、培養ゲル６及び細胞組織７に栄養を供給することができる。また、窓部４がアガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル、アルギン酸ナトリウム又はコラーゲンゲルを含むことにより、第１容器１を回転させた場合でも窓部４が変形することを抑制することができる。窓部４は、好ましくは、アガロースゲル又はポリアクリルアミドゲルである。このことにより、窓部４の硬さを容易に調整することができる。また、細胞培養容器１０の製造コストを低減することができる。
窓部４がアガロースゲルの場合、アガロースの濃度は、例えば、０．５〜４．０％とすることができる。また、窓部４がポリアクリルアミドゲルの場合、ポリアクリルアミドの濃度は、例えば、３〜２０％とすることができる。窓部４がアルギン酸ナトリウムを含む場合、窓部４は、アルギン酸ナトリウム水溶液にカルシウムイオンを加えてゲル化することにより形成することができる。窓部４がコラーゲンゲルの場合、高濃度のコラーゲンゲルで窓部４を形成することができる。このことにより窓部４が十分な強度を有することができる。
例えば、窓部４の強度並びにタンパク質透過性は、窓部４に用いられているハイドロゲルのネットワークを形成する分散質の濃度を調整することによって調整することができる。
ネットワークを形成する分散質の濃度が高いほど窓部４の強度が高くなる。窓部４の強度としては５０ｇ／ｃｍ2以上のゲル強度を有することが好ましく、このことにより、第１容器１の内部の培養ゲル６の重さにより窓部４が変形することを抑制することができる。
一方、分散質の濃度が高すぎると、タンパク質透過性が低下するので、タンパク質透過性を確保する上で、窓部４の強度が１００００ｇ／ｃｍ2以下となるように分散質の濃度に抑えることが好ましい。
従って、窓部４の強度としては５０ｇ／ｃｍ2以上１００００ｇ／ｃｍ2以下が好ましい。なお、このようなゲル強度を得るための分散質の適切な濃度は、分散質の種類により異なる。
例えば、窓部４は、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル、アルギン酸ナトリウム又はコラーゲンゲルを含むことができる。このことのより、窓部４が透光性を有することができる。また、第２容器２に溜めた液体培地９に含まれるタンパク質などの栄養が窓部４を透過することができ、培養ゲル６及び細胞組織７に栄養を供給することができる。また、窓部４がアガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル、アルギン酸ナトリウム又はコラーゲンゲルを含むことにより、第１容器１を回転させた場合でも窓部４が変形することを抑制することができる。窓部４は、好ましくは、アガロースゲル又はポリアクリルアミドゲルである。このことにより、窓部４の硬さを容易に調整することができる。また、細胞培養容器１０の製造コストを低減することができる。
窓部４がアガロースゲルの場合、アガロースの濃度は、例えば、０．５〜４．０％とすることができる。また、窓部４がポリアクリルアミドゲルの場合、ポリアクリルアミドの濃度は、例えば、３〜２０％とすることができる。窓部４がアルギン酸ナトリウムを含む場合、窓部４は、アルギン酸ナトリウム水溶液にカルシウムイオンを加えてゲル化することにより形成することができる。窓部４がコラーゲンゲルの場合、高濃度のコラーゲンゲルで窓部４を形成することができる。このことにより窓部４が十分な強度を有することができる。
第１容器１は、窓部４を囲む枠部５を有することができる。このことにより、第１容器１の強度を大きくすることができ、細胞培養容器１０／観察用試料セル１０の取り扱いが容易になる。また、窓部４が傷つくことを抑制することができる。例えば、図１〜３に示した第１容器１のように、第１容器１を枠部５と窓部４から構成することができる。枠部５の材料は、生体適合性を有する樹脂とすることができる。また、枠部５の材料は、例えば、ポリカーボネートとすることができる。
図１、２に示したような細胞培養容器１０／観察用試料セル１０は、次のように作製することができる。まず、６面にそれぞれ開口を有する立方体の枠部５を準備し、窓部４用のゾルを枠部５の開口に流し込みゲル化させハイドロゲルからなる膜状又はシート状の窓部５を形成する。このようにして、枠部５の５面にそれぞれ窓部５を形成した後、ゲル化前の培養ゲルおよび細胞組織を枠部５の立方体中に注入して培養ゲルをゲル化させる。その後、窓部４用のゾルを残り１つの枠部５の開口に流し込みゲル化させ膜状又はシート状の窓部４を形成する。このようにして細胞組織７と培養ゲル６を内包した第１容器１を形成することができる。
図１、２に示したような細胞培養容器１０／観察用試料セル１０は、次のように作製することができる。まず、６面にそれぞれ開口を有する立方体の枠部５を準備し、窓部４用のゾルを枠部５の開口に流し込みゲル化させハイドロゲルからなる膜状又はシート状の窓部５を形成する。このようにして、枠部５の５面にそれぞれ窓部５を形成した後、ゲル化前の培養ゲルおよび細胞組織を枠部５の立方体中に注入して培養ゲルをゲル化させる。その後、窓部４用のゾルを残り１つの枠部５の開口に流し込みゲル化させ膜状又はシート状の窓部４を形成する。このようにして細胞組織７と培養ゲル６を内包した第１容器１を形成することができる。
第１容器１は、枠部５を有さず窓部４を形成するハイドロゲルから構成されてもよい。このことにより、窓部４から細胞組織を観察する際に死角が生じることを抑制することができる。特に、第１容器１のサイズが十分に小さい場合（例えば、５ｍｍ以下）に第１容器１を枠部５を有さない構成にすることができる。例えば、図４に示した第１容器１のように、第１容器１は枠部５を有さなくてもよい。
図４に示したような細胞培養容器１０／観察用試料セル１０は、次のように作製することができる。まず、窓部４用のゾルを型に流し込みゲル化させて、１つの面に開口を有する中空の立方体ゲルを形成する。その後、ゲル化前の培養ゲルおよび細胞組織を立方体ゲル中に注入して培養ゲルをゲル化させる。その後、立方体ゲルの開口に窓部４用のゾルを流し込みゲル化させ窓部５を形成する。このようにして細胞組織７と培養ゲル６を内包した第１容器１を形成することができる。
図４に示したような細胞培養容器１０／観察用試料セル１０は、次のように作製することができる。まず、窓部４用のゾルを型に流し込みゲル化させて、１つの面に開口を有する中空の立方体ゲルを形成する。その後、ゲル化前の培養ゲルおよび細胞組織を立方体ゲル中に注入して培養ゲルをゲル化させる。その後、立方体ゲルの開口に窓部４用のゾルを流し込みゲル化させ窓部５を形成する。このようにして細胞組織７と培養ゲル６を内包した第１容器１を形成することができる。
細胞培養実験及び細胞観察実験
図１、２に示したような気管支組織を内包した第１容器を作成し、図３に示したように、第１容器を液体培地中に配置して気管支組織を培養した。まず、一辺１ｃｍのポリカーボネート製の立方体の枠部を準備し、１．５％アガロースゲルで窓部を形成した。その後、立方体内部に培養ゲルであるマトリゲル（登録商標）と気管支組織を注入しゲル化した後、残りの開口に１．５％アガロースゲルで窓部を形成することにより、第１容器を作製した。この第１容器を液体培地中に配置して、気管支組織を１０日間三次元培養した。その後、培養した気管支組織を光学顕微鏡を用いて観察した。
なお、細胞培養実験では、第１容器中の培養ゲルの膨潤や細胞活性の劣化は観察されなかった。
図１、２に示したような気管支組織を内包した第１容器を作成し、図３に示したように、第１容器を液体培地中に配置して気管支組織を培養した。まず、一辺１ｃｍのポリカーボネート製の立方体の枠部を準備し、１．５％アガロースゲルで窓部を形成した。その後、立方体内部に培養ゲルであるマトリゲル（登録商標）と気管支組織を注入しゲル化した後、残りの開口に１．５％アガロースゲルで窓部を形成することにより、第１容器を作製した。この第１容器を液体培地中に配置して、気管支組織を１０日間三次元培養した。その後、培養した気管支組織を光学顕微鏡を用いて観察した。
なお、細胞培養実験では、第１容器中の培養ゲルの膨潤や細胞活性の劣化は観察されなかった。
図６は、培養後の第１容器の写真である。図７は、第１容器の下面の窓部から気管支組織を撮影した写真（図１、２の（Ａ）方向からの写真）であり、図８は、第１容器の前面の窓部から気管支組織を撮影した写真（図１、２の（Ｂ）方向からの写真）であり、図９は、第１容器の右面の窓部から気管支組織を撮影した写真（図１の（Ｃ）方向からの写真）である。
図７の下面の窓部からの写真では、気管支組織の中心部が暗くなった。これは、気管支組織が上下方向に成長したため、試料に照射した光が気管支組織を透過できなかったためである。図７の写真では、気管支組織の中心部から側面に向かって成長した気管支組織の二次元形状を把握することができた。また、図示していないが、上面の窓部からの写真からも気管支組織の中心部から側面に向かって成長した気管支組織の二次元形状を把握することができた。
図８の前面の窓部からの写真及び図９の右面の窓部からの写真では、上下方向に成長した気管支組織の二次元形状を把握することができた。また、図示していないが、後面の窓部からの写真及び左面の窓部からの写真からも気管支組織の二次元形状を把握することができた。
これらのすべての窓部からの気管支組織の二次元画像を照合することにより、三次元培養した気管支組織の三次元構造を把握することができる。
図８の前面の窓部からの写真及び図９の右面の窓部からの写真では、上下方向に成長した気管支組織の二次元形状を把握することができた。また、図示していないが、後面の窓部からの写真及び左面の窓部からの写真からも気管支組織の二次元形状を把握することができた。
これらのすべての窓部からの気管支組織の二次元画像を照合することにより、三次元培養した気管支組織の三次元構造を把握することができる。
１： 第１容器 ２：第２容器 ４：窓部 ５：枠部 ６：培養ゲル ７：細胞組織（細胞） ９：液体培地 １０：細胞培養容器又は観察用試料セル １２：開口 １３：内部空間
Claims (10)
- 細胞又は細胞組織を包埋する培養ゲルと、前記培養ゲルを内包する第１容器とを備え、
前記培養ゲルは、第１容器内のスペースを満たし、
第１容器は、ハイドロゲルからなる透光性の窓部を有し、
前記窓部は、５０ｇ／ｃｍ 2 以上１００００ｇ／ｃｍ 2 以下のゲル強度を有することを特徴とする細胞培養容器。 - 前記窓部は、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル、アルギン酸ナトリウム又はコラーゲンゲルを含む請求項１に記載の細胞培養容器。
- 第１容器の形状は、立方体又は直方体であり、
第１容器は、各面に前記窓部を有する請求項１又は２に記載の細胞培養容器。 - 第１容器は、前記窓部を囲む枠部を有する請求項１〜３のいずれか１つに記載の細胞培養容器。
- 液体培地を溜める第２容器をさらに備え、
第１容器は、前記液体培地中に配置される請求項１〜４のいずれか１つに記載の細胞培養容器。 - 細胞又は細胞組織を包埋する培養ゲルと、前記培養ゲルを内包する第１容器とを備え、
前記培養ゲルは、第１容器内のスペースを満たし、
第１容器は、ハイドロゲルからなる透光性の窓部を有し、
前記窓部は、５０ｇ／ｃｍ 2 以上１００００ｇ／ｃｍ 2 以下のゲル強度を有することを特徴とする観察用試料セル。 - 細胞又は細胞組織を包埋する培養ゲルが充填される内部空間を有する第１容器を備え、
第１容器は、ハイドロゲルからなる透光性の窓部を有し、
前記窓部は、５０ｇ／ｃｍ 2 以上１００００ｇ／ｃｍ 2 以下のゲル強度を有することを特徴とする細胞培養容器。 - 第１容器の形状は、立方体又は直方体であり、
第１容器は、各側面に前記窓部を有する請求項７に記載の細胞培養容器。 - ハイドロゲルからなる透光性の窓部を有する第１容器の開口から第１容器の内部空間に培養ゲル及び細胞又は細胞組織を充填する工程を備え、
前記窓部は、５０ｇ／ｃｍ 2 以上１００００ｇ／ｃｍ 2 以下のゲル強度を有する細胞培養容器の製造方法。 - 前記内部空間が培養ゲル及び細胞又は細胞組織で充填された後に、前記開口にハイドロゲルからなる透光性の窓部を形成する工程を備える請求項９に記載の製造方法。
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